CN108517567B - 用于cfDNA建库的接头、引物组、试剂盒和建库方法 - Google Patents

用于cfDNA建库的接头、引物组、试剂盒和建库方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了用于cfDNA建库的接头、引物组、试剂盒和建库方法，其中，接头包括顶部接头和底部接头，分别为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；引物组包括SEQ ID NO:4‑6所示的序列；试剂盒包括上述接头和引物组；cfDNA建库的方法包括：(1)将cfDNA进行末端修复，并在cfDNA的3’端添加A碱基；(2)将cfDNA末端连接上接头得到连接产物；(3)对连接产物进行第一轮扩增，并对产物进行磁珠纯化；(4)对磁珠纯化后的第一轮扩增产物进行建库扩增，产物磁珠纯化后，得到高通量测序文库。利用该接头和cfDNA建库方法获得的文库，适用于Illumina测序平台，并可以提高文库转化效率。

Description

用于cfDNA建库的接头、引物组、试剂盒和建库方法
技术领域
本发明涉及分子基因学技术领域，特别是指用于cfDNA建库的接头、引物组、试剂盒和建库方法。
背景技术
血浆游离DNA(Plasma cell-free DNA，cfDNA)是存在于人体血液中一种无细胞状态的胞外DNA，在人体的尿液、脑脊液、支气管肺泡灌洗液、羊水和***等体液和体外细胞培养液当中也可检出一定量的cfDNA。自1947年由Mandel和Metais发现cfDNA以来，随着分子检测技术的飞速发展，血浆游离DNA现已被检测到已有300多种，且观察到与肿瘤细胞DNA相同的基因突变，使得cfDNA作为标记物应用于临床疾病的诊断、预后、检测等有潜在价值。近年来cfDNA检测已用于多种急性或慢性疾病的诊断和预后评价中。
如今，人们通常利用新一代测序(NGS)技术对cfDNA进行高通量分析，看看哪些基因有突变，并根据突变信息来确定下一步的诊疗方案。NGS技术以Illumina公司的Hiseq和Nextseq测序仪为代表的第二代测序技术，具有检测通量高(每次运行可以产生上百G的基因数据)，覆盖面广(可以进行人类全基因组的测序分析)，性价比高(平均每G成本仅需几十块钱)等优点，因此特别适用于多个基因的多种突变类型的并行检测。但是NGS技术首先需要对DNA进行文库构建，在现有的文库构建过程中，步骤繁琐，需要经过多次纯化过程，会造成DNA的损失，同时在接头连接的过程中会出现接头自连现象，致使文库构建效率低、质量差。或者通过末端修复并加A后纯化、连接头后纯化、扩增、纯化等步骤来完成。虽然减少了纯化步骤，降低DNA的损耗，但是仍然是接头自连的问题难以解决。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提出指用于cfDNA建库的接头、引物组、试剂盒和建库方法，本发明的方法能够有效排除建库过程中PCR反应引入的随机突变，排除假阳性，极大地提高了NGS数据分析的准确度。
基于上述目的，本发明提供的一种用于cfDNA建库的接头，其特征在于，所述接头为双链接头，包括顶部接头和底部接头，所述顶部接头的序列为：5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNGCCGCCGCCGCCG*T-3’，其为SEQ ID NO:1所示；所述底部接头的序列为：5’-P-CGGCGGCGGCGGC-3’，其为SEQ ID NO:2所示，5’端进行磷酸化；其中顶部接头中12个碱基“NNNNNNNNNNNN”为标签序列。
本发明设计了一种特殊的接头(如图1所示)，接头的3’端(绿色)是一段高GC含量的固定片段，突出的T用于和被修复的带A的cfDNA连接；接头的中间是12个碱基(黄色)随机单分子标签序列，此标签可实现对所有起始建库模板核酸片段进行标记，以有效排除建库过程中PCR反应引入的随机突变，排除假阳性，极大地提高了NGS数据分析的准确度；接头的5’端是建库P5引物的部分序列(紫色)，在cfDNA和接头连接后，可直接以该序列为上游非特异引物、含有P7序列的fusion gene的特异下游引物进行多重PCR，获得的目的片段进行扩增建库。
其中，顶部接头中N为随机碱基(即随机核苷酸)，每一个N独立地可以是A、G、C、T中的任一个。由于N是随机碱基，因此当N为不同碱基时可形成不同序列，这些不同序列退火形成的不同双链序列的混合物构成本发明的接头。因此，本发明中，所使用的随机接头是混合物，其中含有N为不同碱基时形成的不同序列退火而成的多条不同的双链序列。
本发明的接头的制备方法为：将合成好的两条序列分别稀释至30μM的浓度；然后分别取20μl混合均匀，转移至PCR管中；将混合好的溶液置于PCR仪中，设置温度为95℃，孵育5min；孵育完成后，直接关闭PCR仪，继续孵育2小时，获得制备好的接头。
本发明还提供了一种用于cfDNA建库的引物组，所述引物组包括SEQ ID NO:4-6所示的序列。
进一步的，本发明还提供了一种cfDNA建库试剂盒，所述试剂盒包括所述的接头和所述的引物组。
更进一步的，本发明还提供了一种cfDNA建库的方法，包括如下步骤：
(1)将cfDNA进行末端修复，并在cfDNA的3’端添加A碱基；
