CN110894544A - 鲑鱼甲病毒（sav）的raa恒温荧光检测方法及试剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鲑鱼甲病毒（SAV）RAA恒温荧光检测方法和检测试剂盒。检测试剂盒包括一条正向引物SEQ ID NO.1、一条反向引物SEQ ID NO.2、一条特异性荧光探针SEQ ID NO.3、反应液、逆转录酶、重组聚合酶和对照品。本发明的试剂盒特异性强；检测灵敏度高，可达到1.93fg/μL；准确度高、可靠；操作简便快捷，适合现场检测，具有广泛的应用场景。

Description

鲑鱼甲病毒(SAV)的RAA恒温荧光检测方法及试剂

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及海洋水产养殖业的检测方法，具体涉及一种鲑鱼甲病毒的RAA恒温荧光检测方法及试剂盒。

背景技术

鲑鱼甲病毒((Salmonid alphavirus，SAV)自20世纪90年代末开始流行于爱尔兰、挪威、英国等国家，主要感染大西洋鲑(Salmo salar)和虹鳟(Oncorhynchus mykiss)等鲑科鱼类，引起胰腺、心肌炎症和昏睡等症状，致死率达1％～48％，在鱼类养殖各生长阶段均有爆发。又被称为鲑鱼胰腺病或昏睡病。2013年鲑鱼甲病毒感染被列入OIE水生动物疫病名录中。鲑鱼甲病毒隶属于披膜病毒科(Togaviridae)，甲病毒属(Alphavirus)的RNA型病毒，，球型(直径55-65nm)，对氯仿敏感，在pH4.0、pH 12.0和60℃时迅速灭活，在氯化铯中的浮力密度为1.20g/mL。

受鲑鱼甲病毒感染的病鱼一般食欲减退、昏睡、眼突、腹水以及粪便拖尾，无法保持在水中的位置，螺旋或绕圈地游动，或者在水底不动，但抓捕时会游开，有时出现突然死亡。解剖发现病鱼心脏苍白，肠道空虚，有黄色黏液，体内脂肪很少，有时在幽门盲肠和四周的脂肪出现瘀斑出血；胰腺、心肌和骨骼肌病变是比较主要的症状。

近年来基于临床组织病理学、免疫学以及PCR技术等的各种诊断方法已被用于SAV的检测。但是现有的这些方法都存在一定的不足，例如：基于组织病理学的方法不仅操作繁琐、费时，而且灵敏度较低；基于免疫学的方法虽然具有敏感性高、检测快速等特点，可用于大批标本的检测，但对新鲜样品进行检测时出现的假阳性问题在一定程度上还限制着该方法的广泛应用；而PCR方法敏感、准确、快速，可替代病原学检测，但由于需要昂贵的仪器设备、较高检测费用以及对检测人员较高的技术要求而使其不适用于现场快速检测及基层普及应用。与一般PCR技术相比，荧光PCR检测技术简化了操作步骤，而且可消除扩增产物引起的交叉污染，减少假阳性的发生。但实时荧光PCR耗时长，成本较高，目前在水产养殖动物的常规病原体检测中的应用还不多。LAMP等温扩增技术同样由于假阳性较高，准确度低，水产病原检测中的应用还是比较局限。本发明建立了RAA恒温荧光来检测SAV的方法，快速方便，准确可靠，是适应口岸快速检测和大通关的时代要求，对促进中国海洋养殖及其产品的贸易有重要作用。

重组酶介导扩增(Recombinase-aid Amplification，RAA)技术也是一种在恒温下可以使核酸快速扩增的方法。与RPA不同的是，RAA扩增法使用的是从细菌或真菌中获得的重组酶，在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-strandedDNAbinding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下，形成新的DNA互补链，反应产物也是以指数级增长，通常在1h内即能得到可以用琼脂糖凝胶电泳检测到的扩增片段。在RAA反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监控整个RAA扩增过程，20分钟内，可实现对起始模板的定量及定性分析。整个反应简单快速，因为不需要高温循环，所以特别适合在有大量样品的非实验室检测场所使用，适用于食品快速检测领域。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的是提供鲑鱼甲病毒(SAV)的RAA恒温荧光核酸检测试剂盒及检测方法。

为实现以上目的，本发明采用以下技术方案：

一种鲑鱼甲病毒(SAV)核酸的检测试剂盒，包括：鲑鱼甲病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述鲑鱼甲病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述鲑鱼甲病毒反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

