CN109655435A - 一种检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸及其制备方法与应用 - Google Patents

一种检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于免疫测定技术方法领域，具体涉及一种检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸及其制备方法与应用。该荧光淬灭试纸包括样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和PVC底板，其结合垫上喷涂有胶体金颗粒标记的OA单抗，硝酸纤维素膜上的检测线为荧光微球与OA‑BSA的混合液，质控线为荧光微球。该荧光淬灭试纸特异性强，没有交叉反应，其灵敏度为1.56ppb，与同参数胶体金试纸相比提高9.6倍，其检测限为3.12～50ppb，检测时间短至9min。所得荧光淬灭试纸对贝肉组织的干扰具有很高的稳定性，通过配合简易的荧光免疫层析照相仪及数据分析软件就能够达到对OA毒素的定量，其结果判断直观，不容易导致非专业人员的误判，具有巨大的发展和应用前景。

Description

一种检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于免疫测定技术方法领域，具体涉及一种检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸及其制备方法与应用。
背景技术
藻类生物毒素是继细菌、寄生虫、病毒和化学污染物之后另一个威胁海产品食用安全的重要因素，其中，腹泻性贝类毒素(DSP)是一类大环内酯类或聚醚类化合物，在全球海域中均有分布。误食了被DSP污染的贝类会引起胃肠紊乱，出现恶心、腹痛、腹泻、呕吐等症状。大田软海绵酸(OA)是DSP的主要成分，我国2001年规定，水产品中OA安全标准为20μg/100g可食组织，2006年规定无公害水产品OA不得检出。
目前，赤潮毒素的检测方法主要有生物、化学和免疫分析法等。生物分析法应用广泛和操作简单，但测量结果重复性差、灵敏度低。化学分析法如高效液相色谱法，其灵敏度高、检出限低，能实现毒素定性和定量分析，但是该法的样品前处理复杂，如毒素DSP必须经衍生才能检测，衍生后的产物不稳定，容易造成检测结果误差。为克服这一缺陷，色谱-质谱联用技术逐渐成为检测海洋毒素的潮流，但该分析法需要的仪器昂贵，只能在实验室检测，这些因素限制了该方法的广泛应用。基于抗原-抗体反应检测的酶联免疫分析法具有高特异性和高灵敏度的特点，分析过程中无需样品前处理，但检测过程需要进行酶反应的比色检测，检测过程长达数小时且检测过程仍需要实验室环境，无法满足现场快速分析检测的要求。胶体金免疫侧向层析技术具有快速、方便，能够达到现场分析的要求，但胶体金免疫侧向层析法仍存在一些不足。首先，该法的检测结果是非直观的，即T线出现信号表示结果为阴性，反之为阳性，这样很容易导致非专业人员的误判且不能定量，其次，胶体金免疫侧向层析试纸条判断结果为阳性的标准是T线不能观察到信号，即需要较大量的待测物浓度才能使T线完全没有信号出现，这较大程度的影响了试纸条的灵敏度。
发明内容
为克服现有技术的缺点和不足，本发明的首要目的在于提供一种直观高灵敏度的检测大田软海绵酸(OA)的荧光淬灭试纸。
本发明的另一目的在于提供上述检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述荧光淬灭试纸的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸，以PVC为底板，其上依次连接样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，各部分在相邻处重叠，结合垫上喷涂有胶体金颗粒标记的OA单抗，硝酸纤维素膜的平面中设置有检测线和质控线，检测线为荧光微球与OA-BSA的混合液，质控线为荧光微球；
