CN112020648A - 针对癌症个体化疗法的制品和方法 - Google Patents

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D·D·格恩金
亚历山大·加比博维奇·加比博夫
理查德·A·勒纳
阿列克谢·阿纳托利耶维奇·别洛古罗夫
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Abstract

描述了用于提供用于治疗包括淋巴瘤的B细胞恶性肿瘤的个体化药物的方法。该方法利用嵌合抗原受体(CAR)技术。

Description

针对癌症个体化疗法的制品和方法
相关申请
本申请要求2017年10月4日提交的俄罗斯申请第2017134483号、2018年4月4日提交的俄罗斯申请第2018112009号和2018年10月1日提交的俄罗斯申请第2018134321号的优先权，这些申请的每一个的全部内容在此通过引用并入本文。
发明背景
淋巴瘤是免疫***淋巴细胞中的一种癌症。通常，淋巴瘤表现为淋巴样细胞(lymphoid cell)的实体瘤。这些恶性细胞通常起源于***，表现为***肿大，即肿瘤。它也可以影响其他器官，在这种情况下，它被称为结外淋巴瘤。结外部位包括皮肤、脑、肠和骨骼。淋巴瘤与淋巴样白血病(lymphoid leukemias)密切相关，淋巴样白血病也起源于淋巴细胞，但通常仅涉及循环血液和骨髓，且通常不形成静态肿瘤(static tumor)(Parham,P.The immune system.New York:Garland Science.第414页,2005)。治疗包括化学疗法，并且在一些情况下还包括放射疗法和/或骨髓移植，并且取决于疾病的组织学、类型和阶段可以是可治愈的。较晚期的淋巴瘤病例是耐药的，并且因此需要新的治疗方法。
发明概述
本公开内容提供了用于使用个体化药物治疗B细胞恶性肿瘤的方法。更具体地，该方法提供了从受试者的B细胞恶性肿瘤中分离B细胞受体，鉴定该B细胞受体的配体，并且然后用与治疗剂偶联的B细胞受体配体，例如其中B细胞受体配体包含抗原结合结构域的CART细胞治疗受试者。
在一些实施方案中，本公开内容的方法使用基于自分泌的形式来鉴定对肿瘤特异性的B细胞受体配体。一旦B细胞受体配体被鉴定出，就可以用与治疗剂附接的配体治疗患者。从诊断到治疗的整个过程可以在短时间段内，例如在几周内完成。例如，可以通过使来自肿瘤的B细胞受体和嵌合抗原受体(CAR)在T细胞中共表达来鉴定B细胞受体配体，其中CAR的胞外结构域包含来自文库的肽。T细胞通过CAR的活化指示CAR的胞外结构域已经结合B细胞受体，并且来自肽文库中的肽是B细胞受体配体。可选地，本文预期的是使用噬菌体展示来鉴定B细胞受体配体。
本公开内容还提供了治疗癌症的方法，所述方法通过施用表达CAR的T细胞以及疫苗来进行，其中该CAR包含以癌症特异性方式特异性结合癌症特异性抗原的抗原结合结构域，例如具有包含如本文描述的B细胞受体配体的抗原结合结构域的CAR，该疫苗包含表达相同癌症特异性抗原或其癌症特异性片段(例如，B细胞受体或其片段)的多肽或核酸。已经出人意料地发现，当对癌症抗原是特异性的CAR以及该相同抗原被施用至受试者时，两者对肿瘤体积的减少具有协同作用。
在一个方面，本文提供了治疗受试者中的淋巴瘤的方法。该方法包括：
鉴定在受试者的淋巴瘤细胞中表达的独特的B细胞受体；
使所述独特的B细胞受体在细胞中表达；
使细胞与来自文库的推定的独特的B细胞受体配体接触；
检测所述独特的B细胞受体与推定的独特的B细胞受体配体的结合，从而鉴定独特的B细胞受体配体；以及
向受试者施用治疗有效量的与治疗剂偶联的B细胞受体配体。
在一些实施方案中，推定的独特的B细胞受体配体包括肽、环肽、类肽、环类肽、多糖、脂质或小分子。在一些实施方案中，独特的B细胞受体和推定的独特的B细胞受体配体在T细胞中共表达。在一些实施方案中，细胞包含含有推定的独特的B细胞受体配体的CAR。
在一些实施方案中，通过噬菌体展示使独特的B细胞受体与来自的文库的推定的独特的B细胞受体配体接触。在一些实施方案中，文库包括与噬菌体连接的推定的B细胞受体配体的文库。在一些实施方案中，独特的B细胞受体被附接至固体支持物。在一些实施方案中，使独特的B细胞受体与来自文库的推定的独特的B细胞受体配体接触包括用与噬菌体连接的推定的B细胞受体配体的文库淘选被附接至固体支持物的独特的B细胞受体一轮或更多轮。在一些实施方案中，每一轮淘选包括阴性选择。
在一些实施方案中，所述检测方法包括鉴定T细胞的活化。
在另一个方面，本文提供了治疗受试者中的淋巴瘤的方法。该方法包括：
鉴定在受试者的淋巴瘤细胞中表达的独特的B细胞受体；
使独特的B细胞受体和来自文库的推定的独特的B细胞受体配体在细胞中共表达；
检测所述独特的B细胞受体与推定的独特的B细胞受体配体的结合，从而鉴定独特的B细胞受体配体；以及
向受试者施用治疗有效量的与治疗剂偶联的B细胞受体配体。
在一些实施方案中，独特的B细胞受体和推定的独特的B细胞受体配体在T细胞中共表达。
在一些实施方案中，T细胞包含含有推定的独特的B细胞受体配体的CAR。
在一些实施方案中，所述检测方法包括鉴定T细胞的活化。
在一些实施方案中，将B细胞受体或其片段与治疗剂伴随施用至受试者。
在另一个方面，本文提供了鉴定B细胞受体配体的方法。该方法包括：
向T细胞的群体提供编码嵌合抗原受体(CAR)的文库和B细胞受体的核酸分子，其中文库中的每一个CAR包含不同的推定的B细胞受体配体结构域；
使B细胞受体和CAR的文库在T细胞中共表达；
测量所述T细胞的活化，其中如果表达B细胞受体和CAR的T细胞被活化，则来自CAR的文库的CAR的推定的B细胞受体配体结构域包含所述B细胞受体的配体；以及
从活化的T细胞中分离编码CAR的核酸分子；以及
对来自活化的T细胞的编码CAR的核酸分子的推定的B细胞受体配体结构域进行测序；
从而鉴定B细胞受体配体。
在一些实施方案中，B细胞受体来自癌细胞。在一些实施方案中，癌细胞是淋巴瘤细胞。在一些实施方案中，淋巴瘤细胞从来自患者的肿瘤获得。
在一些实施方案中，该方法还包括用B细胞受体配体治疗患有淋巴瘤的受试者，其中B细胞受体在来自受试者的肿瘤中表达；并且B细胞受体配体与治疗剂偶联。
在一些实施方案中，将B细胞受体或其片段与治疗剂伴随施用至受试者。
在另一个方面，本文提供了治疗淋巴瘤的方法。该方法包括：
向受试者施用治疗有效剂量的与治疗剂偶联的B细胞受体配体，
其中所述B细胞受体配体包含推定的B细胞受体配体结构域，并且其中含有所述推定的B细胞受体配体结构域的CAR在与淋巴瘤细胞的B细胞受体共表达时活化T细胞。
在另一个方面，本文提供了治疗受试者中的淋巴瘤的方法。该方法包括：
鉴定在受试者的淋巴瘤细胞中表达的独特的B细胞受体；
使独特的B细胞受体和来自CAR的文库的嵌合抗原受体(CAR)在T细胞中共表达，其中文库中的每一个CAR包含不同的推定的B细胞受体配体结构域；
通过鉴定活化的T细胞来鉴定B细胞受体配体，其中如果表达B细胞受体和CAR的T细胞被活化，则来自CAR的文库的CAR的推定的B细胞受体配体结构域包含所述独特的B细胞受体的配体；以及
向受试者施用治疗有效剂量的与治疗剂偶联的B细胞受体配体。
在一些实施方案中，该方法还包括制备与治疗剂偶联的B细胞受体配体。
在一些实施方案中，T细胞通过CAR的基于自分泌的活化而被活化。
在一些实施方案中，鉴定B细胞受体配体还包括从活化的T细胞中分离编码CAR的核酸分子；以及对来自活化的T细胞的编码CAR的核酸分子的推定的B细胞受体配体结构域进行测序。
在一些实施方案中，将B细胞受体或其片段与治疗剂伴随施用至受试者。
在另一个方面，本文提供了治疗受试者中的淋巴瘤的方法，该方法包括：
鉴定在受试者的淋巴瘤细胞中表达的独特的B细胞受体；
使独特的B细胞受体和来自文库的推定的独特的B细胞受体配体在细胞中共表达；
通过检测方法鉴定所述独特的B细胞受体配体，其中如果推定的独特的B细胞受体配体与独特的B细胞受体相互作用，则所述推定的独特的B细胞受体配体是独特的B细胞受体配体；以及
向受试者施用治疗有效量的与治疗剂偶联的B细胞受体配体。
在一些实施方案中，独特的B细胞受体和推定的独特的B细胞受体配体在T细胞中共表达。
在一些实施方案中，细胞包含含有推定的独特的B细胞受体配体的CAR。
在一些实施方案中，所述检测方法包括鉴定T细胞的活化。
在一些实施方案中，将B细胞受体或其片段与治疗剂伴随施用至受试者。
在另一个方面，本文提供了用于治疗受试者中的淋巴瘤的方法，该方法包括向受试者施用治疗有效量的表达第一CAR的CART细胞，其中：
(i)第一CAR包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含来自环肽文库的多肽，所述多肽结合在受试者的淋巴瘤细胞中表达的独特的B细胞受体，
(ii)抗原结合结构域通过以下鉴定
(a)鉴定在受试者的淋巴瘤细胞中表达的独特的B细胞受体；
(b)使独特的B细胞受体和来自CAR的文库的第二CAR在T细胞中共表达，其中文库中的每一个CAR包含不同的推定的配体结构域，所述不同的推定的配体结构域包含来自环肽文库的多肽；和
(c)通过鉴定活化的T细胞来鉴定所述第一CAR的抗原结合结构域，其中如果表达所述B细胞受体和所述第二CAR的T细胞被活化，则来自CAR的文库的第二CAR的推定的B细胞受体配体结构域包含所述第一CAR的抗原结合结构域；以及
(iii)所述第一CAR比对照具有更高的特异性和/或活性。
在一些实施方案中，对照包括CART细胞。在一些实施方案中，由CART细胞表达的CAR的抗原结合结构域结合除了B细胞受体之外的配体。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合CD-19。
在一些实施方案中，第一CAR和第二CAR是相同的CAR。在一些实施方案中，第一CAR和第二CAR是不同的CAR。
在一些实施方案中，活性包括相对于对照的对表达独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性。在一些实施方案中，在1:1-10:1的效应物:靶比，CART对表达独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性比对照高0％-10％，如通过裂解％测量的。在一些实施方案中，在10:1或更高的效应物:靶比，CART对表达独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性比对照高至少10％，如通过裂解％测量的。
在一些实施方案中，对照包含含有抗原结合结构域的CAR，该抗原结合结构域结合除了在表达独特的B细胞受体的细胞上表达的B细胞受体之外的配体。
在一些实施方案中，特异性包括对不表达独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性。在一些实施方案中，CART对不表达独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性小于10％，如通过裂解％测量的。在一些实施方案中，在小于10:1的效应物:靶比，CART对不表达独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性比结合在细胞上表达的配体的对照的细胞毒性低0％-10％。在一些实施方案中，在10:1或更高的效应物:靶比，CART对不表达独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性比结合在细胞上表达的配体的对照的细胞毒性低至少15％。
在一些实施方案中，将B细胞受体或其片段与治疗剂伴随施用至受试者。
在另一个方面，本文提供了用于治疗受试者群体中的淋巴瘤的方法，该方法包括：
选择患有淋巴瘤的受试者；以及
向每一个受试者施用治疗有效量的CART细胞，所述CART细胞表达对每一个受试者的淋巴瘤细胞上表达的B细胞受体独特的第一CAR，其中：
(i)第一CAR包括抗原结合结构域，该抗原结合结构域包含来自环肽文库的多肽，该多肽结合在每一个受试者的淋巴瘤细胞中表达的独特的B细胞受体，
(ii)抗原结合结构域通过以下鉴定
(a)鉴定在受试者的淋巴瘤细胞中表达的独特的B细胞受体；
(b)使独特的B细胞受体和来自CAR的文库的第二CAR在T细胞中共表达，其中该文库中的每一个CAR包含不同的推定的配体结构域，该不同的推定的配体结构域包含来自环肽文库的多肽；和
(c)通过鉴定活化的T细胞来鉴定第一CAR的抗原结合结构域，其中如果表达B细胞受体和第二CAR的T细胞被活化，则来自CAR的文库的第二CAR的推定的B细胞受体配体结构域包含第一CAR的抗原结合结构域；以及
(iii)第一CAR比对照具有更高的特异性和/或活性。
在一些实施方案中，对照包括CART细胞。在一些实施方案中，由CART细胞表达的CAR的抗原结合结构域结合除了B细胞受体之外的配体。在一些实施方案中，抗原结合结构域结合CD-19。
在一些实施方案中，第一CAR和第二CAR是相同的CAR。在一些实施方案中，第一CAR和第二CAR是不同的CAR。
在一些实施方案中，活性包括相对于对照的对表达独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性。在一些实施方案中，在1:1-10:1的效应物:靶比，CART对表达独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性比对照高0％-10％，如通过裂解％测量的。在一些实施方案中，在10:1或更高的效应物:靶比，CART对表达独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性比对照高至少10％，如通过裂解％测量的。
在一些实施方案中，对照包含含有抗原结合结构域的CAR，该抗原结合结构域结合除了在表达独特的B细胞受体的细胞上表达的B细胞受体之外的配体。
在一些实施方案中，特异性包括对不表达独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性。在一些实施方案中，CART对不表达独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性小于10％，如通过裂解％测量的。在一些实施方案中，在小于10:1的效应物:靶比，CART对不表达独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性比结合在细胞上表达的配体的对照的细胞毒性低0％-10％。在一些实施方案中，在10:1或更高的效应物:靶比，CART对不表达独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性比结合在细胞上表达的配体的对照的细胞毒性低至少15％。
在另一个方面，本文提供了快速鉴定对B细胞淋巴瘤特异性的个体化抗体结合配体，例如B细胞受体配体的方法，该方法包括：
鉴定来自B细胞淋巴瘤细胞的B细胞受体，
向T细胞的群体提供编码嵌合抗原受体(CAR)的文库和所述B细胞受体的核酸分子，其中文库中的每一个CAR包含不同的推定的B细胞受体配体结构域；
使所述B细胞受体和CAR的文库在T细胞中共表达；
测量所述T细胞的活化，其中如果表达所述B细胞受体和CAR的T细胞被活化，则来自CAR的文库的CAR的推定的B细胞受体配体结构域包含所述B细胞受体的配体；以及
从活化的T细胞中分离编码CAR的核酸分子；以及
对来自活化的T细胞的编码CAR的核酸分子的推定的B细胞受体配体结构域进行测序；
从而鉴定B细胞受体配体。
在一些实施方案中，B细胞受体配体在4周内、3周内、2周内或1周内被鉴定出。在一些实施方案中，B细胞受体配体在3周内被鉴定出。
在一些实施方案中，B细胞淋巴瘤细胞从来自患者的肿瘤获得。
在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体结构域包含30个氨基酸或更少氨基酸的多肽。在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体结构域包含来自环肽文库的多肽。在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体结构域还包含Fc区。
在一些实施方案中，T细胞活化通过CD69或CD25的表达的增加来测量。在一些实施方案中，T细胞活化通过在Jun、NF-κB和/或Rel的控制下的荧光蛋白报告物基因的表达的增加来测量。
在一些实施方案中，该方法还包括用B细胞受体配体治疗患有淋巴瘤的受试者，其中B细胞受体配体与治疗剂偶联。
在另一个方面，本文提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体(CAR)包含：
推定的B细胞受体配体结构域，该推定的B细胞受体配体结构域包含来自环肽文库的多肽；
跨膜结构域；和
胞内区域。
在一些实施方案中，CAR在与B细胞受体共表达时活化T细胞，其中B细胞受体的B细胞受体配体包含推定的B细胞受体配体结构域。在一些实施方案中，B细胞受体配体包含SEQID NO:1-3中任一个的氨基酸序列。
在另一个方面，本文提供了一种治疗受试者中的淋巴瘤的方法，该方法包括：
鉴定在受试者的淋巴瘤细胞中表达的独特的B细胞受体；
使所述独特的B细胞受体与噬菌体展示文库接触，其中所述噬菌体展示文库包括与噬菌体连接的推定的独特的B细胞受体配体的文库；
检测所述独特的B细胞受体与推定的独特的B细胞受体配体的结合，从而鉴定独特的B细胞受体配体；以及
向受试者施用治疗有效量的与治疗剂偶联的所述B细胞受体配体。
在一些实施方案中，推定的独特的B细胞受体配体包括肽、环肽、类肽、环类肽、多糖、脂质或小分子。
在一些实施方案中，独特的B细胞受体被附接至固体支持物。
在一些实施方案中，使独特的B细胞受体与来自文库的推定的独特的B细胞受体配体接触包括用与噬菌体连接的推定的B细胞受体配体的文库淘选被附接至固体支持物的独特的B细胞受体一轮或更多轮。在一些实施方案中，每一轮淘选包括阴性选择。
在一些实施方案中，受试者被确定为患有淋巴瘤。
在一些实施方案中，受试者被确定为具有与淋巴瘤相关的一个或更多个单核苷酸多态性(SNP)。
在一些实施方案中，鉴定独特的B细胞受体包括：
从活检物获得细胞；
从所述细胞提取RNA；
由所提取的RNA合成cDNA；以及
对所述cDNA进行测序。在一些实施方案中，鉴定独特的B细胞受体包括对循环无细胞DNA进行克隆和测序。
在一些实施方案中，该方法在3周或更少时间内进行。
在一些实施方案中，治疗剂包括放射性同位素。
在一些实施方案中，偶联有治疗剂的B细胞受体配体包括治疗性CAR。在一些实施方案中，治疗剂包括化学疗法。在一些实施方案中，治疗剂包括免疫疗法。
在另一个方面，本文提供了一种治疗受试者中的癌症的方法。在一些实施方案中，该方法包括伴随施用：表达CAR的T细胞，其中CAR包含以癌症特异性方式特异性结合癌症特异性抗原的抗原结合结构域；和疫苗，该疫苗包含表达癌症特异性抗原或其癌症特异性片段的多肽或核酸。
在一些实施方案中，癌症特异性抗原是B细胞受体。在一些实施方案中，癌症是淋巴瘤。在一些实施方案中，多肽或核酸包含重链可变区或轻链可变区或其片段。
在一些实施方案中，癌症特异性抗原在癌症中表达，并且包含体细胞突变。在一些实施方案中，受试者的非癌细胞没有体细胞突变。在一些实施方案中，突变是点突变、剪接位点突变、移码突变、读通突变(read-through mutation)或基因融合突变。在一些实施方案中，体细胞突变包括EGFRvIII、PSCA、BCMA、CD30、CEA、CD22、L1CAM、ROR1、ErbB、CD123、IL13Rα2、间皮素、FRα、VEGFR、c-Met、5T4、CD44v6、B7-H4、CD133、CD138、CD33、CD28、GPC3、EphA2、CD19、ACVR2B、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、MYCN、BCR、HER2、NY-ESO1、MUC1或MUC16中的突变。在一些实施方案中，癌症包括肿瘤。在一些实施方案中，多肽或核酸包含体细胞突变。
在一些实施方案中，伴随施用在受试者中发生至少两次、至少三次、至少四次、至少五次、至少六次、至少七次、至少八次、至少九次或至少十次。一些实施方案中，表达CAR的T细胞在疫苗之前施用。在一些实施方案中，表达CAR的T细胞在疫苗之后施用。
在一些实施方案中，该方法还包括鉴定受试者中的癌症特异性抗原。在一些实施方案中，鉴定癌症特异性抗原包括：(i)从受试者获得癌细胞；(ii)从所述细胞提取DNA；以及(iii)对DNA进行测序。在一些实施方案中，鉴定癌症特异性抗原还包括将从癌细胞获得的DNA序列与从非癌细胞获得的同一基因的DNA序列进行比较。在一些实施方案中，DNA是从肿瘤细胞分离的。在一些实施方案中，鉴定癌症特异性抗原包括对受试者的循环无细胞DNA进行分离并测序。在一些实施方案中，鉴定癌症特异性抗原包括：(i)从受试者获得癌细胞；(ii)从所述细胞提取RNA；(iii)由所提取的RNA合成cDNA；以及(iv)对cDNA进行测序。在一些实施方案中，鉴定癌症特异性抗原还包括将从癌细胞获得的cDNA序列与从非癌细胞获得的同一基因的cDNA序列进行比较。
在一些实施方案中，疫苗包含具有重叠序列的两种或更多种多肽，每一种多肽表达癌症特异性抗原的片段。
在一些实施方案中，该方法还包括通过以下提供表达CAR的T细胞：(i)鉴定以癌症特异性方式特异性结合癌症特异性抗原的抗原结合结构域；以及(ii)使含有抗原结合结构域的CAR在T细胞中表达。
在一些实施方案中，多肽被缀合至KLH。
在一些实施方案中，疫苗通过静脉内施用、腹膜内施用、经粘膜施用、口服施用、皮下施用、肺部施用、鼻内施用、皮内施用或肌内施用来施用。在一些实施方案中，疫苗被瘤内施用。
在一些实施方案中，表达CAR的T细胞通过静脉内施用来施用。
在一些实施方案中，该方法还包括施用TLR9激动剂。在一些实施方案中，癌症特异性抗原是OX40。
在另一个方面，本文提供了一种用于治疗受试者中的癌症的组合物，该组合物包含：表达CAR的T细胞，其中CAR包含以癌症特异性方式特异性结合癌症特异性抗原的抗原结合结构域；和表达癌症特异性抗原或其癌症特异性片段的多肽或核酸。
在一些实施方案中，癌症特异性抗原是B细胞受体。在一些实施方案中，多肽或核酸包含重链可变区或轻链可变区或其片段。
在一些实施方案中，癌症特异性抗原在癌症中表达，并且包含体细胞突变。
在一些实施方案中，受试者的非癌细胞没有体细胞突变。在一些实施方案中，突变是点突变、剪接位点突变、移码突变、读通突变或基因融合突变。在一些实施方案中，体细胞突变包括EGFRvIII、PSCA、BCMA、CD30、CEA、CD22、L1CAM、ROR1、ErbB、CD123、IL13Rα2、间皮素、FRα、VEGFR、c-Met、5T4、CD44v6、B7-H4、CD133、CD138、CD33、CD28、GPC3、EphA2、CD19、ACVR2B、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、MYCN、BCR、HER2、NY-ESO1、MUC1或MUC16中的突变。在一些实施方案中，多肽或核酸包含体细胞突变。
在一些实施方案中，疫苗包含具有重叠序列的两种或更多种多肽，每一种多肽表达癌症特异性抗原的片段。
在一些实施方案中，多肽被缀合至KLH。
在一些实施方案中，该方法还包括施用TLR9激动剂。在一些实施方案中，癌症特异性抗原是OX40。
在一些实施方案中，CAR，例如本文描述的CAR，包含跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域包括T细胞受体的α链、β链或δ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和/或CD154。
在一些实施方案中，CAR，例如本文描述的CAR，包含胞内区域。在一些实施方案中，胞内区域包括MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD25/CD18)、4-29B(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD423、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD129、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244,304)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD123和/或与CD83特异性结合的配体。
在一些实施方案中，CAR，例如本文描述的CAR，包含铰链结构域。
在一些实施方案中，治疗剂包括放射性同位素。在一些实施方案中，偶联有治疗剂的B细胞受体配体包括治疗性CAR。在一些实施方案中，治疗剂包括化学疗法。在一些实施方案中，治疗剂包括免疫疗法。
在一些实施方案中，鉴定独特的B细胞受体包括：从活检物获得细胞；从所述细胞提取RNA；由提取的RNA合成cDNA；以及对cDNA进行测序。在一些实施方案中，鉴定独特的B细胞受体包括对循环无细胞DNA进行克隆和测序。
