CN112259165A - 用于检测微卫星不稳定性状态的方法及*** - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微卫星位点检测技术领域，具体涉及用于检测微卫星不稳定性状态的方法及***，通过对癌变组织样本进行DNA提取，片段化处理，末端修复，接头连接；再经扩增、杂交、捕获、PCR扩增、纯化得到测序文库；通过二代上机测序得到肿瘤组织样本靶向捕获测序数据，根据MSI模型进行微卫星不稳定状态检测相关的信息分析。与现有技术相比，本发明采用目前成熟的二代测序技术获取被测试者肿瘤组织的遗传信息，可进行单一肿瘤组织分析，不依赖对照样本，打破了微卫星检测的局限性，可适用于多个基因组合，不需要专门设计MSI位点探针，适用性强，并且可以节约检测成本，具有高效、***、经济简便性，并且提高了检测的敏感性。

Description

用于检测微卫星不稳定性状态的方法及***
技术领域
本发明涉及微卫星位点检测技术领域，具体涉及用于检测微卫星不稳定性状态的方法及***。
背景技术
微卫星（Microsatellite,简称MS）序列又称短串联重复序列（Short tandemrepeats, STRs）或简单重复串联序列（Simple Sequence Repeat, SSR），广泛存在于原核及真核基因组中，是由10~50个1~6个核苷酸组成的重复单元串联而成的具有高度多态性的简单串联重复序列。当人体的错配修复（Mismatch repair, 简称MMR）机制发生缺陷时，MS序列会出现长度的变化，成为微卫星不稳定性（Microsatellite instability, 简称MSI）。大量研究证明，微卫星不稳定性与肿瘤的发生相关，尤其是结直肠癌等胃肠道癌症，并在肿瘤的治疗和预后的过程中具有重要的作用。
美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，简称NCCN）结直肠癌指南中提到MSI检测应在所有结直肠癌史的病人中进行，可以作为结直肠癌预后的良好标志物并且MSI-H的结直肠癌II期病人有较好的预后。
FDA在2017年5月批准默沙东PD-1单抗Keytruda用于治疗携带MSI-H或错配修复缺陷(dMMR)的实体瘤患者，证明了MSI-H可以作为一种独立于肿瘤发病位置的泛癌种癌症标志物。紧接着2017年8月批准了nivolumab用于曾接受过氟嘧啶、奥沙利铂或伊立替康化疗发生疾病进展或对上述药物不耐受的dMMR或MSI-H的成年人或12岁以上儿童转移性结直肠癌患者的治疗；2018年7月又批准了Ipilimumab联合nivolumab，用于治疗12岁及以上的MSI-H或dMMR并且在使用氟嘧啶、奥沙利铂或伊立替康治疗后疾病进展的转移性结直肠癌患者。可见MSI检测对于癌症患者的重要性。
目前，市场上对于肿瘤MSI的诊断方法多数停留在单个肿瘤单个或几个位点的检测水平，这些方法都存在不同的缺陷，免疫组化的方法特异性和可重复性较低，对样本质量要求高，操作也比较复杂；PCR的方法通常选择5-11个单核苷酸重复位点，长度为25bp左右，PCR扩增后通过毛细管电泳测量其长度分布区间来确定样本的微卫星(不)稳定状态，为目前的金标准检测方法，但需要额外的检测样本来进行，且需要患者的正常组织作为对照来进行状态判定，因此从操作角度上而言并不便捷。所以，目前的MSI的检测方法难以满足目前检测样本数量大、检测位点多、分布广、检测准确性高等检测要求。因此，如何建立一种高效便捷的MSI检测体系，并寻找高度灵敏性及特异性的用于检测结直肠癌相关的MSI位点已成为目前需要解决的问题。
发明内容
为了克服上述技术缺陷的不足，本发明提供了用于检测微卫星不稳定性状态的方法及***，可实现样本中多个微卫星位点和多个疾病相关基因的同时检测，能够针对所检测的样本给出更加全面的预后、治疗、排查等方面的结论和建议。
用于检测微卫星不稳定性状态的***，关键在于：包括用于对肿瘤样本的微卫星不稳定状态进行信息分析的MSI模型，所述MSI模型包括MSI模型准备模块，用于判别样本微卫星不稳定性状态的高灵敏度位点；数据质控模块，用于对靶向捕获数据进行质控，进行微卫星不稳定性检测；MSI状态检测模块，用于扫描样本比对结果中所有有效位点，对该样本的微卫星位点状态进行预测，根据MSI score来判别样本的MSI状态。高灵敏度位点如下表1所示：
表1
序号 微卫星位点 基因 区域 重复单元 重复长度 试剂盒中检测长度（bp）
1 NR21 SLC7A8 chr14:23652347-23652367 A 21 341
2 NR22 STT3A chr11:125490766-125490786 T 21 341
3 NR24 ZNF2 chr2:95849362-95849384 T 23 343
4 NR27 BIRC3 chr11:102193509-102193534 A 26 346
5 BAT25 KIT chr4:55598212-55598236 T 25 360
6 BAT26 MSH2 chr2:47641560-47641586 A 27 347
7 Mono27 MAP4K3 chr2:39536690-39536716 T 27 341
8 D2S123 MSH2 chr2:51286141-51286150 AC 5 325
9 D5S346 APC chr5:112213679-112213718 TG 20 340
10 D17S250 BRCA1 chr17:37152193-37152206 TA 7 327
11 Penta C - chr9:33834923-33834942 AAAAG 4 324
12 Penta D - chr21:46458621-46458635 AAAAG 3 323
13 chr1_26646611 CD52 chr1:26646611-26646626 A 16 336
14 chr1_31732677 SNRNP40 chr1:31732677-31732687 A 11 331
15 chr1_39900058 MACF1 chr1:39900058-39900074 T 17 337
16 chr1_44805012 ERI3 chr1:44805012-44805029 A 18 338
17 chr1_54395673 HSPB11 chr1:54395673-54395690 A 18 338
