CN111748628B - 一种用于检测甲状腺癌预后相关基因变异的引物及试剂盒 - Google Patents
一种用于检测甲状腺癌预后相关基因变异的引物及试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种用于检测甲状腺癌预后相关基因变异的引物及试剂盒。本分明基于高通量测序技术，能够快速、全面、准确地检测BRAF基因T1799A、A1801G突变，TERT基因C228T、C250T突变，RET基因T2753C突变，EIF1AX基因G25C/A/T、G370T、G371T突变和TP53基因G818A突变。这些基因的上述位点突变与甲状腺癌的预后密切相关。因此使用本发明对患者的样本进行检测，可以协助医生对甲状腺癌患者的预后情况进行评估和判断，对医生选择合适的手术方式以及有针对性地制定术后随访方案提供有价值的决策依据和参考信息，有助于提高甲状腺癌患者的治疗效果及生存质量，具有非常重要的临床价值。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种用于检测甲状腺癌预后相关基因变异的引物及试剂盒。
背景技术
甲状腺癌是最常见的内分泌恶性肿瘤。根据GLOBOCAN2018的数据，全球甲状腺癌的发病人数占全部恶性肿瘤的3.1%，占女性恶性肿瘤的5.1%。自20世纪70年代以来，全世界大部分地区，包括美国、加拿大、欧洲、澳大利亚、亚洲和南美洲部分地区，均报道了甲状腺癌发病率的迅速上升和相对稳定的死亡率。根据中国癌症中心的统计数据显示，我国女性甲状腺癌的发病率位居女性所有恶性肿瘤的第4位。
甲状腺癌可分为***状癌、滤泡状癌、髓样癌和未分化癌，其中***状癌和滤泡状癌预后较好，未分化癌预后最差。但也有研究表明，部分甲状腺***状癌和滤泡状癌患者的预后也比较差，不同的基因发生突变可能是影响其预后质量的关键因素。随着分子生物学技术的进展，分子诊断在甲状腺癌预后评估中的作用和价值，逐渐受到人们的关注。BRAF基因突变和TERT基因突变是甲状腺癌预后不良的重要指标。无论BRAF基因T1799A或TERT基因C228T/C250T单独还是同时发生突变，患者的无复发生存率均明显下降。但BRAF基因A1801G突变则是甲状腺滤泡型腺瘤或滤泡型甲状腺***状癌（Follicular Variants ofPapillary Thyroid Carcinoma，FVPTC）中的特有突变。临床数据证实，和BRAF基因T1799A突变不同的是，BRAF基因A1801G突变往往是患者预后较好的指标之一。此外，RET基因T2753C突变也与甲状腺癌患者的预后差有显著相关。相比于RET基因野生型患者，RET基因T2753C突变患者更容易发生远端转移，无转移生存期缩短，生存率显著降低。携带EIF1AX基因G25C/A/T、G370T或G371T突变的甲状腺癌患者，其预后也较EIF1AX基因野生型患者差，易发生远端转移，易出现疾病复发。此外，TP53基因G818A突变，也是甲状腺癌的重要致病突变，且很多的在未分化甲状腺癌中被检出，这部分患者的预后普遍较差。
目前检测基因突变，常用的检测方法包含，一代测序（Sanger测序）法、扩增阻滞突变***PCR（ARMS-PCR）法、数字PCR（dPCR）法等。Sanger测序法是基因检测的“金标准”，能够直接检测不同碱基突变信号，结果分析方便，但是该方法的检测灵敏度较低，无法检出低水平的突变，且操作步骤多，耗时长。ARMS-PCR法对于多基因多位点的检测，往往需要进行多管反应，耗时耗力。dPCR法适用于低拷贝量样本，低频突变样本的检测，但是操作过程较多，操作对结果影响较大，而且耗材成本高，通量小。
因此，我们发明了一种基于高通量测序（NGS测序）法，能快速、全面、准确地检测一组甲状腺癌预后相关基因的多个变异位点的引物组合及试剂盒。通过对一组甲状腺癌预后相关的基因变异进行检测，其检测结果可以用来协助医生对甲状腺癌患者的预后情况进行评估和判断，对医生选择合适的手术方式以及有针对性地制定术后随访方案提供有价值的决策依据和参考信息，有助于提高甲状腺癌患者的治疗效果及生存质量，具有非常重要的临床价值。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种基于二代测序技术的能快速、全面、准确地检测甲状腺癌预后相关基因变异的引物及试剂盒，为评估甲状腺癌预后情况提供良好的辅助作用。使用本发明方法，可以同时检测5个基因上的9个突变位点，所述9个突变位点分别如表1所示：
表1 基因名称和突变位点表