在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体结构域包括30个氨基酸或更少氨基酸的多肽。在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体结构域包含来自环肽文库的多肽。在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体结构域还包含Fc区。
在一些实施方案中，T细胞活化通过CD69或CD25的表达的增加来测量。在一些实施方案中，T细胞活化通过在Jun、NF-κB和/或Rel的控制下的荧光蛋白报告物基因的表达的增加来测量。
在一些实施方案中，该方法在3周或更少时间内进行。
在一些实施方案中，受试者被确定为患有淋巴瘤。在一些实施方案中，受试者被确定为具有与淋巴瘤相关的一个或更多个单核苷酸多态性(SNP)。
附图简述
以下附图构成本说明书的一部分并且被包括以进一步说明本公开内容的某些方面，通过参考这些附图中的一个或更多个，结合本文呈现的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解本公开内容的某些方面。在附图中：
图1是示出用于个体化滤泡性淋巴瘤CAR-T疗法的配体选择的工作流程的示意图。分离来自患有滤泡性淋巴瘤的患者的***活检样品，并且将收集的肿瘤细胞用于鉴定恶性BCR基因，此后使用PDGFR作为膜锚将恶性BCR基因重建为膜结合的BCR。重建的恶性BCR与环肽CAR文库在Jurkat细胞系表面上共表达，用作用于选择肿瘤细胞靶向配体的报告物细胞***。在几轮淘选后，与嵌合抗原受体融合的选择的肽配体被测序，并且可以被立即用于产生经肿瘤特异性CAR修饰的治疗性T淋巴细胞。从上至下的序列对应于SEQ ID NO:31和32。
图2A-图2C示出了恶性FL-BCR配体的基于自分泌的选择。图2A示出了报告物***形式。图2B是示出通过Myc-CAR/抗Myc抗体对相互作用验证报告物细胞测定的流式细胞术数据。图2C示出了CAR上的患者BCR特异性肽活化了由膜栓系的滤泡性淋巴瘤BCR转导的报告物Jurkat细胞。
图3A-图3D是示出了所选择的肽配体与FL-BCR特异性地相互作用并且将CTL重定向以杀伤肿瘤细胞的图。图3A是一系列直方图，示出了所选择的环肽CILDLPKFC(FL1)(SEQID NO:1)、CMPHWQNHC(FL2)(SEQ ID NO:2)和CTTDQARKC(FL3)(SEQ ID NO:3)与恶性BCR的相互作用的SPR分析。淋巴瘤BCR scFv转导的Raji细胞用合成的生物素化肽和抗IgG Fc抗体的表面染色。对于IgG Fc染色，在三个直方图中使用相同的Raji细胞群流式细胞术结果作为对照。图3B是示出了细胞裂解％的一系列图。将FL-CART与用不同的淋巴瘤BCR转导的Raji细胞共培养。模拟转导的T细胞和CD19-CART用作比较。通过测量6小时后乳酸脱氢酶释放来确定细胞毒性。图3C示出了用合成的生物素化FL1肽对来自患者的活检物的细胞或对照B细胞进行染色。B细胞群体通过B220特异性抗体来鉴定，并且FL1肽用生物素标记并用FITC标记的链霉亲和素检测。图3D是示出来源于淋巴瘤活检样品的B细胞通过FL1-CART的裂解与通过Myc-CART以及模拟转导的T细胞的裂解进行比较的图。
图4A-图4F示出了通过FL1-CAR重定向的CTL抑制体内淋巴瘤发生(lymphomagenesis)。图4A是示出实验设计的示意图，指示NOD SCID小鼠植入了5×106个Raji-FL1细胞。在第15天，根据肿瘤体积将动物(每组12只)随机分组，并且在第17天每只小鼠静脉内(i.v.)接受3×106个FL1-CART、CD19-CAR或Myc-CART。图4B是示出了用表达FL1-CAR、Myc-CAR和CD19-CAR构建体的基于慢病毒的载体对活化的CD3/CD28珠扩增的人类CD8+T细胞的转导效率的一系列图。将细胞用IgG1特异性抗体或蛋白L染色。图4C是示出在肿瘤注射后第17天用3×106个CTL治疗的Raji-F1异种移植小鼠的存活率的图(每组n＝12只小鼠)。总存活曲线使用Kaplan-Meier法绘制，并且使用对数秩(Mantel-Cox)检验进行比较(*p<0.01)。图4D是示出在注射Raji-FL1后第17天通过静脉内施用3×106个FL1-CART、CD19-CART或Myc-CART治疗的小鼠组(n＝12)中的肿瘤生长曲线的图。用CD3+特异性抗体使用流式细胞术分析，监测从眼眶后(retro-orbital)穿刺获得的血液中过继转移的修饰的T细胞的绝对计数(插图)。图4E示出了注射前和注射后第21天的FL1-CART细胞的表型的流式细胞术分析。图4F是示出了注射后第21天初始
Figure BDA0002525200530000161
中央记忆和效应记忆CART的相对百分比的图。
图5A-图5C图示了重建的恶性BCR和组合环肽文库的结构。图5A示出了与嵌合抗原受体信号传导结构域融合的组合环肽文库的氨基酸序列。该序列对应于SEQ ID NO:33。图5B示出了与IgG1 Fc铰链和跨膜PDGFR结构域融合的重建的恶性BCR。该序列对应于SEQ IDNO:34。图5C示出了分泌的分子的示意图。
图6示出了在没有外源淋巴瘤BCR的情况下，FL-CART未消除Raji细胞。仅CD-19CART显示出对常规Raji细胞的杀伤活性。当FL1-CAR、FL2-CAR和FL3-CART细胞与Raji细胞一起孵育时，观察到最小的非特异性裂解。通过测量6小时后乳酸脱氢酶释放来确定细胞毒性。
图7A-图7C示出了通过FL1-CAR重定向的CTL浸润实体瘤并且防止异种移植物转移。图7A示出了在用CD19-CART、FL1-CART和Myc-CART治疗的小鼠中，在肿瘤植入后第35天Raji-FL1细胞(绿色，由箭头指示)的器官特异性转移的生物发光成像。对于Raji-FL1细胞检测，小鼠接受了腹膜内(i.p.)注射的D萤光素。图7B示出了来自CD19-CART、FL1-CART或Myc-CART治疗的动物的肿瘤的组织病理学变化分析。为了鉴定组织病理学变化，将肿瘤用苏木精-伊红染色。具有嗜碱性细胞质和高有丝***率的淋巴瘤B细胞在右图以黑色箭头示出。呈现特征性的“星空(starry sky)”外观的含有细胞碎片的巨噬细胞在右图以红色箭头指示。被认为处于凋亡状态的细胞在左图由箭头指示。图7C示出了CD19-CART、FL1-CART或Myc-CART浸润到肿瘤中(黑色箭头)的免疫组织化学分析。使用人类CD8特异性抗体用于CART染色。
图8A-图8E示出了恶性B细胞受体识别自身抗原myoferlin。图8A示出了myoferlin驱动的自身反应性淋巴瘤发生的示意图。图8B示出了在FL患者1活检样品中的bcl-2重排的PCR分析。示出了用可溶性恶性BCR对HEp-2细胞(图8C)和表达myoferlin的HEK293T细胞(图8D)的染色。图8E中示出的是已鉴定的恶性特异性肽FL1与蛋白Myoferlin和来自缓症链球菌(Streptococcus mitis)和杰氏肺囊虫(Pneumocytis jirovecii)的表面蛋白的氨基酸序列的比对。从上至下的序列对应于SEQ ID NO:1、35、36和37。
图9示出了在移植后不同时间点对PBMC进行的淋巴样(lymphoid)门控中的hCD45+淋巴细胞、CD3+ T细胞和CD19+ B细胞的百分比。
图10示出了在移植后不同时间点的PBMC中的CD4+和CD8+人类T细胞子集的百分比。
图11示出了在移植后不同时间点的人源化小鼠血浆中的人类IgM和IgG的水平。
图12示出了实验组中的肿瘤生长动力学。
图13示出了在第38天的CAR T细胞的数量。
图14示出了对PBMC进行的淋巴样(lymphoid)门控中的hCD45+淋巴细胞、CD3+ T细胞和CD19+ B细胞的水平。
图15示出了PBMC中CD4+和CD8+人类T细胞子集的百分比。
图16示出了在移植后不同时间点的小鼠血浆中的人类IgM和IgG的水平。
图17示出了CAR T慢病毒载体。
图18示出了实验组中的肿瘤生长动力学。
图19示出了实施例3中使用的噬菌体展示环肽文库试剂盒(Phage DisplayCyclopeptide Library Kit)中使用的侧接半胱氨酸的NNK编码部分。从上至下的序列对应于SEQ ID NO:38、39和40。
图20示出了如实施例3中描述的，使用患者FL1和FL5的BCR针对患者FL1的BCR进行的I-III轮淘选产生的噬菌体结合的ELISA结果。对于示出的每一种抗体，从左至右，每一轮淘选的噬菌体浓度为5、2.5、1.25、0.63和0.31mk/孔。
发明详述
本公开内容提供了使用个体化药物治疗B细胞恶性肿瘤的方法。更具体地，该方法提供了从受试者的B细胞恶性肿瘤中分离B细胞受体，鉴定该B细胞受体的配体，并且然后用与治疗剂偶联的B细胞受体配体，例如其中B细胞受体配体包含抗原结合结构域的CART细胞治疗受试者。在一些实施方案中，本公开内容的方法使用基于自分泌的形式来鉴定对肿瘤特异性的B细胞受体配体。通过使B细胞受体和推定的B细胞受体配体的文库共表达，B细胞受体配体可以通过其与B细胞受体的结合来鉴定。可选地，B细胞受体配体可以通过噬菌体展示来鉴定。B细胞受体配体当与治疗剂偶联时可以是有效的治疗剂，因为B细胞受体配体可以通过结合B细胞受体使治疗剂靶向至B细胞恶性肿瘤。本文描述的方法对于治疗B细胞恶性肿瘤特别有用，因为B细胞肿瘤是具有B细胞受体的克隆群体，B细胞受体存在于肿瘤的所有细胞中并且仅存在于肿瘤的细胞中。这允许鉴定没有或具有很少脱靶效应(offtarget effects)的个体化治疗靶。
在一些实施方案中，本文描述的方法利用自分泌信号传导。因此，本文描述的方法利用自分泌信号传导来鉴定用于治疗B细胞恶性肿瘤的新的治疗剂。如本文使用的，“自分泌信号传导”是指其中细胞分泌与同一细胞上的自分泌受体(例如B细胞受体)结合的激素或化学信使(例如抗原)、导致细胞中的变化的细胞信号传导形式。
例如，可以通过使来自肿瘤的B细胞受体和CAR在T细胞中共表达来鉴定B细胞受体配体，其中CAR的胞外结构域包含来自组合肽文库的肽。T细胞通过CAR的活化指示CAR的胞外结构域已经结合B细胞受体，并且来自肽文库的肽是B细胞配体。
一旦鉴定出B细胞受体配体，就可以用与治疗剂附接的配体治疗患者。治疗剂可以包括化学疗法药物、免疫疗法或放射性同位素。含有B细胞受体配体的CAR可以包含治疗剂。CAR可以是用于鉴定B细胞受体配体的相同CAR，允许特别快速地鉴定个体化治疗靶并合成个体化药物。
从诊断到治疗的整个过程可以在短时间段内，例如在几周内完成。
本公开内容还提供了用于治疗癌症的方法，所述方法通过施用表达CAR的T细胞以及疫苗来进行，其中该CAR包含以癌症特异性方式特异性结合癌症特异性抗原的抗原结合结构域，该疫苗包含表达相同癌症特异性抗原或其癌症特异性片段的多肽或核酸。已经出人意料地发现，当对癌症抗原特异性的CAR和该相同抗原被施用至受试者时，两者对肿瘤体积的减少具有协同作用。
在一些实施方案中，表达CAR的T细胞包含具有推定的B细胞受体配体的CAR，并且疫苗包含B细胞受体的片段或全部。在一些实施方案中，表达CAR的T细胞包含对癌细胞特异性的抗原的抗体片段，并且疫苗包含该相同抗原的片段或全部。
B细胞受体
B细胞受体或BCR是位于B细胞外表面上的跨膜受体蛋白。受体的结合部分包括膜结合抗体，与所有抗体一样，膜结合抗体具有由V(D)J重组产生的独特且随机确定的抗原结合位点。当B细胞被其第一次遇到与其受体结合的抗原(其“同源抗原(cognate antigen)”)活化时，该细胞增殖并分化产生一群分泌抗体的血浆B细胞和记忆B细胞。
BCR与跨膜蛋白CD79复合，并在BCR识别抗原后产生信号。CD79包括两条不同的链，CD79A和CD79B，它们在B细胞表面上形成通过二硫键稳定的异二聚体。CD79a和CD79b都是免疫球蛋白超家族的成员。两条CD79链在其胞内尾部都含有免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif)(ITAM)，它们使用免疫受体酪氨酸活化基序以在B细胞中传播信号(其方式与在T细胞上T细胞受体活化期间观察到的CD3产生的信号转导相似)。
如本文使用的，术语“抗体”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白。例如，抗体可以包含重(H)链可变区(本文缩写为VH)和轻(L)链可变区(本文缩写为VL)。在另一个实例中，抗体包含两个重(H)链可变区和两个轻(L)链可变区。抗体可以具有IgA、IgG、IgE、IgD、IgM(及其亚型)的结构特征。
VH区和VL区可以被进一步细分为被称为“互补决定区”(“CDR”)的高变区，高变区间散布着被称为“框架区”(“FR”)的更保守的区域。已经精确定义了框架区和CDR的范围(参见，Kabat,E.A.,等人(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,U.S.Department of Health and Human Services,NIH公布第91-3242号,以及Chothia,C.等人(1987)J.Mol.Biol.196:901-917，还参见www.hgmp.mrc.ac.uk)。本文使用Kabat定义。每一个VH和VL通常包含三个CDR和四个FR，按以下顺序从氨基末端至羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
抗体的VH链或VL链还可以包含重链恒定区或轻链恒定区，从而分别形成免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链。在一种实施方案中，抗体是两个免疫球蛋白重链和两个免疫球蛋白轻链的四聚体，其中免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链通过例如二硫键相互连接。在IgG中，重链恒定区包含三个免疫球蛋白结构域，CH1、CH2和CH3。
B细胞恶性肿瘤代表了包括大多数非霍奇金淋巴瘤(NHL)、一些白血病和骨髓瘤的多样化疾病的集合。实例包括慢性淋巴细胞白血病、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤。B细胞恶性肿瘤可以被表征为惰性或侵袭性。惰性恶性肿瘤，诸如滤泡性淋巴瘤、小淋巴细胞性淋巴瘤和边缘区淋巴瘤，其特征是生长缓慢和高初始响应率，随后是复发和进行性疾病过程。侵袭性淋巴瘤，诸如弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤和伯基特淋巴瘤，其特征是快速生长和较低的初始响应率，总存活期(OS)较短。
B细胞恶性肿瘤的特征在于它们是B细胞的克隆群体。因为它们是B细胞的克隆群体，所以癌细胞的群体(例如肿瘤)中的每一个癌细胞都具有相同的B细胞受体。因此，癌细胞上的B细胞受体是可以被BCR的配体靶向的肿瘤特异性抗原(或“抗原”)。
因此，本文公开了用于鉴定BCR配体的方法。一旦鉴定后，BCR配体可以被用作例如癌症治疗。治疗剂可以通过BCR和BCR配体之间的相互作用靶向癌细胞。
在一些实施方案中，本文描述的方法包括鉴定或提供例如在癌细胞中表达的B细胞受体。在一些实施方案中，鉴定或提供B细胞受体包括从受试者获得样品。在一些实施方案中，样品是流体样品，例如血液。在一些实施方案中，样品是组织样品。在一些实施方案中，样品包括，例如肿瘤样品或活检物。在一些实施方案中，活检是***活检物。
在一些实施方案中，样品来自具有或疑似具有癌症的受试者。在一些实施方案中，癌症是B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症是淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症选自弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(MZL)或粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤(primary effusion lymphoma)、淋巴瘤样肉芽肿病、原发性中枢神经***淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、发生于HHV8相关多中心性Castleman病的大B细胞淋巴瘤和B细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，受试者被确定为具有本文描述的癌症的任何一种。在一些实施方案中，受试者被确定为具有B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，受试者被确定为患有淋巴瘤。在一些实施方案中，受试者被确定为具有与癌症(例如，B细胞恶性肿瘤和/或淋巴瘤)相关的一个或更多个单核苷酸多态性。如本文使用的，“单核苷酸多态性”(SNP)是指当基因组(或其他共有序列)中的单核苷酸——A、T、C或G——在生物物种成员之间或个体的成对染色体之间不同时发生的DNA序列变异。
在一些实施方案中，鉴定或提供B细胞受体包括从样品的细胞中提取RNA。用于从细胞中提取RNA的方法是本领域技术人员熟知的，并且包括例如基于苯酚/氯仿的提取方法或RNAeasy kitTM(Qiagen)的使用。
在一些实施方案中，鉴定或提供B细胞受体包括从所提取的RNA中合成cDNA。用于产生cDNA的方法是本领域技术人员熟知的，并且包括通过逆转录酶由mRNA形成cDNA。
在一些实施方案中，鉴定或提供B细胞受体包括对cDNA进行测序。进行的测序的类型可以是，例如，焦磷酸测序、单分子实时测序、ion torrent测序、边合成边测序、边连接边测序(SOLiDTM)和链终止测序(例如，Sanger测序)。测序方法是本领域已知的并且是商购可得的(参见，例如，Ronaghi等人；Uhlén,M；Nyrén,P(1998).“A sequencing method basedon real-time pyrophosphate”.Science 281(5375):363；和Ronaghi等人；Karamohamed,S；Pettersson,B；Uhlén,M；Nyrén,P(1996)."Real-time DNA sequencing usingdetection of pyrophosphate release".Analytical Biochemistry 242(1):84–9.；以及从以下可得的服务和产品：Roche(454平台)、Illumina(HiSeq和MiSeq***)、PacificBiosciences(PACBIO RS II)、Life Technologies(Ion ProtonTM***和SOLiDTM***))。
在一些实施方案中，使用本文描述的方法将B细胞受体克隆到表达载体中用于在T细胞中表达B细胞受体。
在一些实施方案中，使用载体，例如pComb3X载体，将B细胞受体克隆成scFv形式。
在一些实施方案中，将B细胞受体的scFv形式克隆到载体中，用于将抗体分子表达为二聚体，使可变区在质膜中而结合位点面向溶剂。在一些实施方案中，将B细胞受体的scFv形式克隆到含有接头的载体中。在一些实施方案中，接头是血小板来源生长因子受体的跨膜结构域的柔性接头。在一些实施方案中，载体还包含抗体的恒定结构域，例如Fc，例如IgG1Fc。
鉴定B细胞受体配体
在一些实施方案中，本文描述的方法包括鉴定B细胞受体配体。一旦B细胞受体被鉴定后，就通过使B细胞受体与推定的B细胞受体配体，例如，推定的B细胞受体配体的文库接触来鉴定B细胞受体的配体。
在一些实施方案中，本文描述的方法提供了使B细胞受体和推定的B细胞受体配体的文库在细胞例如T细胞中共表达，并且检测B细胞受体与推定的B细胞受体配体的结合，从而鉴定独特的B细胞受体配体。
在一些实施方案中，检测结合包括测量B细胞受体信号传导的水平。当B细胞受体和推定的B细胞受体配体都表达时，例如在B细胞中都表达时，如果推定的B细胞受体配体是B细胞受体的配体，则对B细胞受体的结合将启动信号传导级联。在一些实施方案中，检测结合包括测量由BCR信号传导调节的基因的表达。
在一些实施方案中，本文描述的方法提供了使B细胞受体和含有推定的B细胞受体配体结构域的CAR的文库在T细胞中共表达，并且通过鉴定T细胞通过CAR的活化检测B细胞受体与推定的B细胞受体配体的结合，从而鉴定独特的B细胞受体配体。
在一些实施方案中，用编码B细胞受体和CAR的核酸转导或转染T细胞，并且在一段时间后测量T细胞活化。在一些实施方案中，在转导或转染后2小时、4小时、6小时、8小时、12小时、16小时或20小时，或1天、1.5天、2天、2.5天、3天、3.5天、4天、4.5天或5天，例如转导或转染后2天，测量T细胞活化。
在一些实施方案中，使B细胞受体和CAR共表达包括将用编码B细胞受体和CAR的核酸转导或转染的T细胞在培养基中培养。用于培养T细胞的培养基是本领域技术人员熟知的。在一些实施方案中，T细胞在DMEM或RPMI培养基中培养。在一些实施方案中，培养基补充有FBS，例如，5％-20％FBS，例如，10％FBS。在一些实施方案中，培养基补充有HEPES，例如，1-100mM HEPES，例如，10mM HEPES。在一些实施方案中，培养基补充有青霉素，例如，10-500U/ml青霉素，例如，100U/ml青霉素。在一些实施方案中，培养基补充有链霉素，例如，10-500ug/ml链霉素，例如，100ug/ml链霉素。在一些实施方案中，培养基补充有L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，例如，0.1-10mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺，例如，2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺。
在一些实施方案中，测量T细胞活化的水平包括测量在活化的T细胞中表达的基因的核酸或蛋白水平。在T细胞活化期间被下调的基因的实例包括，例如，L-选择素、CD127和BCL-2。在T细胞活化期间被下调的基因的实例包括，例如，CD69、CD25、CD40L、CD44、Ki67和KLRG1。在一些实施方案中，T细胞包含在转录因子的控制下的荧光蛋白报告物基因，该转录因子在T细胞被活化时活化转录，并且测量活化包括测量产生的荧光蛋白的量。在一些实施方案中，转录因子是Jun、NF-κB或Rel。
基因表达可以在RNA水平或蛋白水平上测量。用于检测RNA的测定包括，但不限于，RNA印迹分析、RT-PCR、测序技术、RNA原位杂交(使用，例如，DNA探针或RNA探针来使样品中存在的RNA杂交)、原位RT-PCR(例如，如以下中描述的：Nuovo GJ,等人Am J SurgPathol.1993,17:683-90；Komminoth P,等人Pathol Res Pract.1994,190:1017-25)和寡核苷酸微阵列(例如，通过使来源于样品的多核苷酸序列与被附接至固体表面(例如，具有可寻址位置的玻璃晶片，诸如Affymetrix微阵列(
Figure BDA0002525200530000241
Santa Clara,CA))的寡核苷酸的杂交。
用于检测蛋白水平的测定包括，但不限于，免疫测定(本文也称为基于免疫(immune-based)的测定或基于免疫(immuno-based)的测定，例如，蛋白印迹、ELISA、邻近延伸测定和ELISpot测定)、质谱测定和基于珠的多重测定(multiplex bead-based assays)。蛋白检测和定量方法的其他实例包括如，例如，美国专利第6939720号和第8148171号以及公布的美国专利申请第2008/0255766号中描述的多重免疫测定，以及如例如公布的美国专利申请第2009/0088329号中描述的蛋白微阵列。
在一些实施方案中，一旦活化的T细胞被鉴定出，在T细胞中表达的CAR被鉴定出。因此，在一些实施方案中，用于鉴定活化的T细胞的方案允许鉴定活化的T细胞以及将活化的T细胞与未活化的T细胞分离。这样的方案的一个实例是流式细胞术。使用通常的流式细胞术，并且特别是荧光活化细胞分选(FACS)，用于基于多种特性进行细胞分选的目的，是本领域技术人员容易知晓的。在FACS中，基于每个细胞的特定光散射和荧光特征，生物细胞的异质混合物可以被分选到两个或更多个容器中，一次一个细胞。这允许例如基于荧光标志物对细胞进行分选。因此，在某些实施方案中，T细胞活化可以通过荧光标志的或标记的转录物或蛋白的水平来测量。在一些实施方案中，蛋白，例如，细胞表面定位的蛋白，例如，在本文描述的活化的T细胞中被上调或被下调的蛋白的表达水平可以通过使细胞与共价或非共价偶联至荧光标记物的抗体接触来测量。在一些实施方案中，抗体靶向在活化的T细胞中被上调或被下调的蛋白。这可以允许基于活化的T细胞中被上调或被下调的蛋白的表达水平来分选细胞，从而允许将活化的T细胞与未活化的T细胞分离。在一个示例性实施方案中，活化的T细胞可以通过T细胞与GFP标记的抗CD69抗体的结合来鉴定。