18 chr1_64245841 ROR1 chr1:64245841-64245853 T 13 333
19 chr1_66037973 LEPR chr1:66037973-66037999 T 27 347
20 chr1_94497662 ABCA4 chr1:94497662-94497671 T 10 330
21 chr1_113657018 LRIG2 chr1:113657018-113657031 T 14 334
22 chr1_114281007 PHTF1 chr1:114281007-114281017 A 11 331
23 chr1_148904052 AK310441;LOC645166 chr1:148904052-148904071 A 20 340
24 chr1_201948138 TIMM17A;RNPEP chr1:201948138-201948148 A 11 331
25 chr1_237965133 RYR2 chr1:237965133-237965144 T 12 332
26 chr2_32690253 BIRC6 chr2:32690253-32690271 T 19 339
27 chr2_47635523 MSH2 chr2:47635523-47635535 T 13 333
28 chr2_48032740 MSH6 chr2:48032740-48032752 T 13 333
29 chr2_48605827 FOXN2 chr2:48605827-48605841 T 15 335
30 chr2_109371849 RANBP2 chr2:109371849-109371863 T 15 335
31 chr2_111886180 BCL2L11 chr2:111886180-111886197 T 18 338
32 chr2_113127925 RGPD8 chr2:113127925-113127935 G 11 331
33 chr2_120714401 PTPN4 chr2:120714401-120714416 T 16 336
34 chr2_228142038 LOC654841 chr2:228142038-228142055 A 18 338
35 chr3_48491350 ATRIP chr3:48491350-48491364 A 15 335
36 chr3_101520971 NXPE3 chr3:101520971-101520981 A 11 331
37 chr3_121202433 POLQ chr3:121202433-121202449 A 17 337
38 chr3_140678384 SLC25A36 chr3:140678384-140678398 A 15 335
39 chr3_142231062 ATR chr3:142231062-142231079 A 18 338
40 chr3_178938735 PIK3CA chr3:178938735-178938740 TA 6 326
41 chr4_39904142 PDS5A chr4:39904142-39904158 T 17 337
42 chr4_55131001 PDGFRA chr4:55131001-55131017 A 17 337
43 chr4_153268227 FBXW7 chr4:153268227-153268240 A 14 334
44 chr5_34183081 C1QTNF3;DQ587763 chr5:34183081-34183100 T 20 340
45 chr5_55055878 DDX4 chr5:55055878-55055892 T 15 335
46 chr5_87494728 TMEM161B chr5:87494728-87494742 T 15 335
47 chr5_118500981 DMXL1 chr5:118500981-118500998 A 18 338
48 chr5_134063499 SEC24A chr5:134063499-134063512 A 14 334
49 chr5_147795697 FBXO38 chr5:147795697-147795711 T 15 335
50 chr6_44364261 CDC5L chr6:44364261-44364275 T 15 335
51 chr6_47955155 PTCHD4 chr6:47955155-47955167 A 13 333
52 chr6_52677230 GSTA1;GSTA5 chr6:52677230-52677242 A 13 333
53 chr6_111329221 RPF2 chr6:111329221-111329237 T 17 337
54 chr6_128385956 PTPRK chr6:128385956-128385965 A 10 330
55 chr7_6750054 ZNF12;PMS2CL chr7:6750054-6750068 A 15 335
56 chr7_98639904 SMURF1 chr7:98639904-98639915 T 12 332
57 chr7_99916348 SPDYE3 chr7:99916348-99916362 T 15 335
58 chr7_102883497 DPY19L2P2 chr7:102883497-102883511 A 15 335
59 chr7_116381121 MET chr7:116381121-116381136 T 16 336
60 chr7_151832596 KMT2C chr7:151832596-151832606 T 11 331
61 chr8_80948734 TPD52 chr8:80948734-80948745 T 12 332
62 chr8_95793284 DPY19L4 chr8:95793284-95793301 T 18 338
63 chr8_100287517 VPS13B chr8:100287517-100287534 T 18 338
64 chr9_35382559 UNC13B chr9:35382559-35382576 T 18 338
65 chr9_71081186 PGM5 chr9:71081186-71081201 T 16 336
66 chr9_135773000 TSC1 chr9:135773000-135773017 A 18 338