(2)将经过步骤(1)处理后得到的cfDNA末端连接上含有随机标签序列的接头，得到连接产物，并对连接产物进行磁珠纯化；
(3)利用通用前引物和特异后引物对上述连接产物进行第一轮扩增，并对第一轮扩增产物进行磁珠纯化；
(4)利用引物P7和P5对磁珠纯化后的第一轮扩增产物进行建库扩增，并对建库扩增产物进行磁珠纯化，得到高通量测序文库。
在本发明的一些实施例中，在步骤(2)中，所述接头为双链接头，包括顶部接头和底部接头，所述顶部接头的序列为：5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNGCCGCCGCCGCCG*T-3’，其为SEQ ID NO:1所示；所述底部接头的序列为：5’-P-CGGCGGCGGCGGC-3’，其为SEQ ID NO:2所示，5’端进行磷酸化；其中顶部接头中12个碱基“NNNNNNNNNNNN”为标签序列。
在本发明的一些实施例中，在步骤(3)中，所述通用前引物的序列为：5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTC CGATCT-3’，其为SEQ ID NO:3所示；所述特异后引物的序列为：5’-CAGACGTGTGCTCTTCCGATCTxxxxxxxxxxxxxxxxx-3’，其为SEQ ID NO:4所示。通用前引物的序列为illumina建库P5引物的部分序列，特异后引物中的“CAGACGTGTGCTCTTCCGATCT”序列为illumina建库P7引物的部分序列，“xxxxxxxxxxxxxxxxx”可根据不同的靶序列进行设计。在cfDNA和接头连接后，可直接以通用前引物为上游非特异引物、含有P7序列的fusion gene为特异后引物进行多重PCR，获得的目的片段进行扩增建库。
在本发明的一些实施例中，在步骤(4)中，P5引物的序列：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3’，其为SEQ ID NO:5所示；P7引物的序列：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’，其为SEQID NO:6所示。
从上面所述可以看出，本发明具有以下有益效果：
利用本发明的接头和cfDNA建库方法获得的文库，适用于Illumina测序平台，并可以提高文库转化效率。本发明提供的建库方法操作简单，测序结果稳定，测序成本低。本发明给接头添加分子标签序列后，在经过PCR和测序以后，可以通过分子标签将归属相同原始模板的扩增产物测序结果进行鉴别分类。理论上来说，来源于同一分子标签的某类DNA分子应该携带相同的序列，因此可通过分子标签鉴别真正的基因突变和这些***错误，去除PCR和测序过程中引入的***错误，避免他们干扰最后的测序结果，最终达到提高cfDNA测序的灵敏度的结果。
附图说明
图1是本发明接头的示意图；
图2是本发明cfDNA建库流程图；
图3是文库毛细电泳图；
图4是融合基因分析结果示意图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并结合附图，对本发明进一步详细说明。
在本发明中，cfDNA建库流程如图2所示，包括：(1)将cfDNA进行末端修复，并在cfDNA的3’端添加A碱基；(2)将经过步骤(1)处理后得到的cfDNA末端连接上含有随机标签序列的接头，得到连接产物，并对连接产物进行磁珠纯化；(3)利用通用前引物和特异后引物对上述连接产物进行扩增，并对扩增产物进行磁珠纯化；(4)利用引物P7和P5对磁珠纯化后的产物进行扩增，并对扩增产物进行磁珠纯化，得到高通量测序文库。
实施例1cfDNA文库的构建方法
(1)DNA末端修复反应
①向200μl PCR管中(置于冰上，立即进行下步反应)加入以下试剂：
Figure BDA0001635652820000041
此时管中溶液总体积为65μl。
该末端修复反应中包括了3’末端加“A”。
根据QIAGEN公司提供的QIAamp Circulating Nucletic Acid Kit(50)试剂盒的使用说明书，使用该试剂盒对血浆中游离的cfDNA进行提取；
②用枪头将上述溶液轻轻吹吸混匀，短暂离心，使所有组分收集到管底。
③将上述PCR管置于PCR仪中，反应程序如下：
37℃ 10min
72℃ 10min
Hold on 4℃
(2)Adaptor连接
①向上述已完成DNA末端修复的反应液中直接加入以下试剂：
Figure BDA0001635652820000051
此时管中溶液总体积为83.5μl。
所述接头为双链接头，包括顶部接头和底部接头，所述顶部接头的序列为：5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNGCCGCCGCCGCCG*T-3’，其为SEQ ID NO:1所示；所述底部接头的序列为：5’-P-CGGCGGCGGCGGC-3’，其为SEQ ID NO:2所示，5’端进行磷酸化。
接头的制备方法为：将合成好的两条序列(SEQ ID NO:1序列和SEQ ID NO:2序列)分别稀释至30μM的浓度；然后分别取20μl混合均匀，转移至PCR管中；将混合好的溶液置于PCR仪中，设置温度为95℃，孵育5min；孵育完成后，直接关闭PCR仪，继续孵育2小时，获得制备好的接头。