在一些实施方案中，检测推定的B细胞受体配体和表达B细胞受体的细胞之间的结合包括使推定的B细胞受体配体与表达B细胞受体的细胞的结合可视化。例如，在一些实施方案中，配体被加标签以允许配体定位的可视化。合适的标签包括，例如，荧光基因，诸如，GFP、YFP、RFP等。在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体对表达B细胞受体的细胞的定位可以使用本领域技术人员已知的任何合适的方法，例如，荧光显微术、免疫组织化学或FACS来评估。在一些实施方案中，B细胞受体配体与表达B细胞受体的细胞结合，并且当B细胞受体不表达时，不与相同的细胞类型结合。
在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体的文库通过噬菌体展示与B细胞受体接触。
“噬菌体展示”是一种技术，通过这种技术，变体多肽以与外壳蛋白的融合蛋白的形式被展示在噬菌体，例如，丝状噬菌体颗粒的表面上。噬菌体展示的一个用途在于，对于以高亲和力与靶分子结合的那些序列，可以对随机蛋白变体的大文库进行快速且有效分选的事实。在噬菌体上展示肽和蛋白文库已被用于筛选数百万个多肽以获得具有特异性结合特性的多肽。多价噬菌体展示方法已经被用于通过与丝状噬菌体的基因III或基因VIII的融合来展示小的随机肽和小的蛋白。Wells和Lowman,Curr.Opin.Struct.Biol.,1992,3:355-362和其中引用的参考文献。在单价噬菌体展示中，蛋白或肽文库与基因III或其一部分融合，并且在野生型基因III蛋白存在下以低水平表达，使得噬菌体颗粒展示一个拷贝的融合蛋白或不展示融合蛋白。亲合力(avidity)效应相对于多价噬菌体降低，因此分选是基于固有的配体亲和力，并且使用噬菌粒载体，这简化了DNA操作。Lowman和Wells,Methods:Acompanion to Methods in Enzymology,1991,3:205-216。
蛋白、肽及其突变的变体的噬菌体展示是已知的，并且可以与本发明的转化方法一起使用，蛋白、肽及其突变的变体的噬菌体展示包括：构建含有被可操作地连接至编码融合体多肽的基因融合体的转录调节元件的变体可复制载体家族，转化合适的宿主细胞，培养转化的细胞以形成在噬菌体颗粒的表面上展示融合体多肽的噬菌体颗粒，使重组噬菌体颗粒与靶分子接触，使得至少一部分颗粒与靶结合，将结合的颗粒与未结合的颗粒分离。参见美国专利第5,750,373号；WO 97/09446；美国专利第5,514,548号；第5,498,538号；第5,516,637号；5,432,018；WO 96/22393；美国专利第5,658,727号；第5,627,024号；WO 97/29185；O'Boyle等人，1997，Virology,236:338-347；Soumillion等人，1994,Appl.Biochem.Biotech.,47:175-190；O'Neil和Hoess,1995,Curr.Opin.Struct.Biol.,5:443-449；Makowski,1993,Gene,128:5-11；Dunn,1996,Curr.Opin.Struct.Biol.,7:547-553；Choo和Klug,1995,Curr.Opin.Struct.Biol.,6:431-436；Bradbury和Cattaneo,1995,TINS,18:242-249；Cortese等人,1995,Curr.Opin.Struct.Biol.,6:73-80；Allen等人,1995,TIBS,20:509-516；Lindquist和Naderi,1995,FEMS Micro.Rev.17:33-39；Clarkson和Wells,1994,Tibtech,12:173-184；Barbas,1993,Curr.Opin.Biol.,4:526-530；McGregor,1996,Mol.Biotech.,6:155-162；Cortese等人,1996,Curr.Opin.Biol.,7:616-621；McLafferty等人,1993,Gene,128:29-36。在一些实施方案中，使用噬菌体展示，从合适的文库中分离出能够与如本文描述的B细胞受体结合的推定的B细胞受体配体。示例性推定的B细胞受体配体文库包括噬菌体肽文库，诸如New England Biolabs Ph.D.-7和Ph.D.-12文库。以下中也公开了产生肽文库和筛选这些文库的方法：美国专利第5,723,286号；第5,432,018号；第5,580,717号；第5,427,908号和第5,498,530号。还参见，例如，美国专利第5,770,434号；第5,734,018号；第5,698,426号；第5,763,192号和第5,723,323号。在选择过程中，可以用靶B细胞受体或其片段来探测推定的B细胞受体配体文库，并且可以分离能够与B细胞受体结合的文库成员(通常通过保留在支持物上)。这样的筛选过程可以通过多轮(例如，包括阳性选择和阴性选择两者)来进行，以富集能够与B细胞受体结合的推定的B细胞受体配体池(pool)。在一些实施方案中，在每一轮淘选中进行阴性选择。然后可以分离单独的富集池的克隆，并且进一步表征以鉴定具有所期望的结合活性和生物活性的那些克隆。推定的B细胞受体配体的序列也可以通过常规方法确定。
例如，噬菌体展示通常使用共价连接使蛋白(例如，推定的B细胞受体配体结构域)组分与细菌噬菌体外壳蛋白结合。该连接是由编码与外壳蛋白融合的推定的B细胞受体配体结构域组分的核酸翻译产生的。该连接可以包括柔性肽接头、蛋白酶位点或由于终止密码子阻遏而掺入的氨基酸。噬菌体展示在以下中描述：例如，美国专利第5,223,409号；Smith(1985)Science 228:1315-1317；WO 92/18619；WO 91/17271；WO 92/20791；WO 92/15679；WO 93/01288；WO 92/01047；WO 92/09690；WO 90/02809；de Haard等人(1999)J.Biol.Chem 274:18218-30；Hoogenboom等人(1998)Immunotechnology 4:1-20；Hoogenboom等人(2000)Immunol Today 2:371-8以及Hoet等人(2005)Nat Biotechnol.23(3)344-8。展示推定的B细胞受体配体结构域组分的细菌噬菌体可以使用标准噬菌体制备方法生长以及收获，例如从生长培养基中进行PEG沉淀。在选择单独的展示噬菌体之后，可以在扩增之后从用选择的噬菌体感染的细胞或从噬菌体本身分离编码选择的蛋白组分的核酸。可以选择个体的菌落或噬菌斑，并且然后可以分离核酸并测序。
在展示文库成员由于与靶抗原结合被分离之后，也可以对每一个分离的文库成员测试其与非靶分子结合的能力以评估其结合特异性。非靶分子的实例包括磁珠上的链霉亲和素，封闭剂诸如牛血清白蛋白、脱脂牛乳、大豆蛋白、任何捕获或靶固定化单克隆抗体或不表达靶的非转染细胞。例如，可以使用高通量ELISA筛选来获得数据。ELISA筛选还可以被用于获得每一个文库成员与靶的结合的定量数据以及与相关靶或靶抗原亚基以及另外在不同条件诸如pH6或pH7.5下的跨物种反应性的定量数据。比较非靶和靶结合数据(例如，使用计算机和软件)，以鉴定与靶特异性结合的文库成员。
推定的B细胞受体配体
本文提供了鉴定独特的B细胞受体配体(例如，用于癌症疗法)的方法，该方法包括将推定的独特的B细胞受体配体鉴定为结合独特的B细胞受体。
在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体包括多肽。在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体包括环肽。在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体包括类肽。在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体包括环类肽。在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体包括多糖。在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体包括脂质。在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体包括小分子。
在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体包括编码部分或完整细胞蛋白的氨基酸序列。在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体包括不编码部分或完整细胞蛋白的氨基酸序列。
在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体的长度是1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个或40个氨基酸，例如，长度是9个氨基酸。在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体的长度小于20个氨基酸、小于15个氨基酸或小于10个氨基酸。在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体的长度是2-20个氨基酸、5-15个氨基酸或7-10个氨基酸。
在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体包含序列YXnZ。在一些实施方案中，Y和Z是极性不带电荷的氨基酸。在一些实施方案中，Y和Z是C或C的保守取代，例如，S、A、M或T。在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体包含序列CXnC。在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体包含序列SXnS。在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体包含序列CXnS。在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体包含序列SXnC。在一些实施方案中，X是由DNA编码的20种氨基酸中的任何一种。在一些实施方案中，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，例如，n是7。在一些实施方案中，n是15或更小、12或更小或者9或更小。在一些实施方案中，n是2-15、5-10或6-8。在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体包含SEQID NO:1-3中的任一个。
在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体包括具有序列CXnC的环肽，并且N-末端和C-末端Cys形成Cys-Cys相互作用，使环肽环化。
本文还提供了推定的B细胞受体配体的文库。
在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体的文库由cDNA文库产生，并且每一个推定的B细胞受体配体包括部分或完整cDNA。
在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体的文库包括肽文库。在一些实施方案中，肽文库是组合肽文库。在一些实施方案中，肽文库中的推定的B细胞受体配体包含序列YXnZ，其中推定的B细胞受体配体在Xn序列不同。在一些实施方案中，Y和Z是极性不带电荷的氨基酸。在一些实施方案中，Y和Z是C或C的保守取代，例如，S、A、M或T。在一些实施方案中，肽文库中的推定的B细胞受体配体包含序列CXnC，其中推定的B细胞受体配体在Xn序列上不同。在一些实施方案中，肽文库中的推定的B细胞受体配体包含序列SXnS，其中推定的B细胞受体配体在Xn序列不同。在一些实施方案中，肽文库中的推定的B细胞受体配体包含序列CXnS，其中推定的B细胞受体配体在Xn序列不同。在一些实施方案中，肽文库中的推定的B细胞受体配体包含序列SXnC，其中推定的B细胞受体配体在Xn序列不同。在一些实施方案中，X是由DNA编码的20种氨基酸中的任何一种。在一些实施方案中，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20，例如，n是7。在一些实施方案中，n是15或更小、12或更小或者9或更小。在一些实施方案中，n是2-15、5-10或6-8。在一些实施方案中，Xn序列是用在X位具有简并NNN、NNK或NNS密码子的寡核苷酸通过PCR产生的。在一些实施方案中，简并密码子是NNK密码子。
在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体包含CAR的抗原结合结构域。在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体与噬菌体连接，例如，作为噬菌体展示文库的组分。
嵌合抗原受体(CAR)
本文公开了用于鉴定B细胞受体配体的方法，该方法通过使B细胞受体和具有推定的B细胞受体配体结构域作为胞外结构域的CAR共表达并测量T细胞活化来鉴定B细胞受体配体。
本文还公开了用于通过用表达CAR的T细胞和疫苗治疗受试者来治疗癌症的方法，其中CAR包含以癌症特异性方式特异性结合癌症特异性抗原的抗原结合结构域，疫苗包含表达该癌症特异性抗原或其癌症特异性片段的多肽或核酸。
在一个方面，本文公开的示例性CAR构建体包含任选的前导序列、胞外推定的B细胞受体配体结构域、铰链、跨膜结构域和胞内刺激结构域。在一个方面，示例性CAR构建体包含任选的前导序列、胞外推定的B细胞受体配体结构域、铰链、跨膜结构域、胞内共刺激结构域和胞内刺激结构域。
术语“嵌合抗原受体”或可选地“CAR”是指重组多肽构建体，其至少包含胞外配体结构域、跨膜结构域和胞质信号传导结构域(本文也称为“胞内信号传导结构域”)，胞质信号传导结构域包括来源于如下定义的刺激分子的功能信号传导结构域。在一些实施方案中，CAR多肽构建体中的结构域在相同的多肽链中，例如，包括嵌合融合蛋白。在一些实施方案中，CAR多肽构建体中的结构域彼此不相邻。
抗原结合结构域
在一些实施方案中，本文描述的CAR包含细胞外结构域。在一些实施方案中，细胞外结构域包含抗原结合结构域。
在一些实施方案中，抗原结合结构域是包含推定的B细胞受体配体，例如，本文描述的推定的B细胞受体配体的推定的B细胞受体配体结构域。在一些实施方案中，本文提供了CAR文库，其中CAR在其抗原结合结构域不同，例如，在推定的B细胞受体配体结构域不同。在一些实施方案中，文库中的每一个CAR包含不同的抗原结合结构域，例如，推定的B细胞受体配体结构域。在一些实施方案中，CAR的文库包含胞外结构域，并且胞外结构域包含抗原结合结构域，例如，本文描述的推定的B细胞受体配体的文库。
在一些实施方案中，推定的B细胞受体配体结构域还包含Fc结构域，其为重链恒定区的CH2和CH3。在一些实施方案中，Fc结构域来自重链恒定区，所述重链恒定区选自，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD和IgE的重链恒定区；特别地，选自，例如，(例如，人类)IgG1、IgG2、IgG3和IgG4的重链恒定区。
在一些实施方案中，抗原结合结构域包括免疫球蛋白链或其片段，其包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列。术语“抗原结合结构域”包括抗体及抗体片段。在一种实施方案中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如，它包含多于一个免疫球蛋白可变结构域序列，其中多于一个免疫球蛋白可变结构域序列中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性，并且多于一个免疫球蛋白可变结构域序列中的第二疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一种实施方案中，多特异性抗体分子是双特异性隆抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于对第一表位具有结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列和对第二表位具有结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。
在一些实施方案中，抗原结合结构域特异性结合癌症特异性抗原。
在一些实施方案中，本发明的CAR包含含有与MHC呈递的肽结合的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段)的CAR。通常，来源于内源蛋白的肽充满填充主要组织相容性复合物(MHC)I类分子的口袋，并且被CD8+T淋巴细胞上的T细胞受体(TCR)识别。MHC I类复合物由所有有核细胞组成型表达。在癌症中，病毒特异性和/或肿瘤特异性肽/MHC复合物代表免疫疗法的一类独特的细胞表面靶。已经描述了在人类白细胞抗原(HLA)-A1或HLA-A2的情况下靶向来源于病毒或肿瘤抗原的肽的TCR样抗体(参见，例如，Sastry等人,J Virol.201185(5):1935-1942；Sergeeva等人,Blood,2011 117(16):4262-4272；Verma等人,J Immunol2010 184(4):2156-2165；Willemsen等人,Gene Ther 2001 8(21):1601-1608；Dao等人,Sci Transl Med 2013 5(176):176ra33；Tassev等人,Cancer Gene Ther 2012 19(2):84-100)。例如，TCR样抗体可以从筛选文库，诸如，人类scFv噬菌体展示文库中鉴定。
抗原结合结构域可以是与抗原结合的任何蛋白，包括但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、人类抗体、人源化抗体及其功能片段，包括但不限于单结构域抗体，诸如来源于骆驼科动物(camelid)的纳米体(nanobody)的重链可变结构域(VH)、轻链可变结构域(VL)和可变结构域(VHH)，以及本领域已知的起抗原结合结构域作用的替代支架诸如重组纤连蛋白结构域等等。在一些情况下，抗原结合结构域来源于最终将使用CAR的同一物种是有益的。例如，对于在人类中的使用，CAR的抗原结合结构域包括抗体或抗体片段的抗原结合结构域的人类或人源化残基可能是有益的。
在一个方面，抗原结合结构域包括人类抗体或抗体片段。
在一个方面，抗原结合结构域包括人源化抗体或抗体片段。
可以使用本领域已知的多种技术产生人源化抗体，所述技术包括但不限于CDR移植(参见，例如，欧洲专利第EP 239,400号；国际公布第WO 91/09967号；和美国专利第5,225,539号、第5,530,101号和第5,585,089号，其每一个都通过引用以其整体并入本文)、镶饰(veneering)或重塑(resurfacing)(参见，例如，欧洲专利第EP 592,106号和第EP 519,596号；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489-498；Studnicka等人,1994,Protein Engineering,7(6):805-814；和Roguska等人,1994,PNAS,91:969-973,其每一个通过引用以其整体并入本文)、链改组(参见，例如，美国专利第5,565,332号，其通过引用以其整体并入本文)，以及以下中公开的技术：例如，美国专利申请公布第US2005/0042664号、美国专利申请公布第US2005/0048617号、美国专利第6,407,213号、美国专利第5,766,886号、国际公布第WO 9317105号，Tan等人,J.Immunol.,169:1119-25(2002),Caldas等人,Protein Eng.,13(5):353-60(2000),Morea等人,Methods,20(3):267-79(2000),Baca等人,J.Biol.Chem.,272(16):10678-84(1997),Roguska等人,Protein Eng.,9(10):895-904(1996),Couto等人,Cancer Res.,55(23Supp):5973s-5977s(1995),Couto等人,CancerRes.,55(8):1717-22(1995),Sandhu J S,Gene,150(2):409-10(1994),和Pedersen等人,J.Mol.Biol.,235(3):959-73(1994)，其每一个通过引用以其整体并入本文。通常，框架区域中的框架残基将被来自CDR供体抗体的对应残基取代，以改变(例如，改善)抗原结合。这些框架取代通过本领域熟知的方法鉴定，例如，通过对CDR和框架残基的相互作用建模来鉴定对抗原结合重要的框架残基，并进行序列比较以鉴定特定位置处的异常框架残基。参见，例如，Queen等人,美国专利第5,585,089号；和Riechmann等人，1988，Nature，332:323，其通过引用以其整体并入本文)。
人源化抗体或抗体片段具有保留在其中的来自非人类来源的一个或更多个氨基酸残基。这些非人类氨基酸残基通常被称为“输入(import)”残基，通常取自“输入”可变结构域。如本文提供的，人源化抗体或抗体片段包含框架区和来自非人类免疫球蛋白分子的一个或更多个CDR，其中构成框架的氨基酸残基完全或主要来自人类种系。用于抗体或抗体片段人源化的多种技术是本领域熟知的，并且基本上可以按照Winter及同事的方法进行(Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988))，通过用啮齿动物的多个CDR或CDR序列取代人类抗体的对应序列，即CDR移植(EP 239,400；PCT公布第WO 91/09967号；和美国专利第4,816,567号；第6,331,415号；第5,225,539号；第5,530,101号；第5,585,089号；第6,548,640号，其每一个在此通过引用以其整体并入本文)。在这样的人源化抗体及抗体片段中，基本上少于一个完整的人类可变结构域已经被来自非人类物种的对应序列取代。人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能地一些框架(FR)残基被来自啮齿动物抗体的类似位点的残基取代的人类抗体。抗体及抗体片段的人源化也可以通过以下来实现：镶饰或重塑(EP592,106；EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489-498；Studnicka等人,Protein Engineering,7(6):805-814(1994)；以及Roguska等人,PNAS,91:969-973(1994))或链改组(美国专利第5,565,332号)，其内容在此通过引用以其整体并入本文。
在一些实施方案中，抗原结合结构域来源于展示文库。展示文库是实体的集合；每个实体包括可接近的多肽组分和编码或鉴定多肽组分的可回收组分。多肽组分是变化的，因此代表不同的氨基酸序列。多肽组分可以是任何长度，例如，从三个氨基酸至超过300个氨基酸。展示文库实体可以包括多于一个多肽组分，例如，Fab的两条多肽链。在一个示例性实施方案中，展示文库可以被用于鉴定抗原结合结构域。在选择中，用抗原或其中的片段探测文库中每一个成员的多肽组分，并且如果多肽组分与抗原结合，则通常通过保留在支持物上来鉴定展示文库成员。
从支持物回收保留的展示文库成员并分析。分析可以包括在相似或不同条件下的扩增和随后的选择。例如，阳性选择和阴性选择可以交替。分析还可以包括确定多肽组分的氨基酸序列和纯化多肽组分以进行详细表征。
多种形式可以被用于展示文库。实例包括噬菌体展示。在噬菌体展示中，蛋白组分通常与细菌噬菌体外壳蛋白共价连接。该连接是由编码与外壳蛋白融合的蛋白组分的核酸翻译产生的。该连接可以包括柔性肽接头、蛋白酶位点或由于终止密码子阻遏而掺入的氨基酸。噬菌体展示在以下中描述：例如，美国专利第5,223,409号；第WO 92/18619号；第WO91/17271号；第WO 92/20791号；第WO 92/15679号；第WO 93/01288号；第WO 92/01047号；第WO 92/09690号；第WO 90/02809号。展示蛋白组分的细菌噬菌体可以使用标准噬菌体制备方法生长以及收获，例如从生长培养基中进行PEG沉淀来收获。在选择个体的展示噬菌体之后，可以在扩增之后从用选择的噬菌体感染的细胞或从噬菌体本身分离编码选择的蛋白组分的核酸。可以挑选个体的菌落或噬菌斑，分离核酸并测序。