其中，OA-BSA为OA与牛血清白蛋白(BSA)偶联得到的检测完全抗原。
上述检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸的制备方法，包括以下步骤：
(1)OA人工抗原的制备
用将OA与牛血清白蛋白(BSA)进行偶联，将产物用PBS(磷酸盐缓冲液)稀释，得到检测完全抗原OA-BSA；
(2)样品垫的处理
将BSA、PEG4000、PVP40000和Tween-20加至PBS中，得到样品垫处理液，将样品垫浸泡于样品垫处理液中，干燥；
(3)结合垫的处理
用胶体金溶液标记OA单抗，得到金标抗体复合物，将金标抗体复合物喷涂于结合垫上，干燥；
(4)硝酸纤维素膜的处理
将步骤(1)制备的检测完全抗原OA-BSA用PBS稀释，得到OA-BSA完全抗原稀释液；制备超纯水复溶沉淀荧光微球-BSA(FM-BSA)，用PBS稀释，得到FM-BSA稀释液；再将OA-BSA完全抗原稀释液与FM-BSA稀释液混合，得到荧光微球与OA-BSA的混合液，划膜于硝酸纤维素膜的T线上；
将所述FM-BSA稀释液划膜于硝酸纤维素膜的C线上；
(5)试纸的制备
在PVC底板上，依次粘贴步骤(2)制备的样品垫、步骤(3)制备的结合垫、步骤(4)制备的硝酸纤维素膜和吸水纸，各部分在相邻处重叠，即得到所述的检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸。
步骤(1)中所述的检测完全抗原OA-BSA优选如下：浓度为0.8～1.2mg/mL，偶联比为10:1～12:1；更优选如下：浓度为1.0mg/mL，偶联比为10:1。
步骤(2)中所述的样品垫处理液中的各物质质量分数优选为BSA 1～3％、PEG40001～3％、PVP40000 1～3％、Tween-20 1～3％和PBS余量，上述物质总计为100％。
步骤(3)中所述的OA单抗优选通过如下步骤制备得到：用活泼酯法将OA与人的免疫球蛋白进行偶联，所得产物用PBS稀释，得到免疫抗原OA-IgG，用免疫抗原OA-IgG免疫小鼠，取免疫后小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞(sp2/0)融合，筛选出稳定分泌OA单抗的细胞株，再用腹水法制备OA单抗，纯化，得到纯化的OA单抗；
所述的免疫抗原OA-IgG优选如下：浓度为0.8～1.2mg/mL，偶联比为10:1～12:1；更优选如下：浓度为1.0mg/mL，偶联比为11:1；
所述的OA单抗的浓度优选为2.0～3.0mg/mL，更优选为2.39mg/mL。
步骤(3)中所述的胶体金溶液的制备方法优选为：将100mL双蒸水与0.5～1.5mL浓度为质量百分比1％的氯金酸溶液混合，加热沸腾，然后加入1～3mL浓度为质量百分比1％的柠檬酸三钠溶液继续沸腾，当溶液的颜色由黑色变为酒红色时停止搅拌，静置冷却至室温即得；所述胶体金溶液中的胶体金粒径为20nm。
步骤(3)中所述的胶体金溶液在标记OA单抗之前，优选先用K2CO3溶液调节pH值，调节方法为每毫升胶体金溶液中加入8μL浓度为250mM的K2CO3溶液，然后再标记OA单抗。
步骤(3)中所述的用胶体金溶液标记OA单抗的方法优选为将胶体金溶液与OA单抗混合，室温下静置。
步骤(3)中所述的用胶体金溶液标记OA单抗的标记量优选为每毫升胶体金溶液标记4μLOA单抗。
步骤(3)中所述的将金标抗体复合物喷涂于结合垫上时，金标抗体的喷量优选为0.8～2μL/cm；更优选为1.6μL/cm。
步骤(4)中所述的超纯水复溶沉淀FM-BSA的制备方法优选为，将荧光微球(FM)与超纯水混合，加入EDC和NHS，避光反应30min，再加入BSA，封闭1h，离心，即得到所述的超纯水复溶沉淀FM-BSA。
步骤(1)、步骤(2)和步骤(4)中所述的PBS优选为：15mmol/L，pH＝7.4。
步骤(4)中所述的OA-BSA完全抗原稀释液的浓度优选为0.1～0.6μg/mL，更优选为0.5μg/mL。