在一些实施方案中，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。

在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、A Buffer、B Buffer、RAA干粉试剂、鲑鱼甲病毒标准品和DEPC处理水中至少一种。

在一些实施方案中，所述的试剂盒，所述的逆转录体系由RTE逆转录酶、RNA酶抑制剂组成。

在一些实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述A Buffer为20％PEG；B Buffer为280mM MgAc。

在一些实施方案中，所述的试剂盒，其中，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/L dNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μLRad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶，30ng/mL RTE逆转录酶、100mmol/L Tricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。

在一些实施方案中，所述的核酸检测试剂盒，鲑鱼甲病毒标准品为含有鲑鱼甲病毒保守基因部分序列的阳性质粒。

在一些实施方案中，所述的试剂盒，所述含有鲑鱼甲病毒保守区域基因部分序列的阳性质粒的序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种鲑鱼甲病毒的RAA恒温荧光检测方法，提取待测样品的RNA，以待测样品的RNA为模板，在鲑鱼甲病毒的正向引物、反向引物、特异性荧光探针及RAA干粉试剂、A Buffer、B Buffer和DEPC处理水存在下进行实时荧光RAA反应，根据实时荧光RAA扩增曲线分析待测样品；其中所述对鲑鱼甲病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述鲑鱼甲病毒反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

在一些实施方案中，所述实施荧光RAA反应程序为：37℃，40s；37℃，20min，共计40个循环；

本发明所述检测方法需要实时荧光RAA反应结束后，利用实时荧光RAA仪分析软件，根据实时荧光RAA的扩增曲线分析待测样品。优选的，所述分析待测样品为待测样本FAM通道荧光曲线呈“S”型且CT值≤35，判断为对鲑鱼甲病毒阳性结果；当待测样本曲线不呈“S”型或CT值＞35，判断为对鲑鱼甲病毒阴性结果。

有益效果

1、快速高效：整个扩增只需20-30min即可完成，扩增产量可以达到10⁹-10¹⁰个拷贝；

2、操作简单：不需要特殊试剂，不需要预先进行RNA的逆转录等繁琐步骤，只需要恒温的荧光仪，条件比较温和；

3、高特异性：本发明对鱼其他的病症传染性鲑鱼贫血症病毒(ISAV)、草鱼出血病(GCRV-Ⅰ)、鳗鲡疱疹病毒(HVA)、鲤鱼浮肿病(CEV)和细菌性败血症(FBS)的DNA/RNA均不发生扩增；

4、高灵敏度：本发明的检测极限可以达到1.93fg/μL；

5、鉴定简单：根据实时荧光数据，直接判断扩增结果，无需电泳检测，适合现场检测。

附图说明

图1为本发明中涉及的4对引物RAA扩增曲线图。

图2为RAA检测方法对SAV的灵敏度实验图，从左到右依次为1927fg/μL、192.7fg/μL、19.27fg/μL、1.93fg/μL、0.19fg/μL的阳性标准品的扩增结果。

图3为RAA检测方法对SAV的特异性实验图。

具体实施方法

以下通过具体实施例对本发明进一步说明，但并不局限于此。

实施例1：

本发明对鲑鱼甲病毒在Genebank数据库中搜索鲑鱼甲病毒株基因序列，使用DNAMAN 6.0软件对多序列进行比对，找出保守的区段。在保守区域设计了4组引物和探针，并在NCBI数据库中进行BLAST比对，引物和探针的序列如表1所示。阳性样本扩增曲线如图1所示。

表1引物和探针序列:

由图1结果可见，第四组引物和探针的扩增曲线最为典型，有明显的指数期和平台期，有较高荧光强度(纵坐标值)，且CT值较小(曲线与阈值线的交叉点所对应的横坐标)结果分析见表2。其它引物探针曲线上升高度较低，CT值较大，平台期不明显；或者没有出现扩增，出现漏检。说明第四组引物和探针目的产物的复制速度更快、数量更多，扩增反应效率更高。

表2引物探针筛选结果分析

组别\结果	CT值	荧光强度
			第一组	5.33	260,000
第二组	5.88	350,000
			第三组	7.20	400,000
第四组	5.81	510,000