具体的，本发明提供了一种能够特异性扩增甲状腺癌预后相关基因变异的引物组合，包括如下扩增引物对：核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的BRAF基因的扩增引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的TERT基因的扩增引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的RET基因的扩增引物对，核苷酸序列如SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的EIF1AX基因的扩增引物对，核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的TP53基因的扩增引物对，核苷酸序列如SEQ IDNO.13和SEQ ID NO.14所示的通用扩增引物对。特异性多重PCR引物序列见表2所示。
表2 引物序列表
其中，SEQ ID NO.13中的M和SEQ ID NO.14中的N分别为6个随机碱基序列，index编号不同，这6个碱基序列也不同，用于区分不同样品。
本发明还提供了一种检测甲状腺癌预后相关基因变异的试剂盒，所述试剂盒包含：特异性多重PCR引物、NGS建库试剂、阳性对照、阴性对照、无核酸酶水。NGS建库试剂为本领域常规使用试剂，能够从市场购买。
优选地，所述NGS建库试剂可以选择市售二代测序快速DNA建库试剂盒（Illumina）。
优选地，所述阳性对照为BRAF基因T1799A突变的人类基因组DNA储存液。
优选地，所述阴性对照为经确认不包含本发明所述基因变异的健康人类基因组DNA储存液。
所使用的样本为肿瘤患者的实体组织。
优选地，所用的样本为可以是新鲜手术组织和/或穿刺组织、冷冻手术组织和/或穿刺组织、***固定石蜡包埋（FFPE）的组织样本中的一种或多种。更优选地，检测样本为新鲜手术组织和/或穿刺组织。
一种用于检测甲状腺癌预后相关基因变异的试剂盒，其检测流程包括如下步骤：
(1) 样本提取：使用DNA样本抽提试剂盒提取样本中的DNA；
(2) 多重PCR扩增：用特异性多重PCR引物与NGS建库试剂中的扩增试剂，对从步骤（1）中获得的DNA进行扩增；
(3) 产物纯化：在步骤（2）获得的PCR扩增产物中加入定量的磁珠，进行纯化，去除基因组DNA和残余扩增引物；
(4) 接头连接：在步骤（3）获得的纯化产物中加入NGS建库试剂中的特异性标签和接头试剂，进行反应；
(5) 文库纯化：在步骤（4）所获得的已加上标签序列的小片段文库中加入磁珠，进行纯化，去除大片段和残余接头；
(6) 文库检测：将步骤（5）制备好的文库用Qubit进行定量，并用AgilientBioanalyzer 2100进行质检，检测文库的浓度以及文库的片段大小，确保最终文库片段在300bp左右；
(7) 上机测序：将步骤（6）检测合格的文库用Illumina测序平台进行高通量测序；
(8) 生信分析：对测序结果用生物信息软件进行分析和注释。
优选的，
所述核苷酸序列SEQ ID NO.1～12所示的DNA特异性引物混合池浓度为10μM。
所述核苷酸序列SEQ ID NO.13～14所示的通用引物混合池浓度为10μM。
所述PCR扩增产物纯化使用的磁珠为Beckman Agencourt AMPure XP磁珠。
本发明的有益效果是：（1）本发明提供了一种可以同时检测BRAF基因、TERT基因、RET基因、EIF1AX基因及TP53基因上的9个常见突变位点的引物及试剂盒，可以对甲状腺癌BRAF基因、TERT基因、RET基因、EIF1AX及TP53基因上的这9个常见突变位点进行突变检测，降低检测成本，缩短检测周期，提高检测效率；（2）本发明提供了一种可以同时检测BRAF基因、TERT基因、RET基因、EIF1AX及TP53基因上的9个常见突变位点的引物及试剂盒，这些基因突变与甲状腺癌预后密切相关，因此其检测结果可以用来协助医生对甲状腺癌患者预后情况进行评估和判断，从而对医生选择合适的手术方式以及有针对性地制定术后随访方案提供有价值的决策依据和参考信息，提高甲状腺癌患者治疗效果及生存质量；（3）本发明所提供的引物及试剂盒适用于甲状腺癌患者新鲜组织、冷冻组织和***固定石蜡包埋（FFPE）的组织的检测。
附图说明
图1为本发明试剂盒文库构建原理图。
图2为本发明试剂盒的检测流程图。
图3为本发明试剂盒构建文库片段分布图。
具体实施方式
为了更加透彻和全面地理解本发明所公开的内容，下面将参照附图对本发明进行详细的描述，但是本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例，通常属于本发明的技术领域的普通技术人员都能够理解这些描述，并可能在不脱离本发明方法的前提下，做出若干非意想不到的改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
实施例1 一种用于检测甲状腺癌预后相关基因变异的引物组合。
本实施例涉及的甲状腺癌预后相关基因及位点选自COSMIC(Catalogue ofSomatic Mutations in Cancer)数据库，依据相关基因序列进行突变热点引物设计，设计范围包含了甲状腺癌预后相关基因中的突变热点。