其他展示形式包括基于细胞的展示(参见，例如，WO 03/029456)、蛋白-核酸融合体(参见，例如，美国专利第6,207,446号)、核糖体展示和大肠杆菌(E.coli)周质展示。
在一个方面，CAR在抗原结合结构域的氨基末端(N-ter)处包括前导序列。在一个方面，CAR还在抗原结合结构域的N-末端处包括前导序列，其中在细胞加工和CAR定位于细胞膜期间，前导序列任选地被从抗原结合结构域(例如，aa scFv)裂解。在一些实施方案中，前导序列是白细胞介素2信号肽。
跨膜结构域
跨膜结构域可以来源于天然来源或来源于重组来源。在来源是天然的情况下，结构域可以来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。在一个方面，每当CAR与靶结合时，跨膜结构域能够向胞内结构域发送信号。在本发明中特别有用的跨膜结构域可以至少包括例如T细胞受体的α链、β链或δ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8(例如，CD8α、CD8β)、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的跨膜结构域。在一些实施方案中，跨膜结构域可以至少包括例如，KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Ra、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、rfGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMFl、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D、NKG2C和CD19的跨膜结构域。
在一些情况下，跨膜结构域可以通过铰链(例如，来自人类蛋白的铰链)被附接至CAR的细胞外区域(例如，CAR的配体结构域)。例如，在一种实施方案中，铰链可以是人类Ig(免疫球蛋白)铰链，例如，IgG4铰链或CD8a铰链。
胞质结构域
本发明CAR的胞质结构域或区域包括胞内信号传导结构域。胞内信号传导结构域能够活化已引入CAR的免疫细胞的至少一种正常效应物功能。
用于在本发明CAR中使用的胞内信号传导结构域的实例包括T细胞受体(TCR)和共受体的胞质序列(它们协同作用以在抗原受体接合后启动信号转导)、以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同功能能力的任何重组序列。
T细胞活化可以被认为是由两类不同的胞质信号传导序列介导的：通过TCR启动抗原依赖性初级活化的胞质信号传导序列(初级胞内信号传导结构域)，以及以不依赖抗原的方式作用以提供次级或共刺激信号的胞质信号传导序列(次级胞质结构域，例如，共刺激结构域)。
如本文使用的术语“胞内信号传导结构域”是指分子的胞内部分。胞内信号传导结构域可以产生促进含CAR细胞(例如，CART细胞或表达CAR的NK细胞)的免疫效应物功能的信号。免疫效应物功能的实例，例如，在CART细胞或表达CAR的NK细胞中，包括细胞溶解活性和辅助活性，包括细胞因子的分泌。在实施方案中，胞内信号结构域转导效应物功能信号并指导细胞进行专门化功能。虽然可以使用整个胞内信号传导结构域，但在许多情况下，没有必要使用整个链。就使用胞内信号传导结构域的截短部分的程度而言，只要它能转导效应物功能信号，这样的截短部分可以被用来代替完整的链。因此，术语胞内信号传导结构域意味着包括足以转导效应物功能信号的胞内信号传导结构域的任何截短部分。在一种实施方案中，胞内信号传导结构域可以包括初级胞内信号传导结构域。示例性初级胞内信号传导结构域包括来源于负责初级刺激或抗原依赖性刺激的分子的那些胞内信号传导结构域。在一种实施方案中，胞内信号传导结构域可以包括共刺激胞内结构域。示例性共刺激胞内信号传导结构域包括来源于负责共刺激信号或不依赖抗原刺激的分子的那些胞内信号传导结构域。例如，在表达CAR的免疫效应物细胞，例如，CART细胞或表达CAR的NK细胞的情况下，初级胞内信号传导结构域可以包括T细胞受体的胞质序列，并且共刺激胞内信号传导结构域可以包括来自共受体或共刺激分子的胞质序列。
初级胞内信号传导结构域可以包括信号传导基序，该信号传导基序被称为免疫受体酪氨酸活化基序或ITAM。含有初级胞质信号传导序列的ITAM的实例包括，但不限于，来源于CD3δ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b、CD278(“ICOS”)、FceRI、CD66d、DAP10和DAP12的那些。
CAR的胞内信号传导结构域可以包括单独的初级信号传导结构域例如CD3δ信号传导结构域，或者初级信号传导结构域例如CD3δ信号传导结构域可以与在本发明的CAR的情况下有用的任何其他期望的胞内信号传导结构域组合。例如，CAR的胞内信号传导结构域可以包括初级信号传导结构域，例如，CD3δ链部分，和共刺激信号传导结构域。
共刺激胞内信号传导结构域是指共刺激分子的胞内部分。胞内信号传导结构域可以包括其来源分子的整个胞内部分，或整个天然胞内信号传导结构域，或其功能片段。术语“共刺激分子”是指T细胞上与共刺激配体特异性结合，从而介导T细胞的共刺激响应的同源结合配偶体，T细胞的共刺激响应例如但不限于增殖。共刺激分子是有效免疫应答所需的除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子。这样的分子的实例包括MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、4-1BB(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGLl、CDIOO(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a和与CD83特异性结合的配体。例如，CD27共刺激已被证明在体外增强人类CART细胞的扩增、效应物功能和存活，并且加强人类T细胞在体内的持久性和抗肿瘤活性(Song等Blood.2012；119(3):696-706)。
细胞中的表达
在一些实施方案中，本文描述的方法包括使B细胞受体和推定的B细胞受体配体(例如，含有推定的B细胞受体配体的CAR)在细胞(例如，T细胞)中表达用于鉴定B细胞受体配体，例如，用于治疗癌症。本文描述的方法还包括使CAR在T细胞中表达用于癌症治疗。
在一些实施方案中，本公开内容包括用于使CAR在细胞(例如，T细胞)中表达的DNA构建体。编码所需分子的核酸序列可以使用本领域已知的重组方法使用标准技术获得，所述方法诸如，例如，通过筛选来自表达基因的细胞的文库，通过从已知含有该基因的载体中获得该基因，或者通过直接从含有该基因的细胞和组织中分离该基因。例如，如本文描述的，B细胞受体的序列可以从癌细胞获得。本文使用的重组DNA和分子克隆技术是本领域中熟知的，并且例如由以下描述：例如，Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL,第2版；Cold Spring Harbor Laboratory:Cold SpringHarbor,N.Y.,1989(下文"Maniatis")；以及Silhavy,T.J.,Bennan,M.L.和Enquist,L.W.EXPERIMENTSWITH GENE FUSIONS；Cold Spring Harbor Laboratory:Cold SpringHarbor,N.Y.,1984；以及Ausubel,F.M.等,IN CURRENT PROTOCOLSIN MOLECULAR BIOLOGY,由Greene Publishing和Wiley-Interscience出版,1987；(其每一个的全部内容在此通过引用并入本文)。
可选地，感兴趣的基因可以合成而不是克隆产生。
本公开内容还提供了***本公开内容的DNA的载体。来源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因的长期稳定整合并使其在子代细胞中繁殖。慢病毒载体相比于来源于肿瘤逆转录病毒诸如鼠白血病病毒的载体具有额外的优势，因为它们可以转导非增殖细胞，诸如肝细胞。它们还具有低免疫原性的额外优势。在另一种实施方案中，所需的B细胞受体或CAR可以通过转座子在细胞中表达。
如本文使用的术语“慢病毒”是指逆转录病毒科的属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，能够感染非***细胞；它们可以将大量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV都是慢病毒的实例。来源于慢病毒的载体提供了在体内实现显著水平基因转移的手段。
编码B细胞受体和CAR的天然或合成核酸的表达通常通过将编码表达B细胞受体或CAR或其部分的多肽的核酸可操作地连接至启动子，并且将构建体掺入表达载体中来实现。该载体可适于在真核生物中复制并整合。通常的克隆载体含有转录和翻译终止子、起始序列和用于调节期望的核酸序列的表达的启动子。本公开内容的表达构建体也可以被用于使用标准基因递送方案进行核酸免疫和基因疗法。用于基因递送的方法是本领域已知的。参见，例如，美国专利第5,399,346号、第5,580,859号、第5,589,466号，其通过引用以其整体并入本文。在另一种实施方案中，本公开内容提供了基因疗法载体。
核酸可以被克隆到多种类型的载体中。例如，核酸可以被克隆到载体中，包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和黏粒。特别感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
此外，表达载体可以病毒载体的形式提供给细胞。病毒载体技术是本领域熟知的，并且例如，在Sambrook等人(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory,New York)以及其他病毒学和分子生物学手册中描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体含有在至少一种生物体中有功能的复制起点、启动子序列、方便的限制性内切酶位点和一种或更多种可选择标志物(例如，WO 01/96584；WO 01/29058；和美国专利第6,326,193号)。
已经开发了用于将基因转移到哺乳动物细胞中的许多基于病毒的***。例如，逆转录病毒为基因递送***提供了一个方便的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因***载体中并包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以将重组病毒分离，并且在体内或离体将其递送至受试者的细胞。许多逆转录病毒***是本领域已知的。在一些实施方案中，使用逆转录病毒载体。许多逆转录病毒载体是本领域已知的。在一些实施方案中，使用慢病毒载体。
另外的启动子元件，例如，增强子调节转录起始的频率。通常，这些启动子元件位于起始位点上游30-110bp的区域，但最近已显示许多启动子也含有起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔通常是灵活的，因此当元件相对于彼此反转或移动时，启动子功能得以保留。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可以增加至相距50bp，然后活性开始下降。取决于启动子，似乎个体元件可以协同作用或独立作用来活化转录。
合适的启动子的一个实例是极早期(immediate early)巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是强组成型启动子序列，能够驱动与其可操作地连接的任何多核苷酸序列的高水平表达。合适的启动子的另一个实例是延伸因子-1a(EF-1a)。然而，也可以使用其他组成型启动子序列，包括但不限于猿猴(simian)病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复序列(LTR)启动子、MoMuLV启动子、禽白血病病毒启动子、EB(Epstein-Barr)病毒极早期启动子、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcomavirus)启动子以及人类基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子和肌酸激酶启动子。此外，本公开内容不限于组成型启动子的使用。诱导型启动子也被预期是本公开内容的一部分。诱导型启动子的使用提供了一种分子开关，当需要与其可操作地连接的多核苷酸序列的表达时，该分子开关能够开启这样的表达，或者当不需要表达时，关闭该表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。在一些实施方案中，启动子是EF-1a启动子。
为了评估B细胞受体或CAR或其部分的表达，被引入细胞的表达载体还可以含有可选择标志物基因或报告物基因或两者，以促进表达细胞的鉴定和选择。在其他方面，可选择标志物可以被携带在单独的一段DNA(a separate piece of DNA)上，并用于共转染程序。可选择标志物和报告物基因可以与适当的调节序列侧接，以使在宿主细胞中能够表达。有用的可选择标志物包括，例如，抗生素抗性基因，诸如neo等，以及荧光基因，诸如GFP、YFP、RFP等。在一些实施方案中，报告物基因或可选择标志物基因被排除在如本文描述的治疗中使用的CAR多肽之外。
报告物基因被用于鉴定潜在的转染细胞并评估调节序列的功能。通常，报告物基因是在接受者生物体或组织中不存在或不表达并且编码通过一些可容易检测的特性例如酶活性、抗生素抗性或荧光显示其表达的多肽的基因。报告物基因的表达在将DNA引入受体细胞后在合适的时间进行测定。合适的报告物基因可以包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌性碱性磷酸酶或绿色荧光蛋白基因的基因(例如，Ui-Tei等,2000FEBS Letters 479:79-82)。合适的表达***是熟知的，并且可以使用已知的技术制备或商业获得。通常，显示最高水平的报告物基因表达的具有最小5’侧翼区域的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区域可以被连接至报告物基因，并且用于评估剂调节启动子驱动转录的能力。
将基因引入细胞并表达的方法是本领域已知的。在表达载体的情况下，可以通过本领域的任何方法将载体容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，可以通过物理、化学或生物手段将表达载体转移到宿主细胞中。在一些实施方案中，宿主细胞是T细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质体转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。用于产生包含载体和/或外源核酸的细胞的方法是本领域熟知的。参见，例如，Sambrook等人，(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory,NewYork)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选的方法是磷酸钙转染。
用于将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA载体和RNA载体。病毒载体，并且特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的用于将基因***哺乳动物，例如，人类细胞的方法。其他病毒载体可以来源于慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I型、腺病毒和腺相关病毒等。参见，例如，美国专利第5,350,674号和第5,585,362号。
用于将多核苷酸引入宿主细胞的化学方法包括胶体分散***，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠、和基于脂质的***，基于脂质的***包括水包油乳液、微团、混合的微团和脂质体。用作体外和体内递送媒介物的胶体***的实例是脂质体(例如，人工膜囊泡)。
细胞来源
在一些实施方案中，用表达B细胞受体和/或CAR的核酸转染细胞。如本文使用的术语“转染的”或“转化的”或“转导的”是指外源核酸借以被转移或引入宿主细胞的过程。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。细胞包括原代受试者细胞及其后代。
在一些实施方案中，细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，细胞是人类细胞。在一些实施方案中，细胞是免疫细胞，例如，B细胞、T细胞或NK细胞。在特定实施方案中，细胞是T细胞。
免疫细胞(例如，T细胞)可以从许多来源获得，所述来源包括外周血单核细胞、骨髓、***组织、脐带血、胸腺组织、感染部位的组织、腹水、胸膜渗出物、脾组织和肿瘤。免疫细胞(例如，T细胞)也可以由诱导多能干细胞或造血干细胞或祖细胞产生。在一些实施方案中，可以使用任何数目的免疫细胞系，包括但不限于T细胞系，包括例如本领域中可用的Hep-2细胞系、Jurkat细胞系和Raji细胞系。在一些实施方案中，免疫细胞(例如，T细胞)可以使用本领域技术人员已知的任何数目的技术诸如FicollTM分离从从受试者收集的单位血液中获得。在一些实施方案中，来自个体循环血液的细胞通过清血法(apheresis)获得。清血法产品通常含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、NK细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施方案中，通过清血法收集的细胞可以被洗涤以去除血浆级分，并且将细胞放置在适当的缓冲液或培养基中用于随后的处理步骤。在一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在替代实施方案中，洗涤溶液缺乏钙，且可能缺乏镁，或者可能缺乏许多(如果不是全部的话)二价阳离子。同样，出人意料地，在钙不存在的情况下，最初的活化步骤会导致放大的活化。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法来完成，所述方法诸如根据制造商的说明使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics CellSaver 5)。洗涤后，可以将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中，例如，无Ca2+的PBS、无Mg2+的PBS、PlasmaLyte A或其他含或不含缓冲液的盐溶液。可选地，可以去除清血法样品中不需要的组分，并且将细胞直接重悬于培养基中。
在一些实施方案中，免疫细胞(例如，T细胞)通过裂解红细胞和消耗单核细胞，例如，通过经由PERCOLLTM梯度的离心或通过逆流离心淘洗而从外周血淋巴细胞中分离。可以通过阳性选择或阴性选择技术进一步分离特定的T细胞亚群，例如CD3+ T细胞、CD28+ T细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、CD45RA+ T细胞、和CD45RO+ T细胞。
通过阴性选择富集T细胞群体可以通过针对对阴性选择细胞独特的表面标志物的抗体的组合来实现。一种方法是通过阴性磁性免疫黏附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，该方法使用针对阴性选择的细胞上存在的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方案中，可能需要富集或阳性选择通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节性T细胞。
可选地，在某些实施方案中，通过抗C25缀合珠或其他类似的选择方法消耗T调节性细胞。
治疗方法
本文提供了使用本文鉴定的B细胞受体配体的治疗方法。具体地，本文提供了用于快速治疗B细胞恶性肿瘤的方法。例如，本文描述的方法允许通过使具有推定的B细胞受体配体的CAR和B细胞受体在T细胞中共表达，并且通过活化B细胞鉴定推定的B细胞受体配体与B细胞受体的结合来快速鉴定B细胞受体配体，并且在一些实施方案中，用于鉴定B细胞受体配体的相同CAR可以用于治疗，允许快速鉴定B细胞恶性肿瘤并治疗。在一些实施方案中，本文提供了使用B细胞受体配体的治疗方法，当含有B细胞配体的CAR与待治疗的受试者的淋巴瘤细胞的B细胞受体在T细胞中共表达时，所述B细胞受体配体活化T细胞。
在一些实施方案中，用与治疗剂偶联的B细胞受体配体治疗受试者。
在一些实施方案中，偶联有治疗剂的B细胞受体配体包括治疗性CAR，例如如本文描述的在T细胞中表达的本文描述的CAR，例如CAR-T细胞。在一些实施方案中，治疗性CAR包含在鉴定B细胞受体的方法中使用的CAR。
在一些实施方案中，CART细胞，例如，表达本文描述CAR的T细胞，比对照产生更高的特异性和/或活性。在一些实施方案中，对照包括CAR T细胞。在一些实施方案中，CAR T细胞具有对与癌症不相关的抗原特异性的抗原结合结构域。在一些实施方案中，CAR T细胞具有对癌症特异性抗原特异性的抗原结合结构域，如本文描述的。
在一些实施方案中，活性和特异性可以通过细胞毒性来显示。在一些实施方案中，活性包括相对于对照的对表达独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性，例如，如通过裂解％测量的。在一些实施方案中，裂解％比对照大0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或更多。
在一些实施方案中，特异性包括对不表达独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性，例如，通过裂解％测量的。在一些实施方案中，裂解％比对照少0.1％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％或更少。在一些实施方案中，裂解％在1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1或更高的效应物:靶标比测量。
在一些实施方案中，用CART细胞(例如，表达本文描述的CAR的T细胞)治疗的受试者，相对于用对照治疗的受试者，表现出降低的细胞因子释放综合征(CRS)。
如本文使用的，“偶联”是指两个分子通过共价和非共价相互作用，例如，通过氢键、离子键或范德华键的缔合。由于至少两个相同或不同的原子或离子的电子密度的重新分布，这种键可以在所述至少两个相同或不同的原子或离子之间形成。例如，B细胞配体可以与治疗剂偶联作为融合蛋白。
在一些实施方案中，治疗剂包括放射性同位素，诸如α发射体、β发射体或γ发射体，或β和γ发射体。