67 chr10_11362789 CELF2 chr10:11362789-11362805 T 17 337
68 chr10_75135833 ANXA7 chr10:75135833-75135845 A 13 333
69 chr10_89725293 PTEN chr10:89725293-89725303 T 11 331
70 chr10_98510006 PIK3AP1;LCOR chr10:98510006-98510018 A 13 333
71 chr10_105139888 TAF5 chr10:105139888-105139901 T 14 334
72 chr10_105990647 WDR96 chr10:105990647-105990658 T 12 332
73 chr10_124745744 PSTK chr10:124745744-124745762 A 19 339
74 chr11_10795431 CTR9 chr11:10795431-10795449 A 19 339
75 chr11_64715330 C11orf85 chr11:64715330-64715347 T 18 338
76 chr11_108114661 ATM chr11:108114661-108114675 T 15 335
77 chr12_42835328 PPHLN1 chr12:42835328-42835342 A 15 335
78 chr12_55038408 DCD chr12:55038408-55038430 T 23 343
79 chr12_64491002 SRGAP1 chr12:64491002-64491017 T 16 336
80 chr12_110933707 VPS29 chr12:110933707-110933719 A 13 333
81 chr12_118463653 RFC5 chr12:118463653-118463670 T 18 338
82 chr13_32893197 BRCA2 chr13:32893197-32893206 T 10 330
83 chr13_32907535 BRCA2 chr13:32907535-32907545 T 11 331
84 chr13_43491778 EPSTI1 chr13:43491778-43491794 A 17 337
85 chr13_68485590 PCDH9;LINC00550 chr13:68485590-68485600 T 11 331
86 chr13_99890849 MIR548AN chr13:99890849-99890860 T 12 332
87 chr14_27397159 MIR4307;BC148262 chr14:27397159-27397169 A 11 331
88 chr14_68934755 RAD51B chr14:68934755-68934767 T 13 333
89 chr14_91365646 RPS6KA5 chr14:91365646-91365662 A 17 337
90 chr15_35174666 AQR chr15:35174666-35174684 A 19 339
91 chr15_44671816 CASC4 chr15:44671816-44671835 T 20 340
92 chr15_55789793 DYX1C1;DYX1C1-CCPG1 chr15:55789793-55789804 A 12 332
93 chr15_64231578 DAPK2 chr15:64231578-64231589 A 12 332
94 chr15_85077359 UBE2Q2P1 chr15:85077359-85077374 A 16 336
95 chr16_18893709 SMG1 chr16:18893709-18893722 A 14 334
96 chr16_18897122 SMG1 chr16:18897122-18897135 A 14 334
97 chr16_19073947 TMC7 chr16:19073947-19073956 A 10 330
98 chr16_70176003 CLEC18C;PDPR chr16:70176003-70176017 A 15 335
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100 chr16_81066159 CENPN chr16:81066159-81066171 T 13 333
101 chr16_81954996 PLCG2 chr16:81954996-81955010 T 15 335
102 chr17_15973417 NCOR1 chr17:15973417-15973433 T 17 337
103 chr17_18508346 CCDC144B chr17:18508346-18508361 T 16 336
104 chr17_18827348 PRPSAP2 chr17:18827348-18827352 TTGA 5 325
105 chr17_19678884 ULK2 chr17:19678884-19678895 A 12 332
106 chr17_47923640 FLJ45513;TAC4 chr17:47923640-47923655 T 16 336
107 chr17_66038979 KPNA2 chr17:66038979-66038997 A 19 339
108 chr19_14038596 CC2D1A chr19:14038596-14038607 A 12 332
109 chr19_14038610 CC2D1A chr19:14038610-14038620 A 11 331
110 chr19_47916654 MEIS3 chr19:47916654-47916668 A 15 335
111 chr19_50911947 POLD1 chr19:50911947-50911958 T 12 332
112 chr19_54304348 NLRP12 chr19:54304348-54304363 A 16 336
113 chr20_60587772 TAF4 chr20:60587772-60587786 A 15 335