步骤(4)中所述的将超纯水复溶沉淀FM-BSA稀释的倍数优选为600倍。
步骤(4)中所述的荧光微球与OA-BSA的混合液中，OA-BSA的浓度优选为0.3mg/mL。
本发明进一步提供上述荧光淬灭试纸在检测大田软海绵酸中的应用。
本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：
本发明制备的荧光淬灭试纸特异性强，没有交叉反应，其灵敏度为1.56ppb，与同参数胶体金试纸相比提高9.6倍，其检测限为3.12～50ppb，检测时间短至9min。所得荧光淬灭试纸对贝肉组织的干扰具有很高的稳定性，通过配合简易的荧光免疫层析照相仪及数据分析软件就能够达到对OA毒素的定量，其结果判断直观，不容易导致非专业人员的误判，具有巨大的发展和应用前景。
附图说明
图1为应用实施例的(1)中滴加OA标准品稀释液的试纸条的照片图；其中图(a)为荧光免疫层析照相仪拍摄的照片，图(b)为自然光下拍摄的照片。
图2为应用实施例的(1)中FT/FC与OA浓度变化的拟合直线图。
图3为应用实施例的(2)中FT/FC随检测时间的变化曲线图；其中曲线1为滴加0ng/mL的OA标准品，曲线2为滴加25ng/mL的OA标准品。
图4为应用实施例的(3)中滴加不同检测样品的试纸条的荧光免疫层析照片。
图5为应用实施例的(3)中FT/FC随不同检测样品变化的柱状图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明，但本发明的实施方式不限于此。对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。
下列实施例中使用的OA单克隆抗体除了按照所述制备方法可获得外，也可从深圳三方圆生物科技有限公司获得。
实施例1
本实施例提供一种检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸及其制备方法。
(1)OA人工抗原的制备
取4mg OA、0.62mg NHS(N-羟基丁二酰亚胺，购自MACKLIN(麦克林))和1.14mg DCC(N,N-双环乙烷碳二亚胺，购自MACKLIN(麦克林))于240μL的DMF(N,N-二甲基甲酰胺，购自MACKLIN(麦克林))中混匀，室温孵育2h，之后将160μL的反应液加入3.8mg BSA(购自SIGMA公司，溶于200μL 0.1moL/L NaHCO3)，另外将80μL的反应液加入3mg IgG(购自YESEN(翊圣生物)，溶于200μL 0.1moL/L NaHCO3)，室温继续孵育2h，未反应的小分子及副产物用超滤离心管(10K)超滤(4℃，8000rpm，15min)去除，超滤离心管用之前需要进行预处理，使用前要用超纯水完全过膜，然后冰浴，之后将水倒出放在冰上预冷，最后加入蛋白液，离心的转速不能太快，开始离心前让离心机预冷至4℃。最终所得的偶联物用适当的PBS溶解，得到浓度为1.0mg/mL的免疫抗原OA-IgG和检测完全抗原OA-BSA，-20℃保存。
(2)OA单克隆抗体的制备
取240μL步骤(1)中得到的免疫抗原OA-IgG与240μL的佐剂(弗氏完全佐剂CFA)进行乳化，然后以100μL/只的注射量在小鼠(Balb/c雌鼠，购自南方医科大学动物实验中心，鼠龄6周龄)的背部和四肢皮下多点注射进行首次免疫。21天后，取240μL步骤(1)中得到的免疫抗原OA-IgG与240μL的佐剂(弗氏不完全佐剂IFA)进行乳化，再以100μL/只的注射量在上述小鼠的背部和四肢皮下多点注射进行第二次免疫(加强免疫)。此后，每隔14天，取上述不完全佐剂IFA乳化的免疫抗原OA-IgG，对上述小鼠以相同的计量和方法进行加强免疫，共3次，且每次加强免疫后10天进行间接ELISA跟踪检测血清效价。免疫3天后，取血清效价高且亲和力较强(IC50值较低的)的小鼠的脾细胞作为细胞融合对象。