在一些实施方案中，治疗剂包括化学疗法。化疗剂包括，例如，包括烷基化剂、蒽环霉素类、细胞骨架干扰剂(紫杉烷类(Taxanes))、埃博霉素、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂、激酶抑制剂、核苷酸类似物和前体类似物、肽抗生素、基于铂的剂、类视黄醇、长春花生物碱及其衍生物。非限制性实例包括：(i)抗血管生成剂(例如，TNP-470、血小板因子4、血小板反应蛋白-1、金属蛋白酶组织抑制剂(TIMP1和TIMP2)、催乳素(16-Kd片段)、血管抑素(纤溶酶原的38-Kd片段)、内皮抑制素、bFGF可溶性受体、转化生长因子β、干扰素α、可溶性KDR和FLT-1受体、胎盘增殖蛋白相关蛋白，以及由Carmeliet和Jain(2000)列出的那些)；(ii)VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂诸如抗VEGF抗体、VEGF变体、可溶性VEGF受体片段、能够阻断VEGF或VEGFR的适配体、中和性抗VEGFR抗体，VEGFR酪氨酸激酶抑制剂及其任何组合；以及(iii)化学治疗化合物诸如例如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟脲苷(floxuridine)、卡培他滨、吉西他滨和阿糖胞苷)、嘌呤类似物、叶酸拮抗剂和相关的抑制剂(巯基嘌呤、硫代鸟嘌呤、喷司他汀和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨))；抗增殖剂/抗有丝***剂，包括天然产物诸如长春花生物碱类(长春花碱、长春新碱和长春瑞滨)、微管干扰剂诸如紫杉烷类(taxane)(紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛)、长春新碱、长春花碱、诺考达唑、埃博霉素和诺维本(navelbine)、表二鬼臼毒素类(epidipodophyllotoxins)(依托泊苷、替尼泊苷)、DNA损伤剂(放线菌素、安吖啶、蒽环霉素类、博来霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、癌得星(cytoxan)、更生霉素、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、六甲基三聚氰胺、奥沙利铂、异环磷酸胺、美法仑、merchlorehtamine、丝裂霉素、米托蒽醌、亚硝基脲、普卡霉素、丙卡巴肼(procarbazine)、紫杉酚(taxol)、泰索帝(taxotere)、替尼泊苷、三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和依托泊苷(VP16))；抗生素诸如更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、伊达比星、蒽环霉素类、米托蒽醌、博来霉素、普卡霉素(光神霉素(mithramycin))和丝裂霉素；酶(L-天冬酰胺酶，其全身性地代谢L-天冬酰胺，并且剥夺不具有合成它们自己的天冬酰胺的能力的细胞)；抗血小板剂；抗增殖/抗有丝***的烷基化剂诸如氮芥类(氮芥、环磷酰胺及类似物、美法仑、苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺类和甲基三聚氰胺类(六甲基三聚氰胺和塞替派)、烷基磺酸盐-白消安(alkylsulfonates-busulfan)、亚硝基脲类(卡莫司汀(BCNU)及类似物、链脲霉素)、trazenes-dacarbazinine(DTIC)；抗增殖/抗有丝***的抗代谢物诸如叶酸类似物(氨甲蝶呤)；铂配位络合物(顺铂、卡铂)、丙卡巴肼、羟基脲、米托坦、氨鲁米特；激素类，激素类似物(***、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡鲁胺、尼鲁米特)和芳香酶抑制剂(来曲唑、阿那曲唑)；抗凝剂(anticoagulant)(肝素、合成肝素盐以及其他凝血酶抑制剂)；纤维蛋白溶解剂(fibrinolyticagents)(诸如组织纤溶酶原活化剂、链激酶和尿激酶)、阿司匹林、双嘧达莫(dipyridamole)、噻氯匹定(ticlopidine)、氯吡格雷(clopidogrel)、阿昔单抗(abciximab)；抗迁移剂(antimigratoryagent)；抗分泌剂(breveldin)；免疫抑制剂(环孢菌素、他克莫司(tacrolimus)(FK-506)、西罗莫司(雷帕霉素)、硫唑嘌呤(azathioprine)、霉酚酸酯(mycophenolatemofetil))；抗血管发生化合物(例如，TNP-470、染料木素(genistein)、贝伐单抗)和生长因子抑制剂(例如，成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；血管紧张素受体阻断剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗)；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维甲酸)；mTOR抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(多柔比星(阿霉素)、安吖啶、喜树碱、柔红霉素、更生霉素、eniposide、表柔比星、依托泊苷、伊达比星、米托蒽醌、拓泊替康和伊立替康)；皮质激素类(corticosteroid)(可的松、***、氢化可的松、甲基强的松龙、***和***龙)；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍诱导剂和半胱天冬蛋白酶活化剂；和染色质干扰剂。
在一些实施方案中，治疗剂包括免疫疗法。癌症免疫疗法是利用免疫***来排斥癌症。主要前提是刺激受试者的免疫***来攻击导致疾病的肿瘤细胞。这可以是通过受试者的免疫，在这种情况下，受试者自身的免疫***被赋予(rendered)识别肿瘤细胞为待破坏的靶，或者是通过施用治疗剂，诸如抗体，作为药物，在这种情况下，受试者的免疫***被招募来通过治疗剂破坏肿瘤细胞。癌症免疫疗法包括基于抗体的疗法和基于细胞因子的疗法。
许多治疗性单克隆抗体已经被FDA批准用于人类，并且更多的正在进行中。FDA批准的用于癌症免疫疗法的单克隆抗体包括针对CD52、CD33、CD20、ErbB2、血管内皮生长因子受体和表皮生长因子受体的抗体。经FDA批准用于癌症疗法的单克隆抗体的实例包括但不限于：利妥昔单抗(作为RituxanTM可得)、曲妥珠单抗(作为HerceptinTM可得)、阿仑单抗(作为Campath-IHTM可得)、西妥昔单抗(作为ErbituxTM可得)、贝伐单抗(作为AvastinTM可得)、帕尼单抗(作为VectibixTM可得)、吉妥单抗奥加米星(作为MylotargTM可得)、替伊莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)(作为ZevalinTM可得)、托西莫单抗(作为BexxarTM可得)、易普利姆玛(作为YervoyTM可得)、奥法木单抗(作为ArzerraTM可得)、达克珠单抗(作为ZinbrytaTM可得)、纳武单抗(作为OpdivoTM可得)和派姆单抗(作为KeytrudaTM可得)。目前在美国进行癌症疗法的人类临床测试的单克隆抗体的实例包括但不限于：WX-G250(作为RencarexTM可得)、Zanolimumab(作为HuMax-CD4可得)，ch14.18，Zalutumumab(作为HuMax-EGFr可得)、奥戈伏单抗(Oregovomab)(作为B43.13,OvalRexTM可得)、依决洛单抗(Edrecolomab)(作为IGN-101,PanorexTM可得)、131I-chTNT-I/B(作为CotaraTM可得)、Pemtumomab(作为R-1549,TheragynTM可得)、林妥珠单抗(Lintuzumab)(作为SGN-33可得)、Labetuzumab(作为hMN14,CEAcideTM可得)、卡妥索单抗(Catumaxomab)(作为RemovabTM可得)、CNTO328(作为cCLB8可得)、3F8、177Lu-J591、尼妥珠单抗(Nimotuzumab)、SGN-30、Ticilimumab(作为CP-675206可得)、依帕珠单抗(Epratuzumab)(作为hLL2,LymphoCideTM可得)、90Y-依帕珠单抗、加利昔单抗(Galiximab)(作为IDEC-114可得)、MDX-060、CT-011、CS-1008、SGN-40、Mapatumumab(作为TRM-I可得)、Apolizumab(作为HuID10,RemitogenTM可得)和Volociximab(作为M200可得)。
癌症免疫疗法也包括基于细胞因子的疗法。基于细胞因子的癌症疗法利用一种或更多种调节受试者免疫应答的细胞因子。可用于癌症治疗的细胞因子的非限制性实例包括干扰素-α(IFN-α)、白细胞介素-2(IL-2)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和白细胞介素-12(IL-12)。
本文描述的与治疗剂偶联的B细胞受体配体，以及编码核酸或核酸集、包含该核酸或核酸集的载体或包含该载体的宿主细胞可用于治疗癌症，包括B细胞恶性肿瘤，例如B细胞淋巴瘤。
在一些实施方案中，可以向需要治疗的受试者施用与治疗剂偶联的多于一种B细胞受体配体，或者与治疗剂偶联的B细胞受体配体和另一种合适的治疗剂的组合。与治疗剂偶联的B细胞受体配体也可以与用于增强和/或补充剂的效力的其他剂结合使用。
本文还预期了治疗的方法，所述方法包括伴随施用：表达CAR的T细胞，其中CAR包含以癌症特异性方式特异性结合癌症特异性抗原的抗原结合结构域；和疫苗，该疫苗包含表达该癌症特异性抗原或其癌症特异性片段的多肽或核酸。在一些实施方案中，癌症特异性抗原包括B细胞受体，并且抗原结合结构域包括本文描述的B细胞受体配体。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括通过本文描述的方法鉴定的本文描述的B细胞受体配体。
术语“癌症特异性抗原”或“肿瘤抗原”可互换地指完整地或作为片段(例如，MHC/肽)在癌细胞的表面表达的分子(通常是蛋白、糖类或脂质)，并且其可用于将药剂优先靶向癌细胞。在一些实施方案中，癌症特异性抗原包括B细胞受体，并且抗原结合结构域包括本文描述的B细胞受体配体。在一些实施方案中，抗原结合结构域包括通过本文描述的方法鉴定的本文描述的B细胞受体配体。在一些实施方案中，肿瘤抗原是由正常细胞和癌细胞两者表达的标志物，例如，谱系标志物，例如，B细胞上的CD19。在一些实施方案中，肿瘤抗原是与正常细胞相比在癌细胞中过量表达的细胞表面分子，例如，与正常细胞相比1倍过量表达、2倍过量表达、3倍过量表达或更多过量表达。在一些实施方案中，肿瘤抗原包含体细胞突变，例如，是在癌细胞中不适当合成的细胞表面分子，例如，与在正常细胞上表达的分子相比，含有缺失、添加或突变的分子。在一些实施方案中，癌症特异性抗原包含点突变、剪接位点突变、移码突变、读通突变或基因融合突变。在一些实施方案中，癌症特异性抗原包含在EGFRvIII、PSCA、BCMA、CD30、CEA、CD22、L1CAM、ROR1、ErbB、CD123、IL13Rα2、间皮素、FRα、VEGFR、c-Met、5T4、CD44v6、B7-H4、CD133、CD138、CD33、CD28、GPC3、EphA2、CD19、ACVR2B、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、MYCN、BCR、HER2、NY-ESO1、MUC1或MUC16中的突变。在一些实施方案中，肿瘤抗原将完整地或作为片段(例如，MHC/肽)仅在癌细胞的细胞表面表达，而不在正常细胞的表面上合成或表达。
在一些实施方案中，癌症特异性抗原以癌症特异性方式结合癌症特异性抗原。在一些实施方案中，当癌症特异性抗原以癌症特异性方式结合癌症特异性抗原时，癌症特异性抗原以为非癌细胞的1.1×、1.5×、2×、3×、4×、5×、6×、7×、8×、9×、10×、20×、30×、40×、50×、60×、70×、80×、90×、100×、200×、300×、400×、500×、600×、700×、800×、900×、1,000×或更多的亲和力结合癌细胞。
在一些实施方案中，本文描述的方法包括鉴定受试者中的癌症特异性抗原。在一些实施方案中，鉴定癌症特异性抗原包括从受试者获得癌细胞。在一些实施方案中，癌细胞是从活检物获得的。在一些实施方案中，癌细胞在受试者的血液中。
在一些实施方案中，从癌细胞提取DNA并测序。在一些实施方案中，将DNA或者一个或更多个基因的序列与非癌细胞中的相同序列进行比较。
在一些实施方案中，从癌细胞提取RNA并合成cDNA。在一些实施方案中，对cDNA测序。在一些实施方案中，将cDNA或者一个或更多个基因的序列与非癌细胞中的相同序列进行比较。
在一些实施方案中，鉴定癌症特异性抗原包括对受试者的循环无细胞DNA进行分离并测序。
“伴随(concomitantly)”意指以在时间上相关，优选地在时间上充分相关以便提供对免疫应答的调节的方式向受试者施用两种或更多种物质。在实施方案中，伴随施用可以通过以同一剂型施用两种或更多种物质来进行。在其他实施方案中，伴随施用可以包括以不同剂型，但是在指定的时间段内，优选地在1个月内、更优选地在1周内、仍更优选地在1天内且甚至更优选地在1小时内施用两种或更多种物质。术语“伴随”的使用并不限制向受试者施用治疗剂的顺序。第一治疗剂，诸如CAR-T细胞，可以在向受试者施用第二治疗剂，诸如本文描述的疫苗之前(例如，之前5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、与其同时地或在其之后(例如，之后5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)被施用。因此，第一剂可以与第二治疗剂单独、依次或同时(simultaneously)施用。在一些实施方案中，伴随施用在受试者中发生至少两次、至少三次、至少四次、至少五次、至少六次、至少七次、至少八次、至少九次或至少十次。
在一些实施方案中，表达CAR的T细胞在疫苗之前施用。在一些实施方案中，表达CAR的T细胞在疫苗之后施用。
为了实践本文公开的方法，可以通过合适的途径，诸如静脉内施用，例如，作为团注(bolus)或通过在一定时间段内连续输注，通过肌内途径、腹膜内途径、脊髓内途径、皮下途径、关节内途径、滑膜内途径、鞘内途径、口服途径、吸入途径或局部途径，将有效量的本文描述的与治疗剂偶联的B细胞受体配体、CAR和疫苗施用至需要治疗的受试者(例如，人类)。在一些实施方案中，本文描述的疫苗被瘤内施用。在一些实施方案中，本文描述的CART细胞是静脉内施用的。用于液体制剂的商购可得的喷雾器(nebulizer)，包括喷射喷雾器和超声波喷雾器，可用于施用。液体制剂可以被直接雾化，并且冻干粉末可以在重构后被雾化。可选地，如本文描述的与治疗剂偶联的B细胞受体配体、CAR和疫苗可以使用氟碳化合物(fluorocarbon)制剂和定量吸入器(metered doseinhaler)雾化，或作为冻干粉末和研磨粉末吸入。
待通过本文描述的方法治疗的受试者可以是哺乳动物，更优选地是人类。哺乳动物包括但不限于农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、马、犬、猫、小鼠和大鼠。需要治疗的人类受试者可以是具有目标疾病/紊乱诸如癌症的人类患者、处于目标疾病/紊乱诸如癌症风险的人类患者或被怀疑具有目标疾病/紊乱诸如癌症的人类患者。具有目标疾病或紊乱的受试者可以通过常规医学检查来鉴定，例如，实验室测试、器官功能测试、CT扫描或超声波。被怀疑具有任何此类目标疾病/紊乱的受试者可能显示出该疾病/紊乱的一种或更多种症状。处于疾病/紊乱风险的受试者可以是具有该疾病/紊乱的一种或更多种风险因素的受试者。
本文描述的方法和组合物可以被用于治疗任何与癌症相关的疾病或紊乱。在一些实施方案中，癌症是B细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，癌症是淋巴瘤。在一些实施方案中，癌症选自弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤(MZL)或粘膜相关淋巴组织淋巴瘤(MALT)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、伯基特淋巴瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、结边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、原发性中枢神经***淋巴瘤、ALK阳性大B细胞淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、发生于HHV8相关多中心性Castleman病的大B细胞淋巴瘤和B细胞淋巴瘤。
其他癌症包括，但不限于：口部(oral)：口腔(buccal cavity)、唇、舌、口(mouth)、咽；心脏：肉瘤(血管肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤)、黏液瘤、横纹肌瘤、纤维瘤、脂肪瘤和畸胎瘤；肺：非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌、支气管癌(鳞状细胞癌或表皮癌、未分化小细胞癌、未分化大细胞癌、腺癌)、肺泡癌(细支气管癌)、支气管腺瘤、肉瘤、淋巴瘤、软骨瘤样错构瘤(chondromatous hamartoma)、间皮瘤；胃肠：食管(鳞状细胞癌、喉癌、腺癌、平滑肌肉瘤、淋巴瘤)、胃(癌、淋巴瘤、平滑肌肉瘤)、胰腺(导管腺癌、胰岛素瘤、胰高血糖素瘤、胃泌素瘤、类癌瘤、舒血管肠肽瘤(vipoma))、小肠(small bowel)或小肠(smallintestines)(腺癌、淋巴瘤、类癌瘤、卡波氏肉瘤、平滑肌瘤、血管瘤、脂肪瘤、神经纤维瘤、纤维瘤)、大肠(large bowel)或大肠(large intestines)(腺癌、管状腺瘤、绒毛状腺瘤、错构瘤、平滑肌瘤)、直肠、结肠、结肠直肠、结直肠(colorectal)；泌尿生殖道：肾(腺癌、Wilm肿瘤(Wilm'stumor)[肾胚细胞瘤]、淋巴瘤、白血病)、膀胱和尿道(鳞状细胞癌、移行细胞癌、腺癌)、***(腺癌、肉瘤)、睾丸(***瘤、畸胎瘤、胚胎癌、畸形恶瘤(teratocarcinoma)、绒毛膜癌、肉瘤、***癌、纤维瘤、纤维腺瘤、腺瘤样瘤、脂肪瘤)；肝：肝癌(肝细胞癌)、胆管癌、肝母细胞瘤、血管肉瘤、肝细胞腺瘤、血管瘤、胆道(biliarypassages)；骨：成骨性肉瘤(骨肉瘤)、纤维肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、软骨肉瘤、尤因氏肉瘤(Ewing's sarcoma)、恶性淋巴瘤(网状细胞肉瘤)、多发性骨髓瘤、恶性巨细胞瘤、脊索瘤、骨软骨瘤(骨软骨性外生骨疣(osteocartilaginous exostoses))、良性软骨瘤、软骨母细胞瘤、软骨肌瘤样纤维瘤(chondromyxofibroma)、骨样骨瘤和巨细胞瘤；神经***：颅骨(骨瘤、血管瘤、肉芽肿、黄瘤、畸形性骨炎)、头颈癌、脑膜(脑膜瘤、脑膜肉瘤(meningiosarcoma)、神经胶质瘤病)、脑(星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、胶质瘤、室管膜瘤、生殖细胞瘤[松果体瘤]、多形性胶质母细胞瘤(glioblastomamultiform)、少突胶质细胞瘤、神经鞘瘤、视网膜母细胞瘤、先天性肿瘤)、脊髓神经纤维瘤、脑膜瘤、胶质瘤、肉瘤)；妇科：子宫(子宫内膜癌)、子宫颈(***、肿瘤前宫颈发育不良(pre-tumor cervicaldysplasia))、卵巢(卵巢癌[浆液性囊腺癌、黏液性囊腺癌(mucinouscystadenocarcinoma)、未分类癌)、颗粒-卵泡膜细胞肿瘤(granulosa-thecal celltumors)、支持***细胞瘤(SertolI-Leydigcell tumors)、无性细胞瘤、恶性畸胎瘤)、外阴(鳞状细胞癌、上皮内癌、腺癌、纤维肉瘤、黑素瘤)、***(透明细胞癌、鳞状细胞癌、葡萄状肉瘤(胚胎性横纹肌肉瘤)、输卵管(癌)、乳腺；血液学：血液(骨髓性白血病[急性和慢性]、急性淋巴细胞白血病、骨髓增生性疾病、多发性骨髓瘤、骨髓增生异常综合征)、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤[恶性淋巴瘤]毛细胞；淋巴样紊乱(lymphoid disorder)；皮肤：恶性黑素瘤、基底细胞癌、鳞状细胞癌、卡波氏肉瘤、角化棘皮瘤、异型增生痣(moles dysplasticcnevi)、脂肪瘤、血管瘤、皮肤纤维瘤、瘢痕瘤、银屑病，甲状腺：***状甲状腺癌、滤泡性甲状腺癌；甲状腺髓样癌、2A型多发性内分泌瘤、2B型多发性内分泌瘤、家族性甲状腺髓样癌、嗜铬细胞瘤、副神经节瘤；以及肾上腺：神经母细胞瘤。
如本文使用的，“有效量”是指单独或与一种或更多种其他活性剂组合，赋予对受试者的治疗效果所需的每种活性剂的量。在一些实施方案中，治疗效果是减少癌症的进展。对本领域技术人员来说，确定本文描述的偶联有治疗剂的B细胞受体配体或本文描述的CAR和疫苗的量是否达到治疗效果是明显的。如本领域技术人员认识的，治疗有效量根据所治疗的特定状况、状况的严重程度、个体患者参数包括年龄、身体状况、尺寸、性别和体重、治疗的持续时间、联合疗法(如果有的话)的特性、具体的施用途径以及健康专业人员的知识和专业知识中的类似因素而变化。这些因素对本领域普通技术人员是熟知的，并且可以使用不超过常规的实验解决。通常优选的是使用最大剂量的单独组分或其组合，即根据合理的医学判断，最高的安全剂量。
经验因素，诸如半衰期，通常将有助于剂量的确定。施用频率可以在疗法过程中确定和调整，并且通常但不一定基于目标疾病/紊乱的治疗和/或抑制和/或改善和/或延缓。
在一个实例中，剂量可以在已经给予一次或更多次分子施用的个体中经验地确定。个体被给予递增剂量的分子。为了评估与治疗剂偶联的B细胞受体配体或CAR和疫苗的功效，可以跟踪疾病/紊乱的指标(indicator)。
出于本公开内容的目的，适当的剂量将取决于疾病/紊乱的类型和严重程度、本文描述的与治疗剂偶联的B细胞受体配体或CAR和疫苗是否被施用用于预防目的或治疗目的、先前的疗法、患者的临床病史和对与治疗剂偶联的B细胞受体配体或CAR和疫苗的响应、以及主治医生的判断。通常，临床医生将施用与治疗剂偶联的B细胞受体配体或CAR和疫苗，直到达到实现期望的结果的剂量。在一些实施方案中，期望的结果是降低癌症的严重程度。对于本领域技术人员来说，确定剂量是否导致期望的结果的方法是明显的。与治疗剂偶联的一种或更多种B细胞受体配体或CAR和疫苗的施用可以是连续的或间歇的，这取决于例如接受者的生理状况、施用的目的是治疗性还是预防性、以及专业人员已知的其他因素。与治疗剂偶联的B细胞受体配体或CAR和疫苗的施用可以在预选的时间段内基本上连续，或者可以是一系列间隔剂量，例如在发展目标疾病或紊乱之前、期间或之后。
如本文使用的，术语“治疗”是指将包含一种或更多种活性剂的组合物应用或施用至具有目标疾病或紊乱、疾病/紊乱的症状或对疾病/紊乱的易感性的受试者，目的是治疗、治愈、缓解、减轻、改变、补救、改善、改进或影响紊乱、疾病的症状或对疾病或紊乱的易感性。
缓解目标疾病/紊乱包括延缓疾病的发展或进展，或降低疾病的严重程度。缓解疾病不一定需要治愈结果(curative results)。如其中使用的，“延缓”目标疾病或紊乱的发展意指推迟、阻碍、减缓、阻止、稳定和/或延迟疾病的进展。这种延缓可以是不同的时间长度，取决于疾病的历史和/或所治疗的个体。当与不使用该方法相比时，“延缓”或缓解疾病的发展或者延缓疾病的发作的方法是一种降低在给定时间帧内发展疾病的一种或更多种症状的可能性和/或降低在给定时间帧内症状的程度的方法。这样的比较通常基于使用足以给出统计学意义结果的受试者数目的临床研究。
疾病的“发展”或“进展”意指疾病的最初表现和/或随后的进展。疾病的发展是可检测的并可以使用本领域熟知的标准临床技术来评估。然而，发展也指可能检测不到的进展。出于本公开内容的目的，发展或进展是指症状的生物学过程。“发展”包括发生、复发和发作。如本文使用的，目标疾病或病症的“发作”或“发生”包括初始发作和/或复发。
本文描述的与治疗剂偶联的B细胞受体配体或CAR和疫苗可以通过常规途径施用，例如，口服、胃肠外、通过吸入喷雾剂、局部、直肠、鼻腔、含服、***或通过植入的贮器(reservoir)施用。如本文使用的，术语“肠胃外”包括皮下注射、皮内注射、静脉内注射、肌内注射、关节内注射、动脉内注射、滑膜内注射、胸骨内注射、鞘内注射、病灶内注射和颅内注射或输注技术。此外，肠胃外可以通过可注射贮库(depot)施用途径，诸如使用1个月、3个月或6个月贮库可注射或生物可降解的材料和方法向受试者施用。在一些实例中，药物组合物是眼内或玻璃体内施用的。
在一种实施方案中，本文描述的与治疗剂偶联的B细胞受体配体或CAR和疫苗通过位点特异性或靶向局部递送技术施用。位点特异性或靶向局部递送技术的实例包括抗体的多种可植入贮库来源或局部递送导管，诸如输注导管、留置导管或针导管、合成移植物、外膜覆膜(adventitial wraps)、分流器和支架或其他可植入装置、位点特异性运载体(carrier)、直接注射或直接应用。参见，例如，PCT公布第WO 00/53211号和美国专利第5,981,568号。
还可以使用含有反义多核苷酸、表达载体或亚基因组多核苷酸的治疗性组合物的靶向递送。受体介导的DNA递送技术在以下中描述：例如，Findeis等人,TrendsBiotechnol.(1993)11:202；Chiou等人,Gene Therapeutics:Methods And ApplicationsOf Direct Gene Transfer(J.A.Wolff,编著)(1994)；Wu等人,J.Biol.Chem.(1988)263:621；Wu等人,J.Biol.Chem.(1994)269:542；Zenke等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87:3655；Wu等人,J.Biol.Chem.(1991)266:338。