实时例2：所述试剂盒对鲑鱼甲病毒

本发明所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、A Buffer、BBuffer、RAA干粉试剂、鲑鱼甲病毒标准品和DEPC处理水。

本发明所述的试剂盒，其中，所述的A Buffer为20％PEG；B Buffer为280mM MgAc。

本发明所述的试剂盒，其中，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/L dNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重组酶蛋白(SC-recA/BS-recA)或30ng/μL Rad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶，100mmol/L Tricine、20％PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。

本发明所述的引物混合液中，所述的正向引物碱基序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的碱基序列SEQ ID NO.2所示，正向引物和反向引物的摩尔配比为SEQ ID NO.1：SEQ ID NO.2为1:1。

本发明提供的鲑鱼甲病毒的特异性探针碱基序列如SEQ ID NO.3所示，探针的5’端标记有FAM荧光报告基团，3’端标记有BHQ1荧光淬灭基团。

本发明提供的鲑鱼甲病毒标准品包含有对鲑鱼甲病毒保守区基因序列的阳性质粒，该质粒的碱基序列如SEQ ID NO.4所示。

质粒的碱基序列(SEQ ID NO.4):

TATGACACACAGATCCTCGCCGCCCACGCAGCTGCCTCTCCGTACAGGGCGTACTGCCCCGATTGTGACGGAACAGCGTGTATCTCGCCGATAGCCATCGACGAGGTGGTGAGCAGCGGCAGCGACCACGTCCTCCGCATCCGGGTTGGTTCTCAATCGGGAGTGACCGCTAAGGGTGGTGCGGCGGGTGAAACCTCTCTGCGATACCTGGGAAGGGACGGGAAGGTTCACGCCGCAGACAACACGCGACTCGTGGTGCGCACGACTGCAAAGTGCGACGTGCTGCAGGCCACTGGCCACTACATCCTGGCCAACTGCCCAGTGGGGCAGAGCCTAACCGTTGCGGCCACACTGGATGGCACCCGGCATCAATGCACCACGGTTTTCGAACACCAAGTAACGGAGAAGTTCACCAGAGAACGCAGCAAGGGCCACCATCTGTCCGACATGACCAAGAAATGCACCAGATTTTCCACTACACCAAAAAAGTCCGCCCTCTACCTCGTTGATGTGTATGACGCTCTGCCGATTTCTGTAGAGATTAGCACCGTCGTAACATGCAACGACAGCCAGTGCACAGTGAGGGTGCCACCTGGTACCACAGTGAAATTCGACAAGAAATGCAAGAGCGCTGACTTGGCAACCGTCACTTTCACCAGCGACTCCCAGACGTTTACGTGTGAGGAGCCAGTCCTAACGGCTGCCAGTATCACCCAGGGCAAGCCACACCTCAGATCGGCAATGTTGCCTAGCGGAGGCAAGGAAGTGAAAGCAAGGATCCCGTTCCCGTTCCCGCCGGAAACCGCAACTTGCAGAGTGAGTGTAGCCCCACTGCCGTCGATTACCTACGAGGAAAGCGATGTCCTGCTAGCCGGTACCGCAAAATACCCTGTGCTGCTAACCACACGGAACCTTGGTTT

本发明提供的DEPC处理水购买于Solarbio公司。

实例3：本发明所述试剂盒对鲑鱼甲病毒

1、阳性样品核酸的提取

1.1、核酸提取：取待检鱼肌肉组织约100mg，用研磨棒充分研磨后放入1.5mL离心管中，随即向离心管中加入1mL Trizol，振荡混匀，冰浴10min。加入350μL氯仿，充分振荡，稍静止后出现分层，随即于4℃，12000r/min离心15min。将上层水相转移至新的1.5mL离心管中。加入等体积的异丙醇(4℃预冷)混匀。4℃，12000r/min离心15min。倒掉上清，再次12000r/min离心30s，加入200μL 75％乙醇，晃荡洗涤1次并小心倒掉乙醇。室温干燥。然后加入20μL DEPC水溶解沉淀(沉淀即所需的总RNA)。将提取好的核酸进行分装，冻存于-20℃备用。

2、RAA反应体系的配置：每个检测样品对应一个RAA反应干粉管，每个RAA反应干粉管中各反应组分和所加入的体积如表3所示。

表3:

RAA反应体系组分	体积(μL)
		A Buffer	12.5μL
B Buffer	2.5μL
		引物混合液	4μL
特异性荧光探针	0.6μL
		DNA模板	2μL
DEPC处理水	28.4μL
		总体积	50μL

A Buffer为20％PEG；B Buffer为280mM MgAc

3、将配置好反应体系的RAA反应管放置于ABI7500扩增仪中，按照下列程序进行RAA扩增：39℃，40s；39℃，20min，共计40个循环。每个循环收集FAM通道的荧光。

4、扩增结束后根据荧光曲线判断和CT值判定对鲑鱼甲病毒阳性或阴性结果。判定结果：FAM通道荧光曲线呈“S”型且CT值≤35，判断为鲑鱼甲病毒阳性结果；当待测样本曲线不呈“S”型或CT值＞35，判断为鲑鱼甲病毒阴性结果。

实施例4：本发明RAA检测试剂盒在临床实际应用中的评估

采用本发明试剂盒进行临床盲样的实验，检测50份鱼样本；实验结果表明，本发明的第四引物对可以区分出鲑鱼甲病毒，与反转录PCR阳性符合率很高。在50份样本中，反转录PCR，有28份为阳性结果，22份为阴性结果，通过RAA方法检测的结果为29份为阳性，有21份也为阴性结果，存在一份阳性结果不同，对这个样本进行反转录PCR扩增并测序，测序结果显示该样本为阳性，说明本发明的RAA检测试剂有更高的准确率。

试验例5：本发明所述试剂盒的灵敏度试验

本发明实施例2所述试剂盒提供的鲑鱼甲病毒标准品质粒，提取阳性质粒，并用NanoDrop测量阳性质粒的浓度，并将其分别稀释到1927fg/μL、192.7fg/μL、19.27fg/μL、1.93fg/μL、0.19fg/μL 5个浓度梯度进行灵敏度试验。

检测结果如图2所示，从左到右依次为1927fg/μL、192.7fg/μL、19.27fg/μL、1.93fg/μL、0.19fg/μL的阳性标准品的扩增结果，从中可以看出本发明的RAA荧光扩增试剂和检测的灵敏度可达1.93fg/μL，精确性优于普通PCR检测方法，表明本发明的RAA恒温荧光检测试剂盒和检测方法对SAV的诊断具有高度的灵敏性。

试验例6：本发明所述试剂盒的特异性试验

为了检测本发明试剂盒的特异性，采用实例3中的检测方法，分别对病毒ISAV、GCRV-Ⅰ、HVA、CEV和FBS样本进行检测，分析本试剂盒对SAV和鱼其他常见病毒的检测情况。

检测结果表明：仅SAV样品出现正常扩增，阴性对照(DEPC处理水)及ISAV、GCRV-Ⅰ、HVA、CEV和FBS样品均未出现扩增(如图3所示)。上述结果说明，本发明RAA恒温荧光检测试剂盒能特异性扩增出SAV中的靶序列，而不与其他病毒核酸发生交叉反应。说明本发明方法及试剂盒特异性好，未出现假阴性。

同时，采用本发明设计的1-3对引物进行同样的特异性实验，发现这些引物不能很好的特异区分不同的样本，特异性不是很好(具体实验数据略)。

在缺少本文中所具体公开的任何元件、限制的情况下，可以实现本文所示和所述的发明。所采用的术语和表达法被用作说明的术语而非限制，并且不希望在这些术语和表达法的使用中排除所示和所述的特征或其部分的任何等同物，而且应该认识到各种改型在本发明的范围内都是可行的。因此应该理解，尽管通过各种实施例和可选的特征具体公开了本发明，但是本文所述的概念的修改和变型可以被本领域普通技术人员所采用，并且认为这些修改和变型落入所附权利要求书限定的本发明的范围之内。

本文中所述或记载的文章、专利、专利申请以及所有其他文献和以电子方式可得的信息的内容在某种程度上全文包括在此以作参考，就如同每个单独的出版物被具体和单独指出以作参考一样。申请人保留把来自任何这种文章、专利、专利申请或其他文献的任何及所有材料和信息结合入本申请中的权利。

序列表

<110> 杭州众测生物科技有限公司

<120> 鲑鱼甲病毒（SAV）的RAA恒温荧光检测方法及试剂

<130> 18-100070-00006981

<141> 2018-09-13

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gatttctgta gagattagca ccgtcgtaac 30