取骨髓瘤细胞sp2/0(缺乏雌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT酶)的株)，将上述小鼠的脾细胞(1.08×108个)和sp2/0(2.02×107个)按照5:1的比例混合均匀，滴入细胞融合剂(50％PEG4000)进行细胞融合2min，离心去掉上清液，加入HAT完全培养基中，在细胞培养箱(37℃，5％CO2)中培养5天，期间，对细胞团较大的孔进行全换液，8天后吸取细胞团较大的孔的细胞上清液，通过ELISA法筛选出阳性杂交瘤细胞。采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆化培养，其中，第一次克隆化选用HAT选择培养基，将细胞稀释至10个细胞/mL，置于细胞培养箱(37℃，5％CO2)中培养一周，取OD值高的阳性孔再进行第二次克隆化培养，此时采用完全培养基，培养条件同上。然后取OD值高的阳性孔再进行第三次克隆化培养，仍采用完全培养基，培养条件同上。三次克隆化后形成稳定分泌抗体的单克隆细胞。将克隆化后稳定的细胞株转入细胞培养皿中进行扩大化培养，当细胞长至1×106个时即可对细胞进行冻存。
对Balb/c小鼠腹腔注射500μL的不完全弗氏佐剂，注射完后轻柔小鼠的腹腔，使其均匀。7～14天后，将上述得到的稳定分泌抗体的单克隆细胞注射3只小鼠，每只老鼠注射的细胞量为1×106个/mL，注射体积为500μL。缓慢注射进小鼠腹腔，注射完后轻柔小鼠肚子，使细胞液分散均匀。两周左右观察小鼠腹腔的膨胀情况，抽取腹水，纯化，得到浓度为2.39mg/mL的纯化的OA单抗。
(3)样品垫的处理
制备样品垫处理液，该处理液按质量分数计含有BSA 1％、PEG4000 1％、PVP400003％和Tween-20 1％和PBS余量，将样品垫浸泡于样品垫处理液中24h，干燥，其中，PEG4000、PVP40000和Tween-20购自健阳生物科技有限公司。
(4)结合垫的处理
取250mL三角瓶一个里面装有磁力搅拌子，加100mL双蒸水及1mL质量分数为1％氯金酸溶液，加热沸腾之后加入2mL质量分数为1％柠檬酸三钠溶液继续沸腾30min，溶液的颜色由黑色变为酒红色时停止搅拌，静置冷却至室温后即得到胶体金粒径为20nm的胶体金溶液，于4℃保存。按照每毫升胶体金溶液中加入8μL浓度为250mM的K2CO3溶液调节pH值，然后与等量的OA单抗混合，室温下静置，得到金标抗体复合物，按照1.4μL/cm的喷金量将金标抗体复合物喷涂于结合垫上，干燥。
(5)硝酸纤维素膜的处理
将步骤(1)制备的检测完全抗原OA-BSA用浓度为15mmol/L，pH＝7.4的PBS稀释，得到浓度为0.5μg/mL的OA-BSA完全抗原稀释液；
取100μL荧光微球FM(10mg/mL，Ex 468nm；Em 508nm；购自为度科技)加入到1.5mL的EP管中，再加入400μL超纯水中混匀超声2min，接着加入21.1μL的EDC(碳二亚胺，1mg/mL)和12.7μL的NHS(1mg/mL)混匀，室温避光反应30min，再加入100μL质量分数为10％BSA封闭1h，10000rcf离心40min，去除上清，用1mL超纯水复溶沉淀(FM-BSA)，再用上述PBS稀释至600倍，得到FM-BSA稀释液；将OA-BSA完全抗原稀释液与FM-BSA稀释液混合，得到OA-BSA浓度为0.3mg/mL的荧光微球与OA-BSA混合液，划膜于硝酸纤维素膜的T线上；
将所述FM-BSA稀释液划膜于硝酸纤维素膜的C线上。
(6)试纸的制备
在PVC底板上，沿某一轴向依次粘贴步骤(3)制备的样品垫、步骤(4)制备的结合垫、步骤(5)制备的硝酸纤维素膜和吸水纸，各部分在相邻处重叠，即得到所述的检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸。
实施例2
本实施例提供一种检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸及其制备方法。
(1)OA人工抗原的制备