114 chr21_33979904 C21orf59 chr21:33979904-33979920 A 17 337
115 chr21_34907636 GART chr21:34907636-34907652 A 17 337
116 chr22_32891355 FBXO7 chr22:32891355-32891369 T 15 335
117 chr22_40731481 TNRC6B chr22:40731481-40731496 A 16 336
118 chrX_16761748 SYAP1 chrX:16761748-16761762 A 15 335
119 chrX_30849029 TAB3 chrX:30849029-30849040 C 12 332
120 chrX_70390927 NLGN3 chrX:70390927-70390941 T 15 335
121 chrX_148576998 IDS chrX:148576998-148577014 T 17 337
用于检测微卫星不稳定性状态的方法，关键在于包括以下步骤：
步骤一、对肿瘤患者的癌变组织样本进行DNA提取，之后进行DNA片段化处理，末端修复加poly-A尾，进行接头连接；
步骤二、将接头的DNA纯化后，加入PCR反应混合液进行扩增，将扩增产物纯化后，进行杂交、捕获、PCR扩增、纯化得到测序文库；
步骤三、通过二代上机测序得到肿瘤组织样本靶向捕获测序数据，根据MSI模型进行微卫星不稳定状态检测相关的信息分析。
优选的，所述步骤一中DNA末端修复加poly-A尾方法具体为：将体积比为（5-8）:（10-20）:100的“A”酶混合物、“A”缓冲液和片段化处理的DNA涡旋混匀后离心，放置在热循环仪上，反应程序如下：20℃ 30min，65℃，30min，4℃，保持。
优选的，所述步骤一中接头连接具体为：将体积比为（3-5）:（25-30）:（3-8）:100的UMI标签的接头、连接缓冲液、连接酶和末端修复的DNA涡旋混匀后离心，放置于热循环仪上，反应程序如下：20℃ 30min，4℃，保持。
优选的，所述步骤二中文库扩增具体为：将体积比为1：（2-5）：（4-7）的扩增引物、接头的DNA和2X PCR混合液，涡旋混匀后离心，放置于热循环仪上，反应程序如下：98℃45s，循环1次；98℃ 15s，60℃ 30s，72℃ 30s，循环8次；72℃ 30s，循环1次；4℃ 1min，循环1次。
优选的，所述步骤二中纯化具体为：将DNA样本加入质量分数为80%wt的乙醇纯化后的磁珠，充分混合均匀后，室温静置5min后，置于磁力架静置2min，待磁珠全部吸附至侧壁，移除清液后，缓慢加入质量分数为80%wt的乙醇，静置30-60s，移除清液，干燥磁珠直到磁珠状态为表面不反光，然后用TE缓冲液重悬磁珠，充分混匀，室温静置1min，置于磁力架静置2min，待磁珠完全吸附至侧壁，将上清液移出待用。
优选的，所述步骤二中杂交具体为：将500ngDNA扩增产物中加入5 μL快速封闭试剂和2 μL P5、P7封闭试剂，使用浓缩仪将扩增产物浓缩到干粉状态，然后加入体积比为（80-90）：（25-30）：（15-20）的杂交缓冲液、杂交增强剂和无核酶水，室温静置10min，充分震荡混匀后放置在热循环仪上，反应程序如下：95℃ 10min，65℃，保持。
优选的，所述步骤二中捕获具体为：将杂化后的DNA样品中加入捕获探针，混合均匀后，65℃静置4h，使用链霉亲和素磁珠对探针结合的样品进行捕获，然后分别使用65℃和室温下的清洗液清洗多次，置于磁力架上，待磁珠全部吸附至侧壁，移除清液后，加入无核酶水重悬磁珠；所述步骤二中PCR扩增具体为：将体积比为（18-25）：1：1（15-20）的2×热启动酶混合物、P5接头引物、P7接头引物和磁珠捕获到的DNA片段混合进行PCR扩增，反应程序如下：98℃ 45s，循环1次；98℃ 15s，60℃ 30s，72℃ 30s，循环15次；72℃ 60s，循环1次；4℃ 保持。
优选的，所述步骤三具体为：将测序文库在高通量测序仪（Illumina）上完成测序得到测序文库，通过MSI模型对肿瘤样本的微卫星不稳定状态进行信息分析，所述MSI模型包括MSI模型准备模块、数据质控模块和MSI状态检测模块。
优选的，所述MSI模型准备模块的工作过程为：通过扫描人类参考基因组，获取基因组序列上所有的微卫星位点的位置和侧翼序列；对于上述获取的微卫星位点，利用2000个全外显子肿瘤-正常成对的测序样本数据比对到参考基因组上，来获取全基因组上所有微卫星位点列表；过滤位点并采用机器学习方法进行训练，共得到121个高灵敏度微卫星位点，同时这121个微卫星位点能够被测序的试剂盒覆盖；
所述数据质控模块的工作过程为：对靶向捕获数据进行质控，去掉质量不合格的数据；将质控合格的数据与人类基因组进行比对，用于获取参考基因组的微卫星位点作为候选MS位点信息；对比对结果进行质控，将对比结果的捕获效率、目标区域平均测序深度、微卫星位点的覆盖深度和污染率进行阈值筛选，选出阈值范围内的候选MS位点区域，对样本进行微卫星不稳定性检测；
所述MSI状态检测模块的工作过程为：采用MSIsensor扫描样本比对结果中所有的有效位点，并获取其reads支持的位点，采用每个位点模型对该样本的微卫星位点状态进行预测，输出该样本模型判断为微卫星不稳定位点占微卫星有效位点的百分比，即为MSIscore；根据MSI score来判别样本的MSI状态。
有益效果：与现有技术相比，本发明所提供的用于检测微卫星不稳定性状态的方法及***，采用目前成熟的二代测序技术获取被测试者肿瘤组织的遗传信息，可进行单一肿瘤组织分析，不依赖对照样本，打破了微卫星检测的局限性，可适用于多个基因组合，不需要专门设计MSI位点探针，适用性强，并且可以节约检测成本，具有高效、***、经济简便性，并且提高了检测的敏感性。
附图说明
图1为本发明检测结果与PCR检测结果一致性比较图。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明作详细说明。
实施例 用于检测微卫星不稳定性状态的方法
（1）样本提取：采用试剂盒（用QIAamp DNA FFPE tissue kit）提取肿瘤组织样本，组织样本不限于石蜡包埋组织、新鲜组织和冰冻切片。
（2）样本DNA浓度测定 采用Qubit® 4.0 荧光仪配套的dsDNA HS assay kits进行DNA浓度精确定量。