本文描述的治疗性多核苷酸和多肽可以使用基因递送媒介物递送。基因递送媒介物可以是病毒或非病毒来源的(通常参见，Jolly,Cancer Gene Therapy(1994)1:51；Kimura,Human Gene Therapy(1994)5:845；Connelly,Human Gene Therapy(1995)1:185；和Kaplitt,Nature Genetics(1994)6:148)。这样的编码序列的表达可以使用内源哺乳动物启动子和/或增强子或者异源启动子和/或增强子来诱导。编码序列的表达可以是组成型的或调节型的。
用于递送期望的多核苷酸和在期望的细胞中表达的基于病毒的载体是本领域中熟知的。示例性基于病毒的媒介物包括但不限于重组逆转录病毒(参见，例如，PCT公布第WO90/07936号；第WO 94/03622号；第WO 93/25698号；第WO 93/25234号；第WO 93/11230号；第WO 93/10218号；第WO 91/02805号；美国专利第5,219,740号和第4,777,127号；英国专利第2,200,651号；和欧洲专利第0 345 242号)、基于甲病毒的载体(例如，辛德毕斯病毒(Sindbis virus)载体、塞姆利基森林病毒(Semliki forest virus)(ATCC VR-67；ATCCVR-1247)、罗斯河病毒(Ross River virus)(ATCC VR-373；ATCC VR-1246)和委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)(ATCC VR-923；ATCC VR-1250；ATCCVR1249；ATCC VR-532))和腺相关病毒(AAV)载体(参见，例如，PCT公布第WO 94/12649号、第WO 93/03769号；第WO 93/19191号；第WO 94/28938号；第WO 95/11984号和第WO 95/00655号)。还可以采用如在Curiel,Hum.Gene Ther.(1992)3:147中描述的被连接至灭活腺病毒的DNA的施用。
还可以采用非病毒递送媒介物和方法，包括但不限于与单独的灭活腺病毒(killed adenovirus)连接或未与其连接的聚阳离子浓缩的DNA(参见，例如，Curiel,Hum.Gene Ther.(1992)3:147)；配体连接的DNA(参见，例如，Wu,J.Biol.Chem.(1989)264:16985)；真核细胞递送媒介物细胞(参见，例如，美国专利第5,814,482号；PCT公布第WO 95/07994号；第WO 96/17072号；第WO 95/30763号；和第WO97/42338号)以及核电荷中和或与细胞膜融合。还可以使用裸DNA。示例性裸DNA引入方法在以下中描述：PCT公布第WO 90/11092号和美国专利第5,580,859号。可以用作基因递送媒介物的脂质体在以下中描述：美国专利第5,422,120号；PCT公布第WO 95/13796号；第WO 94/23697号；第WO 91/14445号；和欧洲专利第0524968号。另外的方法以下中描述：Philip,Mol.Cell.Biol.(1994)14:2411和Woffendin,Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)91:1581。
本文描述的方法中使用的特定给药方案，即剂量、时机和重复，将取决于特定受试者和该受试者的病史。
目标疾病/紊乱的治疗效果可以通过本领域熟知的方法评估
如本文使用的，术语“组合”是指使用多于一种治疗剂。术语“组合”的使用并不限制向受试者施用治疗剂的顺序。第一治疗剂可以在第二治疗剂施用之前(例如，之前5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)、与第二治疗剂施用伴随地或在第二治疗剂施用之后(例如，之后5分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、12小时、24小时、48小时、72小时、96小时、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周或12周)被施用。因此，第一剂可以与第二治疗剂单独、依次或同时施用。
在一些实施方案中，本文描述的CAR-T细胞和疫苗与TLR9激动剂组合施用。在一些实施方案中，TLR9激动剂是CpG寡核苷酸。
疫苗
在一些实施方案中，本文描述的表达CAR的T细胞与疫苗一起施用。在一些实施方案中，疫苗包括表达癌症特异性抗原或其癌症特异性片段的多肽或核酸，如上所述。
在一些实施方案中，疫苗包括癌症特异性抗原的癌症特异性片段。
在一些实施方案中，癌症特异性抗原的癌症特异性片段是1-1000个氨基酸长或10-500个氨基酸长。在一些实施方案中，癌症特异性抗原的癌症特异性片段是10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、200个、300个、400个或500个或更多个氨基酸长。
在一些实施方案中，癌症特异性抗原或其癌症特异性片段包含如上描述的体细胞突变，例如，包含点突变、剪接位点突变、移码突变、读通突变或基因融合突变，并且表达癌症特异性抗原或其癌症特异性片段的多肽或核酸包含体细胞突变。
肽疫苗
在一些实施方案中，疫苗包括表达癌症特异性抗原或其癌症特异性片段的多肽。
在特定实施方案中，编码蛋白疫苗的DNA可以被引入表达载体，诸如质粒。含有限制性酶识别的DNA序列的多个克隆位点可以促进蛋白疫苗DNA***载体。在特定实施方案中，编码感兴趣的蛋白的DNA构建体(诸如表达载体)可以被引入细胞以诱导蛋白表达，并且可以收获细胞以提取感兴趣的蛋白。编码感兴趣的蛋白的DNA可以被包含在表达载体中，该载体还包含控制基因表达的序列，诸如启动子序列。5’和3’非翻译区可以被编码在蛋白编码序列的上游和下游，以增强表达。例如，可以使用5’非翻译前导序列和3’聚腺苷酸化序列。在特定实施方案中，可以通过热休克转化将DNA引入细胞中用于蛋白表达。在特定实施方案中，可以通过转染、电穿孔、穿刺转染(impalefection)或流体动力递送(hydrodynamicdelivery)将DNA引入细胞中用于蛋白表达。在特定实施方案中，用于蛋白表达的DNA可以病毒载体的形式递送。在特定实施方案中，感兴趣的蛋白可以从裂解的细胞收获并纯化。蛋白纯化可以使用尺寸排阻色谱进行，或者通过基于蛋白标签(诸如6×组氨酸标签或c-myc标签)分离蛋白的色谱技术进行。组氨酸标签可以被编码在被蛋白酶识别并裂解的序列附近，以便于在蛋白纯化后去除组氨酸标签。可以被用于从蛋白去除组氨酸标签的蛋白酶的实例是人类鼻病毒3C蛋白酶。
在一些实施方案中，疫苗包括具有重叠序列的两种或更多种多肽，每一种多肽表达癌症特异性抗原的片段。
在一些实施方案中，多肽被缀合至运载体蛋白，例如，OVA、KLH或BSA。
DNA疫苗
在一些实施方案中，疫苗包括表达癌症特异性抗原或其癌症特异性片段的核酸。
在一些实施方案中，核酸是DNA。DNA疫苗可以包括“表达载体”或“表达盒”，即能够实现蛋白编码序列在与这样的序列相容的宿主中的表达的核苷酸序列。表达盒至少包括与多肽编码序列可操作地连接的启动子；和任选地与其他序列，例如，转录终止信号可操作地连接的启动子。还可以包括实现表达所必需或有帮助的其他因素，例如，增强子。
“可操作地连接”意指编码序列以允许表达编码序列的方式被连接至调节序列。选择已知的调节序列来指导期望的蛋白在适当的宿主细胞中的表达。因此，术语“调节序列”包括启动子、增强子和其他表达控制元件。这样的调节序列在以下中描述：例如，Goeddel,Gene Expression Technology.Methods in Enzymology,第185卷,Academic Press,SanDiego,Calif.(1990))。
DNA分子或RNA分子的启动子区域结合RNA聚合酶，并促进“可操作连接的”核酸序列的转录。如本文使用的，“启动子序列”是存在于由RNA聚合酶转录的DNA或RNA链上的启动子的核苷酸序列。当核酸分子的两个序列，诸如启动子和编码序列，以允许两个序列被转录到同一RNA转录物上或允许在一个序列开始的RNA转录物延伸到第二个序列的方式彼此连接时，它们是“可操作地连接的”。因此，如果在启动子序列中开始的转录将产生可操作地连接的编码序列的RNA转录物，则两个序列，诸如启动子序列和DNA或RNA的编码序列是可操作地连接的。为了被“可操作地连接”，两个序列不必在线性序列中彼此紧邻。
本发明优选的启动子序列必须在哺乳动物细胞中是可操作的，并且可以是真核生物启动子或病毒启动子。合适的启动子可以是诱导型的、抑制型的或组成型的。“组成型”启动子是在细胞环境和整个发育过程中遇到的大多数条件下都有活性的启动子。“诱导型”启动子是处于环境或发育调节下的启动子。“组织特异性”启动子在生物体的某些组织类型中是有活性的。组成型启动子的实例是病毒启动子MSV-LTR，其在多种细胞类型中是有效且有活性的，并且与大多数其他启动子不同，在停滞和生长的细胞中具有相同的增强活性。其他优选的病毒启动子包括存在于CMV-LTR(来自巨细胞病毒)(Bashart,M.等人,Cell 41:521,1985)或RSV-LTR(来自劳斯肉瘤病毒)(Gorman,C.M.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6777,1982)中的启动子。还有用的是小鼠金属硫蛋白I基因的启动子(Hamer,D,等人,J.Mol.Appl.Gen.1:273-88,1982)；疱疹病毒的TK启动子(McKnight,S,Cell 31:355-65,1982)；SV40早期启动子(Benoist,C.,等人,Nature 290:304-10,1981)；和酵母gal4基因启动子(Johnston,S A等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79:6971-5,1982)；Silver,P A,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)81:5951-5,1984))。与启动子区域相关的转录因子以及转录因子的单独活化和DNA结合的其他说明性描述包括：Keegan等人,Nature 231:699,1986；Fields等人,Nature 340:245,1989；Jones,Cell 61:9,1990；Lewin,Cell 61:1161,1990；Ptashne等人,Nature 346:329,1990；Adams等人,Cell 72:306,1993。
启动子区域还可以包括八聚体区域，该八聚体区域还可以通过与存在于特定组织中的某些蛋白相互作用而作为组织特异性增强子起作用。本发明的DNA构建体的增强子结构域是对待转染的靶细胞特异性的结构域，或者被这样的靶细胞的细胞因子高度活化的结构域。载体(质粒或逆转录病毒)的实例在以下中公开：例如，Roy-Burman等人的美国专利第5,112,767号。关于增强子及其在转录中的作用的一般性讨论，参见，Lewin,BM,Genes IV,Oxford University Press第552-576页,1990(或更高版本)。特别有用的是逆转录病毒增强子(例如，病毒LTR)，其优选地被放置于与其相互作用以刺激基因表达的启动子的上游。为了与逆转录病毒载体一起使用，内源病毒LTR可以被赋予无增强子，并被赋予组织特异性或其他期望特性诸如转录效率的其他期望的增强子序列取代。
因此，表达盒包括质粒、重组病毒、任何形式的重组“裸DNA”载体等。“载体”包括能够感染、转染、瞬时或永久转导细胞的核酸。将认识到的是，载体可以是裸核酸，或者是与蛋白或脂质复合的核酸。载体任选地包括病毒或细菌核酸和/或蛋白和/或膜(例如，细胞膜、病毒脂质包膜等)。载体包括复制子(例如，RNA复制子)、细菌噬菌体，DNA片段可以附接至其并变成复制的。因此，载体包括但不限于RNA、自主自我复制的环状或线性DNA或RNA，例如，质粒、病毒等(美国专利第5,217,879号)，并且包括表达质粒和非表达质粒两种。在重组细胞或培养物被描述为容纳(host)“表达载体”的情况下，这包括染色体外环状和线性DNA以及已经整合到宿主染色体中的DNA两者。在载体由宿主细胞维持的情况下，载体可以在有丝***期间作为自主结构被细胞稳定复制，或者被掺入宿主基因组中。
可以使用的示例性病毒载体包括重组腺病毒(Horowitz,M S,In:Virology,Fields,B N等人,编著,Raven Press,NY,1990,第1679页；Berkner,K L,Biotechniques 6:616-29,1988；Strauss,S E,In:The Adenoviruses,Ginsberg,H S,编著,Plenum Press,NY,1984,第11章)和单纯疱疹病毒(HSV)。腺病毒载体用于人类基因递送的优势包括以下事实：重组很少、已知没有人类恶性肿瘤与这样的病毒相关、腺病毒基因组是双链DNA(其可以***纵以接受尺寸最多7.5kb的外源基因)，并且活腺病毒是安全的人类疫苗生物体。根据本发明，腺相关病毒也可用于人类疗法(Samulski,R J等人,EMBO J.10:3941,1991)。
另一种能够表达本发明的DNA分子并可用于本发明治疗环境的载体是牛痘病毒(vaccinia virus)，其可被赋予成不可复制的(美国专利第5,225,336号；第5,204,243号；第5,155,020号；第4,769,330号；Fuerst,T R等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:2549-53,1992；Chakrabarti,S等人,Mol Cell Biol 5:3403-9,1985)。重组牛痘病毒和其他含有异源DNA的病毒的描述及其在免疫和DNA疗法中的用途在以下文献中进行了综述：Moss,B,Curr Opin Genet Dev 3:86-90,1993；Moss,B,Biotechnol.20:345-62,1992)。
可以使用的其他病毒载体包括病毒载体或非病毒载体，包括腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体和质粒载体。示例性病毒类型包括HSV(单纯疱疹病毒)、AAV病毒(腺相关病毒)、HIV(人类免疫缺陷病毒)、BIV病毒(牛免疫缺陷病毒)和MLV病毒(鼠白血病病毒)。
DNA疫苗也可以使用复制子，例如，RNA复制子，一种自我复制的RNA载体。通常，RNA复制子疫苗可以来源于甲病毒载体，诸如辛德毕斯病毒(Hariharan,M J等人,1998.JVirol 72:950-8.)、塞姆利基森林病毒(Berglund,P M等人,1997.AIDS Res Hum Retroviruses 13:1487-95；Ying,H T等人,1999.Nat Med 5:823-7)或委内瑞拉马脑炎病毒(Pushko,P M等人,1997.Virology 239:389-401)。这些自我复制和自我限制的疫苗可以以(1)RNA或(2)DNA的形式施用，其然后在体外或体内转染的细胞中转录成RNA复制子(Berglund,P C等人,1998.Nat Biotechnol 16:562-5；Leitner,W W等人,2000.CancerRes 60:51-5)。示例性塞姆利基森林病毒是pSCA1(DiCiommo,D P等人,J Biol Chem 1998；273:18060-6)。
除了裸DNA或病毒载体之外，工程化细菌也可以被用作载体。许多细菌菌株，包括沙门氏菌(Salmonella)，BCG和单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)(LM)(Hoiseth等人,Nature 291:238-9,1981；Poirier,T P等人,J Exp Med 168:25-32,1988)；Sadoff,J C等人,Science 240:336-8,1988；Stover,C K等人,Nature 351:456-60,1991；Aldovini,A等人,Nature 351:479-82,1991)。这些生物体展示出两个用作疫苗载体的有希望的特征：(1)肠道感染途径，提供口服疫苗递送的可能性；和(2)感染单核细胞/巨噬细胞，从而将抗原靶向专业的APC。
除了体内病毒介导的基因转移之外，本领域熟知的物理手段可以被用于直接转移DNA，包括施用质粒DNA(Wolff等人,1990,同上)和粒子轰击介导的基因转移(Yang,N-S,等人,Proc Natl Acad Sci USA 87:9568,1990；Williams,R S等人,Proc Natl Acad SciUSA 88:2726,1991；Zelenin,A V等人,FEBS Lett 280:94,1991；Zelenin,A V等人,FEBSLett 244:65,1989)；Johnston,S A等人,In Vitro Cell Dev Biol 27:11,1991)。此外，电穿孔，一种在体外将基因转移到细胞中的熟知的方法，可以被用于将根据本发明的DNA分子转移到体内组织中(Titomirov,A V等人,Biochim Biophys Acta 1088:131,1991)。
“载体介导的基因转移”也被描述(Wu,C H等人,J Biol Chem 264:16985,1989；Wu,G Y等人,J Biol Chem 263:14621,1988；Soriano,P等人,Proc Nat.Acad Sci USA 80:7128,1983；Wang,C-Y等人,Pro.Natl Acad Sci USA 84:7851,1982；Wilson,J M等人,JBiol Chem 267:963,1992)。优选的运载体是靶向脂质体(Nicolau,C等人,Proc Natl AcadSci USA 80:1068,1983；Soriano等人,同上)，诸如免疫脂质体，其可以将酰化mAb掺入脂质双层(Wang等人，同上)。可以使用聚阳离子，诸如无唾液酸糖蛋白/聚赖氨酸(Wu等人,1989,同上)，其中缀合物包括靶组织识别分子(例如，用于肝的无唾液酸血清类黏蛋白(asialo-orosomucoid))和与待转染的DNA结合而不引起损伤的DNA结合化合物，诸如聚赖氨酸。然后将该缀合物与本发明的质粒DNA复合。
用于转染或显微注射的质粒DNA可以使用本领域熟知的方法制备，例如使用Qiagen程序(Qiagen)，随后使用已知方法，诸如本文例示的方法进行DNA纯化。
这样的表达载体可以被用于转染宿主细胞(体外、离体或体内)，用于表达DNA和产生编码的蛋白(包括融合蛋白或肽)。在一种实施方案中，将DNA疫苗施用至细胞或者与细胞接触，细胞例如，从受试者获得的细胞(例如抗原呈递细胞)，并且施用至受试者，其中在将细胞施用至受试者之前、之后或同时对受试者进行治疗。
RNA疫苗
在一些实施方案中，疫苗包括表达癌症特异性抗原或其癌症特异性片段的核酸，并且核酸是RNA。
如本文提供的RNA疫苗包括至少一种(一种或更多种)核糖核酸(RNA)多核苷酸，其具有编码至少一种癌症特异性抗原或其癌症特异性片段的开放阅读框。术语“核酸”以其最广泛的意义包括任何包括核苷酸聚合物的化合物和/或物质。这些聚合物被称为多核苷酸。
在一些实施方案中，本公开内容的多核苷酸起信使RNA(mRNA)的作用。“信使RNA”(mRNA)是指编码(至少一种)多肽(天然存在、非天然存在或修饰的氨基酸聚合物)，并且可以被翻译以在体外、体内、原位或离体产生编码的多肽的任何多核苷酸。
mRNA分子的基本组分通常包括至少一个编码区，5’非翻译区(UTR)、3’UTR、5’帽和poly-A尾。本公开内容的多核苷酸可以起mRNA的作用，但是可以在其功能和/或结构设计特征上与野生型mRNA区分开，所述功能和/或结构设计特征用于克服使用基于核酸的疗法有效表达多肽的现有问题。
在一些实施方案中，本公开内容的RNA(例如，mRNA)疫苗包括至少一种核糖核酸(RNA)多核苷酸，其具有编码至少一种癌症特异性抗原或其癌症特异性片段的开放阅读框，其中所述RNA包含至少一个化学修饰。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包含多个(多于一个)不同的修饰。在一些实施方案中，多核苷酸的特定区域含有一个、两个或更多个(任选地不同的)核苷或核苷酸修饰。在一些实施方案中，相对于未修饰的多核苷酸，引入到细胞或生物体的修饰的RNA多核苷酸(例如，修饰的mRNA多核苷酸)在细胞或生物体中分别表现出降低的降解。在一些实施方案中，引入细胞或生物体的修饰的RNA多核苷酸(例如，修饰的mRNA多核苷酸)可以在细胞或生物体中分别表现出降低的免疫原性(例如，降低的先天响应)。
在一些实施方案中，多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)包括非天然修饰的核苷酸，其在多核苷酸的合成期间或合成后被引入以实现期望的功能或特性。修饰可以存在于核苷酸间键、嘌呤碱基或嘧啶碱基或糖上。修饰可以通过化学合成或聚合酶在链的末端或链中的任何其他地方引入。多核苷酸的任何区域都可以被化学修饰。
本公开内容提供了多核苷酸(例如，RNA多核苷酸，诸如mRNA多核苷酸)的修饰的核苷和核苷酸。“核苷”是指含有糖分子(例如，戊糖或核糖)或其衍生物与有机碱基(例如，嘌呤或嘧啶)或其衍生物(本文也称为“核碱基”)组合的化合物。“核苷酸”是指核苷，包括磷酸基团。修饰的核苷酸可以通过任何有用的方法，诸如，例如，化学、酶促或重组合成，以包括一个或更多个修饰的或非天然核苷。多核苷酸可以包含一个连接的核苷区域或更多个连接的核苷区域。这样的区域可以具有可变的骨架连接。连接可以是标准的磷酸二酯连接，在这种情况下，多核苷酸将包含核苷酸区域。
本公开内容的癌症疫苗包括至少一种RNA多核苷酸，诸如mRNA(例如，修饰的mRNA)。例如，mRNA在体外由模板DNA(称为“体外转录模板”)转录。在一些实施方案中，体外转录模板编码5’非翻译(UTR)区，含有开放阅读框，并且编码3’UTR和polyA尾。体外转录模板的特定核酸序列组成和长度将取决于模板编码的mRNA。
在一些实施方案中，多核苷酸包括200至3,000个核苷酸。例如，多核苷酸可以包括200至500个、200至1000个、200至1500个、200至3000个、500至1000、500至1500个、500至2000个、500至3000个、1000至1500个、1000至2000个、1000至3000个、1500至3000个或2000至3000个核苷酸。
在其他方面，本发明涉及一种用于通过IVT方法制备mRNA癌症疫苗的方法。体外转录(IVT)方法允许模板指导合成几乎任何序列的RNA分子。可以使用IVT方法合成的RNA分子的尺寸范围从短寡核苷酸至几千个碱基的长核酸聚合物。IVT方法允许合成大量的RNA转录物(例如，从微克至毫克的量)(Beckert等人,Synthesis of RNA by in vitrotranscription,Methods Mol Biol.703:29-41(2011)；Rio等人RNA:A LaboratoryManual.Cold Spring Harbor:Cold Spring Harbor Laboratory Press,2011,205-220.；Cooper,Geoffery M.The Cell:A Molecular Approach.第4版Washington D.C.:ASMPress,2007.262-299)。通常，IVT利用以感兴趣序列上游的启动子序列为特征的DNA模板。启动子序列最常见的是细菌噬菌体来源的(例如T7启动子序列、T3启动子序列或SP6启动子序列)，但是许多其他启动子序列也是可以容忍的，包括从头设计的那些。通常，通过使用对应于特定细菌噬菌体启动子序列的RNA聚合酶，可以最好地实现DNA模板的转录。示例性RNA聚合酶包括但不限于T7 RNA聚合酶、T3 RNA聚合酶或SP6 RNA聚合酶以及其他。IVT通常在dsDNA上起始，但可以在单链上进行。
疫苗组合物
在一些实施方案中，疫苗最低限度包括抗原。
为了进一步实现根据本公开内容的有效疫苗，可以采用提高疫苗的可用性的材料和方法。一种这样的方法采用佐剂。
术语“佐剂”是指增强对抗原的免疫响应的材料，并且本文以该术语的惯用用法使用。尚不了解所有佐剂的确切的作用方式，但这样缺乏了解的情况并不妨碍其在多种疫苗中的临床使用，无论是基于蛋白还是基于DNA的疫苗。传统上，一些佐剂在注射部位物理捕获抗原，增强抗原在注射部位的存在并减缓其释放。这继而延长和/或增加APC的募集和活化，诸如在这种情况下，是iDC。
在特定实施方案中，使用基于角鲨烯的佐剂。角鲨烯是已知为三萜类(triterpenes)的一组分子的一部分，三萜类全部是具有30个碳分子的烃。角鲨烯可以来源于某些植物来源，诸如米糠、小麦胚芽、苋菜籽和橄榄，以及来自动物来源，诸如鲨鱼肝油。在特定实施方案中，基于角鲨烯的佐剂是
