CN102093475B - 胰高血糖素样肽-1的类似物 - Google Patents
胰高血糖素样肽-1的类似物 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102093475B CN102093475B CN200910200399.7A CN200910200399A CN102093475B CN 102093475 B CN102093475 B CN 102093475B CN 200910200399 A CN200910200399 A CN 200910200399A CN 102093475 B CN102093475 B CN 102093475B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- glp
- analogue
- diabetes
- gly
- polypeptide
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Images
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
本发明提供了胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的类似物及含有该GLP-1类似物的药物组合物,多肽(1-33)药物,该多肽与天然GLP-1相比,在C一端增加3个氨基酸,在N-端改变结构为His-Gly(1-2),具有降低血糖作用,可用于治疗2型糖尿病,能对抗DPPIV酶的水解作用,作用时间可以延长,结构接近人源GLP-1。本发明还提供了含有该多肽的药物组合物和通过化学合成和重组DNA进行生产。本发明利用基因工程技术,大量生产该多肽的工艺,能降低成本,为广大2型糖尿病患者提供一个新的治疗药物。
Description
技术领域
本发明涉及胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的类似物的多肽,该多肽具有降低血糖作用,可用于治疗2型糖尿病。本发明还提供了通过化学合成和重组DNA生产工艺生产这些多肽的方法。
背景技术
糖尿病已成为继心脑血管疾病、肿瘤之后严重危害人类健康的第三大慢性病。随着人们生活水平的提高,糖尿病的发病率逐年增加并演变为世界范围内爆发流行的疾病,而且有扩大化和年轻化的倾向。随着病程的进展,患者会出现多种并发症,如失明、肾功能衰竭、肢体坏疽、心血管疾病和脑血管意外等。美国估计有二千零八十万糖尿病患者,并还在不断增加,其中已经诊断的约为一千四百六十万,而六百二十万患者尚未被诊断,每天新诊断患者逾4100例。世界上糖尿病患病率增长最快的国家是中国(68%)和印度(59%),印度和中国的糖尿病人数位居世界前两位,我国已跨入糖尿病中等患病率国家(3-10%)行列。根据糖尿病患病率资料估算,目前中国大约有3000-4000万的糖尿病人,其中2型糖尿病占90%以上。我国城市人口中,成年人糖尿病发病率在年龄标准化后已达9.7%。2003年,IDF卫生经济专门小组的研究人员估计全球每年的糖尿病医疗保健费用在1530亿一2870亿国际美元之间。世界各国糖尿病患者人数逐年增多,现在中国有5000万,印度6000万,美国1800万,日本600万,全球已达2.2亿患者。糖尿病患者分为两种,一是胰岛素依赖型糖尿病(1型糖尿病)和非胰岛素依赖型糖尿病(2型糖尿病)。其中,2型糖尿病占糖尿病患者的90%以上。
2型糖尿病患者表现了许多特征,如β-细胞减少,餐后胰岛素分泌量不足,胰岛素分泌时间滞后,空腹及餐后血糖增高,糖化血红蛋白HbA1c升高,胰岛素抵抗等。
根据美国UKPDS对2型糖尿病患者的多年跟踪研究报告指出目前6类药物对2型糖尿病患者皆不能逆转糖尿病进程,不能遏制胰脏β细胞的不断进行性的凋亡,也不能阻止糖尿病的并发症如冠心病、肾功能衰竭的发生和发展,改变糖尿病患者预后。因此需要研究新的2型糖尿病治疗药物。
Exendin 4和Exendin 3是南美产巨蜥蜴(Gila monster,Heloderme Suspectum)的唾液中分泌的两种多肽,其中Exendin 4由39个氨基酸残基组成,化学合成品作为抗2型糖尿病药物,2005年获美国FDA批准,商品名为Byetta,2009年中国上市。
Exendin 4能促进胰岛素原的合成,促胰岛素分泌,降低空腹、餐后血糖,当血糖正常之后不再继续作用,因而不易产生低血糖昏迷、休克,安全性高。它能降低HbA1c,增加胰腺β细胞数量及体积,增加2型糖尿病患者胰岛素受体的敏感性,抑制胰高血糖素分泌等作用。每日注射2次,每次5-10ug。但也存在不足,Exendin4来源于巨蜥蜴,而GLP-1是人的内源物质,临床试验报告Exendin 4有52%的患者产生抗体(Diabetes(1997)46,433-439;Diabetes Care(2002)25,330-336;JAMA(2002)287,373-379;Diabetes(1995)44,1249-1258;Diatetes(2002)512796-2803;Diabetes Care(2000)2364-69;N.Engl.J.Med(2002)346,393-463;Lancet(1998)352,837-853)。