②用枪头将上述试剂吹吸混匀，短暂离心，使溶液收集到管底。
③20℃温浴15分钟，若此操作使用PCR仪，请将热盖关闭。
(3)DNA片段的回收
1.涡旋振荡CMpure 20秒，使其彻底混匀为均一溶液。
2.将adaptor连接反应液转移至一新的1.5ml离心管中。
5.向离心管中加入120μl混合均匀的CMPure，涡旋震荡5秒钟后室温放置5分钟。
6.短暂离心，将离心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清(约需5分钟)，小心吸取上清并弃除，期间避免接触已结合目标DNA的磁珠。
注意：不要弃除磁珠。
7.继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入250μl新鲜配置的80％乙醇，室温放置30秒，待悬起的磁珠完全吸附后，小心弃除上清。
8.重复步骤7。
9.保持离心管固定于磁力架上，室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥。
10.将离心管从磁力架上取下，加入25μl EB(自备)或去离子水，涡旋振荡使磁珠完全重悬于去离子水中，室温静置5分钟。
11.短暂离心，将离心管放于磁力架上直至溶液澄清(约需5分钟)，将23μl澄清溶液转移至一个新的PCR管中。
(4)第一轮PCR扩增
①在PCR管中加入以下试剂并混匀。
Figure BDA0001635652820000061
在第一轮PCR扩增中使用通用前引物和特异后引物，所述通用前引物的序列为：5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTC CGATCT-3’，其为SEQ IDNO:3所示；所述特异后引物的序列为：5’-CAGACGTGTGCTCTTCCGATCTxxxxxxxxxxxxxxxxx-3’，其为SEQ ID NO:4所示。
②PCR反应条件
Figure BDA0001635652820000062
③第一轮PCR产物的纯化
1.涡旋振荡CMpure 20秒，使其彻底混匀为均一溶液。
2.将PCR反应液转移至一新的1.5ml离心管中。
3.加入1.5倍样品体积的CMpure，涡旋震荡5秒钟后室温静置5分钟。
4.短暂离心，将离心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清(约需5分钟)，小心吸取上清并弃除，期间避免接触已结合目标DNA的磁珠。
注意：不要弃除磁珠。
5.继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入250μl新鲜配置的80％乙醇，室温放置30秒，待悬起的磁珠完全吸附后，小心弃除上清。
6.重复步骤5。
7.保持离心管固定于磁力架上，室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥。
8.将离心管从磁力架上取下，加入25μl EB(自备)或去离子水，涡旋振荡使磁珠完全重悬于去离子水中，室温静置5分钟。
9.短暂离心，将离心管放于磁力架上直至溶液澄清(约需5分钟)，将22μl澄清溶液转移至一个新的PCR管中。用nanodrop测浓度。
(5)PCR建库扩增
①在PCR管中加入以下试剂并混匀。
Figure BDA0001635652820000071
在第一轮PCR扩增中使用通用前引物和特异后引物，
P5引物的序列：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3’，其为SEQ ID NO:5所示；P7引物的序列：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’，其为SEQ ID NO:6所示。
②PCR反应条件
Figure BDA0001635652820000072
③PCR产物的纯化
1.涡旋振荡CMpure 20秒，使其彻底混匀为均一溶液。
2.将PCR反应液转移至一新的1.5ml离心管中。
3.加入1倍样品体积的CMpure，涡旋震荡5秒钟后室温静置5分钟。
4.短暂离心，将离心管放于磁力架上，使磁珠和上清溶液分离，直至溶液澄清(约需5分钟)，小心吸取上清并弃除，期间避免接触已结合目标DNA的磁珠。
注意：不要弃除磁珠。
5.继续保持离心管固定于磁力架上，向离心管中加入250μl新鲜配置的80％乙醇，室温放置30秒，待悬起的磁珠完全吸附后，小心弃除上清。
6.重复步骤5。
7.保持离心管固定于磁力架上，室温静置10分钟，使磁珠在空气中干燥。
8.将离心管从磁力架上取下，加入30μl EB(自备)或去离子水，涡旋振荡使磁珠完全重悬于去离子水中，室温静置5分钟。
9.短暂离心，将离心管放于磁力架上直至溶液澄清(约需5分钟)，将25μl澄清溶液转移至一个新的PCR管中。DNA文库在-20℃保存。
(6)文库毛细电泳图：将纯化后的文库稀释至1ng/ul,，用bioanalyzer进行分析，结果如图3。由于只有下游引物是特异引物，所以文库的大小比较宽泛，主峰位于300bp处，不同样本主峰位置略有偏差。
