CN109061140A - 一种和肽素免疫层析检测试剂卡及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种和肽素免疫层析检测试剂卡及其制备方法，旨在提供一种快速简便，灵敏度高且检测结果可靠的和肽素检测方法；该检测试剂卡，包括盒体，所设盒体设有底板和盒盖，所述盒盖设有加样孔和结果检测窗口，所述盒体内设有检测试纸，所述检测试纸下方设有底板，所述检测试纸设有检测区，所述检测区设有样品垫、抗和肽素抗体示踪物标记垫、包被膜和吸水垫，所述包被膜上设有一条和肽素抗体检测区T线和一条质控区C线，所述检测区T线与质控区C线平行排列。利用本发明的试剂盒和方法具有灵敏度高、特异性强、快速、简便、可实现对分析物进行定量或定性的测定等优点。

Description

一种和肽素免疫层析检测试剂卡及其制备方法
技术领域
本发明属于生物医药领域，具体涉及一种测定血液（血清、血浆、全血）中的和肽素含量的检测试剂卡及其制备方法。
背景技术
下丘脑-脑垂体-肾上腺这一条轴线也被称作“压力轴线”，每次在中风发作时都会被激活。在发病过程中，脑垂体后叶分泌的精氨酸加压素（AVP，又称抗利尿激素、后叶加压素等）扮演着重要角色。然而，精氨酸加压素（AVP）呈脉冲式分泌、释放，结构极不稳定，半衰期短，极易被清除，很难在体外进行准确测量。
和肽素（copeptin）作为精氨酸加压素原的碳端部分肽段，不但与AVP等摩尔浓度产生，而且稳定性好、检测方便，因此它可以作为AVP检测的理想替代物，在中风、心衰患者的诊断、病情和预后评估方面发挥积极作用。但现市面上的试剂盒检测操作复杂，费时且结果具有一定偏差，不能满足检测需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种操作简单、诊断迅速、检测结果可靠的和肽素免疫层析检测试剂卡。
为了达到本发明的目的，本发明提供的技术方案如下：一种和肽素免疫层析检测试剂卡，包括盒体，所设盒体设有底板和盒盖，所述盒盖设有加样孔和结果检测窗口，所述盒体内设有检测试纸，所述检测试纸下方设有底板，所述检测试纸设有检测区，所述检测区设有样品垫、抗和肽素抗体示踪物标记垫、包被膜和吸水垫，所述包被膜上设有一条和肽素抗体检测区T线和一条质控区C线，所述和肽素抗体检测区T线与质控区C线平行排列。
进一步，所述包被膜两端分别与吸水垫和抗和肽素抗体示踪物标记垫相互交叠连接，所述抗和肽素抗体示踪物标记垫上压贴有样品垫，所述抗和肽素抗体示踪物表面设有修饰活性基团，优选地活性基团为氨基、羧基或巯基，所述抗和肽素抗体示踪物为量子点、镧系稀土络合物、纳米荧光微球或有色纳米颗粒，所述量子点为CdSe、ZnS，所述镧系稀土络合物为Eu (TTA) 3Phen，所述纳米荧光微球为聚苯乙烯纳米荧光微球，所述有色纳米颗粒为胶体金、有色聚苯乙烯微球。
进一步，所述样品垫为玻璃纤维样品垫，所述包被膜为硝酸纤维素膜，所述抗和肽素抗体示踪物标记垫为涂布标记和肽素抗体玻璃纤维或聚酯纤维。
一种和肽素免疫层析检测试剂卡的制备方法，包括样品垫、抗和肽素抗体示踪物标记垫与包被膜的制备方法。
进一步，所述抗和肽素抗体示踪物标记垫包括量子点、稀土络合物标记抗和肽素抗体，聚苯乙烯纳米荧光微球、有色聚苯乙烯微球标记抗和肽素抗体和胶体金标记抗和肽素抗体。
进一步，所述抗和肽素抗体量子点与稀土络合物标记垫的制备步骤为：
①用标记缓冲液将水溶性羧基量子点、镧系稀土络合物溶解；
②在量子点、镧系稀土络合物溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸溶液，室温反应1～2小时，超滤除去未反应的化学物质后加入标记缓冲液；
③将抗和肽素抗体加入上述活化的量子点、镧系稀土络合物溶液中，室温偶联反应1～2小时，加入封闭液反应30～60min，超滤除去未反应的化学物质后加入抗体保存液，即可得抗和肽素抗体量子点、稀土络合物标记溶液；
④将上述所得的抗和肽素抗体量子点、稀土络合物标记溶液用喷金划膜仪喷至玻璃纤维或聚酯纤维上，喷量为1～5μL/cm，干燥裁剪后即得抗和肽素抗体量子点、稀土络合物标记垫；
所述抗和肽素抗体聚苯乙烯纳米荧光微球、有色聚苯乙烯微球标记垫的制备步骤为：
①用标记缓冲液将羧基聚苯乙烯纳米荧光微球、有色聚苯乙烯微球稀释至固含量约0.2%；
②在上述聚苯乙烯纳米荧光微球、有色聚苯乙烯微球溶液中加入EDC溶液和sulfo-NHS溶液，活化10～20min，高速离心30min，去上清后加入适量抗和肽素抗体溶液，混合偶联反应1～2h；
③将聚苯乙烯纳米荧光微球、有色聚苯乙烯微球溶液与抗和肽素抗体偶联溶液，加入封闭液反应30～60min，高速离心20min，去上清，加入抗体保存液即得抗和肽素抗体聚苯乙烯纳米荧光微球、有色聚苯乙烯微球标记溶液；
④将上述所得的标记溶液用喷金划膜仪喷至玻璃纤维或聚酯纤维上，喷量为1～5μL/cm，干燥裁剪后即得抗和肽素抗体聚苯乙烯纳米荧光微球、有色聚苯乙烯微球标记垫；
所述抗和肽素抗体胶体金标记垫的制备步骤为：
①制备粒径在 30nm左右的胶体金溶液；
②在磁力搅拌下，胶体金溶液中逐滴加入0.05 MK2CO3调节pH值为8.0～8.5，加入抗和肽素抗体，减慢转速，充分混匀30min；按BSA终浓度质量比1%～2%，加入10％的BSA溶液进行封闭反应，充分混匀30min；
③冷冻高速离心30min，弃上清，按原初始标记时所用胶体金溶液体积的40％～100％加入抗体保存液复溶，即得抗和肽素抗体胶体金标记溶液；
④将上述所得的标记溶液用喷金划膜仪喷至玻璃纤维或聚酯纤维上，喷量为1～5μL/cm，干燥裁剪后即得抗和肽素抗体胶体金标记垫。
进一步，所述包被膜的制备方法的步骤为：
①将羊抗兔或羊抗鼠抗体用0.02M 磷酸盐缓冲液稀释0.5～2mg/mL，加入3%的甲醇，即为质控区工作液；
②将抗和肽素抗体用0.02M 磷酸盐缓冲液稀释至0.8～1.5mg/mL，加入3%的甲醇，即为检测区工作液；
③将步骤①、步骤②所得的溶液，用喷金划膜仪以0.8～1.2μL/cm包被到硝酸纤维膜上，检测区与质控区间距为0.4～0.7cm，位于硝酸纤维素膜中间位置，将硝酸纤维膜放入37℃烘箱中，干燥即可。
进一步，所述样品垫的制备方法为将样品垫用样品垫缓冲液浸泡，所述的样品垫缓冲液为含0.5～5wt%BSA、0.5～5wt%聚乙烯吡咯烷酮、0.5～5wt%聚乙二醇、0.1～5wt%吐温-20、1～5wt%曲拉通-100的0.01M磷酸盐缓冲液。
进一步，所述标记缓冲液为pH 5.0～9.0的0.1M MES缓冲液；所述抗体保存液为含1wt% BSA，20wt%蔗糖，10wt% 海藻糖，0.1wt%吐温-20，0.1wt%聚乙烯吡咯烷酮的0.05MTris-HCl缓冲液。
与现有技术相比，本发明所提供的和肽素免疫层析检测试剂卡具有如下优点：本发明提供的技术方案，利用免疫层析技术，两种抗体的特异结合反应，形成特异的“抗体-抗原-抗体”免疫复合物，再结合荧光或有色的示踪物标记，试剂卡与荧光仪相配合可对人体血液样本的和肽素进行定量或定性检测。本方法操作简单，诊断迅速，特异性强，灵敏度高，易储存，无须专门的操作人员，只需简单的仪器设备，即可得出结果。这样有利于医护人员抓住最佳治疗时间，在中风、心衰患者的诊断、病情和预后评估方面发挥积极作用。
附图说明
图1是本发明的检测试剂卡结构示意图；
图2是本发明的检测试剂卡的盒盖俯视图；
图3是本发明的检测试纸结构示意图；
图4是本发明的检测试纸俯视图；
图5是本发明的检测卡判定结果为阴性时示意图；
图6是本发明的检测卡判定结果为阳性时示意图；
图中：1、底板；2、样品垫；3、抗和肽素抗体示踪物标记垫；4、包被膜；5、吸水垫；6、盒体；61、盒盖；71、加样孔；72、结果观察窗口；8、和肽素抗体检测区T线；9、质控区C线。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
除非上下文另有特定清楚的描述，本发明中的检测物名称和参数，数量既可以单个的形式存在，也可以多个的形式存在，本发明并不对此进行限定。本发明中的步骤虽然用标号进行了排列，但并不用于限定步骤的先后次序，除非明确说明了步骤的次序或者某步骤的执行需要其他步骤作为基础，否则步骤的相对次序是可以调整的。可以理解，本文中所使用的术语“和/或”涉及且涵盖相关联的所列项目中的一者或一者以上的任何和所有可能的组合。
参见图1-图6，一种和肽素免疫层析检测试剂卡，包括盒体6，所设盒体6设有底板1和盒盖61，所述盒盖61设有加样孔71和结果检测窗口72，所述盒体6内设有检测试纸，所述检测试纸下方设有底板1，所述检测试纸设有检测区，所述检测区设有样品垫2、抗和肽素抗体示踪物标记垫3、包被膜4和吸水垫5，所述包被膜上设有一条和肽素抗体检测区T线8和一条质控区C线9，所述和肽素抗体检测区T线8与质控区C线9平行排列。所述包被膜4两端分别与吸水垫5和抗和肽素抗体示踪物标记垫3相互交叠连接，所述抗和肽素抗体示踪物标记垫3上压贴有样品垫2，所述抗和肽素抗体示踪物表面设有修饰活性基团，优选地活性基团为氨基、羧基或巯基，所述抗和肽素抗体示踪物为量子点、镧系稀土络合物、纳米荧光微球或有色纳米颗粒，所述量子点为CdSe、ZnS，所述镧系稀土络合物为Eu (TTA) 3Phen，所述纳米荧光微球为聚苯乙烯纳米荧光微球，所述有色纳米颗粒为胶体金、有色聚苯乙烯微球。所述样品垫2为玻璃纤维样品垫，所述包被膜4为硝酸纤维素膜，所述抗和肽素抗体示踪物标记垫3为涂布标记和肽素抗体玻璃纤维或聚酯纤维。
一种和肽素免疫层析检测试剂卡的制备方法，包括样品垫、抗和肽素抗体示踪物标记垫与包被膜的制备方法。所述抗和肽素抗体示踪物标记垫包括抗和肽素抗体量子点、稀土络合物、抗和肽素抗体聚苯乙烯纳米荧光微球、有色聚苯乙烯微球和抗和肽素抗体胶体金。所述抗和肽素抗体量子点与稀土络合物标记垫的制备步骤为：
① 用标记缓冲液将水溶性羧基量子点、镧系稀土络合物溶解；
② 在量子点、镧系稀土络合物溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸溶液，室温反应1～2小时，超滤除去未反应的化学物质后加入标记缓冲液；
③ 将抗和肽素抗体加入上述活化的量子点、镧系稀土络合物溶液中，室温偶联反应1～2小时，加入封闭液反应30～60min，超滤除去未反应的化学物质后加入抗体保存液，即可得抗和肽素抗体量子点、稀土络合物标记溶液；
④ 将上述所得的抗和肽素抗体量子点、稀土络合物标记溶液用喷金划膜仪喷至玻璃纤维或聚酯纤维上，喷量为1～5μL/cm，干燥裁剪后即得抗和肽素抗体量子点、稀土络合物标记垫；
所述抗和肽素抗体聚苯乙烯纳米荧光微球、有色聚苯乙烯微球标记垫的制备步骤为：
① 用标记缓冲液将羧基聚苯乙烯纳米荧光微球、有色聚苯乙烯微球稀释至固含量约0.2%；
② 在上述聚苯乙烯纳米荧光微球、有色聚苯乙烯微球溶液中加入EDC溶液和sulfo-NHS溶液，活化10～20min，高速离心30min，去上清后加入适量抗和肽素抗体溶液，混合偶联反应1～2h；
③ 将聚苯乙烯纳米荧光微球、有色聚苯乙烯微球溶液与抗和肽素抗体偶联溶液，加入封闭液反应30～60min，高速离心20min，去上清，加入抗体保存液即得抗和肽素抗体聚苯乙烯纳米荧光微球、有色聚苯乙烯微球标记溶液；
④ 将上述所得的标记溶液用喷金划膜仪喷至玻璃纤维或聚酯纤维上，喷量为1～5μL/cm，干燥裁剪后即得抗和肽素抗体聚苯乙烯纳米荧光微球、有色聚苯乙烯微球标记垫；
所述抗和肽素抗体胶体金标记垫的制备步骤为：
②制备粒径在 30nm左右的胶体金溶液；
② 在磁力搅拌下，胶体金溶液中逐滴加入0.05 M K2CO3调节pH值为8.0～8.5，加入抗和肽素抗体，减慢转速，充分混匀30min；按BSA终浓度质量比1%～2%，加入10％的BSA溶液进行封闭反应，充分混匀30min；
③ 冷冻高速离心30min，弃上清，按原初始标记时所用胶体金溶液体积的40％～100％加入抗体保存液复溶，即得抗和肽素抗体胶体金标记溶液；
④ 将上述所得的标记溶液用喷金划膜仪喷至玻璃纤维或聚酯纤维上，喷量为1～5μL/cm，干燥裁剪后即得抗和肽素抗体胶体金标记垫。
进一步，所述包被膜的制备方法的步骤为：
① 将羊抗兔或羊抗鼠抗体用0.02M 磷酸盐缓冲液稀释0.5～2mg/mL，加入3%的甲醇，即为质控区工作液；
② 将抗和肽素抗体用0.02M 磷酸盐缓冲液稀释至0.8～1.5mg/mL，加入3%的甲醇，即为检测区工作液；
③ 将步骤①、步骤②所得的溶液，用喷金划膜仪以0.8～1.2μL/cm包被到硝酸纤维膜上，检测区与质控区间距为0.4～0.7cm，位于硝酸纤维素膜中间位置，将硝酸纤维膜放入37℃烘箱中，干燥即可。
所述样品垫的制备方法为将样品垫用样品垫缓冲液浸泡，所述的样品垫缓冲液为含0.5～5wt%BSA、0.5～5wt%聚乙烯吡咯烷酮、0.5～5wt%聚乙二醇、0.1～5wt%吐温-20、1～5wt%曲拉通-100的0.01M磷酸盐缓冲液。所述标记缓冲液为pH 5.0～9.0的0.1M MES缓冲液；所述抗体保存液为含1wt% BSA，20wt%蔗糖，10wt% 海藻糖，0.1wt%吐温-20，0.1wt%聚乙烯吡咯烷酮的0.05M Tris-HCl缓冲液。
实施例1，和肽素免疫层析检测试剂卡的制备方法（量子点、稀土络合物标记）：
1）样品垫的制备方法是：
将样品垫用含0.5～5wt%BSA、0.5～5wt%聚乙烯吡咯烷酮、0.5～5wt%聚乙二醇、0.1～5wt%吐温-20、1～5wt%曲拉通-100的0.01M磷酸盐缓冲液（0.01 M 磷酸氢二钠：0.01M磷酸二氢钠=81:19（V：V））（pH 7.4）浸泡完全后，37℃ 烘干或在相对湿度≤35%的环境下干燥，裁剪待用。
样品垫缓冲液优选为0.01M磷酸盐缓冲液中溶解0.5wt%BSA、0.5wt%聚乙烯吡咯烷酮、0.5wt%聚乙二醇、0.25wt%吐温-20和1wt%曲拉通-100。
2）抗和肽素抗体量子点或稀土络合物标记垫的制备方法是：
① 用pH 8.0的0.1M MES缓冲液（配0.1M MES水溶液，用1 M NaOH溶液调整pH），将水溶性羧基CdSe/ZnS或Eu (TTA) 3Phen溶解并稀释至1μM。
② 取1mL 1μM的CdSe/ZnS或Eu (TTA) 3Phen，加入30μL 10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸溶液，室温反应1～2小时。用30kDa的超滤管超滤，除去未反应的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸，吸取超滤管内剩余液体，加入0.1M MES缓冲液恢复为体积至1mL。
③ 将抗和肽素抗体（一抗）加入100kDa的超滤管中，用0.1M MES缓冲液调整抗体含量为4mg/mL； 按200μg/1mL的量，将抗和肽素抗体加入到步骤②活化后CdSe/ZnS或Eu(TTA) 3Phen溶液中，室温反应1～2小时。
④ 按10μL/1mL 的量，向步骤③中加入10mg/mL的甘氨酸，封闭未偶联抗体的活化羧基位点，反应30～60min。
⑤ 将偶联抗体的CdSe/ZnS或Eu (TTA) 3Phen溶液加入到30kDa的超滤管中，加入pH 9.0浓度 0.05M Tris-HCl溶液置换溶液缓冲体系，重复3～5次，恢复终体积为1mL。
⑥ 将步骤⑤中的溶在液4℃ 1800g离心，取上清液。
⑦ 在步骤⑥所得的上清液中加入1mL抗体保存液，所述的抗体保存液为含1wt%BSA，20wt% 蔗糖，10wt% 海藻糖，0.1wt% 吐温-20和0.1wt% 聚乙烯吡咯烷酮的0.05MTris-HCl缓冲液。
⑧ 将上述所得的溶液用喷金划膜仪喷至玻璃纤维或聚酯纤维上，喷量为1～5μL/cm（优选2μL/cm），放入37℃烘箱，干燥2～5小时，裁剪待用。
3）包被膜的制备方法是：
① 将羊抗兔/羊抗鼠抗体用0.02M 磷酸盐缓冲液稀释至1mg/mL，加入3%的甲醇，即为质控区工作液。
② 将抗和肽素抗体（二抗）用0.02M 磷酸盐缓冲液稀释至1.2mg/mL，加入3%的甲醇，即为检测区工作液。
③ 将①、②所得的溶液，用喷金划膜仪以1μL/cm包被到硝酸纤维膜上。检测区与质控区间距为0.4～0.7cm（优选0.5cm），位于硝酸纤维素膜中间位置。
④ 将步骤③硝酸纤维膜放入37℃烘箱中，干燥过夜。
4）组装：
① 硝酸纤维素膜的粘贴：轻轻揭开PVC板上NC膜粘贴处的保护膜，将NC膜从左向右均匀推进，使其牢固的粘贴在PVC板上。
② 吸水垫的粘贴：将PVC板平铺于工作台面上，轻轻揭开PVC板上吸收垫粘贴处的保护膜，将吸收垫粘附于其上，均匀、轻微滚动式推进，以加强粘合力，并防止产生气泡，吸收垫覆盖在NC膜上1mm处。
③ 抗和肽素抗体示踪物标记垫的粘贴：将量子点或镧系稀土络合物标记垫裁为5mm×300mm。轻轻揭开PVC底板标记垫粘贴处的保护膜，将量子点或镧系稀土络合物标记垫粘附于其上，方法同吸收垫。抗和肽素抗体量子点或镧系稀土络合物标记垫3覆盖在NC膜上1mm处。
④ 样品垫的粘贴：将干燥后的样品垫裁为18mm×300mm后，轻轻揭开PVC底板最上端的保护膜，将样品垫粘附于抗和肽素抗体示踪物标记垫3上部，方法同吸收垫。样品垫覆盖在抗和肽素抗体示踪物标记垫上2mm处。
⑤ 抗和肽素示踪物标记垫的加固：将衔接胶带裁为12mm×300mm，粘贴到样品垫处，顶端距试纸条样品垫端15mm。
⑥ 切条与装卡：将粘贴好的PVC板切成3.0mm（2.5～4.5mm）宽的试纸条。将每一试纸条装入塑料卡盒内，将每一试剂卡置于铝膜袋中，并加入1g干燥剂1包，热合封口。
实施例2，和肽素免疫层析检测试剂卡的制备方法（纳米荧光微球或有色纳米微球标记）：
1）抗和肽素抗体聚苯乙烯纳米荧光微球或有色聚苯乙烯微球标记垫的制备：
① 用pH 6.0的0.1M MES缓冲液（配0.1M MES水溶液，用1 M NaOH溶液调整pH）将羧基聚苯乙烯纳米荧光微球（粒径190nm）或有色聚苯乙烯微球（粒径200nm）稀释至固含量约0.2%；
② 取1mL固含量0.2%的聚苯乙烯纳米荧光微球或有色聚苯乙烯微球，加入50μL EDC溶液(10mg/mL)和50μL sulfo-NHS溶液（50mg/mL），活化10min，16500r/min 离心30min，去上清后加入240μg抗和肽素抗体（一抗），混合偶联反应1h；
③ 在偶联溶液中，加入650μL封闭液（10%BSA溶液），反应30min，13000r/min离心20min，去上清，加入2500μL抗体保存液，超声分散即得抗和肽素抗体聚苯乙烯纳米荧光微球或有色聚苯乙烯微球标记溶液；
④ 将上述所得的标记溶液用喷金划膜仪喷至玻璃纤维或聚酯纤维上，喷量为2μL/cm，干燥裁剪后即得抗和肽素抗体聚苯乙烯纳米荧光微球或有色聚苯乙烯微球标记垫；
2）其他的步骤如样品垫制备、包被膜制备、组装等与实施例1相同。
实施例3，和肽素免疫层析检测试剂卡的制备方法（胶体金标记）：
1）抗和肽素抗体胶体金标记垫的制备：
① 使用粒径为30nm的胶体金溶液，取20ml，逐滴加入0.05 M K2CO3调节pH值为8.0；
②在磁力慢速搅拌下，在上述胶体金溶液中加入200μg抗和肽素抗体（一抗），充分混匀30min；然后逐滴加入10％的BSA溶液2mL进行封闭反应，缓慢搅拌30min；
③ 在冷冻离心机中(4～10)℃、10000rpm离心30min，弃上清，加入1mL抗体保存液复溶，即得抗和肽素抗体胶体金标记溶液；
④ 将上述所得的标记溶液用喷金划膜仪喷至玻璃纤维或聚酯纤维上，喷量为3μL/cm，干燥裁剪后即得抗和肽素抗体胶体金标记垫；
2）其他的步骤如样品垫制备、包被膜制备、组装等与实施例1相同。
实施例4，一种和肽素免疫层析检测试剂卡的具体使用方法：
精确吸取10μl样本（血清、血浆、全血），加入到稀释液中，混合均匀；打开铝箔袋包装，取出检测卡，水平放置；吸取稀释后的样本75μl，加入到检测卡的加样孔中，然后开始计时，室温反应5min。
用有色纳米颗粒作为示踪标记物的试剂卡，凭肉眼观察，根据质控区C线、检测区T线显色结果进行定性判读。当C线显色，T线不显色，结果为阴性，即样本中无目标分析物或目标分析物低于试剂卡灵敏度；当C线显色，T线也显色，结果为阳性，即样本中含目标分析物，并且T线显色越深，目标分析物含量越高。当C线不显色，无论T线显不显色，表明该测试无效，需要重测。
用荧光示踪物标记的试剂卡可通过荧光定量仪对试纸条进行检测，获取测试线及质控线的荧光信号强度，并依据标准曲线实现对目标分析物的定量检测。正常人群的血液和肽素界限值为11pmol／L，少于或等于该数值为阴性，高于该数值为阳性。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims (9)

1.一种和肽素免疫层析检测试剂卡，包括盒体，其特征在于：所设盒体设有底板和盒盖，所述盒盖设有加样孔和结果检测窗口，所述盒体内设有检测试纸，所述检测试纸下方设有底板，所述检测试纸设有检测区，所述检测区设有样品垫、抗和肽素抗体示踪物标记垫、包被膜和吸水垫，所述包被膜上设有一条和肽素抗体检测区T线和一条质控区C线，所述和肽素抗体检测区T线与质控区C线平行排列。
2.根据权利要求1所述的一种和肽素免疫层析检测试剂卡，其特征在于：所述包被膜两端分别与吸水垫和抗和肽素抗体示踪物标记垫相互交叠连接，所述抗和肽素抗体示踪物标记垫上压贴有样品垫，所述抗和肽素抗体示踪物表面设有修饰活性基团，所述抗和肽素抗体示踪物为量子点、镧系稀土络合物、纳米荧光微球或有色纳米颗粒，所述量子点为CdSe、ZnS，所述镧系稀土络合物为Eu (TTA) 3Phen，所述纳米荧光微球为聚苯乙烯纳米荧光微球，所述有色纳米颗粒为胶体金、有色聚苯乙烯微球。
3.根据权利要求1所述的一种和肽素免疫层析检测试剂卡，其特征在于：所述样品垫为玻璃纤维样品垫，所述包被膜为硝酸纤维素膜，所述抗和肽素抗体示踪物标记垫为玻璃纤维或聚酯纤维。
4.一种和肽素免疫层析检测试剂卡的制备方法，其特征在于：所述方法包括样品垫、抗和肽素抗体示踪物标记垫与包被膜的制备方法。
5.根据权利要求4所述的一种和肽素免疫层析检测试剂卡的制备方法，其特征在于：所述抗和肽素抗体示踪物标记垫包括抗和肽素抗体量子点、稀土络合物、抗和肽素抗体聚苯乙烯纳米荧光微球、有色聚苯乙烯微球和抗和肽素抗体胶体金。
6.根据权利要求5所述的一种和肽素免疫层析检测试剂卡的制备方法，其特征在于：所述抗和肽素抗体量子点与稀土络合物标记垫的制备步骤为：
①用标记缓冲液将水溶性羧基量子点、镧系稀土络合物溶解；
②在量子点、镧系稀土络合物溶液中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸溶液，室温反应1～2小时，超滤除去未反应的化学物质后加入标记缓冲液；
③将抗和肽素抗体加入上述活化的量子点、镧系稀土络合物溶液中，室温偶联反应1～2小时，加入封闭液反应30～60min，超滤除去未反应的化学物质后加入抗体保存液，即可得抗和肽素抗体量子点、稀土络合物标记溶液；
④将上述所得的抗和肽素抗体量子点、稀土络合物标记溶液用喷金划膜仪喷至玻璃纤维或聚酯纤维上，喷量为1～5μL/cm，干燥裁剪后即得抗和肽素抗体量子点、稀土络合物标记垫；
所述抗和肽素抗体聚苯乙烯纳米荧光微球、有色聚苯乙烯微球标记垫的制备步骤为：
①用标记缓冲液将羧基聚苯乙烯纳米荧光微球、有色聚苯乙烯微球稀释至固含量约0.2%；
②在上述聚苯乙烯纳米荧光微球、有色聚苯乙烯微球溶液中加入EDC溶液和sulfo-NHS溶液，活化10～20min，高速离心30min，去上清后加入适量抗和肽素抗体溶液，混合偶联反应1～2h；
③将聚苯乙烯纳米荧光微球、有色聚苯乙烯微球溶液与抗和肽素抗体偶联溶液，加入封闭液反应30～60min，高速离心20min，去上清，加入抗体保存液即得抗和肽素抗体聚苯乙烯纳米荧光微球、有色聚苯乙烯微球标记溶液；
④将上述所得的标记溶液用喷金划膜仪喷至玻璃纤维或聚酯纤维上，喷量为1～5μL/cm，干燥裁剪后即得抗和肽素抗体聚苯乙烯纳米荧光微球、有色聚苯乙烯微球标记垫；
所述抗和肽素抗体胶体金标记垫的制备步骤为：
①制备粒径在 30nm左右的胶体金溶液；
②在磁力搅拌下，胶体金溶液中逐滴加入0.05 MK2CO3调节pH值为8.0～8.5，加入抗和肽素抗体，减慢转速，充分混匀30min；按BSA终浓度质量比1%～2%，加入10％的BSA溶液进行封闭反应，充分混匀30min；
③冷冻高速离心30min，弃上清，按原初始标记时所用胶体金溶液体积的40％～100％加入抗体保存液复溶，即得抗和肽素抗体胶体金标记溶液；
④将上述所得的标记溶液用喷金划膜仪喷至玻璃纤维或聚酯纤维上，喷量为1～5μL/cm，干燥裁剪后即得抗和肽素抗体胶体金标记垫。
7.根据权利要求4所述的一种和肽素免疫层析检测试剂卡的制备方法，其特征在于：所述包被膜的制备方法的步骤为：
①将羊抗兔或羊抗鼠抗体用0.02M 磷酸盐缓冲液稀释0.5～2mg/mL，加入3%的甲醇，即为质控区工作液；
②将抗和肽素抗体用0.02M 磷酸盐缓冲液稀释至0.8～1.5mg/mL，加入3%的甲醇，即为检测区工作液；
③将步骤①、步骤②所得的溶液，用喷金划膜仪以0.8～1.2μL/cm包被到硝酸纤维膜上，检测区与质控区间距为0.4～0.7cm，位于硝酸纤维素膜中间位置，将硝酸纤维膜放入37℃烘箱中，干燥即可。
8.根据权利要求4所述的一种和肽素免疫层析检测试剂卡的制备方法，其特征在于：所述样品垫的制备方法为将样品垫用样品垫缓冲液浸泡，所述的样品垫缓冲液为含0.5～5wt%BSA、0.5～5wt%聚乙烯吡咯烷酮、0.5～5wt%聚乙二醇、0.1～5wt%吐温-20、1～5wt%曲拉通-100的0.01M磷酸盐缓冲液。
9.根据权利要求6所述的一种和肽素免疫层析检测试剂卡的制备方法，其特征在于：所述标记缓冲液为pH 5.0～9.0的0.1M MES缓冲液；所述抗体保存液为含1wt% BSA，20wt%蔗糖，10wt% 海藻糖，0.1wt%吐温-20，0.1wt%聚乙烯吡咯烷酮的0.05M Tris-HCl缓冲液。
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109884293A (zh) * 2019-03-29 2019-06-14 中国海洋大学 一种基于量子点荧光的食品过敏原快速检测方法
CN109975532A (zh) * 2019-03-21 2019-07-05 王鑫 缺血性卒中人群康复治疗的预后评估
CN112213501A (zh) * 2020-09-30 2021-01-12 中山火炬职业技术学院 一种定量检测***的荧光微球免疫层析试纸及其制备方法和检测方法
CN112578109A (zh) * 2020-12-08 2021-03-30 广东海洋大学深圳研究院 定性定量检测试剂、制备方法及定性定量检测试剂盒
CN113406339A (zh) * 2021-08-19 2021-09-17 山东康华生物医疗科技股份有限公司 一种干式免疫荧光定量法人和肽素（cpp）检测试剂盒

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101010591A (zh) * 2004-08-19 2007-08-01 B.R.A.H.M.S股份公司 使用copeptin诊断病症的方法
CN102830230A (zh) * 2012-08-28 2012-12-19 暨南大学 莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条及制备与应用
CN103926403A (zh) * 2014-04-29 2014-07-16 广州市微米生物科技有限公司 A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡及其制备方法
CN103937751A (zh) * 2014-04-11 2014-07-23 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 一种基于ndv血凝素蛋白单克隆抗体的胶体金免疫层析检测试纸条
CN105424923A (zh) * 2015-09-10 2016-03-23 南京微测生物科技有限公司 彩色-荧光双功能免疫层析试纸条及其制备方法
CN107328938A (zh) * 2016-09-23 2017-11-07 清华大学深圳研究生院 胃蛋白酶原和抗幽门螺杆菌抗体检测方法及其试剂盒

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101010591A (zh) * 2004-08-19 2007-08-01 B.R.A.H.M.S股份公司 使用copeptin诊断病症的方法
CN102830230A (zh) * 2012-08-28 2012-12-19 暨南大学 莱克多巴胺-克伦特罗荧光微球检测试纸条及制备与应用
CN103937751A (zh) * 2014-04-11 2014-07-23 山东省农业科学院畜牧兽医研究所 一种基于ndv血凝素蛋白单克隆抗体的胶体金免疫层析检测试纸条
CN103926403A (zh) * 2014-04-29 2014-07-16 广州市微米生物科技有限公司 A族链球菌量子点免疫层析检测试剂卡及其制备方法
CN105424923A (zh) * 2015-09-10 2016-03-23 南京微测生物科技有限公司 彩色-荧光双功能免疫层析试纸条及其制备方法
CN107328938A (zh) * 2016-09-23 2017-11-07 清华大学深圳研究生院 胃蛋白酶原和抗幽门螺杆菌抗体检测方法及其试剂盒

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109975532A (zh) * 2019-03-21 2019-07-05 王鑫 缺血性卒中人群康复治疗的预后评估
CN109884293A (zh) * 2019-03-29 2019-06-14 中国海洋大学 一种基于量子点荧光的食品过敏原快速检测方法
CN112213501A (zh) * 2020-09-30 2021-01-12 中山火炬职业技术学院 一种定量检测***的荧光微球免疫层析试纸及其制备方法和检测方法
CN112578109A (zh) * 2020-12-08 2021-03-30 广东海洋大学深圳研究院 定性定量检测试剂、制备方法及定性定量检测试剂盒
CN113406339A (zh) * 2021-08-19 2021-09-17 山东康华生物医疗科技股份有限公司 一种干式免疫荧光定量法人和肽素（cpp）检测试剂盒

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