（3）文库构建 用超声破碎仪Covaris M220将DNA打断到100~500bp长的片段，然后采用DNA Lib Prep Kit for Illumina （RK20217）试剂盒构建文库；将片段化的样本DNA加入“A”酶混合物和“A”缓冲液、进行末端修复和加A，涡旋混匀后离心，放置在热循环仪上，反应程序如下：20℃ 30min，65℃，30min，4℃，保持，反应体系见下表2。
表2
反应体系组分 体积
“A”酶混合物 3 μL
“A”缓冲液 7 μL
片段化DNA 50 μL
表2
接头连接并纯化：将上述末端修复后的DNA加入连接酶、连接缓冲液和带UMI标签的接头进行接头连接，涡旋混匀，微离心，放置于热循环仪上，反应程序如下: 20℃ 30min，4℃，保持，反应体系见下表3。
表3
反应体系组分 体积
带UMI标签的接头 2.5 μL
末修后DNA 60 μL
连接缓冲液 16.5μL
连接酶 3 μL
连接后纯化：Beckman Agencourt AMPure XP磁珠2~8℃保存，室温平衡至少30min，使用1x体积，80μL/每样本。现用现配的80%乙醇，此步骤纯化需要400μL/每样本；在每个样本中加80 μL（1 x体积）AMPure XP 磁珠，用移液器吹打或者振荡充分混匀。室温静置5分钟；放置磁力架静置2分钟。待磁珠全部吸附至侧壁，使用移液器吸取移弃上清。注意勿扰动磁珠；在磁力架上沿磁珠相反方向的管壁缓慢加入200 μL 80%乙醇，注意勿扰动磁珠，静置30s-1min，使用移液器吸取移弃上清；重复上步骤一次，用10 μL的移液器将残留的乙醇尽量吸弃干净，注意勿碰到磁珠；室温干燥磁珠5分钟或放置于干式加热器37℃随时观看干燥状态。此步骤时间根据磁珠状态减少或者增加，达到磁珠状态为表面不反光，不能过度干燥为宜；每个样本用21 μL low TE 缓冲液重悬磁珠，如果进行磁珠分选，则加入51 μL lowTE 缓冲液重悬磁珠，将样本管远离磁力架；用移液器吹打或者振荡充分混匀，室温孵育 1分钟；放置磁力架上，室温孵育2分钟；待磁珠完全吸附至侧壁，将20 μL上清液移到一个新的PCR管中等待扩增。
文库扩增 将接头连接好的DNA加入2X PCR反应混合液、扩增引物涡旋混匀，微离心，放置于热循环仪上反应，反应结束后，按照磁珠纯化的流程使用1X体积磁珠纯化PCR产物，之后用dsDNA HS Assay Kit测定预文库浓度，利用QIAxcel进行片段大小检测。反应体系和反应条件如表4和表5所示。
表4
反应体系组分 体积
接头连接好的DNA 20 μL
2X PCR反应混合液 25 μL
Illumina文库扩增引物混合物 5 μL
表5
Figure 161801DEST_PATH_IMAGE002
（4）杂交捕获 采用xGen® hybridization capture of DNA libraries试剂盒进行杂交捕获；取出500ng扩增产物，加入5 μL快速封闭试剂和2 μL P5、P7封闭试剂，使用浓缩仪将扩增产物浓缩到干粉状态，然后加入杂交试剂，室温孵育10min，充分震荡混匀后放置在热循环仪上。杂交反应体系和反应条件如表6和表7所示。
表6
反应体系组分 体积
杂交缓冲液 8.5 μL
杂交增强剂 2.7 μL
无核酶水 1.8 μL
表7
步骤 温度 时间
1 95℃ 10min
2 65℃ ∞
目标区域捕获：等杂化步骤1结束后，65℃条件下暂停，1min内在PCR仪上加入4μL捕获探针，使用移液器混匀后，计时4h；使用链霉亲和素磁珠对探针结合的样品进行捕获，步骤如下：将1ng磁珠加入1.5 mL离心管，至于磁力架上，弃上清，用200μL磁珠清洗试剂清洗两遍后，使用100 μL磁珠清洗试剂重悬磁珠，转移到0.2 mLPCR管内，等65℃应4h结束后，将其置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清，然后将磁珠置于65℃热循环仪上，在1min内将杂交反应液转移至含有链霉亲和素磁珠的PCR管中，迅速震荡混匀，放回65℃热循环仪，计时45min，每隔8min震荡混匀一次，保持磁珠处于悬浮状态；
洗脱非杂交片段：先使用预热到65℃的清洗液1清洗一遍，再使用预热到65℃的增强清洗液清洗两遍；再使用室温下清洗液1、清洗液2和清洗液3各清洗一遍，最后至于磁力架上，弃上清，加入22.5 μL无核酶水重悬磁珠；
捕获后产物扩增：将磁珠捕获到的DNA片段加入2×热启动酶混合物、P5接头引物和P7接头引物进行PCR扩增（采用Illumina P5、P7接头引物），将得到的PCR扩增产物进行磁珠纯化，使用Qubit 4.0检测浓度，利用Agilent 2100进行片段大小检测。扩增体系和扩增条件见表8和表9。
表8
体系组分 体积
2×热启动酶混合物 25 μL
P5接头引物 1.25 μL
P7接头引物 1.25 μL
磁珠上的目标区域DNA 22.5 μL
表9
Figure 282203DEST_PATH_IMAGE004
（5）上机测序：在高通量测序仪（Illumina）上完成测序。
测序数据预处理分析：数据拆分：测序仪下机后的bcl文件，利用bcl2fastq进行数据拆分，拆分后的文件为fastq；数据预处理：使用fastp（v0.20.0）对fastq格式文件预处理，对测序reads进行去通用引物、接头序列以及过滤低质量等操作；序列比对：采用BWA（v0.7.17）对质控后的序列与参考基因组（human hg19）进行比对，获得SAM格式比对结果；并采用samtools（v1.9）将SAM格式的比对结果转化成BAM格式，并进行排序；之后采用GATK4去除PCR重复和质量校正；比对文件质控：针对每个样本的数据进行质控，如果数据满足质控标准中的各项要求，则可进行后续生物信息学分析。质控标准如表10所示：
表10
Sample Low Upper 说明
Q30 80% NA 碱基错误率在0.1%及以下的bases占总bases比例
Depth 700 NA 平均测序深度
Coverage 95% NA 测序base 占 总panel bases 的比例
Target Coverage 100X 95% NA 测序深度在100×及以上的base 占 总panel bases 的比例