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其是水包油乳液(Novartis,Basel,Switzerland；参见Giudice,G D等Clin Vaccine Immunol.2006Sep；13(9):1010-3)。类似于
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但是是为临床前研究使用而设计的基于角鲨烯的佐剂的实例是AddavaxTM(InvivoGen,San Diego,CA)。MF59已经被FDA批准用于流感疫苗，并且研究表明它在怀孕期间使用是安全的(TsaiT,等人Vaccine.2010.17:28(7):1877-80；Heikkinen T,等人Am JObstet Gynecol.2012.207(3):177)。在特定实施方案中，基于角鲨烯的佐剂可以包括0.1％-20％(v/v)角鲨烯油。在特定实施方案中，基于角鲨烯的佐剂可以包括5％(v/v)角鲨烯油。在特定实施方案中，基于角鲨烯的佐剂是AS03，其包括水包油乳液中的α-生育酚、角鲨烯和聚山梨醇酯80(GlaxoSmithKline；参见Garcon N等Expert Rev Vaccines.2012Mar；11(3):349-66)。
在特定实施方案中，使用聚肌苷酸:聚胞苷酸(也称为poly(I:C))。Poly(I:C)是一种合成的刺激免疫***的双链RNA类似物。在特定实施方案中，使用Poly-ICLC(Hiltinol)(AmmiR等人Pharmacol Ther.2015Feb；146:120-31)。在特定实施方案中，使用Poliu-IC12U(Ampligen)(Martins K A等人Expert Rev Vaccines.2015Mar；14(3):447-59)。
在特定实施方案中，可以使用佐剂明矾。明矾是指含有两个硫酸根基团、单价阳离子和三价金属(诸如铝或铬)的盐类(family of salts)。明矾是FDA批准的佐剂。在特定实施方案中，疫苗可以包括1-1000ug/剂量或0.1mg-10mg/剂量的量的明矾。
在特定实施方案中，可以使用佐剂
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(Vical,Inc.,San Diego,CA)。
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是一种基于阳离子脂质的佐剂，可用于DNA疫苗或蛋白疫苗。
用于施用的组合物。本公开内容的疫苗可以被配制成用于施用的药物组合物。本公开内容的疫苗可以被配制成多种形式，例如，作为液体、凝胶、被冻干或作为压缩固体。具体形式将取决于所治疗的具体适应症，并且对于本领域普通技术人员将是明显的
药物组合物的实例是设计用于肠胃外施用的溶液。尽管在许多情况下，药物溶液制剂是以液体形式提供的，适于立即使用，但这样的肠胃外制剂也可以以冷冻或冻干形式提供。在前一种情况下，组合物必须在使用前解冻。后一种形式通常用于增强组合物中所含活性化合物在更广泛的储存条件下的稳定性，因为本领域技术人员或普通技术人员认识到冻干制剂通常比其液体制剂更稳定。这样的冻干制剂在使用前通过添加一种或更多种合适的药学上可接受的稀释剂诸如无菌的注射用水或无菌的生理盐水溶液来重构。
肠胃外制剂可以制备成冻干制剂或水溶液的形式以用于储存，制备是通过将具有期望纯度的组合物与本领域通常采用的一种或更多种药学上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂(所有这些都被称为“赋形剂”)适当混合，例如缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子去污剂、抗氧化剂和/或其他各种添加剂。
缓冲剂辅助维持pH在接近生理条件的范围内。缓冲剂通常以从2mM至50mM的范围的浓度存在。用于本公开内容使用的合适的缓冲剂包括有机酸和无机酸两者以及其盐，诸如柠檬酸盐缓冲液(例如，柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合物等)、琥珀酸盐缓冲液(例如，琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)、酒石酸盐缓冲液(例如，酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)、富马酸盐缓冲液(例如，富马酸-富马酸单钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸单钠-富马酸二钠混合物等)、葡萄糖酸盐缓冲液(例如，葡萄糖酸-葡萄糖酸钠混合物、葡萄糖酸-氢氧化钠混合物、葡萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)、草酸盐缓冲液(例如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)、乳酸盐缓冲液(例如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)和乙酸盐缓冲液(例如，乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等)。另外可能的是磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液和三甲胺盐诸如Tris。
防腐剂可以被添加以阻碍微生物生长，并且通常以0.2％-1％(w/v)的量被添加。用于本公开内容使用的合适的示例性防腐剂包括苯酚、苯甲醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、卤化苄烷铵(benzalkonium halides)(例如，苯扎氯铵、苯扎溴铵或苯扎碘铵)、六甲氯铵、对羟基苯甲酸烷基酯诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯、儿茶酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。
可以添加等渗剂(isotonicifier)以确保液体组合物的等渗性并且等渗剂包括多元糖醇，三元或更高级的糖醇，诸如甘油、赤藓醇、***糖醇、木糖醇、山梨醇和甘露醇。考虑到其他成分的相对量，多元醇可以以按重量计0.1％和25％之间、通常1％至5％之间的量存在。
稳定剂是指一大类赋形剂，其功能范围从填充剂至使疫苗溶解或有助于防止变性或粘附到容器壁的添加剂。通常的稳定剂可以是多元糖醇(以上列举的)；氨基酸诸如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等，有机糖或糖醇，诸如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、核糖醇、肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇和甘油；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，诸如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、α-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分子量多肽(即<10个残基)；蛋白，诸如人类血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；单糖，诸如木糖、甘露糖、果糖和葡萄糖；二糖，诸如乳糖、麦芽糖和蔗糖；三糖诸如棉子糖，以及多糖诸如右旋糖酐。稳定剂通常以基于疫苗组合物按重量计0.1至10,000份的范围存在。另外各种赋形剂包括填充剂或填料(例如，淀粉)、螯合剂(例如，EDTA)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、甲硫氨酸、维生素E)和共溶剂。
疫苗组合物还可以被包埋在例如通过凝聚(coascervation)技术或界面聚合制备的微胶囊，例如羟甲基纤维素、明胶或聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中，被包埋在胶体药物递送***(例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊)或粗滴乳液(macroemulsions)中。这样的技术在Remington's Pharmaceutical Sciences中公开。
待被用于体内施用的胃肠外制剂通常是无菌的。这可以容易地通过例如通过无菌滤膜的过滤实现。
持续释放疫苗组合物的合适实例包括含有该组合物的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质具有合适的形式，诸如薄膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如，聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)或聚(乙烯醇))、聚丙交酯、L-谷氨酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如
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(Alkermes,Inc.,Waltham,MA)技术或LUPRON
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(包括乳酸-乙醇酸共聚物和乙酸亮丙立德的可注射微球；Abbott Endocrine,Inc.,Abbott Park,IL)，和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然聚合物诸如乙烯-乙酸乙烯酯和乳酸-乙醇酸能够使分子长时间释放，诸如长达或超过100天，但某些水凝胶使化合物释放较短的时间段。
实施例
实施例1
本文报告了一种新平台的开发，该平台显著提高滤泡性淋巴瘤治疗的疗效和安全性。由于淋巴瘤是多样性***的克隆性恶性肿瘤，每个肿瘤在其细胞表面上都有不同的抗体。使用组合的基于自分泌的选择(Combinatorial autocrine-based selection)来快速鉴定FL肿瘤细胞的表面上这些B细胞受体的特异性配体。选择的配体以CAR-T形式用于重定向人类CTL。本质上，该形式与通常的CAR-T方案相反。抗体本身不是引导分子，而是靶。因此，利用私人抗体结合配体，这些研究提高了个体化淋巴瘤治疗的可能性，所述私人抗体结合配体可以在几周内获得。
尽管是特殊情况，淋巴瘤细胞上的B细胞受体(BCR)是肿瘤特异性抗原的最纯粹形式(1)。这是因为淋巴瘤是多样性***中一个成员的肿瘤，其中每个肿瘤仅表达108种不同抗体分子中的一种(2)。因此，值得注意的是，对BCR结合有选择性的抗原尚未更普遍地用于疗法(3,4)。原因可能是，在大多数治疗环境中，为每个患者寻找选择性抗原的工作流程是不可能的。在这里，我们描述了一种基于自分泌的形式，该形式允许对个体BCR以与其在临床中的使用相适应的速度鉴定其选择性肽抗原。这些选择的抗原可以被用作CAR-T或其他方法诸如放射疗法的引导分子。要点是基于自分泌的选择允许实现淋巴瘤个体化疗法所需的速度和特异性。
材料和方法
淋巴瘤细胞BCR的鉴定和重建
来自具有滤泡性淋巴瘤诊断(FL)的患者的***活检物由N.N.彼得罗夫肿瘤研究所(N.N.Petrov Research Institute of On cology)(St.Petersburg,Russia)友好提供。手术后，立即将活检样品分成四等份，其中两份装入RNAlater试剂(Qiagen)，并且其余的冷冻保存。通过流式细胞术确定淋巴瘤细胞计数和表面Ig的表达。将含有约250,000个细胞的细胞悬浮液等分试样在4个管中用单克隆抗体染色：1.同种型对照；2.CD45-FITC、CD20-PE、CD3-PC5、CD19-PE-Cy7；3.IgG-PE-Cy5、IgM-FITC、CD19-PECy7；以及4.κ-FITC、λ-PE、CD19-PE-Cy7。使用SSC/FSC和CD19C进行门控，评估淋巴细胞上的免疫球蛋白表达。检测到M重链或G重链、κ轻链或λ轻链的单克隆免疫球蛋白表达。经RNAlater处理的活检样品被用于使用RNAeasy Mini试剂盒(Qiagen)分离总mRNA。使用QuantiTect逆转录试剂盒(Qiagen)通过逆转录合成总cDNA。通过流式细胞术鉴定的重Ig链和轻Ig链的可变区基因在每个基因的单独反应中被扩增。使用了使用高保真度的DNA聚合酶(Q5,NEB)与一组家族特异性的V基因正向引物和C基因特异性的反向引物的半巢式PCR(表1)。第一步，在聚丙烯酰胺凝胶中对PCR产物进行异源双链体分析，以区分同源双链(单克隆PCR产物)与缓慢移动的异源双链体(来源于多克隆淋巴细胞)的拖尾。提取预期尺寸的DNA片段，并且洗脱DNA。对于第二步扩增和测序，使用近端反向C基因特异性引物。滤泡性淋巴瘤BCR的已鉴定的可变片段以scFv的形式克隆入慢病毒载体pLV2-Fc-MTA，慢病毒载体pLV2-Fc-MTA编码膜锚定的人类抗体Fc片段(5)(图5B和图5C)(FL)。Jurkat细胞和Raji细胞用这些病毒转导。通过FACS分析转导的Jurkat-FL和Raji-FL，以选择携带滤泡性淋巴瘤BCR的细胞，然后将其用于自分泌选择或动物实验。
表1.重Ig链和轻Ig链的可变区基因的扩增的引物列表。
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基于CAR的组合肽文库的构建
合成编码第3代嵌合抗原T细胞受体的DNA片段(GeneCust)，并且将其克隆到pLV2慢病毒载体(Clontech)中处于EF1a启动子的控制下。基因的排列顺序是：在N末端的白细胞介素2信号肽；具有修饰的PELLGG和ISR基序的IgG1 Fc间隔物结构域；GGGS接头；CD28跨膜和胞内区域；OX-40和CD3δ的胞内结构域(图5A和图5C)。为了构建组合环肽文库，使用具有简并NNK密码子的寡核苷酸通过PCR，将CX7C(X＝20种天然氨基酸)形式的随机肽附加至Fc结构域的N末端。产生的文库的多样性被估算为109个成员。通过用文库质粒和包装质粒共转染HEK293T细胞来制备CX7C-Fc-CAR的慢病毒文库。在转染后48h收集含有病毒的上清液。使用Lenti-X p24 ELISA(Clontech)确定慢病毒制备物的滴度。
基于FACS的分选
用慢病毒环肽-CAR文库转导Jurkat-FL1、Jurkat-FL2和Jurkat-FL3细胞。感染后两天，使用FACSAria III(BD Biosciences)分选CD69阳性细胞。通过对编码肽序列的基因进行PCR，从分选的细胞直接确定肽序列，并且将这些基因克隆到慢病毒载体中，以构建用于下一轮选择的文库。进行四轮迭代选择。
细胞和培养条件
将细胞系在补充有10％FBS(Gibco)、10mM HEPES、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素和2mM GlutaMAX(Gibco)的培养基中培养。将293T慢病毒包装细胞系(Clontech)和HEp-2细胞系在DMEM(Gibco)中培养。人类HEp-2(CCL-23)细胞系、Jurkat(TIB-152)细胞系和Raji(CCL-86)细胞系是从Cytology RAS培养物保藏中心(Institute of Cytology RASculture collection)(St.Petersburg,Russia)获得的。将Jurkat细胞系、Jurkat-FL细胞系、Raji细胞系和Raji-FL细胞系在RPMI(Gibco)中培养。将人类外周血单核细胞(PBMC)通过在Ficoll-Paque(GE Healthcare)上的梯度密度离心从健康供体的血液中分离，洗涤，并且然后重悬于无血清RPMI中。
CD8+ T细胞的活化、扩增和转导
利用Dynabeads CD8阳性分离试剂盒(Life Technologies)从人类PBMC分离CD8 T细胞。在含有40IU/ml重组IL-2的完全RPMI培养基中，将人类CD8 T细胞以1:1比例用CD3/CD28珠(Life Technologies)活化72小时。将活化的T细胞以400万个细胞/3ml含FL1-CAR、FL2-CAR、FL3-CAR、CD19-CAR或Myc-Fc-CAR的慢病毒上清液加上1ml新鲜的具有40IU/mlIL-2的RPMI培养基的浓度重悬，并且在6孔板中培养。将板在32℃以1200×g离心90分钟，并且然后在37℃孵育4小时。进行另外两次的第二次转导和第三次转导。
动物实验
所有的动物程序都是严格按照实验室动物正确使用和护理建议(ECC Directive86/609/EEC)进行的。该方案得到了俄罗斯科学院西伯利亚分院(the Siberian Branch ofthe Russian Academy of Sciences)(SB RAS)研究所间生物伦理委员会(the Inter-Institute Bioethics Commission)的批准。实验是在SB RAS的细胞学和遗传学研究所的实验动物遗传资源中心进行的。使用平均体重为16–20g的6至8周龄雌性NOD SCID(CB17-Prkdcscid/NcrCrl)小鼠。通过将在200μL 0.9％盐水溶液中的5×106个Raji-FL1细胞皮下接种到小鼠左侧来植入肿瘤。在肿瘤达到至少50mm3的可触及体积后，将小鼠随机分配到实验组或对照组。在肿瘤接种后第17天，携带肿瘤的小鼠静脉内(i.v.)注射3×106个FL1-CART细胞、CD19-CART细胞或Myc-CART细胞。肿瘤体积用卡尺测量，并且用椭球公式(ellipsoidal formula)估算。当肿瘤结节的体积达到2cm3时，处死动物。在肿瘤接种后第38天(CART输注后第21天)，将来自每个实验组的动物用于分离血液、脾和骨髓细胞。将红细胞用RBC裂解缓冲液(0.15M NH4Cl、10mM NaHCO3、0.1mM EDTA)裂解，并且将细胞用CD3(用于血液样品)、CD45RA和CCR7特异性抗体染色，并且通过Novocyte流式细胞仪(ACEABiosciences)进行分析。将肿瘤在4％中性缓冲甲醛中固定2周，并且利用标准方案进行石蜡切片处理。
生物光子肿瘤成像
将动物腹膜内注射150μl(每只小鼠4.29mg)新鲜解冻的D萤光素钾盐水溶液(GOLDBIO)。10分钟后，处死动物，并且收集脑、肺、心、肝、脾、肾和肿瘤。用PBS冲洗每个器官，并且利用体内MS FX PRO成像***(Carestream)使生物发光强度可视化。
组织学和免疫组织化学
死后宏观分析包括检查外表面、原发肿瘤结节的外观、胸部状况、腹腔和盆腔及其相关器官和组织。为了进一步的组织学评估，在尸体解剖期间收集来自每只动物的肿瘤结节的样本，并且固定在10％中性缓冲***中，在递增的乙醇和二甲苯中脱水，并且包埋在HISTOMIX石蜡(Bio Vitrum)中。将石蜡切片(5μm)用苏木精和曙红染色，显微镜检查并扫描。将用于免疫组织化学(IHC)研究的肿瘤切片(3-4μm)在Microm HM355S切片机(ThermoFisher Scientific)上切片，并且进一步去石蜡和再水合；在700W的微波炉中暴露后进行抗原回收。根据制造商的方案，将样品与CD8特异性抗体(M3164,Spring BioScience)一起孵育。接下来，将切片与第二HRP缀合抗体(Spring Bioscience检测***)一起孵育，暴露于DAB底物，并且用Mayer苏木精染色。使用配有Axiocam MRc5数码相机(Zeiss,Germany)的Axiostar Plus显微镜以10×、20×和40×的放大率获得图像。肿瘤的大体检查(grossexamination)包括评估肿瘤结节的尺寸、包膜的存在以及坏死和出血的存在。肿瘤的显微镜检查包括根据坏死和凋亡、有丝***的存在和CD8淋巴细胞浸润的存在来评估肿瘤组织的组织病理学变化。
统计数据
离体获得的数据(流式细胞术、细胞毒性测试)使用学生t检验(双尾、不成对)进行统计处理。使用单向ANOVA(STATISTICA 10.0)对肿瘤体积测量值进行统计处理。使用Kaplan-Meier方法产生存活曲线，并且使用对数秩(Mantel-Cox)检验进行统计比较。p≤0.05被视为统计学上显著的。
细胞毒性测定
按照制造商的建议，在标准乳酸脱氢酶(LDH)释放测定(CytoTox
Figure BDA0002525200530000741
Non-Radioactive Cytotoxicity Assay,Promega)中评估工程化T细胞的细胞毒性和特异性。将模拟转导的T细胞、CD19-CAR T细胞、FL1-CAR T细胞、FL2-CAR T细胞、FL3-CAR T细胞或Myc-CAR T细胞与104个Raji-FL1细胞、Raji-FL2细胞、Raji-FL3细胞或来自患者活检物的细胞在补充有40U/ml人类IL-2的完整RPMI培养基中共孵育6小时。使用Raji细胞或从不相关淋巴瘤***活检物分离的细胞作为阴性对照。所有实验以一式三份进行。
流式细胞术分析
本研究中使用了以下抗体：抗人类CD3 FITC(Biolegend)、抗人类CD8 PE(Biolegend)、抗人类CCR7 PE(Biolegend)、抗人类CD45RA FITC(Biolegend)、小鼠抗人类CD69 Alexa Fluor488(Biolegend)、抗人类B220APC(Biolegend)。嵌合FL-BCR表达使用抗人类IgG1 PE抗体(Southern Biotech)或合成生物素化环肽(GeneCust)和与FITC或PE缀合的链霉亲和素(Thermo Fisher Scientific)来检测。CAR分子使用与DyLight650缀合的山羊交叉吸附的抗人类IgG抗体(Thermo Fisher Scientific)来检测。CD19-CAR(FMC63clone)分子使用生物素化蛋白L(Thermo Fisher Scientific)和与FITC缀合的链霉亲和素(Thermo Fisher Scientific)来检测。
bcl-2易位的鉴定
粗制DNA提取物通过蛋白酶K消化滤泡性淋巴瘤***活检样品来制备。PCR扩增使用包括以下的引物对进行：JH的共有引物和与bcl2基因的mbr1区域、mcr2区域或icr5区域的序列同源的三种不同引物之一，如(14)中描述的。
IFA
如(15)中描述的，通过间接免疫荧光测定(IFA)在HEp-2和HEL293T细胞上测试淋巴瘤BCR的自身反应性。按照制造商的说明，将编码重组myoferlin(22443,Addgene)的质粒载体用Lipofectamine 2000(Invitrogen)转染到HEK293T细胞中。将代表淋巴瘤BCR的重组Ig和不相关的人类抗体在具有2％BSA的PBS中稀释并且以50μg/mL的浓度使用，与细胞一起孵育1小时。结合抗体的检测使用Nikon Eclipse Ti U显微镜通过抗人类Ig-PE来完成。
结果
总体工作流程
这些概念验证实验的目的是寻找与淋巴瘤细胞的表面上的BCR选择性地反应的抗原(图1)。核心思想是，如果BCR可以被克隆并在同时表达非常大的肽阵列的指示物细胞表面上表达，该***则变成自分泌的，并且每个细胞变成在其自身上进行的选择***。如果整个***被构建使得当BCR与共表达的配体之一反应时发送信号，BCR和配体之间的特异性相互作用可以容易地通过FACS鉴定。重要的是，如此处使用的基于自分泌的选择选择出功能性相互作用，其中抗体结合到CAR上的肽活化了***。
恶性B细胞上的BCR的鉴定
使用来自3名患有滤泡性淋巴瘤(FL)的患者的***活检物确定来自恶性细胞的BCR的核苷酸序列。采集肿瘤活检物的中心部分，以减少来自非恶性细胞的BCR基因的丰度。使用总mRNA作为逆转录反应中的模板，随后进行IgV基因的PCR扩增。由于淋巴瘤的克隆性，高达95％百分比的经分析的序列是相同的。将选择的Ig可变区以scFv的形式克隆到pComb3X载体中(5)。因此，与抗体的恒定结构域(Fc)融合的ScFv通过柔性接头连接至血小板来源的生长因子受体(PDGFR)的跨膜结构域，使得抗体分子作为二聚体整合到质膜中，其结合位点面向溶剂(5)(图5B和图5C)。
恶性细胞上的BCR的配体的基于自分泌的选择
使用基于自分泌的报告物***，用于直接选择对恶性细胞上的BCR特异性的配体(图2A)。该方法允许直接选择可用于肿瘤靶向的配体。使用感染了BCR和含有109个成员的组合环肽文库两者的T细胞作为报告物***。将永生Jurkat人类T淋巴细胞修饰为同时表达淋巴瘤BCR和随机的7个氨基酸环肽文库。将环肽文库与含有信号传导结构域的嵌合抗原受体融合(图5A-图5C)。当与PDGFR跨膜结构域融合的Ig与来自环肽文库的肽反应时，嵌合抗原受体的信号传导结构域触发T细胞活化级联。活化的T细胞开始表达CD69(早期T细胞活化抗原)(6)，并且因此可以容易地利用特异性荧光标记抗体检测到。