如表2所示，本实施例中对甲状腺癌预后相关基因的热点突变共设计了12条特异性引物，每对特异性引物扩增目标区域大小为180-200bp,扩增产物大小为220-280bp，具有覆盖范围广、检测位点多、GC含量均衡、产物结构稳定、二聚体结构少等优点。本实施例的特异性引物在多重PCR扩增时表现出很好的特异性、稳定性及均一性，在确保PCR扩增特异性的同时能保证其扩增效率。
实施例2 一种用于检测甲状腺癌预后相关基因变异的试剂盒。
本实施例中所述用于检测甲状腺癌预后相关基因变异的试剂盒，主要包括：
（1）PCR特异性引物：用于扩增待测样本目标基因上的多个目标区域，扩增范围覆盖目标基因的热点突变区域，序列如表2中SEQ ID NO.1 至SEQ ID NO.12所示。优选的，多重扩增引物对混合在一起构成引物池；
（2）通用引物：用于在文库构建过程中，对特异引物扩增目标区域的扩增产物进行再次扩增，对不同待测样本的测序文库进行标记，进而区分不同的样品，序列如表2中SEQID NO.13 和SEQ ID NO.14所示；
（3）NGS建库试剂：选择市售二代测序快速DNA建库试剂盒（Illumina）；
（4）阳性对照：BRAF基因T1799A突变的人类基因组DNA储存液；
（5）阴性对照：经确认不包含本发明所述基因变异的健康人类基因组DNA储存液。
实施例3 一种用于检测甲状腺癌预后相关基因变异的试剂盒的检测方法。
本实施例的检测方法包括以下步骤（图2）：
（1） 样本DNA提取：参照试剂盒说明书，使用AllPrep DNA Mini Kit 试剂盒提取DNA，使用NanoDrop进行浓度及纯度的测定，根据测定的核酸样本浓度结果，使用无核酸酶水将核酸样本稀释至10-50ng/μL作为扩增建库的核酸起始浓度。
（2） DNA文库构建：
（2a） DNA靶区域扩增：
按照下列反应体系和扩增条件进行第一轮PCR扩增：
| 试剂 | 体积 |
| 高保真DNA酶混合液 | 12.5μL |
| DNA特异性引物混合池 | 4μL |
| DNA模板 | 2μL |
| 无核酸酶水 | 补足至25μL |
DNA多重PCR扩增程序设置：
（2b）第一轮PCR产物纯化：
参照试剂盒说明书，使用AMPure XP Beads纯化试剂盒对第一轮PCR产物进行纯化：
1) 将以上25μL PCR扩增产物涡旋混匀并离心，将上清转移至一个新的1.5mL离心管中，然后加入17.5μL AMPure XP Beads，用移液器吹打混匀，室温静置5分钟；
2) 将上述装有上清的1.5ml离心管放置于磁力架上，静置5分钟，待溶液澄清后，小心吸取上清转移至另一个新的1.5mL离心管中，加入15μL AMPure XP Beads，用移液器吹打混匀，室温静置5分钟；
3) 将上述离心管放置于磁力架上，静置5分钟，待溶液澄清后，小心吸去上清，含有磁珠的离心管仍留在磁力架上；
4) 在上述离心管中加入200μL 80%的乙醇，静置30秒，用移液器小心吸去上清；
5) 重复上述步骤一次；
6) 室温静置10分钟，待乙醇完全挥发；
7) 向离心管中加入12μL无核酸酶水，移液器吹打混匀，充分悬浮磁珠，室温静置5分钟；
8) 将上述离心管放置到磁力架上，静置5分钟，待溶液澄清后，小心吸取10μL上清到新的0.2mL PCR管中，进行第二轮PCR扩增。
（2c） DNA第二轮PCR扩增：
按照下列反应体系和扩增条件进行第二轮PCR扩增：
| 试剂 | 体积 |
| 高保真PCR酶混合液 | 25μL |
| I5XX引物 | 1μL |
| I7XX引物 | 1μL |
| 第一轮PCR纯化产物 | 10μL |
| 无核酸酶水 | 补足至50μL |
不同的样本文库需使用不同的index编号引物。
DNA多重PCR扩增程序设置：
（2d） DNA第二轮PCR产物回收
参照试剂盒说明书，使用AMPure XP Breads纯化试剂盒对第二轮PCR产物进行纯化：
1) 将以上50μL PCR扩增产物涡旋混匀并离心，将上清转移至一个新的1.5mL离心管中，然后加入27.5μL AMPure XP Beads，使用移液器吹打混匀，室温静置5分钟；
2) 将上述装有上清的1.5ml离心管放置于磁力架上，静置5分钟，待溶液澄清后，小心吸取上清转移至一个新的1.5mL离心管中，加入15μL AMPure XP Beads，用移液器吹打混匀，室温静置5分钟；
3) 将上述离心管放置于磁力架上，静置5分钟，待溶液澄清后，小心吸去上清，含有磁珠的离心管仍留在磁力架上；
4)在上述离心管中加入200μL 80%的乙醇，静置30秒，用移液器小心吸去上清；
5)重复上述步骤一次；
6)室温静置10分钟，待乙醇完全挥发；
7)向离心管中加入22μL无核酸酶水，移液器吹打混匀，充分悬浮磁珠，室温静置5分钟；