虽然GLP-1和Exendin 4及其类似物被认为是潜在的治疗2型糖尿病的理想药物,但要真正实现其临床应用价值,尚存在不少有待解决的问题。主要有:1.半衰期:GLP-1属于人源多肽,半衰期太短,只有3-5分钟;2.免疫源性:Exendin 4由39个氨基酸组成,肽链比GLP-1多9个氨基酸,会产生抗体引起过敏反应。3.Exendin 4因为肽链较长,其对胰腺的刺激可能与胰腺炎有关。4.生产:现已上市的Exendin 4类似物Exenatide为全合成产物,价格昂贵,GLP-1 400$/mg,Exendin4达700$/mg。GLP-1及Exendin 4化学合成会产生一系列问题:低产量,高价格,复杂的纯化过程,杂质残留,生产过程中使用的有机溶剂和化学品对环境造成污染。4.Novo Nordisk的Liraglutide是GLP-1的长效脂肪酸酰化后产物,每天只需一次,但DPPIV酶位点仍存在,降糖效果差。
发明内容
本发明的目的是提供一个GLP-1和Exendin 4的效能及其内在独特的血糖依赖性作用机制使其更适宜被制成缓释制剂。我们在天然GLP-1和Exendin 4的基础上,适当改变结构,延长GLP-1的半衰期,将Exendin 4末端的3个氨基酸接在GLP-1末端,而以His-Gly(1-2)作为肽链结构的N-端以对抗DPPIV酶的水解,使其接近人源的GLP-1,减少免疫源性带来的副作用,比Exendin 4更接近天然的GLP-1,副作用更小。长链脂肪酸的酰化衍生物属于中长效药物。这个结构既能适应基因工程的大量生产,大幅度降低成本,又保持母体的生物活性。能适应广大2型糖尿病患者的需要。
本发明的一个方面提供了结构发生改变,及其肉豆蔻酸衍生物而仍具有降血糖活性的胰高血糖素样肽-1(简称GLP-1)类似物。
本发明的的GLP-1类似物,其结构式为:
GLP-1(1-33):1 10
His-Gly-Gly-Glu-Gly-Thr-X1-Ile-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-
20
Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-X2-X3-Gly-Pro-Pro-X4
其中:X1=Phe或Tyr;
X2=Val或Lys
X3=Gln或Gly
X4=Arg或OH或NH2。
优选地,X1为Phe或Tyr;X2为Val或Lys;X3为Gln或Gly;X4为Arg,OH或NH2。
本发明的另一方面提供了含有上述GLP-1类似物的药物组合物,该组合物含有一种或多种具有上述结构式的化合物和一种药学上可接受的稀释剂或赋形剂,优选的该组合物为单位剂量形式,如片剂、丸剂、胶囊(包括持续释放或延迟释放形式)、粉剂、颗粒、酏剂、酊剂、糖浆和乳液,消毒的注射用溶液或悬液,气雾剂或液体喷剂,滴剂、针剂、自动注射装置或栓剂。例如,以片剂或胶囊的形式口服给药,上述活性药物组分可以与一种口服的无毒的药学可接受的惰性载体,如乙醇、甘油、水及其类似物结合。另外,本发明还提供了上述化合物及药物组合的在制备治疗疾病中的用途,优选的该疾病是2型糖尿病。
本发明的又一个方面提供了制备上述GLP-1类似物及衍生物的基因工程方法。对于X4为Arg的上述化合物,可以用基因工程方法来合成,还可以通过化学方法来合成,但优选用基因工程方法来合成。。
本说明提供一个GLP-1的33个氨基酸多肽衍生物。使其肽链长度与人源GLP-1相近,降低其免疫源性。结构中以His-Gly作为肽链结构的N-端以对抗DPPIV酶的水解,将Exendin-4末端的3个氨基酸接在GLP-1的C-末端,使肽链足够长,以延长GLP-1的半衰期,肉豆蔻酸酰化衍生物降糖效果明确,保持中长效的降糖时间,减少反复注射的痛苦。另外本发明利用基因工程技术,大量生产该多肽的工艺,能降低成本,为广大2型糖尿病患者提供一个新的治疗药物。
附图说明
图1是GLP-1类似物基因片断的串联图;
图2是GLP-1降血糖作用的测定;
具体实施方式
实施例一:
用基因工程方法生产GLP-1类似物
材料
GLP-1类似物
EcoRI Bgl II Arg His Gly Gly Glu Gly Thr Phe Ile Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu
Glu Gly Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Gln Gly Pro Pro Arg
GAA GGC CAG GCG GCG AAA GAA TTC ATC GCG TGG CTG GTT CAG GGC CCG CCG CGT
BamH I Sal I
(1)根据GLP-1类似物的氨基酸序列及相应DNA(正链)序列,合成DNA片段:
5′GGAATTCCAGATCTCGTCACGGCGGCGAAGGCACCTTCACCAGCGATCTGAGCAGCTACCTGGAAGGCCAGGCGGCGAAAGAGTTCATCGCGTGGCTGGTTAACGGCCCGCCGCGTGGATCCTAGGTCGAC 3′
下面是设计的引物:
C05A-1 CCAATGGAATTCCAGATCTCGTCACGGC
C05A-2 TGAAGGTGCCTTCGCCGCCGTGACGAGATCTGG
C05A-3 GGCGAAGGCACCTTCACCAGCGATCTGAGCAG
C05A-4 CCTGGCCTTCCAGGTAGCTGCTCAGATCGCTGG
C05A-5 CTACCTGGAAGGCCAGGCGGCGAAAGAGTTCATCG
C05A-6 CCGTTAACCAGCCACGCGATGAACTCTTTCGCCG
C05A-7 CGTGGCTGGTTAACGGCCCGCCGCGTGGA
C05A-8 CCAATGTCGACCTAGGATCCACGCGGCGGG
(2)按PCR常规方法,合成GLP-1类似物基因,经EcoR I/Sal I双酶切后,克隆到含Lac启动子质粒中,测定DNA序列与设计完全一致。
(3)参见图1,按图示方案将GLP-1类似物基因进行串联,得到含8个拷贝基因的质粒。测定DNA全序列,符合设计,转化E.coli JM109,构建基因工程菌。
8个串联后的序列:
GGAATTCCAGATCTCGTCACGGCGGCGAAGGCACCTTCACCAGCGATCTGAGCAGCTACCTGGAAGGCCAGGCGGCGAAAGAGTTCATCGCGTGGCTGGTTAACGGCCCGCCGCGTGGATCTCGTCACGGCGGCGAAGGCACCTTCACCAGCGATCTGAGCAGCTACCTGGAAGGCCAGGCGGCGAAAGAGTTCATCGCGTGGCTGGTTAACGGCCCGCCGCGTGGATCTCGTCACGGCGGCGAAGGCACCTTCACCAGCGATCTGAGCAGCTACCTGGAAGGCCAGGCGGCGAAAGAGTTCATCGCGTGGCTGGTTAACGGCCCGCCGCGTGGATCTCGTCACGGCGGCGAAGGCACCTTCACCAGCGATCTGAGCAGCTACCTGGAAGGCCAGGCGGCGAAAGAGTTCATCGCGTGGCTGGTTAACGGCCCGCCGCGTGGATCTCGTCACGGCGGCGAAGGCACCTTCACCAGCGATCTGAGCAGCTACCTGGAAGGCCAGGCGGCGAAAGAGTTCATCGCGTGGCTGGTTAACGGCCCGCCGCGTGGATCTCGTCACGGCGGCGAAGGCACCTTCACCAGCGATCTGAGCAGCTACCTGGAAGGCCAGGCGGCGAAAGAGTTCATCGCGTGGCTGGTTAACGGCCCGCCGCGTGGATCTCGTCACGGCGGCGAAGGCACCTTCACCAGCGATCTGAGCAGCTACCTGGAAGGCCAGGCGGCGAAAGAGTTCATCGCGTGGCTGGTTAACGGCCCGCCGCGTGGATCTCGTCACGGCGGCGAAGGCACCTTCACCAGCGATCTGAGCAGCTACCTGGAAGGCCAGGCGGCGAAAGAGTTCATCGCGTGGCTGGTTAACGGCCCGCCGCGTGGATCCTAGGTCGAC
实施例二:
GLP-1类似物的制备
(A)GLP-1类似物基因工程菌接种于300ml×2瓶LB培养基中,加氨苄西林(Ampicillin)使其最后浓度为50μg/ml,37℃,摇床培养过夜(150rpm)。第二日转至20L New Brunswik发酵罐培养,培养液组成为M9培养液,加葡萄糖浓度1%,氨苄西林(Ampicillin)浓度为50μg/ml,通气量为20L/min,溶氧维持在20%以上,防泡剂为国产泡敌,pH维持在7~8,用氨水调节。当菌体浓度达log曲线中线,加IPTG,浓度为0.5mM,继续发酵4~6小时,离心收集菌体为湿重30~50g/L。
(B)收集的菌体用pH 7.0 Tris缓冲液20mM匀浆,之后加溶菌酶1g/L,37℃保温1小时,冷冻-20℃过夜,超声破碎3次,每次1分钟左右,离心收集沉淀,2M Urea打碎洗涤1次,再打碎水洗1次。
(C)分离、纯化包涵体:沉淀溶于8M尿素,分子筛Sephadex G-100 A280nm检测,透析过夜,DEAE pH8.0-9.0梯度洗脱,蛋白电泳确定目标蛋白。
(D)二羧酸溶解,pH7.5条件下加入1~2‰高纯度猪胰蛋白酶37℃搅拌2~3小时,HPLC追踪。完成酶解反应后以蠕动泵30000分子量超滤除去胰蛋白酶。
(E)制备型HPLC纯化。
(F)冷冻干燥获得产品。
实施例三:
肉豆蔻酸酰化的GLP-1类似物的衍生物制备
(A)取GLP-1类似物的融合蛋白10g溶于100ml水中,加盐酸胍使其最终浓度为5M,45℃保温过夜。
