CN101735971A - 一种高通量筛选谷氨酸高产菌株的方法 - Google Patents
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Abstract
一种高通量筛选谷氨酸高产菌株的方法，属于发酵工程技术领域。高产菌株的筛选一直是产谷氨酸菌种选育的瓶颈。传统的筛选方法是从平板上挑取单菌落，然后通过试管或小摇瓶发酵初筛，再进行摇瓶发酵复筛。本发明对传统的筛选进行了改良，根据高产谷氨酸菌株的特点，在平板上挑取单菌落，用微孔细胞培养板进行初筛，摇瓶发酵复筛。本发明方法有效地增加了每次筛选的菌落数量，降低筛选工作强度，提高了整个筛选工作的效率。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于平板、微孔细胞培养板的快速、高通量筛选谷氨酸高产菌株的方法，属于发酵工程技术领域。
背景技术
谷氨酸是传统大宗发酵产品，是最早大规模发酵生产的氨基酸，也是目前世界上生产量最大的氨基酸。谷氨酸在食品、医药、工业、农业等方面具有广泛的应用，其单钠盐-谷氨酸钠(商品名称味精)是重要的调味品。2008年我国谷氨酸产量约为160万吨，占全球总量的75％左右。然而我国主要将谷氨酸(味精)作为纯粹调味品(比例为85％)，其他国家将谷氨酸作为纯粹调味品的比例仅为52％，而将其用做化工、医药和保健食品中间体的比例却高达48％(日本味之素公司食品事业报告书，2002年)。预计今后5-20年，我国将谷氨酸用做化工、医药和保健食品中间体的比例将会大大提高。预计2020年全球谷氨酸产量可以达到320万吨，中国占总分额的70％，将达到224万吨。
中国是谷氨酸的生产大国同时也是消耗大国。但目前我国谷氨酸工业存在一些严重制约产业发展的瓶颈问题，最主要的是：缺乏现代生物技术方法改造的高产优良菌株，发酵生产的主要技术指标明显低于国外先进厂家的水平，造成生产运营成本过高(食品科学，2009，30(4)：40-43)。
优良的谷氨酸高产菌株是发酵生产谷氨酸的关键。我国于上世纪60年代开始，先后分离选育获得了北京棒状杆菌AS1.299、钝齿棒状杆菌AS1.452及天津短杆菌T6-13。随后通过UV、60Co辐射、NTG、DES等诱变方法和原生质体融合等方法，选育了适合工业生产的谷氨酸产生菌种。如云逢霖等以T6-13为出发菌株，采用UV和NTG诱变以及原生质体诱变等方法，通过多次诱变处理，选育出S9114菌株。该菌株具有耐高糖(25％-30％)、耐高谷氨酸(20％)、不利用谷氨酸的特点。摇瓶试验初糖15.5％，产酸8.56％，转化率55.15％。该菌株已在多家味精厂推广应用(发酵科技通讯，1993，22(1)：3-7)。但是生产实践发现，产谷氨酸菌种在保存传代过程中，生产性能会逐渐衰退，产酸和转化率会不断下降，因此，必须定期进行复壮，即从衰退的菌株中，通过分离、纯化筛选出未衰退的菌株，这样才能保持菌株的高产性能，不断满足生产需要(发酵科技通讯，1993，22(2)：38-34)。
所以，高产谷氨酸菌株的选育工作在谷氨酸的发酵生产中必不可少。无论是用传统诱变、用现代基因工程手段对现有谷氨酸高产菌株的改造，还是高产菌株的复壮，都需要从众多的单菌株中挑选出高产菌株，而目前常用的筛选方法，都是先从特定的平板上挑选单菌落，然后通过试管或小摇瓶发酵进行产酸初筛，再用摇瓶发酵进行产酸复筛，选出高产菌株。由于谷氨酸摇瓶发酵过程中，需要通过多次补加尿素或氨水来维持发酵液pH7.0，操作繁琐，工作量大，同时人为误差也大，并且用试管或小摇瓶，每次发酵试验的数量有限，筛选工作速度慢，因此，成为高产菌株选育的一个瓶颈。
本发明根据高产谷氨酸菌株的特点，采用选择平板，如平板筛选限制因素为：高糖、高谷氨酸、谷氨酸唯一碳源、抗性(磺胺胍、酮基丙二酸、丙二酸、香豆素等)、琥珀酸敏感型、营养缺陷型(异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸缺陷型)等，或低pH耐受性，或高pH耐受性。
挑取在选择平板生长的菌落；用微孔细胞培养板代替试管或摇瓶进行产酸初筛，一块微孔细胞培养板就可以进行24至384个样品同时摇床发酵，摇床上可放置多个微孔培养板，有效地增加了每次筛选的菌落数量。并且本发明在发酵培养基中添加酸碱指示剂，有效的提示了补加尿素的时间，从而减少人为误差，降低筛选工作强度，提高了整个筛选工作的效率。因此，本发明对于高产谷氨酸产生菌株的选育有积极的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于选择平板、微孔细胞培养板培养技术，建立的快速、高通量筛选谷氨酸高产菌株的方法。
本发明的技术方案：
(1)将从自然界分离微生物样品或通过人工改造的产谷氨酸突变菌样品，涂布到平板28-35℃培养48-72h。平板筛选限制因素为：高糖、高谷氨酸、谷氨酸唯一碳源、抗性(磺胺胍、酮基丙二酸、丙二酸、香豆素等)、琥珀酸敏感型、营养缺陷型(异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸等缺陷型)、低pH耐受、高pH耐受等。
如抗性平板培养基由下述成分组成：葡萄糖5-10g、蛋白胨5-10g、酵母膏1-5g、牛肉膏3-10g、NaCl 2-5g、琼脂15-20g，并含磺胺胍5-20g、酮基丙二酸0.5-2.5g、丙二酸5-20g、香豆素1-5g，蒸馏水定容至1L，pH7.0。
如高糖平板培养基由下述成分组成：葡萄糖250-300g、蛋白胨5-10g、酵母膏1-5g、牛肉膏3-10g、NaCl 2-5g，琼脂15-20g，蒸馏水定容至1L，pH7.0。
如高谷氨酸培养基由下述成分组成：谷氨酸钠150-200g、蛋白胨5-10g、酵母膏1-5g、牛肉膏3-10g、NaCl 2-5g，琼脂15-20g，蒸馏水定容至1L，pH7.0。
如谷氨酸唯一碳源培养基由下述成分组成：谷氛酸钠5-10g、(NH4)2SO40.5-2.5g、K2HPO4 0.5-2.5g、KH2PO4 0.1-0.8g、MgSO4 0.5-5g、FeSO4 1-10mg、MnSO4 1-10mg、硫胺素0.05-0.2mg、生物素0.01-0.1mg，水洗琼脂15-20g，蒸馏水定容至1L，NaOH调pH7.0。
如选育琥珀酸敏感型菌株所用培养基由下述成分组成：葡萄糖5-10g、蛋白胨5-10g、酵母膏1-5g、牛肉膏3-10g、NaCl 2-5g、琥珀酸0.1-3g，琼脂15-20g，蒸馏水定容至1L，pH7.0。
如低pH梯度平板由下述成分组成：葡萄糖1-10g、蛋白胨5-10g、酵母膏1-5g、牛肉膏3-10g、NaCl 2-5g、琼脂15-20g，蒸馏水定容至1L，灭菌后用谷氨酸调节pH 4.0-5.0。
如高pH梯度平板由下述成分组成：葡萄糖100-150g、K2HPO4 0.5-1.5g、MgSO4 0.5-5g、FeSO4 1-10mg、MnSO4 1-10mg、硫胺素0.01-0.1mg、尿素3-10g、玉米浆1-10g、溴百里香酚兰0.05-0.5g、琼脂15-20g，蒸馏水定容至1L，灭菌后用NaOH调pH 10.0-12.0。
(2)微孔培养板初筛：挑选在平板生长的单菌落，接种于每孔含有0.8-1.2mL种子培养基的微孔培养板，28-35℃摇床培养12-24h后，按5％-10％接种量，转接至每孔含有0.8-1.2mL发酵培养基的微孔培养板，30-35℃摇床培养32-48h，摇床转速是200-300rpm，并在发酵12-24h时，补加质量浓度10％-20％的尿素50-100μL，继续发酵20-36h。微孔培养板中的发酵液通过SBA-40C生物传感分析仪检测谷氨酸产量，选取产量高的菌株进行摇瓶复筛。
采用的微孔培养板是24孔或48孔或96孔或384孔的方形深孔板。
种子培养基由下述成分组成：葡萄糖15-25g、K2HPO4 0.5-2.5g、MgSO40.3-6g、FeSO4 1-10mg、MnSO4 1-15mg、尿素1-3g、玉米浆20-35g，定容至1L，pH 7.0。
发酵培养基由下述成分组成：葡萄糖100-150g、K2HPO4 0.5-1.5g、MgSO40.1-6g、FeSO4 1-5mg、MnSO4 1-5mg、硫胺素0.01-0.1mg、尿素3-10g、玉米浆1-10g，定容至1L，pH 7.0。
(3)摇瓶复筛：将上述产谷氨酸含量高的菌株接种到含10-30mL种子培养基的250mL三角瓶中，28-35℃摇床培养8-12h后，按2.5％-10％转接至含有10-50mL发酵培养基的500mL三角瓶中，同时在发酵培养基中添加0.01-0.1g/L的酸碱指示剂。培养在200-250rpm的旋转式摇床、或90-150rpm的往复式摇床上进行，根据发酵液中指示剂颜色变化，补加质量浓度10％-40％的尿素3-8次，每次加量100-800μL，发酵40-50h，通过SBA-40C生物传感分析仪检测谷氨酸产量，选出高产菌株。
发酵液中葡萄糖以及谷氨酸含量用SBA-40C生物传感分析仪检测：发酵液稀释10-100倍，样品进样量25μL，根据仪器显示数据乘以稀释倍数即为谷氨酸以及葡萄糖含量。
摇瓶中菌体生长用752型紫外可见分光光度计检测：摇瓶中菌液适当稀释后，于分光光度计检测OD660；微孔培养板中菌体生长用酶标仪测定：吸取200μL微孔板中的菌液至新的微孔板中，盖盖后置于酶标仪震荡30s后，利用酶标仪测定OD660。
本发明的有益效果：传统的筛选方法是从平板上挑取单菌落，然后通过试管或小摇瓶发酵初筛，再进行摇瓶发酵复筛。本发明对传统的筛选进行了改良，根据高产谷氨酸菌株的特点，在平板上挑取单菌落，用微孔细胞培养板进行初筛，摇瓶发酵复筛。本发明方法有效地增加了每次筛选的菌落数量，降低筛选工作强度，提高了整个筛选工作的效率。
具体实施方式
实施例1微孔培养板用于发酵产谷氨酸的可行性
将实验室保藏的谷氨酸生产菌SW07-1，该菌株巳在文章“耐温性L-谷氨酸发酵菌种的选育”(生物加工过程，2009，7(6)：74-78)中公开，并应用从斜面划线至LB平板活化24h，接种针挑一环至含有10mL种子培养基的250mL摇瓶，30℃，220rpm培养12h，种子转接到发酵培养基时，在96孔微孔细胞培养板的4个角以及边缘一排和中间部分随机预留一些孔作为无菌空白样对照，而选取11个具有代表性的位置接种作为发酵培养的平行样，以8％的接种量接种至该11个孔，每孔含有1mL发酵培养基。接种后盖上无菌纱布置于摇床30℃，220rpm培养，24h后所有的孔(包括空白样)都补加10％尿素80μL，继续发酵24h后分别检测各孔(包括空白样)的谷氨酸含量，同时利用酶标仪测定各个样品的OD660，考察是否出现染菌情况。结果空白样的OD660均小于0.1，平行样的OD660均大于0.8，故可以认为没有染菌现象。
本实例所用培养基成分如下：种子培养基：葡萄糖25g、K2HPO4 1.5g、MgSO40.6g、FeSO4 5mg、MnSO4 5mg、尿素2.5g、玉米浆30g，定容至1L，pH 7.0。
发酵培养基：葡萄糖140g、K2HPO4 1g、MgSO4 6g、FeSO4 5mg、MnSO4 5mg、硫胺素0.05mg、尿素7g、玉米浆3g，定容至1L，pH 7.0。
用SBA-40C生物传感分析仪直接测定孔板中发酵液的谷氨酸含量，结果显示所有空白样的谷氨酸含量低于10-2g/L，而11个平行样的结果(单位：10-2g/L)如下：55.7、55.1、59.2、59.1、57.7、57.6、61.9、59.4、58.4、56.7、57.4，平均值为58.1，方差s2＝3.60，标准差σ＝1.81，据SBA-40C型生物传感分析仪的工作原理和仪器特性，其相对误差为1％左右，且不大于2％。而本实验中各个孔之间的相对误差为2.48％，排除仪器误差后只有0.48％，表明96孔培养板能够较稳定的反应出菌种的产酸情况。
实施例2用抗性平板-微孔培养板对X射线诱变后菌株的筛选
选择平板组成：葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母膏5g、牛肉膏10g、NaCl 5g、磺胺胍20g、酮基丙二酸2.5g、丙二酸16g、香豆素2g、琼脂20g，定容至1L，pH7.0。
种子培养基：葡萄糖25g、K2HPO4 1.5g、MgSO4 0.6g、FeSO4 5mg、MnSO45mg、尿素2.5g、玉米浆30g，定容至1L，pH 7.0。
发酵培养基：葡萄糖140g、K2HPO4 1g、MgSO4 6g、FeSO4 5mg、MnSO4 5mg、硫胺素0.05mg、尿素7g、玉米浆3g，定容至1L，pH 7.0。
将实验室保存的谷氨酸生产菌株SW07-1，用X射线诱变40min获得突变菌库。将诱变后的菌悬液涂布至选择平板，30℃培养3天，挑出平板上长出的菌落共89个，分别接种至含有1mL种子培养基的微孔细胞培养板的96孔中(其中孔A1、B1为原始菌对照)，30℃，220rpm培养24h后，以8％接种量转接至每孔含1mL发酵培养基的96孔微孔细胞培养板中，30℃，220rpm培养24h后，每孔补加10％的尿素80μL，继续32℃，250rpm培养24h发酵结束。SBA-40C生物传感分析仪检测各孔中发酵液的谷氨酸含量(单位：10-2g/L)，其中21株高于对照数据，结果如表1。
表1X射线诱变后抗性突变株96孔微孔细胞培养板结果
实施例3-4用pH耐受平板-微孔培养板对诱变后菌株的筛选
将实验室保存的谷氨酸生产菌株SW07-1，用X射线诱变40min获得突变菌库。将诱变后的菌悬液分别涂布至于低pH梯度平板和高pH梯度平板，30℃培养3天。
其中，低pH梯度平板由下述成分组成：葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母膏5g、牛肉膏10g、NaCl 5g、琼脂20g，定容至1L，灭菌后用谷氨酸调节pH4.6-5.0。
高pH梯度平板由下述成分组成：葡萄糖140g、K2HPO4 1g、MgSO4 6g、FeSO45mg、MnSO4 5mg、硫胺素0.05mg、尿素7g、玉米浆3g、溴百里香酚兰0.1g、琼脂20g，定容至1L，灭菌后用NaOH调pH为10.5-11.2。
挑选在低pH梯度平板上生长单菌落126个，在高pH平板生长单菌落280个。将这406个菌落，按实施例2的方法接种到96孔微孔细胞培养板进行初筛，分别得到9株和41株谷氨酸产量较对照菌株高的菌株。
实施例5对微孔细胞培养板初筛菌株的摇瓶复筛
微孔细胞培养板初筛得到的菌株71株菌株，经LB平板培养24h后，进行摇瓶发酵实验。将菌株接种至含10mL种子培养基(种子培养基、发酵培养基成分同实施例2)的250mL摇瓶中，且发酵摇瓶有2个平行样，30℃，220rpm培养8h，8％接种量转接至含0.01％中性红的发酵培养基，发酵过程中菌体先产碱后产酸，发酵液由最初的红色变成黄色再变成红色，当发酵液再次变红时(约发酵8～10h)，每2h补加适量尿素维持pH7.0左右，直至残糖小于1g/L(约发酵40～48h)。
摇瓶发酵液稀释100倍后通过SBA-40C生物传感分析仪检测谷氨酸及葡萄糖含量。结果有13株突变株的产酸量及糖酸转化率高于对照菌株。
这13株菌连续转接6代后，再进行如上所述的摇瓶发酵试验。结果见表2(表中数据为两个平行样的平均值)。其中编号为D-2-2、D-2-3、D-2-17、G-6-13、G-6-32、G-7-2、X-43菌株的产量仍高于对照菌株。
表2连续传代后菌株的产谷氨酸
实施例6微孔细胞培养板中低产酸菌株的摇瓶检验
从实施例2-4的96孔微孔细胞培养板中产酸少于对照株的负突变株中，随机选取15株，编号为-1、-2、-3、到-15。按实施例5的方法进行摇瓶发酵试验，结果见表3(表中数据为两个平行样的平均值)，负突变组的15株菌产量均少于原菌，说明利用微孔板发酵筛选谷氨酸高产菌的方法出现漏筛的可能小。
表3负突变株的摇瓶发酵结果
| 菌号 | SW07-1(对照) | -1 | -2 | -3 | -4 | -5 | -6 | -7 |
| 谷氨酸产量(g/L) | 64.25 | 27.30 | 15.15 | 38.55 | 1.30 | 15.65 | 4.80 | 15.60 |
| 菌号 | -8 | -9 | -10 | -11 | -12 | -13 | -14 | -15 |
| 谷氨酸产量(g/L) | 11.60 | 1.80 | 7.45 | 16.75 | 21.10 | 6.95 | 0.55 | 0.40 |
Claims (7)
1.一种高通量筛选谷氨酸高产菌株的方法，其特征在于：
(1)从自然界分离或通过人工改造的谷氨酸产生菌样品，涂布到选择平板，28-35℃培养48-72h；
(2)微孔培养板初筛：挑选在平板生长的单菌落，接种到含种子培养基的微孔培养板，28-35℃摇床培养12-24h，转接至含发酵培养基的微孔培养板，28-35℃摇床培养32-48h，测定液体中谷氨酸的含量；
(3)摇瓶复筛：将上述产谷氨酸含量高的菌株接种到含种子培养基的摇瓶中，28-35℃摇床培养8-12h后，转接至含发酵培养基的摇瓶发酵40-50h，检测发酵液中谷氨酸含量，选出高产菌株。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的选择平板，平板培养基是含有限制因素的选择性平板，筛选限制因素为：高糖，或高谷氨酸，或谷氨酸唯一碳源、或抗性：磺胺胍、酮基丙二酸、丙二酸、香豆素抗性，或琥珀酸敏感型，或营养缺陷型：异亮氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸缺陷型，或低pH耐受性，或高pH耐受性。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述种子培养基由下述成分组成：葡萄糖15-25g、K2HPO4 0.5-2.5g、MgSO4 0.3-6g、FeSO4 1-10mg、MnSO41-15mg、尿素1-3g、玉米浆20-35g，定容至1L，pH 7.0。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵培养基由下述成分组成：葡萄糖100-150g、K2HPO4 0.5-1.5g、MgSO4 0.1-6g、FeSO4 1-5mg、MnSO41-5mg、硫胺素0.01-0.1mg、尿素3-10g、玉米浆1-10g，定容至1L，pH 7.0。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于用微孔培养板初筛时，采用的微孔培养板是24孔或48孔或96孔或384孔的方形深孔板，装液量为0.8-1.2mL，发酵培养的接种量是5％-10％，摇床转速是200-300rpm，并在发酵培养12-24h时，补加质量浓度10％-20％的尿素50-100μL，继续发酵20-36h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于摇瓶复筛时，种子培养采用250mL三角瓶，装液量10-30mL；发酵培养采用500mL三角瓶，装液量10-50mL，接种量2.5％-10％，培养在200-250rpm的旋转式摇床、或90-150rpm的往复式摇床上进行，根据发酵液中指示剂颜色变化，补加质量浓度10％-40％的尿素3-8次，每次加量100-800μL，发酵40-50h后，检测发酵液中谷氨酸含量。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述发酵培养基，在摇瓶发酵时，发酵培养基中添加0.01-0.1g/L的酸碱指示剂，酸碱指示剂选用酚红、中性红、甲酚红或溴甲酚紫。
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2010
- 2010-01-12 CN CN201010018137A patent/CN101735971A/zh active Pending
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