8) 将上述离心管放置到磁力架上，静置5分钟，待溶液澄清后，小心吸取20μL上清到新的1.5mL 离心管中，该纯化产物即为构建好的文库；
9) 将上述制备好的文库用Qubit进行定量，并用Agilient Bioanalyzer 2100进行质检，检测文库的浓度以及文库的片段大小，确保最终文库片段在300bp左右（如图3），质检通过后上机测序。
（3） 上机测序：将质检通过的文库，准确定量并稀释到合适浓度，参照Illumina公司的官方操作说明书进行上机测序。
（4） 生信分析：对测序结果利用生物信息软件进行分析和注释。
实施例4 一种用于检测甲状腺癌预后相关基因变异试剂盒的测序深度性能验证。
利用本发明所述的试剂盒，对上海复旦大学附属肿瘤医院头颈外科提供的10例甲状腺癌样本进行检测，检测方法按照实施例3的步骤进行。10例样本检测的结果表明，对于不同样本，本发明所述试剂盒检测深度均表现良好，例如BRAF基因T1799A位点，在10例样本中的检测深度分别为：8657.29、6432.89、5278.83、6905.78、7842.12、11276.26、6745.23、9523.49、9682.13、7659.26，最低测序深度5278.83，最高测序深度11276.26，均达到试剂盒设定的最低测序深大于1000的性能指标，确保了测序结果的准确性。
实施例5 一种用于检测甲状腺癌预后相关基因变异试剂盒的重复性实验。
利用本发明所述的试剂盒，对上海复旦大学附属肿瘤医院头颈外科提供的同1例甲状腺癌样本，由实验室同一技术人员分别进行5次检测，检测方法按照实施例3的步骤进行。5次检测中，以BRAF基因T1799A位点的测序深度为例，其测序深度分别为36534.78、36381.36、39156.13、37890.20、38138.92，BRAF基因T1799A位点突变可以被稳定地检出，检出的突变频率分别为40.2%、40.7%、39.8%、39.4%、40.5%，其他位点的检测情况类似。因此表明，对于同一样本，本发明所述试剂盒具有良好的检测重复性。
实施例6 一种用于检测甲状腺癌预后相关基因变异试剂盒的重现性实验。
利用本发明所述的试剂盒，对上海复旦大学附属肿瘤医院头颈外科提供的同1例甲状腺癌样本，由实验室5位不同实验人员，分别按照实施例3的步骤进行检测，以BRAF基因T1799A位点的检测结果为例，该位点的测序深度分别为40126.23、33113.89、49812.12、46621.52、39529.58，BRAF基因T1799A位点突变可以被稳定地检出，检出的突变频率分别为26.91%、26.15%、27.14%、26.62%、27.21%。结果表明，其他位点的检测情况类似。因此表明，对于同一样本，不同实验操作人员使用本发明所述试剂盒检测结果均表现良好。本发明所述试剂盒具有良好的检测重现性。
实施例7 通过50例临床样品的回顾性实验检验本发明试剂盒的性能。
利用本发明所述的试剂盒，对上海复旦大学附属肿瘤医院头颈外科提供的25例手术1年内疾病无进展的甲状腺癌患者癌组织样本和25例手术1年内疾病进展的甲状腺癌患者癌组织样本进行检测，检测方法按照实施例3的步骤进行。
具体的，对上述50例样本进行DNA抽提纯化，文库构建，使用Illumina公司的NovaSeq高通量测序平台对样本文库进行测序，测序读长为PE150，测序结果要求平均测序深度大于1000，且达到95%，对不合格样本进行重新测序。
对测序结果进行分析，判断每个患者预后情况，并将判断结果与患者的实际临床有无疾病进展情况进行比对，比较结果之间的差异。具体如表3所示：
表3 患者样本试剂盒检测结果与患者临床有无疾病进展情况对照表
| 41 | 未检测到突变 | -- | 较好 | 疾病无进展 | 一致 |
| 42 | BRAF: c.1801A>G:p.K601E | 7.39% | 较好 | 疾病无进展 | 一致 |
| 43 | 未检测到突变 | -- | 较好 | 疾病无进展 | 一致 |
| 44 | 未检测到突变 | -- | 较好 | 疾病无进展 | 一致 |
| 45 | BRAF: c.1799T>A:p.V600E | 14.70% | 较差 | 疾病进展 | 一致 |
| 46 | BRAF: c.1799T>A:p.V600E | 28.23% | 较差 | 疾病进展 | 一致 |
| 47 | 未检测到突变 | -- | 较好 | 疾病进展 | 不一致 |
| 48 | 未检测到突变 | -- | 较好 | 疾病无进展 | 一致 |
| 49 | EIF1AX: c.371G>T:p.G124V | 15.27% | 较差 | 疾病进展 | 不一致 |
| 50 | 未检测到突变 | -- | 较好 | 疾病无进展 | 一致 |