(B)称取肉豆蔻酸(Maristic acid)1.14g,N-羟基琥珀酸亚胺(N-hydroxysuccinimide)0.6g,N,N’-二环己基碳酰亚胺(DCCI)1.03g溶于50ml二氧六环(dioxane)中,室温搅拌,4小时后,过滤除去脲素衍生物,取清液20ml加入(A)中,加100μl四甲基胍(Tetrameltyl-guanidine),室温激烈搅拌下反应4小时后用2N HCl调至pH 3-4,8000rpm离心,将沉淀用乙醇洗涤2次,将脂肪酸酰化的GLP-1类似物溶于水中,以碳酸氢钠粉末调至pH7~8,按重量的1~2‰加高纯度猪胰蛋白酶37℃搅拌反应2~3小时,HPLC追踪。制备型HPLC纯化。冷冻干燥获得产品。
实施例四
GLP-1类似物降血糖作用的测定,参见图2。
C57BL/6的8周龄小鼠,禁食过夜(只给饮水)
对照组、GLP-1 analog组
每组4只,腹腔注射药物一次,GLP-1类似物为2μg/小鼠,然后注射30%葡萄糖溶液300μl,每2小时注射一次葡萄糖,20分钟后眼眶旁取静脉血5μl,以葡萄糖氧化酶试纸测定快速血糖,图2结果表明GLP-1类似物的降血糖作用明确,有效持续时间8小时以上。
Claims (4)
1.胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的类似物,其结构式为:
His-Gly-Gly-Glu-Gly-Thr-X1-Ile-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-Ala-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-X2-X3-Gly-Pro-Pro-X4
其中:X1=Phe;
X2=Val
X3=Gln
X4=Arg。
2.一种含有如权利要求1所述的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的类似物的药物组合物,其进一步含有药学上可接受的载体为:稀释剂或赋形剂。
3.根据权利要求2所述的药物组合物,其中,所述的载体选自于如下一组物质:乙醇、甘油和水。
4.如权利要求1所述的胰高血糖素样肽-1(GLP-1)的类似物的用途,其用途为:用于治疗糖尿病药物的制备,其中,所述的糖尿病是2型糖尿病。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN200910200399.7A CN102093475B (zh) | 2009-12-11 | 2009-12-11 | 胰高血糖素样肽-1的类似物 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN200910200399.7A CN102093475B (zh) | 2009-12-11 | 2009-12-11 | 胰高血糖素样肽-1的类似物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN102093475A CN102093475A (zh) | 2011-06-15 |
CN102093475B true CN102093475B (zh) | 2014-02-26 |
Family
ID=44126762
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN200910200399.7A Expired - Fee Related CN102093475B (zh) | 2009-12-11 | 2009-12-11 | 胰高血糖素样肽-1的类似物 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN102093475B (zh) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN114685643A (zh) * | 2020-12-29 | 2022-07-01 | 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 | 一种人glp-1多肽变体及其应用 |
CN114685644A (zh) * | 2020-12-29 | 2022-07-01 | 苏州康宁杰瑞生物科技有限公司 | 一种人glp-1多肽变体及其应用 |
Citations (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1363654A (zh) * | 2001-07-19 | 2002-08-14 | 上海华谊生物技术有限公司 | 生产促胰岛素分泌肽glp-1(7-36)的基因工程菌以及生产glp-1(7-36)的方法 |
CN1746188A (zh) * | 2004-09-06 | 2006-03-15 | 上海华谊生物技术有限公司 | Glp-1类似物 |
CN101337989A (zh) * | 2008-08-28 | 2009-01-07 | 中国药科大学 | 一类新型胰高血糖素样肽-1(glp-1)类似物及其应用 |