取4mg OA、0.62mg NHS和1.14mg DCC于240μL的DMF中混匀，室温孵育2h，之后将160μL的反应液加入3.8mg BSA(溶于200μL 0.1moL/L NaHCO3)，另外将80μL的反应液加入3mg IgG(溶于200μL 0.1moL/L NaHCO3)，室温继续孵育2h，未反应的小分子及副产物用超滤离心管(10K)超滤(4℃，8000rpm，15min)去除，超滤离心管用之前需要进行预处理，使用前要用超纯水完全过膜，然后冰浴，之后将水倒出放在冰上预冷，最后加入蛋白液，离心的转速不能太快，开始离心前让离心机预冷至4℃。最终所得的偶联物用适当的PBS溶解，得到浓度为0.8mg/mL的免疫抗原OA-IgG和检测完全抗原OA-BSA，-20℃保存。
(2)OA单克隆抗体的制备
同实施例1。
(3)样品垫的处理
制备样品垫处理液，该处理液按质量分数计含有BSA 1％、PEG4000 1％、PVP400001％和Tween-20 1％和PBS余量，将样品垫浸泡于样品垫处理液中24h，干燥。
(4)结合垫的处理
取250mL三角瓶一个里面装有磁力搅拌子，加100mL双蒸水及1mL质量分数为1％氯金酸溶液，加热沸腾之后加入2mL质量分数为1％柠檬酸三钠溶液继续沸腾30min，溶液的颜色由黑色变为酒红色时停止搅拌，静置冷却至室温后即得到胶体金粒径为20nm的胶体金溶液，于4℃保存。按照每毫升胶体金溶液中加入8μL浓度为250mM的K2CO3溶液调节pH值，然后与等量的OA单抗混合，室温下静置，得到金标抗体复合物，按照0.8μL/cm的喷金量将金标抗体复合物喷涂于结合垫上，干燥。
(5)硝酸纤维素膜的处理
将步骤(1)制备的检测完全抗原OA-BSA用浓度为15mmol/L，pH＝7.4的PBS稀释，得到浓度为0.1μg/mL的OA-BSA完全抗原稀释液；
取100μL荧光微球FM(10mg/mL，Ex 468nm；Em 508nm；购自为度科技)加入到1.5mL的EP管中，再加入400μL超纯水中混匀超声2min，接着加入21.1μL的EDC(1mg/mL)和12.7μL的NHS(1mg/mL)混匀，室温避光反应30min，再加入100μL质量分数为10％BSA封闭1h，10000rcf离心40min，去除上清，用1mL超纯水复溶沉淀(FM-BSA)，再用上述PBS稀释至600倍，得到FM-BSA稀释液；将OA-BSA完全抗原稀释液与FM-BSA稀释液混合，得到OA-BSA浓度为0.3mg/mL的荧光微球与OA-BSA混合液，划膜于硝酸纤维素膜的T线上；
将所述FM-BSA稀释液划膜于硝酸纤维素膜的C线上。
(6)试纸的制备
在PVC底板上，沿某一轴向依次粘贴步骤(3)制备的样品垫、步骤(4)制备的结合垫、步骤(5)制备的硝酸纤维素膜和吸水纸，各部分在相邻处重叠，即得到所述的检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸。
实施例3
本实施例提供一种检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸及其制备方法。
(1)OA人工抗原的制备
取4mg OA、0.62mg NHS和1.14mg DCC于240μL的DMF中混匀，室温孵育2h，之后将160μL的反应液加入3.8mg BSA(溶于200μL 0.1moL/L NaHCO3)，另外将80μL的反应液加入3mg IgG(溶于200μL 0.1moL/L NaHCO3)，室温继续孵育2h，未反应的小分子及副产物用超滤离心管(10K)超滤(4℃，8000rpm，15min)去除，超滤离心管用之前需要进行预处理，使用前要用超纯水完全过膜，然后冰浴，之后将水倒出放在冰上预冷，最后加入蛋白液，离心的转速不能太快，开始离心前让离心机预冷至4℃。最终所得的偶联物用适当的PBS溶解，得到浓度为1.2mg/mL的免疫抗原OA-IgG和检测完全抗原OA-BSA，-20℃保存。
(2)OA单克隆抗体的制备
同实施例1。
(3)样品垫的处理
制备样品垫处理液，该处理液按质量分数计含有BSA 3％、PEG4000 3％、PVP400003％和Tween-20 3％和PBS余量，将样品垫浸泡于样品垫处理液中24h，干燥。
(4)结合垫的处理
取250mL三角瓶一个里面装有磁力搅拌子，加100mL双蒸水及1mL质量分数为1％氯金酸溶液，加热沸腾之后加入2mL质量分数为1％柠檬酸三钠溶液继续沸腾30min，溶液的颜色由黑色变为酒红色时停止搅拌，静置冷却至室温后即得到胶体金粒径为20nm的胶体金溶液，于4℃保存。按照每毫升胶体金溶液中加入8μL浓度为250mM的K2CO3溶液调节pH值，然后与等量的OA单抗混合，室温下静置，得到金标抗体复合物，按照2.0μL/cm的喷金量将金标抗体复合物喷涂于结合垫上，干燥。
(5)硝酸纤维素膜的处理
将步骤(1)制备的检测完全抗原OA-BSA用浓度为15mmol/L，pH＝7.4的PBS稀释，得到浓度为0.6μg/mL的OA-BSA完全抗原稀释液；
取100μL荧光微球FM(10mg/mL，Ex 468nm；Em 508nm；购自为度科技)加入到1.5mL的EP管中，再加入400μL超纯水中混匀超声2min，接着加入21.1μL的EDC(1mg/mL)和12.7μL的NHS(1mg/mL)混匀，室温避光反应30min，再加入100μL质量分数为10％BSA封闭1h，10000rcf离心40min，去除上清，用1mL超纯水复溶沉淀(FM-BSA)，再用上述PBS稀释至600倍，得到FM-BSA稀释液；将OA-BSA完全抗原稀释液与FM-BSA稀释液混合，得到OA-BSA浓度为0.3mg/mL的荧光微球与OA-BSA混合液，划膜于硝酸纤维素膜的T线上；
将所述FM-BSA稀释液划膜于硝酸纤维素膜的C线上。
(6)试纸的制备
在PVC底板上，沿某一轴向依次粘贴步骤(3)制备的样品垫、步骤(4)制备的结合垫、步骤(5)制备的硝酸纤维素膜和吸水纸，各部分在相邻处重叠，即得到所述的检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸。
应用实施例
本实施例提供实施例1制备的荧光淬灭试纸的性能检测。
(1)荧光淬灭试纸的灵敏度和线性范围测定
用PBS将OA标准品稀释为100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL、1.56ng/mL、0.78ng/mL，取80μL的各浓度的标准品稀释液，滴加到试纸条的样品垫中，在荧光免疫层析照相仪(实验室自主设计)激发光下拍照。检测结果如图1中的图(a)所示，可见当试纸条滴加OA标准品浓度为大于1.56ppb时，试纸条T线上的荧光没有被淬灭，检测结果为阳性，当试纸条滴加OA标准品浓度为小于1.56ppb时，试纸条T线上的荧光被完全淬灭，检测结果为阴性。重复4次所测定的结果都一致，因此试纸条的灵敏度确定为1.56ppb。图1中的图(b)是在自然光下试纸条的出线情况。利用Image J分析软件对荧光淬灭试纸条的C/T线上荧光强度分析，以T线荧光强度与C线荧光强度的比值(FT/FC)为纵坐标，以OA浓度为横坐标作图，如图2所示，可见在3.12ppb～50ppb的OA浓度范围内可进行线性拟合，拟合出的线性公式为y＝0.0142x+0.0977，R2＝0.9907，证明试纸条的检测限为3.12～50ppb。
(2)荧光淬灭试纸的检测时间的确定
取2条荧光淬灭试纸，分别滴加0ng/mL和25ng/mL的OA标准品，分别在0min、3min、6min、9min、12min、15min、18min下用荧光免疫层析照相仪拍照并用Image J分析处理数据，以T线荧光强度与C线荧光强度的比值(FT/FC)为纵坐标，以检测时间为横坐标作图，结果如图3所示。可见随着时间的增长，FT/FC值逐渐降低。在滴加25ng/mL的阳性样品时，FT/FC值在第6min时不再变化趋于稳定，在滴加PBS时，FT/FC值在第9min达到最低为零，即完全淬灭，重复4次，检测结果都一致。综合两个样品的检测结果最终确定试纸条检测时间为9min。