融合基因分析结果示意图如图4所示，我们成功检测到ROS1基因和SLC34A2基因的融合。ROS1基因的断点在31号内含子，染色***置是chr6:117658326，SLC34A2基因的断点在4号内含子，染色***置是chr4:25666631，并且给出了具体的基因融合序列。数据分析的参考基因组是hg19。
从上面所述可以看出，本发明具有以下有益效果：
利用本发明的接头和cfDNA建库方法获得的文库，适用于Illumina测序平台，并可以提高文库转化效率。本发明提供的建库方法操作简单，测序结果稳定，测序成本低。本发明给接头添加分子标签序列后，在经过PCR和测序以后，可以通过分子标签将归属相同原始模板的扩增产物测序结果进行鉴别分类。理论上来说，来源于同一分子标签的某类DNA分子应该携带相同的序列，因此可通过分子标签鉴别真正的基因突变和这些***错误，去除PCR和测序过程中引入的***错误，避免他们干扰最后的测序结果，最终达到提高cfDNA测序的灵敏度的结果。
所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。
本发明的实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Figure BDA0001635652820000101
Figure BDA0001635652820000111
序列表
<110> 江苏康为世纪生物科技有限公司
<120> 用于cfDNA建库的接头、引物组、试剂盒和建库方法
<130> FI180129
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 59
<212> 人工序列
<223> 顶部接头
<400> 1
acactctttc cctacacgac gctcttccga tctnnnnnnn nnnnngccgc cgccgccg*t 59
<210> 2
<211> 13
<212> 人工序列
<223> 底部接头
<400> 2
cggcggcggc ggc 13
<210> 3
<211> 33
<212> 人工序列
<223> 通用前引物
<400> 3
acactctttc cctacacgac gctcttccga tct 33
<210> 4
<211> 39
<212> 人工序列
<223> 特异后引物
<400> 4
cagacgtgtg ctcttccgat ctxxxxxxxx xxxxxxxxx 39
<210> 5
<211> 58
<212> 人工序列
<223> P5引物
<400> 5
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact ctttccctac acgacgctct tccgatc*t 58
<210> 6
<211> 58
<212> 人工序列
<223> P7引物
<400> 6
caagcagaag acggcatacg agatgtgact ggagttcaga cgtgtgctct tccgatct 58

Claims (3)

1.一种cfDNA建库的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将cfDNA进行末端修复，并在cfDNA的3’端添加A碱基；
(2)将经过步骤(1)处理后得到的cfDNA末端连接上含有随机标签序列的接头，得到连接产物，并对连接产物进行磁珠纯化；
所述接头为双链接头，包括顶部接头和底部接头，所述顶部接头的序列为：5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNNNNNGCCGCCGCCGCCG*T-3’，其为SEQ ID NO:1所示；所述底部接头的序列为：5’-P-CGGCGGCGGCGGC-3’，其为SEQ ID NO:2所示；其中顶部接头中12个碱基“NNNNNNNNNNNN”为标签序列；
(3)利用通用前引物和特异后引物对上述连接产物进行第一轮扩增，并对第一轮扩增产物进行磁珠纯化；
(4)利用引物P7和P5对磁珠纯化后的第一轮扩增产物进行建库扩增，并对建库扩增产物进行磁珠纯化，得到高通量测序文库。
2.根据权利要求1所述的cfDNA建库的方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述通用前引物的序列为：5’-ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’，其为SEQ ID NO:3所示；所述特异后引物的序列为：5’-CAGACGTGTGCTCTTCCGATCTxxxxxxxxxxxxxxxxx-3’，其为SEQ ID NO:4所示。
3.根据权利要求1所述的cfDNA建库的方法，其特征在于，在步骤(4)中，P5引物的序列：5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATC*T-3’，其为SEQ IDNO:5所示；P7引物的序列：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT-3’，其为SEQ ID NO:6所示。
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