样本微卫星状态检测：采用MSIsensor对样本质控后的BAM数据扫描得到所有的有效位点，并获取其reads支持的位点，采用每个位点模型对该样本的微卫星位点进行预测，模型输出判断为该样本上微卫星不稳定位点的百分比，即为MSI分数（MSIscore），根据MSIscore来判别样本的MSI状态，MSI-H样本（微卫星高度不稳定）判定标准为MSIscore大于20%；MSI-L样本（微卫星低度不稳定）判定标准为MSIscore大于等于10%且小于等于20%，MSS样本（微卫星稳定）判定标准为MSIscore小于10%。
对50名结直肠癌患者的肿瘤组织样本同时采用本发明和PCR检测***进行进行微卫星不稳定性对比分析，样本信息、样本质控表格和测试结果如下表11-13所示：
表11
序号 编号 性别 年龄 临床诊断
1 BJ19TFA01710 男 69 直肠癌
2 BJ19TFA01820 男 77 直肠癌肝转移
3 BJ20CM000462 女 54 结直肠癌（待病理）
4 BJ20CM000487 男 55 结肠腺癌
5 BJ20CM000816 女 43 结直肠癌
6 BJ20CM000957 男 53 结肠腺癌
7 BJ20CM001720 女 53 直乙交界癌
8 BJ20CM001761 女 56 直乙交界癌
9 BJ20CM001864 女 59 结直肠癌
10 BJ20CM001938 女 71 肠癌
11 BJ20CM002082 女 68 结直肠癌（未做病理）
12 BJ20CM002108 男 55 直肠癌
13 BJ20CM002140 男 69 直肠癌
14 BJ20CM002143 男 46 直肠癌伴肝转
15 BJ20CM002176 男 50 直肠癌
16 BJ20CM002261 男 84 直肠癌
17 BJ20CM002427 女 47 直肠癌肺转移
18 BJ20CM002483 男 71 直肠癌
19 BJ20CM002486 男 33 直肠癌
20 BJ20CM002627 女 68 肠癌
21 BJ20CM002637 男 61 直肠癌
22 BJ20CM002732 男 57 直肠癌
23 BJ20CM002767 女 53 直肠癌
24 BJ20CM002775 男 65 结直肠癌，盆腔转移
25 BJ20CM002809 男 63 结直肠癌
26 BJ20CM002821 女 71 肠癌
27 BJ20CM002885 男 50 直肠癌
28 BJ20CM002958 男 69 直肠癌
29 BJ20CM003205 男 65 直肠癌
30 BJ20CM003208 女 75 直肠癌
31 BJ20CM003215 男 53 直肠癌
32 BJ20CM003217 男 65 直肠癌，肝、肺转移
33 BJ20CM003226 男 59 肠癌
34 BJ20CM003228 男 48 直肠癌
35 BJ20CM003305 男 46 直肠癌肺转移
36 BJ20CM003516 男 63 结肠中分化腺癌
37 BJ20CM003867 男 61 结肠腺癌
38 BJ20CM004056 男 63 直肠癌肝转移
39 BJ20CM004398 男 48 直肠癌
40 BJ20CM004399 男 63 直肠癌
41 BJ20CM004400 女 55 结直肠癌
42 BJ20CM004402 男 66 直肠癌
43 BJ20CM004459 男 53 结直肠癌
44 BJ20CM004460 男 57 结直肠癌
45 BJ20CM004542 女 69 直肠癌
46 BJ20CM004818 男 59 结直肠癌
47 BJ20CM004877 女 49 结肠腺癌
48 BJ20CM004879 女 39 直肠癌
49 BJ20CM005182 男 60 肠癌
50 BJ20CM005318 男 56 肠癌
表12
Sample Raw Bases Clean Bases Q30 Coverage Depth Target Coverage 100X
BJ19TFA01710 7,680,785,100 7,014,317,453(91.32%) 92.89% 99.70% 987 99.52%
BJ19TFA01820 7,243,690,762 6,772,536,215(93.50%) 91.04% 99.94% 1419 99.78%
BJ20CM000462 8,893,189,696 8,335,151,429(93.73%) 90.18% 99.70% 1482 99.59%
BJ20CM000487 5,973,253,200 5,737,131,100(96.05%) 85.60% 99.87% 885 99.60%
BJ20CM000816 10,341,578,700 9,934,431,835(96.06%) 92.80% 99.95% 1685 99.84%
BJ20CM000957 7,804,765,800 7,447,290,433(95.42%) 93.13% 99.95% 1510 99.80%
BJ20CM001720 9,640,684,500 9,297,566,093(96.44%) 95.08% 99.93% 1530 99.84%
BJ20CM001761 10,188,880,500 9,853,431,771(96.71%) 93.90% 99.97% 1872 99.81%
BJ20CM001864 7,036,657,380 6,708,685,328(95.34%) 93.80% 99.98% 1545 99.78%
BJ20CM001938 8,041,258,500 7,717,534,850(95.97%) 94.98% 99.98% 1050 99.77%
BJ20CM002082 8,496,414,900 5,772,327,033(67.94%) 91.48% 99.78% 1577 99.68%
BJ20CM002108 11,581,997,772 10,683,882,105(92.25%) 89.41% 99.59% 1820 99.65%
BJ20CM002140 6,374,090,218 6,047,177,898(94.87%) 94.20% 99.94% 1243 99.81%
BJ20CM002143 8,549,048,400 8,151,171,810(95.35%) 95.02% 99.59% 1344 99.64%
BJ20CM002176 13,206,564,600 12,801,441,844(96.93%) 93.31% 99.60% 1746 99.85%
BJ20CM002261 6,182,676,300 5,705,723,280(92.29%) 94.23% 99.87% 769 99.48%
BJ20CM002427 5,945,859,900 5,680,344,823(95.53%) 94.39% 99.86% 944 99.49%
BJ20CM002483 11,258,273,700 10,707,673,936(95.11%) 92.51% 99.75% 1835 99.61%
BJ20CM002486 9,957,808,500 9,684,302,652(97.25%) 92.69% 99.83% 1509 99.73%
BJ20CM002627 4,816,148,020 4,584,025,287(95.18%) 95.57% 99.84% 1061 99.69%
BJ20CM002637 6,509,687,916 6,219,072,849(95.54%) 95.66% 99.52% 1361 99.75%
BJ20CM002732 6,928,636,200 6,657,556,798(96.09%) 94.55% 99.97% 1140 99.94%
BJ20CM002767 10,277,869,800 9,743,601,774(94.80%) 95.72% 99.76% 1505 96.73%
BJ20CM002775 7,502,014,200 4,204,129,188(56.04%) 94.22% 99.82% 1018 98.99%
BJ20CM002809 13,252,826,362 11,745,236,439(88.62%) 90.20% 99.54% 1015 99.62%
BJ20CM002821 9,831,496,200 9,542,159,507(97.06%) 93.57% 99.89% 1512 99.40%
BJ20CM002885 5,626,114,800 5,386,776,918(95.75%) 94.33% 99.90% 1032 99.59%
BJ20CM002958 5,895,079,200 5,656,101,493(95.95%) 93.22% 99.56% 985 99.68%
BJ20CM003205 6,191,827,800 5,911,158,660(95.47%) 92.14% 99.86% 1219 99.35%
BJ20CM003208 7,466,456,400 7,074,162,283(94.75%) 94.00% 99.90% 748 99.59%
BJ20CM003215 7,281,563,400 6,862,625,118(94.25%) 85.08% 99.91% 857 99.57%
BJ20CM003217 11,730,852,968 10,748,615,435(91.63%) 92.91% 99.94% 1683 99.59%
BJ20CM003226 4,729,323,000 4,273,711,686(90.37%) 93.33% 99.80% 926 96.32%
BJ20CM003228 9,991,446,218 9,219,828,972(92.28%) 92.40% 99.95% 1683 99.84%
BJ20CM003305 9,336,053,972 8,850,630,238(94.80%) 92.46% 99.56% 1682 99.86%
BJ20CM003516 8,607,877,008 8,012,749,920(93.09%) 90.60% 99.80% 1519 99.65%
BJ20CM003867 9,378,301,054 8,832,790,351(94.18%) 91.73% 99.89% 1947 99.74%
BJ20CM004056 8,666,709,930 7,884,951,715(90.98%) 91.75% 99.96% 1456 99.75%
BJ20CM004398 7,673,893,200 7,121,799,356(92.81%) 94.79% 99.86% 1157 98.65%
BJ20CM004399 8,230,962,586 7,525,813,412(91.43%) 90.19% 99.91% 1275 99.53%
BJ20CM004400 9,912,159,600 9,201,021,983(92.83%) 95.49% 99.72% 920 42.30%
BJ20CM004402 11,038,787,400 10,535,425,475(95.44%) 93.65% 99.93% 1818 99.19%
BJ20CM004459 12,612,741,892 11,710,090,166(92.84%) 89.99% 99.76% 2108 99.69%
BJ20CM004460 10,201,866,530 9,472,730,194(92.85%) 90.19% 99.81% 1736 99.77%
BJ20CM004542 7,068,139,200 6,765,458,691(95.72%) 90.88% 99.80% 1288 99.42%
BJ20CM004818 9,552,590,992 8,903,766,735(93.21%) 91.03% 99.90% 1815 99.62%
BJ20CM004877 8,182,870,500 7,879,139,243(96.29%) 90.75% 99.86% 1401 99.74%
BJ20CM004879 5,878,478,924 5,229,465,812(88.96%) 90.55% 99.95% 928 99.55%
BJ20CM005182 5,942,555,100 5,820,007,605(97.94%) 93.91% 99.83% 1168 99.61%
BJ20CM005318 11,706,034,200 11,316,229,279(96.67%) 91.69% 99.98% 2111 99.87%
表13
Figure DEST_PATH_IMAGE006A
Figure DEST_PATH_IMAGE008
MSI2_score为单肿瘤样本的NGS-MSI检测数值。
MSI_score为肿瘤-正常成对样本的NGS-MSI检测数值。
NGS表示单肿瘤样本的NGS-MSI检测结果。
PCR表示单肿瘤样本的PCR-MSI检测结果。