CN101367873A (zh) * | 2008-10-08 | 2009-02-18 | 南开大学 | 一种改构的胰高血糖素样肽-1的类似物和修饰物及其应用 |
-
2009
- 2009-12-11 CN CN200910200399.7A patent/CN102093475B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1363654A (zh) * | 2001-07-19 | 2002-08-14 | 上海华谊生物技术有限公司 | 生产促胰岛素分泌肽glp-1(7-36)的基因工程菌以及生产glp-1(7-36)的方法 |
CN1531551A (zh) * | 2001-07-19 | 2004-09-22 | \ | 一种生产促胰岛素分泌肽glp-1(7-36)及glp-1类似物的方法 |
CN1746188A (zh) * | 2004-09-06 | 2006-03-15 | 上海华谊生物技术有限公司 | Glp-1类似物 |
CN101337989A (zh) * | 2008-08-28 | 2009-01-07 | 中国药科大学 | 一类新型胰高血糖素样肽-1(glp-1)类似物及其应用 |
CN101367873A (zh) * | 2008-10-08 | 2009-02-18 | 南开大学 | 一种改构的胰高血糖素样肽-1的类似物和修饰物及其应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
CN102093475A (zh) | 2011-06-15 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Zaykov et al. | Pursuit of a perfect insulin | |
CN102363633B (zh) | 胰高血糖素样肽-1突变体多肽及其制备方法、药物组合物和其应用 | |
CN101993485B (zh) | 促胰岛素分泌肽类似物同源二聚体及其用途 | |
CN102766204B (zh) | 胰高血糖素样肽-1突变体多肽及其制备方法和其应用 | |
US20090202494A1 (en) | Combined use of glp-1 agonists and gastrin for regulating blood glucose levels | |
CN106986940A (zh) | 具有增强的作用持续时间的工程化多肽 | |
WO2023124847A1 (zh) | 一种长效glp-1衍生物 | |
CN104080473A (zh) | 包含胰岛素氨基酸序列的治疗剂 | |
CN106117370B (zh) | 高糖基化Exendin‑4及其类似物的融合蛋白、其制备方法和用途 | |
CN113493504A (zh) | GIP-Exendin-4嵌合肽的分子改构及其二聚体在治疗糖尿病中的应用 | |
CN113265007B (zh) | 一种治疗代谢疾病的融合蛋白及其制备方法和应用 | |
JP2022191398A (ja) | アシル化glp-1誘導体 | |
WO2022099991A1 (zh) | 多肽及其衍生物和水凝胶、以及在制备预防和/或治疗i型糖尿病药物中的应用 | |
ES2775185T3 (es) | Modificador de exenatida y uso del mismo | |
CN110386975A (zh) | 酰化的glp-1衍生物 | |
CN114891090B (zh) | 一种酰化的长效glp-1衍生物 | |
CN107033234A (zh) | 酰化的glp‑1衍生物 | |
CN102199206B (zh) | 快速起效且在酸性条件下稳定的胰岛素类似物及其制剂 | |
JP2008546816A (ja) | エキセンディン4ポリペプチドフラグメントおよびその使用 | |
CN115490760A (zh) | 一种glp-1受体和gcg受体共激动多肽衍生物 | |
CN106279430B (zh) | Exendin‑4类似物融合蛋白及其制备方法和用途 | |
CN102093475B (zh) | 胰高血糖素样肽-1的类似物 | |
CN113105561B (zh) | 一种双靶点融合蛋白的制备方法和应用 | |
EP3257523A1 (en) | Use of polypeptide complex as polypeptide or protein drug carrier, method, and fusion protein complex thereof | |
CN102712690B (zh) | 长效Exendin 4的类似物 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20140226 Termination date: 20211211 |
|
CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |