CN112213501A - 一种定量检测***的荧光微球免疫层析试纸及其制备方法和检测方法 - Google Patents

一种定量检测***的荧光微球免疫层析试纸及其制备方法和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种定量检测***的荧光微球免疫层析试纸及其制备方法和检测方法，包括PVC底板，所述PVC底板上沿长度方向依次粘贴有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，所述硝酸纤维素膜上靠近所述结合垫侧设有测试线，所述硝酸纤维素膜上靠近所述吸水纸侧设有质控线，所述结合垫含有***抗体‑荧光微球偶联物；所述测试线上含有***包被抗原；所述质控线上被有羊抗鼠IgG抗体。本发明的定量检测***的荧光微球免疫层析试纸及其制备方法，以商品化的荧光微球为标记物，制备方便，荧光信号稳定，具有良好的抗有机溶剂能力，而且检测灵敏度高。

Description

一种定量检测***的荧光微球免疫层析试纸及其制备方 法和检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种利用荧光微球作为信号放大材料检测***的免疫层析试纸、其制备方法和检测方法。
背景技术
***外用可以降低毛细血管的通透性，减少渗出和细胞浸润，具有强大的抗炎、抗过敏、免疫抑制和抗增生的作用，因此在皮肤科临床上广泛使用。在养殖业方面，可以促进动物的非正常生长，可以大幅提高动物养殖的经济效应，所以在养殖业中被大量使用。但是滥用***会使其在动物组织中及奶制品中存在不同程度的残留，人体食用后会导致机体代谢紊乱和发育异常等状况，存在致癌、致畸的风险。对于一些功能食品、保健品甚至是一些中药材，不法商贩通过非法添加糖皮质类激素，消费者在食用后短期会出现一些积极作用，若长期食用则会引起内分泌失调、致畸、致癌、致突变、水肿、糖尿病等不良反应。另在化妆品方面，由于糖皮质类激素可以抑制细胞增生，减少5-羟色胺的形成，从而对皮肤有一定的嫩白作用。近年来，有许多不法化妆品生产厂家利用了糖皮质类激素的这一特点，在许多嫩肤、美白化妆品中非法添加糖皮质类激素，消费者在使用了这些化妆品之后见效非常快，但在长期使用后，就是造成人体皮肤变薄、毛细血管扩张和毛囊萎缩，从而使皮肤出现干燥脱皮、红血丝和色素沉着等现象，一旦停用后就会出现瘙痒、红肿、丘疹等症状。轻度受害者会让皮肤恢复到使用前状态，中度受害者会出现激素依赖性皮炎症状，重度受害者则会造成更严重的后果比如类固醇性糖尿病、骨坏死和骨质疏松、精神失常、消化性溃疡和高血压等等疾病。
目前，基于抗原抗体特异性识别的免疫学快速检测，如酶联免疫分析方法、胶体金免疫层析法因简便、快速及低成本等，已经被越来越多的用于食品及化妆品风险物质的现场速测。据统计，2016年，仅我市政府监管部门开展的食品、化妆品现场速测就超过50万批次，有效拦截风险样品超2000批次。然而***却缺乏有效的现场快检方，原因在于现有检测方法灵敏度不足，假阴性较高。***是效价较强的激素，在动物养殖中带入到动物肌肉中的***往往只有ppb级甚至ppt级的痕量残留，而现有快检方法无法满足要求。
荧光微球是由高质量的CdSe/ZnS量子点和生物相容性高分子通过自组装的方式制备得到，通过纳米球包覆将量子点的荧光信号放大，可以明显提高免疫检测灵敏度，也解决量子点不稳定的问题，基于荧光微球的检测***的免疫层析试纸条尚未见报道。
发明内容
针对上述提到的现有技术的传统免疫分析技术灵敏度不足，不能足以检测动物源样品中ppb级甚至ppt级痕量残留的***的问题，本发明提供一种利用荧光微球作为信号放大材料检测***的免疫层析试纸、其制备方法和检测方法，具有良好的抗有机溶剂能力，灵敏度高，前处理简单，设备轻便易于携带，实验环境要求低，操作简单等优点，作为现场定量方法，具有显著优势。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
一种定量检测***的荧光微球免疫层析试纸，包括PVC底板，所述PVC底板上沿长度方向依次粘贴有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，所述硝酸纤维素膜上靠近所述结合垫侧设有测试线，所述硝酸纤维素膜上靠近所述吸水纸侧设有质控线，所述结合垫含有***抗体-荧光微球偶联物；所述测试线上含有***包被抗原；所述质控线上被有羊抗鼠IgG抗体。
本发明解决其技术问题采用的技术方案进一步还包括：
如上所述的一种定量检测***的荧光微球免疫层析试纸，所述***包被抗原的浓度为2.0-2.5mg/mL，所述羊抗鼠IgG的浓度为0.3-0.4mg/mL。
如上所述的一种检测***的荧光微球免疫层析试纸，所述荧光微球的直径为150-160nm，其激发波长为505nm，其发射波长分别为515nm。
一种如上任一所述的荧光微球免疫层析试纸的制备方法，包括以下步骤：
S01，制备***抗体-荧光微球偶联物；
S02，在结合垫上喷涂S01制备的***抗体-荧光微球偶联物，于室温真空干燥12h；
S03，将样片垫浸泡于20mmol/L，pH 7.4，含1.0％BSA，0.25％Tween-20、1％PVP K-40、0.5％PEG 40000和0.1％NaN3的磷酸缓冲液中，于60℃干燥2h；
S04，在硝酸纤维素膜上喷涂***包被抗原的测试线和羊抗鼠IgG抗体，于37℃真空干燥12h；
S05，将吸水纸、步骤S04中得到的硝酸纤维素膜、步骤S02中得到的结合垫和经过步骤S03预处理的样本垫按顺序粘贴在PVC底板上，用自动切条机切成4mm宽的试纸条，于室温条件下真空干燥。
如上所述的荧光微球免疫层析试纸的制备方法，步骤S01中制备***抗体-荧光微球偶联物包括以下步骤：
S011，将荧光微球、EDC、NHS按照1：1：1的比例投料，并加入1000倍质量的去离子水，活化过夜；
S012，将得到的溶液离心后除去上清液，将得到的固体用pH7.4的0.01mol/LPBS溶液重悬；
S013，加入***抗体，反应12h；
S014，将得到的液体离心后除去上清液，将得到的固体用含1％BSA、2％蔗糖、0.05％PEG 20000、0.1％proclin 300的pH7.4 0.01M PBS溶液重悬。
如上所述的荧光微球免疫层析试纸的制备方法，步骤S013中加入的所述***抗体与荧光微球的投料比为1：30-1：100。
一种利用如上所述的荧光微球免疫层析试纸定量检测***的方法，包括以下步骤:
S01，取1g均质的待测动物组织样品，加入6mL质量分数为30％的甲醇水溶液，涡旋震荡2min，在2000g的离心加速下离心5分钟，收集上清液，得到样品液；
S02，取上清液0.1mL滴在如权利要求1-3任一所述的荧光微球免疫层析试纸的样品垫上，反应完全后用荧光免疫层析仪读取所述硝酸纤维素膜上测试线和质控线的荧光强度；
S03，根据上述检测线与控制线荧光强度的比值F＝T/C计算F/Fo，再根据F/Fo值和标准曲线得出待测样品中***的浓度。
如上所述的定量检测***的方法，步骤S02中样品与荧光微球免疫层析试纸的反应时间大于8min。
如上所述的定量检测***的方法，***的检测浓度范围为0.7-58.8μg/kg。
本发明的有益效果是：本发明的定量检测***的荧光微球免疫层析试纸及其制备方法，以商品化的荧光微球为标记物，制备方便，荧光信号稳定，具有良好的抗有机溶剂能力，而且检测灵敏度高；利用本发明的荧光微球免疫层析试纸的***检测方法，前处理方法简单，设备轻便易于携带，无需大型实验设备辅助，实验环境要求低，具有较好的特异性，整个检测过程只需15min，能够弥补动物源性食品中***现场快速检测技术的短板。
下面将结合附图和具体实施方式对本发明做进一步说明。
附图说明
图1为本发明荧光微球免疫层析试纸较优实施例的结构示意图；
图2为本发明荧光微球免疫层析试纸与不同浓度的***标准溶液反应在暗室下使用980nm LED激发，用手机摄像头覆盖540±25nm滤光片记录的观察结果；
图3为本发明荧光微球免疫层析试纸的***的荧光免疫层析标准曲线；
图4为发明的荧光微球免疫层析试纸与***反应时检测线和质控线的动态变化曲线；
图中，1、样品垫，2、结合垫，3、硝酸纤维素膜，4、PVC底板，5、吸水纸，6、检测线，7、质控线。
具体实施方式
本实施例为本发明优选实施方式，其他凡其原理和基本结构与本实施例相同或近似的，均在本发明保护范围之内。
实施例1制备定量检测***的荧光微球免疫层析试纸
1、***抗体-荧光微球偶联物的制备。分别取0.6mg的荧光微球、0.6mg的EDC、0.6mg的NHS加入1000倍质量的去离子水，活化过夜后，以2000g的离心加速下离心10min，弃上清液，用pH7.4的0.01mol/LPBS溶液重悬，加入0.2mg***抗体混合均匀，反应12h后，在2000g的离心加速下离心10min，弃上清液，用含1％BSA、2％蔗糖、0.05％PEG 20000、0.1％proclin 300的pH7.4 0.01M PBS溶液重悬后于4℃储存备用。
2、***抗体-荧光微球偶联物喷涂到结合垫上。将制备的***抗体-荧光微球偶联物喷涂到结合垫上，喷涂量为15-20μL/cm，然后室温真空干燥12h，密封。
3、硝酸纤维素膜上的抗原包被。将浓度2.5mg/mL的***和0.3mg/mL的羊抗鼠IgG抗体分别喷涂在同一硝酸纤维素膜上，检测线和质控线之间间隔3.5mm，喷涂量为1μL/cm，37℃真空干燥12h，密封。
4、样品垫处理。将样品垫于20mmol/L，pH 7.4，含1.0％BSA，0.25％Tween-20、1％PVP K-40、0.5％PEG 40000和0.1％NaN3的磷酸缓冲液中浸泡30min，取出后于60℃干燥2h，密封。
5、组装试纸。参照图1所示，试纸设有PVC底板，PVC底板上沿长度方向依次粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，然后用自动切条机切成4mm宽度，于室温下真空干燥2h，密封备用。
实施例2建立标准曲线
配置一系列浓度(0ng/mL、0.1ng/mL、0.4ng/mL、1.6ng/mL、8.4ng/mL)的***标准溶液。取0.1mL标准溶液滴在实施例1制备的试纸样片垫上，10min后，在按时下使用980nmLED激发，用手机(华为荣耀8)摄像头覆盖540±20nm滤光片对试纸进行观察记录，结果如图2所示，在0.1ng/mL***可将试纸条T线荧光强度抑制到等同于C线，为该试纸的最低检测灵敏度。在8.4ng/mL时T线几乎不可见，为线性范围的最高值。
基于上述条件，利用免疫层析荧光度数仪进一步测量试纸上检测线和质控线的荧光值，得到检测线和质控线上荧光强度比值(FIT/FIC)作为纵坐标，然后以***的浓度作为很坐标，建立如图3所示的标准曲线，回归方程为y＝－0.18ln x+0.92(R 2＝0.99)。以线性范围的最低点0.1ng/mL和最高值8.4ng/mL，得到相应的最低检出限为0.7μg/kg，最高检出限位58.8μg/kg。
实施例3样品检测和结果分析
在市场上采购动物组织样品100份(肝脏和肉各50份)，每份样品取1g均质的待测动物组织，加入6mL质量分数为30％的甲醇水溶液，涡旋震荡2min，2000g离心力离心5分钟，收集上清液，得到样品液。取0.1mL滴加至试纸的样品垫，10min后测量试纸上检测线和质控线的荧光值，根据对应的荧光值和标准曲线计算出样品中是否含有***及其含量。
同时，国标GB/T 20741-2006畜禽肉中***残留量测定液相色谱-串联质谱法所规定的方法对同样的100份样品进行对比检验。本试纸条结果为***未检出的93个样本，国标法也为***未检出。本试纸检测结果为阳性的7个样本，有3个国标法为***未检出，其中的一个检出倍他米松，另外两个不符合样品原因不明，4个荧光微球免疫层析法和国标法均检出的样品定量对比如图3所示。可以看出，对于低含量的样本，利用荧光微球免疫层析试纸定量检测***方法的定量结果于国标法的吻合度较好，对于高含量的样本，由于甲醇水提取效率的原因，荧光微球免疫层析试纸的定量结果低于国标法。
实施例4免疫层析反应时间测定和分析
用空白的蒸馏水和1.6ng/mL的***标准溶液做10分钟动态反应试验。实验结果如图4所示，免疫层析反应在8分钟时达到平衡，T线的荧光值与C线的荧光比值不发生显著变化。因此，试纸在反应8分钟后即可进入荧光免疫层析扫描仪读数。
实施例5特异性分析实验
按照实施例2中的方法，将如表1所示的二十五种糖皮质激素应用于实施例制备的试纸检测中，同时利用ELISA法进行交叉反应率的对比检验，结果如
表1所示。
Figure BDA0002713626020000081
从表1中可以看出荧光微球免疫层析试纸的检测结果与ELISA法基本相符，试纸的特异性良好，只与少数几种醋酸***、倍他米松、倍氯米松等***类似物有一定的交叉反应，在试纸条检测的样品为阳性结果需要仪器确证时，需要同时检测表1所示有交叉反应的药物。
本发明的定量检测***的荧光微球免疫层析试纸及其制备方法，以商品化的荧光微球为标记物，制备方便，荧光信号稳定，具有良好的抗有机溶剂能力，灵敏度高；利用本发明的荧光微球免疫层析试纸的***检测方法，前处理方法简单，设备轻便易于携带，无需大型实验设备辅助，实验环境要求低，具有较好的特异性，整个检测过程只需15min，能够弥补动物源性食品中***现场快速检测技术的短板。

Claims (9)

1.一种定量检测***的荧光微球免疫层析试纸，包括PVC底板，所述PVC底板上沿长度方向依次黏贴有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，所述硝酸纤维素膜上靠近所述结合垫侧设有测试线，所述硝酸纤维素膜上靠近所述吸水纸侧设有质控线，其特征在于，所述结合垫含有***抗体-荧光微球偶联物；所述测试线上含有***包被抗原；所述质控线上被有羊抗鼠IgG抗体。
2.如权利要求1所述的定量检测***的荧光微球免疫层析试纸，其特征在于，所述***包被抗原的浓度为2.0-2.5mg/mL，所述羊抗鼠IgG的浓度为0.3-0.4mg/mL。
3.如权利要求1所述的定量检测***的荧光微球免疫层析试纸，其特征在于，所述荧光微球的直径为140-170nm，其激发波长为505nm，其发射波长分别为515nm。
4.一种采用如权利要求1-3任一所述的荧光微球免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:
S01，制备***抗体-荧光微球偶联物；
S02，在结合垫上喷涂S01制备的***抗体-荧光微球偶联物，于室温真空干燥12h；
S03，将样片垫浸泡于20mmol/LpH为7.4，含1.0％BSA，0.25％Tween-20、1％PVP K-40、0.5％PEG 40000和0.1％NaN3的磷酸缓冲液中，于60℃干燥2h；
S04，在硝酸纤维素膜上喷涂***包被抗原的测试线和羊抗鼠IgG抗体，于37℃真空干燥12h；
S05，将吸水纸、步骤S04中得到的硝酸纤维素膜、步骤S02中得到的结合垫和经过步骤S03预处理的样本垫按顺序粘贴在PVC底板上，用自动切条机切成4mm宽的试纸条，于室温条件下真空干燥。
5.一种如权利要求4所述的荧光微球免疫层析试纸的制备方法，其特征在于，步骤S01中制备***抗体-荧光微球偶联物包括以下步骤：
S011，将荧光微球、EDC、NHS按照1：1：1的比例投料，并加入1000倍质量的去离子水，活化过夜；
S012，将得到的溶液离心后除去上清液，将得到的固体用pH7.4的0.01mol/LPBS溶液重新悬浮；
S013，加入***抗体，反应12h；
S014，将得到的液体离心后除去上清液，将得到的固体用含1％BSA、2％蔗糖、0.05％PEG 20000、0.1％proclin 300的pH7.4 0.01M PBS溶液重新悬浮。
6.如权利要求5所述的定量检测***的荧光微球免疫层析试纸，其特征在于，步骤S013中加入的所述***抗体与荧光微球的投料比为1：30-1：100。
7.一种利用如权利要求1-3任一所述的荧光微球免疫层析试纸定量检测***的方法，其特征在于，包括以下步骤:
S01，取1g均质的待测动物组织样品，加入6mL质量分数为30％的甲醇水溶液，涡旋震荡2min，在2000g的离心加速下离心5分钟，收集上清液，得到样品液；
S02，取上清液0.1mL滴在如权利要求1-3任一所述的荧光微球免疫层析试纸的样品垫上，反应完全后用荧光免疫层析仪读取所述硝酸纤维素膜上测试线和质控线的荧光强度；
S03，根据上述检测线与控制线荧光强度的比值F＝T/C计算F/Fo，再根据F/Fo值和标准曲线得出待测样品中***的浓度。
8.如权利要求7所述的荧光微球免疫层析试纸定量检测***的方法，其特征在于，步骤S02中样品与荧光微球免疫层析试纸的反应时间大于8min。
9.如权利要求7所述的荧光微球免疫层析试纸定量检测***的方法，其特征在于，***的检测浓度范围为0.7-58.8μg/kg。
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