针对这50例临床甲状腺结节的患者，将依据本发明试剂盒检测的结果和临床实际的疾病进展情况相对比，应用统计学方法计算得出：本发明试剂盒的敏感度达到了84.0%，特异性达到了88.0%，阳性预测值达到了87.5%，阴性预测值达到了84.6%，准确性达到了86.0%，因此能够成为临床医生评估甲状腺癌预后情况的一个非常重要的参考依据。
最后说明的是，以上所例举的实施例仅为本发明的优选实施例，并非对本发明的技术方案的限制。本领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，可以对本发明的形式、内容和细节做出非意想不到的改变，而这些改变并没有偏离本发明权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 润安医学科技（苏州）有限公司
<120> 一种用于检测甲状腺癌预后相关基因变异的引物及试剂盒
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gctcttccga tcttcttcat aatgcttgct c 31
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctcttccga tcttaactca gcagcatctc 30
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gctcttccga tctacgtggc ggagggac 28
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
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<212> DNA
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<400> 6
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<211> 36
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<400> 7
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<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gctcttccga tctcgtaatt tatgaaaaca c 31
<210> 9
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gctcttccga tcttgatgaa actttgagta aattac 36
<210> 10
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gctcttccga tcttagggga aagttggttt ctcca 35
<210> 11
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
gctcttccga tctaaggcag gggtatttgt tttgatgc 38
<210> 12
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gctcttccga tcttcctacc aggaagaacc ggc 33
<210> 13
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacm acactctttc cctacacgac gctcttccga 60
tct 63
<210> 14
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
caagcagaag acggcatacg agatngtgac tggagttcag acgtgtgctc ttccgatct 59
Claims (3)
1.一种引物组合在制备用于检测甲状腺癌预后相关基因变异试剂盒中的应用，其特征在于，所述引物组合由SEQ ID NO.1～14所示的核苷酸序列组成。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述引物组合能够用于检测BRAF基因T1799A、A1801G突变，TERT基因启动子C228T、C250T突变，RET基因T2753C突变，EIF1AX基因G25C/A/T、G370T、G371T突变和TP53基因G818A突变。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒中还包括NGS建库试剂、阳性对照、阴性对照和无核酸酶水。
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