CN112259165B - 用于检测微卫星不稳定性状态的方法及*** - Google Patents

用于检测微卫星不稳定性状态的方法及*** Download PDF

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Abstract

本发明涉及微卫星位点检测技术领域，具体涉及用于检测微卫星不稳定性状态的方法及***，通过对癌变组织样本进行DNA提取，片段化处理，末端修复，接头连接；再经扩增、杂交、捕获、PCR扩增、纯化得到测序文库；通过二代上机测序得到肿瘤组织样本靶向捕获测序数据，根据MSI模型进行微卫星不稳定状态检测相关的信息分析。与现有技术相比，本发明采用目前成熟的二代测序技术获取被测试者肿瘤组织的遗传信息，可进行单一肿瘤组织分析，不依赖对照样本，打破了微卫星检测的局限性，可适用于多个基因组合，不需要专门设计MSI位点探针，适用性强，并且可以节约检测成本，具有高效、***、经济简便性，并且提高了检测的敏感性。

Description

用于检测微卫星不稳定性状态的方法及***
技术领域
本发明涉及微卫星位点检测技术领域，具体涉及用于检测微卫星不稳定性状态的方法及***。
背景技术
微卫星(Microsatellite,简称MS)序列又称短串联重复序列(Short tandemrepeats,STRs)或简单重复串联序列(Simple Sequence Repeat,SSR)，广泛存在于原核及真核基因组中，是由10～50个1～6个核苷酸组成的重复单元串联而成的具有高度多态性的简单串联重复序列。当人体的错配修复(Mismatch repair,简称MMR)机制发生缺陷时，MS序列会出现长度的变化，成为微卫星不稳定性(Microsatellite instability,简称MSI)。大量研究证明，微卫星不稳定性与肿瘤的发生相关，尤其是结直肠癌等胃肠道癌症，并在肿瘤的治疗和预后的过程中具有重要的作用。
美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network，简称NCCN)结直肠癌指南中提到MSI检测应在所有结直肠癌史的病人中进行，可以作为结直肠癌预后的良好标志物并且MSI-H的结直肠癌II期病人有较好的预后。
FDA在2017年5月批准默沙东PD-1单抗Keytruda用于治疗携带MSI-H或错配修复缺陷(dMMR)的实体瘤患者，证明了MSI-H可以作为一种独立于肿瘤发病位置的泛癌种癌症标志物。紧接着2017年8月批准了nivolumab用于曾接受过氟嘧啶、奥沙利铂或伊立替康化疗发生疾病进展或对上述药物不耐受的dMMR或MSI-H的成年人或12岁以上儿童转移性结直肠癌患者的治疗；2018年7月又批准了Ipilimumab联合nivolumab，用于治疗12岁及以上的MSI-H或dMMR并且在使用氟嘧啶、奥沙利铂或伊立替康治疗后疾病进展的转移性结直肠癌患者。可见MSI检测对于癌症患者的重要性。
目前，市场上对于肿瘤MSI的诊断方法多数停留在单个肿瘤单个或几个位点的检测水平，这些方法都存在不同的缺陷，免疫组化的方法特异性和可重复性较低，对样本质量要求高，操作也比较复杂；PCR的方法通常选择5-11个单核苷酸重复位点，长度为25bp左右，PCR扩增后通过毛细管电泳测量其长度分布区间来确定样本的微卫星(不)稳定状态，为目前的金标准检测方法，但需要额外的检测样本来进行，且需要患者的正常组织作为对照来进行状态判定，因此从操作角度上而言并不便捷。所以，目前的MSI的检测方法难以满足目前检测样本数量大、检测位点多、分布广、检测准确性高等检测要求。因此，如何建立一种高效便捷的MSI检测体系，并寻找高度灵敏性及特异性的用于检测结直肠癌相关的MSI位点已成为目前需要解决的问题。
发明内容
为了克服上述技术缺陷的不足，本发明提供了用于检测微卫星不稳定性状态的方法及***，可实现样本中多个微卫星位点和多个疾病相关基因的同时检测，能够针对所检测的样本给出更加全面的预后、治疗、排查等方面的结论和建议。
用于检测微卫星不稳定性状态的***，关键在于：包括用于对肿瘤样本的微卫星不稳定状态进行信息分析的MSI模型，所述MSI模型包括MSI模型准备模块，用于判别样本微卫星不稳定性状态的高灵敏度位点；数据质控模块，用于对靶向捕获数据进行质控，进行微卫星不稳定性检测；MSI状态检测模块，用于扫描样本比对结果中所有有效位点，对该样本的微卫星位点状态进行预测，根据MSI score来判别样本的MSI状态。高灵敏度位点如下表1所示：
Figure GDA0002945153060000031
Figure GDA0002945153060000041
Figure GDA0002945153060000051
Figure GDA0002945153060000061
Figure GDA0002945153060000071
Figure GDA0002945153060000081
表1
用于检测微卫星不稳定性状态的方法，关键在于包括以下步骤：
步骤一、对肿瘤患者的癌变组织样本进行DNA提取，之后进行DNA片段化处理，末端修复加poly-A尾，进行接头连接；
步骤二、将接头的DNA纯化后，加入PCR反应混合液进行扩增，将扩增产物纯化后，进行杂交、捕获、PCR扩增、纯化得到测序文库；
步骤三、通过二代上机测序得到肿瘤组织样本靶向捕获测序数据，根据MSI模型进行微卫星不稳定状态检测相关的信息分析，不用于癌症诊断和治疗。
优选的，所述步骤一中DNA末端修复加poly-A尾方法具体为：将体积比为(5-8):(10-20):100的“A”酶混合物、“A”缓冲液和片段化处理的DNA涡旋混匀后离心，放置在热循环仪上，反应程序如下：20℃30min，65℃，30min，4℃，保持。
优选的，所述步骤一中接头连接具体为：将体积比为(3-5):(25-30):(3-8):100的UMI标签的接头、连接缓冲液、连接酶和末端修复的DNA涡旋混匀后离心，放置于热循环仪上，反应程序如下：20℃ 30min，4℃，保持。
优选的，所述步骤二中文库扩增具体为：将体积比为1：(2-5)：(4-7)的扩增引物、接头的DNA和2X PCR混合液，涡旋混匀后离心，放置于热循环仪上，反应程序如下：98℃45s，循环1次；98℃ 15s，60℃ 30s，72℃ 30s，循环8次；72℃ 30s，循环1次；4℃ 1min，循环1次。
优选的，所述步骤二中纯化具体为：将DNA样本加入质量分数为80％wt的乙醇纯化后的磁珠，充分混合均匀后，室温静置5min后，置于磁力架静置2min，待磁珠全部吸附至侧壁，移除清液后，缓慢加入质量分数为80％wt的乙醇，静置30-60s，移除清液，干燥磁珠直到磁珠状态为表面不反光，然后用TE缓冲液重悬磁珠，充分混匀，室温静置1min，置于磁力架静置2min，待磁珠完全吸附至侧壁，将上清液移出待用。
优选的，所述步骤二中杂交具体为：将500ngDNA扩增产物中加入5μL快速封闭试剂和2μL P5、P7封闭试剂，使用浓缩仪将扩增产物浓缩到干粉状态，然后加入体积比为(80-90)：(25-30)：(15-20)的杂交缓冲液、杂交增强剂和无核酶水，室温静置10min，充分震荡混匀后放置在热循环仪上，反应程序如下：95℃ 10min，65℃，保持。
优选的，所述步骤二中捕获具体为：将杂化后的DNA样品中加入捕获探针，混合均匀后，65℃静置4h，使用链霉亲和素磁珠对探针结合的样品进行捕获，然后分别使用65℃和室温下的清洗液清洗多次，置于磁力架上，待磁珠全部吸附至侧壁，移除清液后，加入无核酶水重悬磁珠；所述步骤二中PCR扩增具体为：将体积比为(18-25)：1：1(15-20)的2×热启动酶混合物、P5接头引物、P7接头引物和磁珠捕获到的DNA片段混合进行PCR扩增，反应程序如下：98℃ 45s，循环1次；98℃ 15s，60℃ 30s，72℃ 30s，循环15次；72℃ 60s，循环1次；4℃保持。
优选的，所述步骤三具体为：将测序文库在高通量测序仪(Illumina)上完成测序得到测序文库，通过MSI模型对肿瘤样本的微卫星不稳定状态进行信息分析，所述MSI模型包括MSI模型准备模块、数据质控模块和MSI状态检测模块。
优选的，所述MSI模型准备模块的工作过程为：通过扫描人类参考基因组，获取基因组序列上所有的微卫星位点的位置和侧翼序列；对于上述获取的微卫星位点，利用2000个全外显子肿瘤-正常成对的测序样本数据比对到参考基因组上，来获取全基因组上所有微卫星位点列表；过滤位点并采用机器学习方法进行训练，共得到121个高灵敏度微卫星位点，同时这121个微卫星位点能够被测序的试剂盒覆盖；
所述数据质控模块的工作过程为：对靶向捕获数据进行质控，去掉质量不合格的数据；将质控合格的数据与人类基因组进行比对，用于获取参考基因组的微卫星位点作为候选MS位点信息；对比对结果进行质控，将对比结果的捕获效率、目标区域平均测序深度、微卫星位点的覆盖深度和污染率进行阈值筛选，选出阈值范围内的候选MS位点区域，对样本进行微卫星不稳定性检测；
所述MSI状态检测模块的工作过程为：采用MSIsensor扫描样本比对结果中所有的有效位点，并获取其reads支持的位点，采用每个位点模型对该样本的微卫星位点状态进行预测，输出该样本模型判断为微卫星不稳定位点占微卫星有效位点的百分比，即为MSIscore；根据MSIscore来判别样本的MSI状态。
有益效果：与现有技术相比，本发明所提供的用于检测微卫星不稳定性状态的方法及***，采用目前成熟的二代测序技术获取被测试者肿瘤组织的遗传信息，可进行单一肿瘤组织分析，不依赖对照样本，打破了微卫星检测的局限性，可适用于多个基因组合，不需要专门设计MSI位点探针，适用性强，并且可以节约检测成本，具有高效、***、经济简便性，并且提高了检测的敏感性。
附图说明
图1为本发明检测结果与PCR检测结果一致性比较图。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明作详细说明。
实施例用于检测微卫星不稳定性状态的方法
(1)样本提取：采用试剂盒(用QIAamp DNA FFPE tissue kit)提取肿瘤组织样本，组织样本不限于石蜡包埋组织、新鲜组织和冰冻切片。
(2)样本DNA浓度测定采用
Figure GDA0002945153060000111
4.0荧光仪配套的dsDNA HS assay kits进行DNA浓度精确定量。
(3)文库构建用超声破碎仪Covaris M220将DNA打断到100～500bp长的片段，然后采用DNA Lib Prep Kit for Illumina(RK20217)试剂盒构建文库；将片段化的样本DNA加入“A”酶混合物和“A”缓冲液、进行末端修复和加A，涡旋混匀后离心，放置在热循环仪上，反应程序如下：20℃ 30min，65℃，30min，4℃，保持，反应体系见下表2。
反应体系组分 体积
“A”酶混合物 3μL
“A”缓冲液 7μL
片段化DNA 50μL
表2
接头连接并纯化：将上述末端修复后的DNA加入连接酶、连接缓冲液和带UMI标签的接头进行接头连接，涡旋混匀，微离心，放置于热循环仪上，反应程序如下:20℃ 30min，4℃，保持，反应体系见下表3。
反应体系组分 体积
带UMI标签的接头 2.5μL
末修后DNA 60μL
连接缓冲液 16.5μL
连接酶 3μL
表3
连接后纯化：Beckman Agencourt AMPure XP磁珠2～8℃保存，室温平衡至少30min，使用1x体积，80μL/每样本。现用现配的80％乙醇，此步骤纯化需要400μL/每样本；在每个样本中加80μL(1x体积)AMPure XP磁珠，用移液器吹打或者振荡充分混匀。室温静置5分钟；放置磁力架静置2分钟。待磁珠全部吸附至侧壁，使用移液器吸取移弃上清。注意勿扰动磁珠；在磁力架上沿磁珠相反方向的管壁缓慢加入200μL 80％乙醇，注意勿扰动磁珠，静置30s-1min，使用移液器吸取移弃上清；重复上步骤一次，用10μL的移液器将残留的乙醇尽量吸弃干净，注意勿碰到磁珠；室温干燥磁珠5分钟或放置于干式加热器37℃随时观看干燥状态。此步骤时间根据磁珠状态减少或者增加，达到磁珠状态为表面不反光，不能过度干燥为宜；每个样本用21μL low TE缓冲液重悬磁珠，如果进行磁珠分选，则加入51μL low TE缓冲液重悬磁珠，将样本管远离磁力架；用移液器吹打或者振荡充分混匀，室温孵育1分钟；放置磁力架上，室温孵育2分钟；待磁珠完全吸附至侧壁，将20μL上清液移到一个新的PCR管中等待扩增。
文库扩增将接头连接好的DNA加入2X PCR反应混合液、扩增引物涡旋混匀，微离心，放置于热循环仪上反应，反应结束后，按照磁珠纯化的流程使用1X体积磁珠纯化PCR产物，之后用dsDNA HS Assay Kit测定预文库浓度，利用QIAxcel进行片段大小检测。反应体系和反应条件如表4和表5所示。
反应体系组分 体积
接头连接好的DNA 20μL
2X PCR反应混合液 25μL
Illumina文库扩增引物混合物 5μL
表4
Figure GDA0002945153060000131
表5
(4)杂交捕获采用
Figure GDA0002945153060000132
hybridization capture of DNA libraries试剂盒进行杂交捕获；取出500ng扩增产物，加入5μL快速封闭试剂和2μL P5、P7封闭试剂，使用浓缩仪将扩增产物浓缩到干粉状态，然后加入杂交试剂，室温孵育10min，充分震荡混匀后放置在热循环仪上。杂交反应体系和反应条件如表6和表7所示。
反应体系组分 体积
杂交缓冲液 8.5μL
杂交增强剂 2.7μL
无核酶水 1.8μL
表6
步骤 温度 时间
1 95℃ 10min
2 65℃ ∞
表7
目标区域捕获：等杂化步骤1结束后，65℃条件下暂停，1min内在PCR仪上加入4μL捕获探针，使用移液器混匀后，计时4h；使用链霉亲和素磁珠对探针结合的样品进行捕获，步骤如下：将1ng磁珠加入1.5mL离心管，至于磁力架上，弃上清，用200μL磁珠清洗试剂清洗两遍后，使用100μL磁珠清洗试剂重悬磁珠，转移到0.2mLPCR管内，等65℃应4h结束后，将其置于磁力架上，待溶液澄清后，弃上清，然后将磁珠置于65℃热循环仪上，在1min内将杂交反应液转移至含有链霉亲和素磁珠的PCR管中，迅速震荡混匀，放回65℃热循环仪，计时45min，每隔8min震荡混匀一次，保持磁珠处于悬浮状态；
洗脱非杂交片段：先使用预热到65℃的清洗液1清洗一遍，再使用预热到65℃的增强清洗液清洗两遍；再使用室温下清洗液1、清洗液2和清洗液3各清洗一遍，最后至于磁力架上，弃上清，加入22.5μL无核酶水重悬磁珠；
捕获后产物扩增：将磁珠捕获到的DNA片段加入2×热启动酶混合物、P5接头引物和P7接头引物进行PCR扩增(采用Illumina P5、P7接头引物)，将得到的PCR扩增产物进行磁珠纯化，使用Qubit 4.0检测浓度，利用Agilent 2100进行片段大小检测。扩增体系和扩增条件见表8和表9。
体系组分 体积
2×热启动酶混合物 25μL
P5接头引物 1.25μL
P7接头引物 1.25μL
磁珠上的目标区域DNA 22.5μL
表8
Figure GDA0002945153060000151
表9
(5)上机测序：在高通量测序仪(Illumina)上完成测序。
测序数据预处理分析：数据拆分：测序仪下机后的bcl文件，利用bcl2fastq进行数据拆分，拆分后的文件为fastq；数据预处理：使用fastp(v0.20.0)对fastq格式文件预处理，对测序reads进行去通用引物、接头序列以及过滤低质量等操作；序列比对：采用BWA(v0.7.17)对质控后的序列与参考基因组(human hg19)进行比对，获得SAM格式比对结果；并采用samtools(v1.9)将SAM格式的比对结果转化成BAM格式，并进行排序；之后采用GATK4去除PCR重复和质量校正；比对文件质控：针对每个样本的数据进行质控，如果数据满足质控标准中的各项要求，则可进行后续生物信息学分析。质控标准如表10所示：
Figure GDA0002945153060000152
Figure GDA0002945153060000161
表10
样本微卫星状态检测：采用MSIsensor对样本质控后的BAM数据扫描得到所有的有效位点，并获取其reads支持的位点，采用每个位点模型对该样本的微卫星位点进行预测，模型输出判断为该样本上微卫星不稳定位点的百分比，即为MSI分数(MSIscore)，根据MSIscore来判别样本的MSI状态，MSI-H样本(微卫星高度不稳定)判定标准为MSIscore大于20％；MSI-L样本(微卫星低度不稳定)判定标准为MSIscore大于等于10％且小于等于20％，MSS样本(微卫星稳定)判定标准为MSIscore小于10％。