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gttgccaagt cagcgctctt gcatttcttg 30

<210> 3

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgacagccag tgcacagtga gggtgccacc gaccacagtg aaattc 46

<210> 4

<211> 920

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tatgacacac agatcctcgc cgcccacgca gctgcctctc cgtacagggc gtactgcccc 60

gattgtgacg gaacagcgtg tatctcgccg atagccatcg acgaggtggt gagcagcggc 120

agcgaccacg tcctccgcat ccgggttggt tctcaatcgg gagtgaccgc taagggtggt 180

gcggcgggtg aaacctctct gcgatacctg ggaagggacg ggaaggttca cgccgcagac 240

aacacgcgac tcgtggtgcg cacgactgca aagtgcgacg tgctgcaggc cactggccac 300

tacatcctgg ccaactgccc agtggggcag agcctaaccg ttgcggccac actggatggc 360

acccggcatc aatgcaccac ggttttcgaa caccaagtaa cggagaagtt caccagagaa 420

cgcagcaagg gccaccatct gtccgacatg accaagaaat gcaccagatt ttccactaca 480

ccaaaaaagt ccgccctcta cctcgttgat gtgtatgacg ctctgccgat ttctgtagag 540

attagcaccg tcgtaacatg caacgacagc cagtgcacag tgagggtgcc acctggtacc 600

acagtgaaat tcgacaagaa atgcaagagc gctgacttgg caaccgtcac tttcaccagc 660

gactcccaga cgtttacgtg tgaggagcca gtcctaacgg ctgccagtat cacccagggc 720

aagccacacc tcagatcggc aatgttgcct agcggaggca aggaagtgaa agcaaggatc 780

ccgttcccgt tcccgccgga aaccgcaact tgcagagtga gtgtagcccc actgccgtcg 840

attacctacg aggaaagcga tgtcctgcta gccggtaccg caaaataccc tgtgctgcta 900

accacacgga accttggttt 920

Claims (9)

1.一种鲑鱼甲病毒（SAV）核酸的检测试剂盒，包括：鲑鱼甲病毒正向引物、反向引物以及特异性荧光探针，其中所述鲑鱼甲病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示、所述鲑鱼甲病毒反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

2.根据权利要求1所述的核酸检测试剂盒，所述特异性荧光探针的荧光报告基团选自FAM、VIC、JOE、TET、CY3、CY5、ROX、Texas Red或LC RED460中的一种，荧光淬灭基因选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcy1或Tamra中的一种。

3.根据权利要求1和2所述的核酸检测试剂盒，还包括引物混合液、特异性荧光探针、ABuffer、B Buffer、RAA干粉试剂、鲑鱼甲病毒标准品和DEPC处理水中至少一种。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，所述的逆转录体系由RTE逆转录酶、RNA酶抑制剂组成。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其中，所述A Buffer为20% PEG ；B Buffer为280mMMgAc。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，所述的RAA干粉试剂的成分如下：1mmol/LdNTP、90ng/μL SSB蛋白、120ng/μL recA重组酶蛋白（SC-recA/BS-recA）或30ng/μL Rad51、30ng/μL Bsu DNA聚合酶，30ng/mL RTE逆转录酶、 100mmol/L Tricine、20% PEG、5mmol/L二硫苏糖醇、100ng/μL肌酸激酶、Exo核酸外切酶。

7.根据权利要求1-5任意一项所述的核酸检测试剂盒，鲑鱼甲病毒标准品为含有鲑鱼甲病毒保守区基因部分序列的阳性质粒。

8.根据权利要求6所述的试剂盒，所述含有鲑鱼甲病毒保守区基因部分序列的阳性质粒的序列如SEQ ID NO.4所示。

9.鲑鱼甲病毒的RAA恒温荧光检测方法，提取待测样品的RNA，以待测样品的RNA 为模板，在鲑鱼甲病毒的正向引物、反向引物、特异性荧光探针及RAA干粉试剂、A Buffer、BBuffer和DEPC处理水存在下进行实时荧光RAA反应，根据实时荧光RAA扩增曲线分析待测样品；其中所述鲑鱼甲病毒正向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1 所示、所述鲑鱼甲病毒反向引物核苷酸序列如SEQ ID NO.2 所示，所述特异性荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3，其5’端标记有荧光报告基团，3’端标记有荧光淬灭基团。

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