表13中显示本发明的单肿瘤样本MSI检测的结果与肿瘤-正常成对样本的NGS-MSI检测结果是高度一致的，验证了单肿瘤样本MSI检测的结果是可靠的。并且本装置计算50例样本中有9例为MSI-H，有一例PCR检测结果显示其为MSI-L；在本装置计算为MSI-L的17例样本中，有2列PCR检测结果为MSS状态。表明NGS检测方法的灵敏性要高于PCR检测方法。
将对本装置检测结果与PCR检测结果一致性进行比较作图（图1），横坐标为MSI状态，纵坐标为本装置检测出的MSIscore。Both表示本装置检测结果与PCR检测结果MSI状态一致，NGS_only表示本装置检测状态与PCR检测状态不一致，只有本装置检测到该状态，表明NGS检测方法的灵敏性要高于PCR检测方法。
最后需要说明，上述描述仅为本发明的优选实施例，本领域的技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.用于检测微卫星不稳定性状态的***，其特征在于：包括用于对肿瘤样本的微卫星不稳定状态进行信息分析的MSI模型，所述MSI模型包括MSI模型准备模块，用于判别样本微卫星不稳定性状态的高灵敏度位点；数据质控模块，用于对靶向捕获数据进行质控，进行微卫星不稳定性检测；MSI状态检测模块，用于扫描样本比对结果中所有有效位点，对该样本的微卫星位点状态进行预测，根据MSI score来判别样本的MSI状态。
2.使用权利要求1所述的用于检测微卫星不稳定性状态的***来检测微卫星不稳定性状态的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一、对肿瘤患者的癌变组织样本进行DNA提取，之后进行DNA片段化处理，末端修复加poly-A尾，进行接头连接；
步骤二、将接头的DNA纯化后，加入PCR反应混合液进行扩增，将扩增产物纯化后，进行杂交、捕获、PCR扩增、纯化得到测序文库；
步骤三、通过二代上机测序得到肿瘤组织样本靶向捕获测序数据，根据MSI模型进行微卫星不稳定状态检测相关的信息分析。
3.根据权利要求2所述的检测微卫星不稳定性状态的方法，其特征在于所述步骤一中DNA末端修复加poly-A尾方法具体为：将体积比为（5-8）:（10-20）:100的“A”酶混合物、“A”缓冲液和片段化处理的DNA涡旋混匀后离心，放置在热循环仪上，反应程序如下：20℃30min，65℃，30min，4℃，保持。
4.根据权利要求2所述的检测微卫星不稳定性状态的方法，其特征在于所述步骤一中接头连接具体为：将体积比为（3-5）:（25-30）:（3-8）:100的UMI标签的接头、连接缓冲液、连接酶和末端修复的DNA涡旋混匀后离心，放置于热循环仪上，反应程序如下：20℃ 30min，4℃，保持。
5.根据权利要求2所述的检测微卫星不稳定性状态的方法，其特征在于所述步骤二中文库扩增具体为：将体积比为1：（2-5）：（4-7）的扩增引物、接头的DNA和2X PCR混合液，涡旋混匀后离心，放置于热循环仪上，反应程序如下：98℃ 45s，循环1次；98℃ 15s，60℃ 30s，72℃ 30s，循环8次；72℃ 30s，循环1次；4℃ 1min，循环1次。
6.根据权利要求2所述的检测微卫星不稳定性状态的方法，其特征在于所述步骤二中纯化具体为：将DNA样本加入质量分数为80%wt的乙醇纯化后的磁珠，充分混合均匀后，室温静置5min后，置于磁力架静置2min，待磁珠全部吸附至侧壁，移除清液后，缓慢加入质量分数为80%wt的乙醇，静置30-60s，移除清液，干燥磁珠直到磁珠状态为表面不反光，然后用TE缓冲液重悬磁珠，充分混匀，室温静置1min，置于磁力架静置2min，待磁珠完全吸附至侧壁，将上清液移出待用。
7.根据权利要求2所述的检测微卫星不稳定性状态的方法，其特征在于所述步骤二中杂交具体为：将500ngDNA扩增产物中加入5 μL快速封闭试剂和2 μL P5、P7封闭试剂，使用浓缩仪将扩增产物浓缩到干粉状态，然后加入体积比为（80-90）：（25-30）：（15-20）的杂交缓冲液、杂交增强剂和无核酶水，室温静置10min，充分震荡混匀后放置在热循环仪上，反应程序如下：95℃ 10min，65℃，保持。
8.根据权利要求2所述的检测微卫星不稳定性状态的方法，其特征在于：所述步骤二中捕获具体为：将杂化后的DNA样品中加入捕获探针，混合均匀后，65℃静置4h，使用链霉亲和素磁珠对探针结合的样品进行捕获，然后分别使用65℃和室温下的清洗液清洗多次，置于磁力架上，待磁珠全部吸附至侧壁，移除清液后，加入无核酶水重悬磁珠；所述步骤二中PCR扩增具体为：将体积比为（18-25）：1：1（15-20）的2×热启动酶混合物、P5接头引物、P7接头引物和磁珠捕获到的DNA片段混合进行PCR扩增，反应程序如下：98℃ 45s，循环1次；98℃15s，60℃ 30s，72℃ 30s，循环15次；72℃ 60s，循环1次；4℃ 保持。
9.根据权利要求2所述的检测微卫星不稳定性状态的方法，其特征在于步骤三具体为：将测序文库在高通量测序仪Illumina上完成测序得到测序数据，通过MSI模型对肿瘤样本的微卫星不稳定状态进行信息分析，所述MSI模型包括MSI模型准备模块、数据质控模块和MSI状态检测模块。
10.根据权利要求9所述的检测微卫星不稳定性状态的方法，其特征在于所述MSI模型准备模块的工作过程为：通过扫描人类参考基因组，获取基因组序列上所有的微卫星位点的位置和侧翼序列；对于上述获取的微卫星位点，利用2000个全外显子肿瘤-正常成对的测序样本数据比对到参考基因组上，来获取全基因组上所有微卫星位点列表；过滤位点并采用机器学习方法进行训练，共得到121个高灵敏度微卫星位点，同时这121个微卫星位点能够被测序的试剂盒覆盖；
所述数据质控模块的工作过程为：对靶向捕获数据进行质控，去掉质量不合格的数据；将质控合格的数据与人类基因组进行比对，用于获取参考基因组的微卫星位点作为候选MS位点信息；对比对结果进行质控，将对比结果的捕获效率、目标区域平均测序深度、微卫星位点的覆盖深度和污染率进行阈值筛选，选出阈值范围内的候选MS位点区域，对样本进行微卫星不稳定性检测；
所述MSI状态检测模块的工作过程为：采用MSIsensor扫描样本比对结果中所有的有效位点，并获取其reads支持的位点，采用每个位点模型对该样本的微卫星位点状态进行预测，输出该样本模型判断为微卫星不稳定位点占微卫星有效位点的百分比，即为MSIscore；根据MSI score来判别样本的MSI状态。
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