对50名结直肠癌患者的肿瘤组织样本同时采用本发明和PCR检测***进行进行微卫星不稳定性对比分析，样本信息、样本质控表格和测试结果如下表11-13所示：
Figure GDA0002945153060000162
Figure GDA0002945153060000171
Figure GDA0002945153060000181
表11
Figure GDA0002945153060000182
Figure GDA0002945153060000191
Figure GDA0002945153060000201
表12
Figure GDA0002945153060000202
Figure GDA0002945153060000211
Figure GDA0002945153060000221
MSI2_score为单肿瘤样本的NGS-MSI检测数值。
MSI_score为肿瘤-正常成对样本的NGS-MSI检测数值。
NGS表示单肿瘤样本的NGS-MSI检测结果。
PCR表示单肿瘤样本的PCR-MSI检测结果。
表13
表13中显示本发明的单肿瘤样本MSI检测的结果与肿瘤-正常成对样本的NGS-MSI检测结果是高度一致的，验证了单肿瘤样本MSI检测的结果是可靠的。并且本装置计算50例样本中有9例为MSI-H，有一例PCR检测结果显示其为MSI-L；在本装置计算为MSI-L的17例样本中，有2列PCR检测结果为MSS状态。表明NGS检测方法的灵敏性要高于PCR检测方法。
将对本装置检测结果与PCR检测结果一致性进行比较作图(图1)，横坐标为MSI状态，纵坐标为本装置检测出的MSIscore。Both表示本装置检测结果与PCR检测结果MSI状态一致，NGS_only表示本装置检测状态与PCR检测状态不一致，只有本装置检测到该状态，表明NGS检测方法的灵敏性要高于PCR检测方法。
最后需要说明，上述描述仅为本发明的优选实施例，本领域的技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.用于检测微卫星不稳定性状态的***，其特征在于：包括用于对肿瘤样本的微卫星不稳定状态进行信息分析的MSI模型，所述MSI模型包括MSI模型准备模块，用于判别样本微卫星不稳定性状态的高灵敏度位点；数据质控模块，用于对靶向捕获数据进行质控，进行微卫星不稳定性检测；MSI状态检测模块，用于扫描样本比对结果中所有有效位点，对该样本的微卫星位点状态进行预测，根据MSIscore来判别样本的MSI状态；
高灵敏度位点如下表所示：
Figure FDA0002945153050000011
Figure FDA0002945153050000021
Figure FDA0002945153050000031
Figure FDA0002945153050000041
Figure FDA0002945153050000051
Figure FDA0002945153050000061
2.使用权利要求1所述的用于检测微卫星不稳定性状态的***来检测微卫星不稳定性状态的方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤一、对肿瘤患者的癌变组织样本进行DNA提取，之后进行DNA片段化处理，末端修复加poly-A尾，进行接头连接；
步骤二、将接头的DNA纯化后，加入PCR反应混合液进行扩增，将扩增产物纯化后，进行杂交、捕获、PCR扩增、纯化得到测序文库；
步骤三、通过二代上机测序得到肿瘤组织样本靶向捕获测序数据，根据MSI模型进行微卫星不稳定状态检测相关的信息分析，不用于癌症诊断和治疗；
将测序文库在高通量测序仪Illumina上完成测序得到测序数据，通过MSI模型对肿瘤样本的微卫星不稳定状态进行信息分析，所述MSI模型包括MSI模型准备模块、数据质控模块和MSI状态检测模块；
所述MSI模型准备模块的工作过程为：通过扫描人类参考基因组，获取基因组序列上所有的微卫星位点的位置和侧翼序列；对于上述获取的微卫星位点，利用2000个全外显子肿瘤-正常成对的测序样本数据比对到参考基因组上，来获取全基因组上所有微卫星位点列表；过滤位点并采用机器学习方法进行训练，共得到121个高灵敏度微卫星位点，同时这121个微卫星位点能够被测序的试剂盒覆盖。
3.根据权利要求2所述的检测微卫星不稳定性状态的方法，其特征在于所述步骤一中DNA末端修复加poly-A尾方法具体为：将体积比为(5-8):(10-20):100的“A”酶混合物、“A”缓冲液和片段化处理的DNA涡旋混匀后离心，放置在热循环仪上，反应程序如下：20℃30min，65℃，30min，4℃，保持。
4.根据权利要求2所述的检测微卫星不稳定性状态的方法，其特征在于所述步骤一中接头连接具体为：将体积比为(3-5):(25-30):(3-8):100的UMI标签的接头、连接缓冲液、连接酶和末端修复的DNA涡旋混匀后离心，放置于热循环仪上，反应程序如下：20℃30min，4℃，保持。
5.根据权利要求2所述的检测微卫星不稳定性状态的方法，其特征在于所述步骤二中文库扩增具体为：将体积比为1：(2-5)：(4-7)的扩增引物、接头的DNA和2X PCR混合液，涡旋混匀后离心，放置于热循环仪上，反应程序如下：98℃45s，循环1次；98℃15s，60℃30s，72℃30s，循环8次；72℃30s，循环1次；4℃1min，循环1次。
6.根据权利要求2所述的检测微卫星不稳定性状态的方法，其特征在于所述步骤二中纯化具体为：将DNA样本加入质量分数为80％wt的乙醇纯化后的磁珠，充分混合均匀后，室温静置5min后，置于磁力架静置2min，待磁珠全部吸附至侧壁，移除清液后，缓慢加入质量分数为80％wt的乙醇，静置30-60s，移除清液，干燥磁珠直到磁珠状态为表面不反光，然后用TE缓冲液重悬磁珠，充分混匀，室温静置1min，置于磁力架静置2min，待磁珠完全吸附至侧壁，将上清液移出待用。
7.根据权利要求2所述的检测微卫星不稳定性状态的方法，其特征在于所述步骤二中杂交具体为：将500ngDNA扩增产物中加入5μL快速封闭试剂和2μL P5、P7封闭试剂，使用浓缩仪将扩增产物浓缩到干粉状态，然后加入体积比为(80-90)：(25-30)：(15-20)的杂交缓冲液、杂交增强剂和无核酶水，室温静置10min，充分震荡混匀后放置在热循环仪上，反应程序如下：95℃10min，65℃，保持。
8.根据权利要求2所述的检测微卫星不稳定性状态的方法，其特征在于：所述步骤二中捕获具体为：将杂化后的DNA样品中加入捕获探针，混合均匀后，65℃静置4h，使用链霉亲和素磁珠对探针结合的样品进行捕获，然后分别使用65℃和室温下的清洗液清洗多次，置于磁力架上，待磁珠全部吸附至侧壁，移除清液后，加入无核酶水重悬磁珠；所述步骤二中PCR扩增具体为：将体积比为(18-25)：1：1(15-20)的2×热启动酶混合物、P5接头引物、P7接头引物和磁珠捕获到的DNA片段混合进行PCR扩增，反应程序如下：98℃45s，循环1次；98℃15s，60℃30s，72℃30s，循环15次；72℃60s，循环1次；4℃保持。
9.根据权利要求8所述的检测微卫星不稳定性状态的方法，其特征在于所述数据质控模块的工作过程为：对靶向捕获数据进行质控，去掉质量不合格的数据；将质控合格的数据与人类基因组进行比对，用于获取参考基因组的微卫星位点作为候选MS位点信息；对比对结果进行质控，将对比结果的捕获效率、目标区域平均测序深度、微卫星位点的覆盖深度和污染率进行阈值筛选，选出阈值范围内的候选MS位点区域，对样本进行微卫星不稳定性检测；
所述MSI状态检测模块的工作过程为：采用MSIsensor扫描样本比对结果中所有的有效位点，并获取其reads支持的位点，采用每个位点模型对该样本的微卫星位点状态进行预测，输出该样本模型判断为微卫星不稳定位点占微卫星有效位点的百分比，即为MSIscore；根据MSIscore来判别样本的MSI状态。
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