(3)荧光淬灭试纸的特异性测定
选用OA和其他4种常见贝类毒素标准品样(GYM、PTX2、SPX1、DA)检测试纸条的特异性，每个标准品样稀释成3个浓度梯度(12.5、25、50ng/mL)进行实验，重复4次。在荧光免疫层析照相仪激发光下拍照，结果如图4所示，利用Image J分析软件对荧光淬灭试纸条的C/T线上荧光强度分析，以T线荧光强度与C线荧光强度的比值(FT/FC)为纵坐标，以不同标准品样为横坐标作图，结果如图5所示。可见荧光试纸条与其他4种贝类毒素标准品样没有交叉反应，说明所制备的荧光淬灭试纸条特异性较好。
(4)荧光淬灭试纸的准确性测定
用绞肉机将100g贝肉捣碎匀浆，准备7支50mL离心管，每支离心管称取5g匀浆的贝肉，然后依次加入0ng、50ng、75ng、100ng、150ng、200ng、250ng的OA标准稀释液，其OA的含量相当于0ng/100g肉组织、1000ng/100g肉组织、1500ng/100g肉组织、2000ng/100g肉组织、3000ng/100g肉组织、4000ng/100g肉组织、5000ng/100g肉组织，之后每支离心管加入10mL的80％甲醇水溶液，振荡混合3min，超声萃取10min，4000rpm/min离心10min，取上清，将沉淀物再用10mL的80％甲醇水溶液萃取离心，两次上清液合并，每管加入等量正己烷脱脂，混匀，静置分层，弃去上层(正己烷层)，下层用20mL氯仿萃取，混匀，分层吸取上层于另一支干净的50mL离心管中，加氯仿萃取，合并两次氯仿层，于50℃水浴氮吹。残余物用1mL甲醇超声溶解，再用PBS稀释至5mL(使甲醇的溶度在20％以下)，最后用荧光淬灭试纸条进行检测。样品中OA含量的理论值为0ng/mL、10ng/mL、15ng/mL、20ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL。结果如表1所示，荧光淬灭试纸条检测中，加标回收率在89.0％-92.8％之间，相对标准偏差在2.3％-4.0％之间，本实验回收率为89.3～92.8％，OA浓度的理论值和检测值的相关系数达到0.9995，说明由贝肉组织引起的干扰程度是恒定的。
表1荧光淬灭试纸的准确性测定结果
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸，以PVC为底板，其上依次连接样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，各部分在相邻处重叠，硝酸纤维素膜的平面中设置有检测线和质控线，其特征在于：结合垫上喷涂有胶体金颗粒标记的OA单抗，检测线为荧光微球与OA-BSA的混合液，质控线为荧光微球；
其中，OA-BSA为OA与牛血清白蛋白偶联得到的检测完全抗原。
2.权利要求1所述的检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)OA人工抗原的制备
用活泼酯法将OA与牛血清白蛋白进行偶联，将产物用PBS稀释，得到检测完全抗原OA-BSA；
(2)样品垫的处理
将BSA、PEG4000、PVP40000和Tween-20加至PBS中，得到样品垫处理液，将样品垫浸泡于样品垫处理液中，干燥；
(3)结合垫的处理
用胶体金溶液标记OA单抗，得到金标抗体复合物，将金标抗体复合物喷涂于结合垫上，干燥；
(4)硝酸纤维素膜的处理
将步骤(1)制备的检测完全抗原OA-BSA用PBS稀释，得到OA-BSA完全抗原稀释液；制备超纯水复溶沉淀FM-BSA，用PBS稀释，得到FM-BSA稀释液；再将OA-BSA完全抗原稀释液与FM-BSA稀释液混合，得到荧光微球与OA-BSA的混合液，划膜于硝酸纤维素膜的检测线上；
将所述FM-BSA稀释液划膜于硝酸纤维素膜的质控线上；
(5)试纸的制备
在PVC底板上，依次粘贴步骤(2)制备的样品垫、步骤(3)制备的结合垫、步骤(4)制备的硝酸纤维素膜和吸水纸，各部分在相邻处重叠，即得到所述的检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸。
3.根据权利要求2所述的检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的OA单抗的制备方法为：用活泼酯法将OA与人的免疫球蛋白进行偶联，得到产物用PBS稀释，得到免疫抗原OA-IgG，用免疫抗原OA-IgG免疫小鼠，取免疫后小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选出稳定分泌OA单抗的细胞株，再用腹水法制备OA单抗，纯化，得到纯化的OA单抗；
所述的免疫抗原OA-IgG的浓度为0.8～1.2mg/mL，偶联比为10:1～12:1；
所述的OA单抗的浓度为2.0～3.0mg/mL。
4.根据权利要求2所述的检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的胶体金溶液的制备方法为：将100mL双蒸水与0.5～1.5mL浓度为1％氯金酸溶液混合，加热沸腾，然后加入1～3mL浓度为1％柠檬酸三钠继续沸腾，当溶液的颜色由黑色变为酒红色时停止搅拌，静置冷却至室温，再按照每毫升溶液中加入8μL浓度为250mM的K2CO3溶液的方法调节pH值，即得所述的胶体金溶液，含胶体金的粒径为20nm。
5.根据权利要求2所述的检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸的制备方法，其特征在于：
步骤(3)中所述的用胶体金溶液标记纯化的OA单抗的方法为将胶体金溶液与OA单抗混合，室温下静置；
标记量为每毫升胶体金溶液标记4μL纯化的OA单抗。
6.根据权利要求2所述的检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的超纯水复溶沉淀FM-BSA的制备方法为：将荧光微球与超纯水混合，加入EDC和NHS，避光反应30min，再加入BSA，封闭1h，离心，即得到所述的超纯水复溶沉淀FM-BSA。
7.根据权利要求2～6任一项所述的检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的检测完全抗原OA-BSA的浓度为0.8～1.2mg/mL，偶联比为10:1～12:1；
步骤(3)中所述的将金标抗体复合物喷涂于结合垫上时，金标抗体的喷量为0.8～2μL/cm；
步骤(4)中所述的OA-BSA完全抗原稀释液的浓度为0.1～0.6μg/mL。
8.根据权利要求7所述的检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸的制备方法，其特征在于：
步骤(1)中所述的检测完全抗原OA-BSA的浓度为1.0mg/mL，偶联比为10:1；
步骤(3)中所述的将金标抗体复合物喷涂于结合垫上时，金标抗体的喷量为1.6μL/cm；
步骤(4)中所述的OA-BSA完全抗原稀释液的浓度为0.5μg/mL。
9.根据权利要求2～6任一项所述的检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸的制备方法，其特征在于：
步骤(2)中所述的样品垫处理液中的各物质质量分数分别为BSA 1～3％、PEG4000 1～3％、PVP40000 1～3％、Tween-20 1～3％和PBS余量，上述物质总计为100％；
步骤(1)、步骤(2)和步骤(4)中所述的PBS的浓度为15mmol/L，pH＝7.4；
步骤(4)中所述的将超纯水复溶沉淀FM-BSA稀释的倍数为600倍；
步骤(4)中所述的荧光微球与OA-BSA的混合液中，OA-BSA的浓度为0.3mg/mL。
10.权利要求1所述的检测大田软海绵酸的荧光淬灭试纸的应用，其特征在于：将所述的荧光淬灭试纸用于检测大田软海绵酸。
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