首先，使用模型***来确认报告物构建的能力。使用CAR上的c-Myc表位和抗Myc抗体(9E10 clone)的可变结构域作为模型膜结合的BCR。仅表达膜结合抗Myc抗体而不共表达Myc-CAR的Jurkat细胞未显示可检测到的活化。但是，含有膜结合抗Myc抗体和Myc-CAR两者的细胞被活化(图2B)。
来自Myc模型***的结果鼓励我们移向来自患有淋巴瘤的患者的真正的BCR。为了选择重建的淋巴瘤BCR的肽配体，进行了几轮选择，结果发现三种环肽CILDLPKFC(FL1)(SEQID NO:1)、CMPHWQNHC(FL2)(SEQ ID NO:2)和CTTDQARKC(FL3)(SEQ ID NO:3)对三种患者来源的BCR scFv是特异性的。如通过CD69膜表达测量的，选择的肽-CAR个体融合体与由对应的膜栓系BCR共转导时触发Jurkat细胞中的T细胞活化级联(图2C)。
针对淋巴瘤细胞的特异性裂解活性
接下来，测试用FL1-CAR构建体、FL2-CAR构建体和FL3-CAR构建体转导的T细胞在与用分离的滤泡性淋巴瘤B细胞受体(FL-BCR)转导的Raji淋巴瘤细胞系一起孵育时是否显示出体外杀伤活性。来自恶性细胞的功能性BCR的表面表达通过用a-Fc抗体和生物素化FL1、FL2和FL3肽染色来确认(图3A)。这些研究确认了，这些细胞上存在能够与肽结合的BCR。
为了确定表达CAR-T的CTL是否能够杀伤靶细胞，使用编码FL1-CAR、FL2-CAR、FL3-CAR或CD19-CAR的慢病毒载体来转导人类CD8+ T细胞。暴露肽-CAR的活化的人类CD8+ T细胞裂解表达来自淋巴瘤的对应BCR的Raji细胞(Raji-FL1、Raji-FL2和Raji-FL3)，如通过LDH释放测量的(图3B)。值得注意的是，FL1-CAR细胞、FL2-CAR细胞和FL3-CAR细胞的特异性细胞毒性与研究最充分的靶向CD19抗原的CD19CAR-T细胞(FMC63-CAR)相当。相比之下，当使用对照CAR T细胞时，观察到最小裂解。同样，在FL1-CAR、FL2-CAR和FL3-CAR与未修饰的Raji细胞孵育的情况下，未观察到细胞裂解，这表明BCR靶向CART的高治疗潜力和安全性(图6)。
接下来，评估FL1-CART对来自患者1初始活检物的细胞的离体细胞毒性。活检样品中多于60％的细胞是FL1肽特异性的B细胞(图3C，下图)。来自另一个患有滤泡性淋巴瘤的患者(患者4)的对照活检样品的细胞未显示出FL1肽的任何显著染色。CTL测定显示FL1-CAR-T特异性裂解来自活检样品的细胞，而Myc-CAR-T和模拟T细胞不具有任何抗肿瘤裂解活性(图3D)。
FL1-CAR重定向的CTL抑制体内淋巴瘤细胞
使用植入了5×106个表达FL1-BCR的Raji细胞(Raji-FL1)的免疫缺陷NOD SCID(CB17-Prkdcscid/NcrCrl)小鼠，在滤泡性淋巴瘤的相关模型中测试FL1-CART的功效(图4A)。使用编码FL1-CAR、Myc-CAR或CD19-CAR的慢病毒载体转导CD3/CD28珠活化的人类CD8+T细胞，导致高效的基因转移(图4B)。与通过Myc-CART治疗的对照组相比，注射5×106个FL1-CART或CD19-CART显著抑制了肿瘤负荷并提高了存活率(图4C和图4D、图7A-图7C)。在第37天，与FL1-CART组和CD19-CART组中的80％存活动物相比，来自对照Myc-CART组的小鼠100％死亡。使用流式细胞术显示，输注后21天外周血中仍存在CAR修饰的T细胞，FL1-CAR-T细胞和CD19-CAR-T细胞以相对于Myc-CAR-T细胞的显著增加的量存在(图4D插图)。如预期的，表达CD8+CAR的T细胞的扩增与效应物表型相关表面标志物的表达相关(图4E)。有趣的是，外周血中FL1-CART的群体通常由效应记忆子集组成，而脾和骨髓由细胞的中央记忆子集扩增(图4F)。这些晚期细胞被认为对持久性和持续抗肿瘤活性是重要的。
讨论
随着免疫疗法的发展，需要发现更多的肿瘤抗原及其特异性配体的方法。目前肿瘤抗原的“菜单(menu)”有限(7-12)。然而，在淋巴瘤的情况下，肿瘤抗原已经以BCR的形式存在。此外，BCR是一种抗体，其生理作用是与抗原结合。BCR的这一特性极大地简化了寻找与恶性BCR相互作用的配体的问题。本文使用“强制邻近(forced proximity)”自分泌方法(13)，其中每个报告物细胞在细胞表面上共表达大型肽文库的一个成员与靶BCR，其中它们被共整合到报告物细胞的群体的膜中。几轮基于自分泌的选择允许发现BCR的特异性肽配体。
已经证明，由与CAR融合的这些肽修饰的T细胞在离体和体内均有效地消除肿瘤细胞，如同熟知的CD19靶向的CAR一样有效。
这种抗原选择方法的一个优势是，在数轮淘选之后，选择的肽配体已经在其中它们与嵌合抗原受体融合的构建体中。这允许人们立即产生由肿瘤特异性CAR修饰的治疗性T淋巴细胞。
本质上，这里报告的形式与通常的CART方案相反。通常在携带CAR-T的细胞中，方向性由抗体控制，并且靶是肿瘤细胞的表面肽或蛋白。这里使用的是相反的方案，即CAR-T的结合是由肽指导的，而靶是抗体。此外，由于抗体分子是一个巨大的多样性***的一部分，靶库(universe)基本上是无限制的。这个大的靶库极大地简化了选择高度特异性和紧密结合的配体的问题。
随着对更多患者的研究，选择的肽序列可以被用于确定它们来源的蛋白，并由此推断恶性转化的驱动力。在这种情况下，有趣的是，所发现的肽与Myoferlin的一个区域同源，并且与来自缓症链球菌和杰氏肺囊虫的表面蛋白的区域相同(图8A-图8E)。鉴于已暗示一些淋巴瘤诸如MALT是由持续暴露于传染原(infectious agent)引起的，随着更多与BCR结合的抗原被发现，将对淋巴样恶性肿瘤产生的驱动力进行研究。最后，使用除了CD19以外的序列作为靶的能力不仅扩大了治疗环境中的选择，而且当CD19不存在或下调时(如许多患者中可能发生的)，也可以提供帮助。
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实施例2
滤泡性淋巴瘤
淋巴瘤活检样品和患者单核细胞清血法材料由N.N.彼得罗夫肿瘤研究所(St.Petersburg,Russia)提供，来自患有晚期滤泡性淋巴瘤的计划接受高剂量化学疗法和ASCT的患者。按照制造商的方案(Miltenyi Biotech)，使用抗人类CD34微珠和MACS细胞分离技术从清血法材料分离CD34+ HSC。在用抗CD34-PE缀合物(Miltenyi)染色纯化的细胞后，如通过流式细胞术确定的，MACS分离后的细胞纯度是>98％。剩余的单核细胞级分用于分离CD8T细胞。CD34+细胞和CD8T细胞两者被冷冻保存直至使用。将通过活检获得的新鲜且存活的淋巴瘤组织样品以3-5mm3块切割，并且在多个部位皮下植入到4只6周龄雌性NODSCID(CB17-Prkdcscid/NcrCrl)(SB RAS细胞学和遗传学研究所的实验动物)。
患者特异性人源化小鼠的产生
将5周龄的成年雌性NOD/SCID小鼠驯化至少7天时间，并且通过Gammacell40Exactor(Best Theratronics)递送的亚致死全身照射(325rad)进行清髓(myeloablate)。将18只小鼠通过尾静脉注射每只动物总体积200mkl的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的0.25×106个纯化的CD34+HSC细胞。将所有移植的小鼠都圈养在BL-2条件下，并且提供高压灭菌的食物且补充有Baytril(enrofloxacin)的水。
患者特异性人源化小鼠的免疫重建分析
为了测量干细胞移植后人类免疫细胞的重建水平，使用无菌柳叶刀(BraintreeScientific)通过下颌途径(颊囊)给小鼠放血。每次将约～100mkl血液收集到K2EDTA包被的BD微量容器毛细血液收集管(Fisher Scientific)中。
将管以500×g旋转5分钟以分离血浆。将细胞沉淀物用ACK裂解缓冲液处理以裂解RBC，并且用含有BSA(Miltenyi)的MACS缓冲液彻底洗涤以富集外周血单核细胞(PBMC)。
在流式细胞术分析(FACS)期间用作对照的人类PBMC是按照标准的Ficoll密度梯度离心技术从白细胞单采术的血环(blood collar)纯化的。通过用对不同人类免疫细胞表面标志物(例如，CD45、CD3、CD19、CD4、CD8等)特异性的荧光染料缀合抗体对单核细胞进行染色，随后是使用LSRII流式细胞仪(Becton Dickinson,NJ)的多色流式细胞术来进行免疫表型分型。抗体从eBioscience、Biolegend或BD Biosciences获得。在FACS期间，基于前向和侧向散射分布对存活的淋巴样细胞进行细胞门控，且大多数分析对淋巴样门内的细胞(cells within the lymphoid gate)进行。
进行人类CD45+和内源小鼠CD45+的百分比之间的比较，以测量小鼠中的免疫重建水平。使用对应的同种型对照或从未植入动物分离的染色细胞来确定背景染色。使用FlowJo软件版本7.6.5(Tree Star)分析数据。
使用基于电化学发光的MSD平台(Meso Scale Discovery,Gaithersburg,MD)测量在移植后特定时间点的小鼠血浆中人类IgM和IgG的特定水平。将MSD96孔高结合多阵列板在4℃用每孔20mkg/ml浓度的5mkl抗人类IgM或抗人类IgG Fc(Bethyl Laboratories)包被过夜。用PBS/2％胎牛血清封闭板1h，随后用PBS/0.05％Tween-20反复洗涤。小鼠血浆样品以1:50-1:100的稀释度进行测试以确认人类IgG水平，并且以1:500-1:1000的稀释度进行测试以确认人类IgM水平，对于每个样品添加总体积20μl/孔，一式两份。如前描述孵育和洗涤后，使用每孔2μg/ml浓度的具有SULFO-标签的20μl山羊抗人类Ig抗体作为检测Ab，并且将板在室温孵育1h。根据制造商的方案，通过添加适当的基底来使板显影并在MSD SectorImager 2400上读取。使用人类IgM标准品和IgG标准品(Bethyl Labs)获得标准曲线，并且人类Ig水平使用GraphPad Prism程序第5版计算。将结果总结于图9-图11中。
恶性B细胞上的BCR的鉴定在RU 2017134483中详细说明。恶性细胞上的BCR的配体的基于自分泌的选择在RU 2017134483中详细说明。慢病毒CAR T构建体在RU 2017134483中详细说明。
CD8+ T细胞的活化、扩增和转导
利用Dynabeads CD8阳性分离试剂盒(Life Technologies)从通过清血法收集的患者PBMC级分分离CD8 T细胞。在含有40IU/ml重组IL-2的完整RPMI培养基中，将人类CD8 T细胞以1:1比例用CD3/CD28珠(Life Technologies)活化72小时。将活化的T细胞以400万个细胞的浓度重悬于每3ml含FL1-CART的慢病毒上清液加上1ml新鲜的具有40IU/ml IL-2的RPMI培养基中，并且在6孔板中培养。将板在32℃以1200×g离心90分钟，并且然后在37℃孵育4小时。进行另外两次的第二次和第三次转导。
BCR疫苗接种
为了获得作为全尺寸抗体的患者滤泡性淋巴瘤BCR的可溶性形式，将VH和VL克隆到pFUSE抗体表达载体(Invivogen)中，并且利用FreeStyle 293表达***(Thermo FisherScientific)产生。将蛋白进一步纯化并且使用0.1％戊二醛将其与钥孔
Figure BDA0002525200530000831
血蓝蛋白偶联，如Levy(R.Levy.等人1987,Idiotype vaccination against murine B
Figure BDA0002525200530000832
celllymphoma.Humoral and cellular responses elicited by tumor-derived IgM and itsmolecular subunits.J Immunol.139:2825.)描述的。将人类IgG同种型对照抗体(Invitrogen,目录号12000C)与钥孔
Figure BDA0002525200530000833
血蓝蛋白缀合用作对照疫苗。小鼠使用皮下注射以具有等份弗氏完全佐剂和在PBS中的100mkg/ml的KLH-IgG的乳液以0.1ml进行免疫。
动物实验
所有动物程序都严格按照实验室动物的正确使用和护理的建议(ECC Directive86/609/EEC)进行。所有的小鼠手术程序和成像都是对通过肌肉注射50％***、38％赛拉嗪和12％马来酸乙酰丙嗪的0.02ml溶液而麻醉的动物进行。患者B细胞FL肿瘤结节从雌性NOD SCID(CB17-Prkdcscid/NcrCrl)小鼠中切离，将没有坏死迹象的肿瘤组织块(tumorfragments)切成相等的3mm3块，并且皮下移植至16只在18周龄的具有重建患者免疫***的NOD/SCID小鼠。肿瘤体积用卡尺测量，并且使用公式π/6×(长×宽×高)估算。将小鼠分成如下三个实验组：
-组1：移植后第10天静脉内3×106个FL1-CART
-组2：移植后第1天、第5天、第15天皮下KLH患者BCR疫苗
-组3：移植后第10天静脉内3×106个FL1-CART+移植后第1天、第5天和第15天皮下KLH患者BCR疫苗
-组4：移植后第10天静脉内3×106个FL1-CART+移植后第1天、第5天和第15天皮下KLH同种型对照疫苗
在移植后第38天处死动物。实验组的肿瘤生长动力学在图12中示出。
因此，静脉内FL1-CART疗法和使用患者BCR疫苗的疫苗接种的组合导致肿瘤生长的协同抑制。与此相反，静脉内FL1-CART疗法与同种型对照疫苗的组合降低了FL1-CART疗法的疗效。
流式细胞术分析
在肿瘤接种后第38天(CART输注后第21天)，将来自每个实验组的动物用于分离血液。红细胞用RBC裂解缓冲液(0.15M NH4Cl、10mM NaHCO3、0.1mM EDTA)裂解。嵌合的FL-BCR表达使用合成的ACILDLPKFCGGGS-Bio(SEQ ID NO:29)环肽(GeneCust)和与FITC缀合的链霉亲和素(Thermo Fisher Scientific)来检测，并且通过Novocyte流式细胞仪(ACEABiosciences)进行分析。
静脉内FL1-CART疗法和使用患者BCR疫苗的疫苗接种的组合导致循环中最高水平的FL1-CART细胞，而用同型对照疫苗的伴随接种不产生任何协同作用。
基于中尺度的特异性抗体响应分析：
Figure BDA0002525200530000841
对终末血浆样品进行MSD分析，以测量针对患者特异性BCR和IgG同种型对照的抗体响应。
将患者BCR抗原和同种型对照抗原以20–50mkg/ml之间的浓度每孔添加5mkl包被在高结合MSD 96孔板上，并且在4℃孵育过夜。血浆样品以1:80稀释度进行测试。使用Sulfo-加标签的抗人类Ig作为检测抗体，并且使用电化学发光(ECL)底物进行显色反应，并且在MSD Sector Imager 2400(Meso Scale Discovery)中读取。
表2.第38天免疫小鼠中的抗BCR和同种型对照抗体响应(MSD相关单位)。
组1 组2 组3 组4
BCR 700±115 4700±610 9700±1550 1150±175
IgG同种型对照 690±225 950±170 1050±135 3950±375
测量血浆对相应抗原的反应性的MSD分析并比较。数据表示为平均值+/-SEM。静脉内FL1-CART疗法和使用患者BCR疫苗的疫苗接种的组合相比于单独的BCR疫苗导致最高水平的抗BCR反应性。
以上数据清楚地确认了在CART过继免疫疗法和疫苗接种之间发现的实质性治疗协同作用(肿瘤生长抑制和个体化癌症抗原指导的CAR T细胞和免疫球蛋白的水平)，其中CART过继免疫疗法和疫苗接种两者都靶向相同的个体化癌症抗原。
携带EGFRvIII突变的NSCLC
为了进一步确认观察结果，鉴定了一名患有晚期NSCLC的患者，该患者计划在基洛夫军事医学研究院高级外科部(Advanced Surgery Department of Kirov Academy ofMilitary Medicine)(St.Petersburg)进行细胞减灭术手术，并且其肿瘤组织经活检材料的ICH染色确认为EGFRvIII突变阳性。
表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)是一种新的肿瘤特异性基因重排的结果，这种基因重排产生一种独特的蛋白，在约30％的胶质瘤和某些其他癌症(包括肺癌、乳腺癌和卵巢癌)中表达。通过缺失配体结合结构域的区段，EGFRvIII绕过了对配体的需要。该缺失跨越外显子2-7，导致在融合连接处引入一个新的甘氨酸残基。虽然这种突变体不能结合配体，但它存在于细胞膜上，并且呈现出一种已确立的携带肿瘤特异性突变的个体化癌症模型抗原。
手术前两周，患者被动员，每日一次皮下施用10mkg/kg的GM-CSF(Neostim,Pharmsynthez)，持续连续5日。在Cobe光谱清血法***上收集动员的外周血干细胞。在每天收集期间处理约3-6个血体积，持续最多11小时。患者每日两次进行清血法程序，收集2×106个CD34+细胞/kg。使用抗人类CD34微珠和MACS细胞分离技术按照制造商的方案(MiltenyiBiotech)从清血法材料分离CD34+HSC。如在用抗CD34-PE缀合物(Miltenyi)染色纯化的细胞后通过流式细胞术确定的，MACS分离后的细胞纯度是>98％。剩余的单核细胞级分用于分离CD8 T细胞。CD34+细胞和CD8 T细胞两者被冷冻保存直至使用。将在患者手术期间获得的新鲜且存活的肿瘤组织样品以3-5mm3块切割，并且在多个部位皮下植入到4只6周龄雌性NOD SCID(CB17-Prkdcscid/NcrCrl)(SB RAS细胞学和遗传学研究所的实验动物)。
患者特异性人源化小鼠的产生
将5周龄的成年雌性NOD/SCID小鼠驯化至少7天时间，并且通过Gammacell40Exactor(Best Theratronics)递送的亚致死全身照射(325rad)进行清髓。将18只小鼠通过尾静脉注射每只动物总体积200mkl的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的0.25×106个纯化的CD34+HSC细胞。将所有移植的小鼠都圈养在BL-2条件下，并且提供高压灭菌的食物且补充有Baytril(enrofloxacin)的水。
免疫重建的分析
免疫重建的分析在第6周、第12周和第18周如以上描述进行。数据在图14-图16中示出。
CAR T慢病毒载体
使用来自人类抗EGFRvIII抗体131的scFv序列将靶向EGFRvIII的基于139-scFv的CAR载体组装到来自CD28-41BB-CD3δ的T细胞信号传导结构域，如由Rosenberg(Steven A.Rosenberg等人,Recognition of Glioma Stem Cells by Genetically Modified TCells Targeting EGFRvIII and Development of Adoptive Cell Therapy for Glioma,Hum Gene Ther.2012Oct；23(10):1043–1053.)描述的。合成编码CD28-41BB-CD3δ的DNA片段(GeneCust)，并且克隆到pLV2慢病毒载体(Clontech)中，处于EF1a启动子的控制下。基因的排列顺序是：IL2信号序列、139-scFv、GGGS接头；CD28跨膜和胞内区域；OX-40和CD3δ的胞内结构域。慢病毒是通过用pLV2-139-scFv-CD28-41BB-CD3δ质粒和包装质粒(第2代)共转染HEK293T细胞来制备的。转染后在48h收集含有病毒的上清液。使用慢病毒X p24 ELISA(Clontech)确定慢病毒制备物的滴度。
CD8+ T细胞的活化、扩增和转导
利用Dynabeads CD8阳性分离试剂盒(Life Technologies)从通过清血法收集的患者PBMC级分分离CD8 T细胞。在含有40IU/ml重组IL-2的完整RPMI培养基中，将人类CD8 T细胞以1:1比例用CD3/CD28珠(Life Technologies)活化72小时。将活化的T细胞以400万个细胞的浓度重悬于每3ml含CD28-41BB-CD3δ-CAR的慢病毒上清液加上1ml新鲜的具有40IU/ml IL-2的RPMI培养基中，并且在6孔板中培养。将板在32℃以1200×g离心90分钟，并且然后在37℃孵育4小时。第二次和第三次转导再进行两次。
疫苗接种
合成对应于融合连接处的氨基酸序列的14-氨基酸肽(LEEKKGNYVVTDHC)(SEQ IDNO:30)，纯化并与钥孔
Figure BDA0002525200530000871
血蓝蛋白偶联，如由Bigner(Monoclonal Antibodies againstEGFRvIII are Tumor Specific and React with Breast and Lung Carcinomas andMalignant Gliomas.Darell D.Bigner等人,Cancer Res.1995Jul 15；55(14):3140-8.)描述的。LEEKKGNYVVTDHC(SEQ ID NO:30)是由抗体139识别的表位，用于工程化基于139-scFv-的CAR。小鼠使用皮下注射以等份弗氏完全佐剂和在PBS中的100mkg/ml的KLH-LEEK的乳液以0.1ml进行免疫。
动物实验
所有动物程序都严格按照实验室动物的正确使用和护理的建议(ECC Directive86/609/EEC)进行。所有小鼠手术程序和成像都是对通过肌肉注射50％***、38％赛拉嗪和12％马来酸乙酰丙嗪的0.02ml溶液而麻醉的动物中进行。患者NSCLC肿瘤结节从雌性NODSCID(CB17-Prkdcscid/NcrCrl)小鼠中切离，将没有坏死迹象的肿瘤组织块切成相等的3mm3的块，并且皮下移植至15只18周龄的具有重建患者免疫***的NOD/SCID小鼠。肿瘤体积用卡尺测量，并且使用公式π/6×(长×宽×高)估算。将小鼠分成如下三个实验组：
-组1：移植后第10天静脉内3×106个CD28-41BB-CD3δ–CART
-组2：移植后第1天、第5天、第15天皮下KLH-LEEK疫苗
-组3：移植后第10天静脉内3×106个CD28-41BB-CD3δ–CART+移植后第1天、第5天和第15天皮下KLH-LEEK疫苗
在移植后第38天处死动物。实验组的肿瘤生长动力学在图18中示出。
数据确认了在CAR T过继免疫疗法和疫苗接种之间发现的实质性治疗协同作用，其中CAR T过继免疫疗法和疫苗接种两者都靶向相同的个体化癌症抗原。
实施例3
通过噬菌体展示鉴定B细胞受体配体的方法
作为报告物细胞的一般替代物，可以进行噬菌体展示的环肽文库淘选来鉴定恶性BCR特异性部分。可以利用商购可得的噬菌体肽文库，诸如New England Biolabs Ph.D.-7和Ph.D.-12文库。为了随机化，Ph.D.TM-C7C噬菌体展示环肽文库试剂盒使用侧接半胱氨酸的NNK编码部分，如图19中示出的。在此，我们提供了用于恶性BCR特异性肽鉴定的改良NEB方案。建议在每一轮淘选期间进行阴性选择孵育。
淘选程序：
1.用ER2738接种10ml LB+Tet培养基用于滴定。如果在同一天扩增洗脱的噬菌体，还用ER2738接种在250-ml锥形烧瓶中(不使用50-ml锥形管)的20ml LB培养基。将两种培养物在37℃伴随剧烈震摇进行培养。ER2738是大肠杆菌宿主菌株F′proA+B+ lacIqΔ(lacZ)M15 zzf::Tn10(TetR)/fhuA2 glnVΔ(lac-proAB)thi-1Δ(hsdS-mcrB)5。
2.将50μl适于捕获抗体的50％亲和珠水悬浮液转移至微量离心管中。添加1mlTBS+0.1％Tween(TBST)。通过敲击(tap)管来悬浮树脂。
3.通过磁性捕获使树脂沉淀。小心地用移液管吸走上清液并弃去。
4.将树脂悬浮于1ml封闭缓冲液(0.1M NaHCO3(pH 8.6)、5mg/ml BSA、0.02％NaN3(任选的)。过滤消毒，在4℃储存)。
5.在4℃孵育60分钟，偶尔混合。
6.同时，将2×109个噬菌体与2mkg阴性选择抗体混合，用TBST使最终体积为200μl。
7.在室温孵育20分钟。
8.在步骤4中的封闭反应后，如步骤3中使树脂沉淀，并用1ml TBST洗涤4次，每次使树脂沉淀。
9.将树脂重悬于1ml中，并且等分至两个单独的管中(各自500mkl)。
10.将噬菌体-阴性抗体混合物转移至含有洗涤树脂的第一管中。轻轻混合，并且在室温孵育15分钟，偶尔混合。
11.如步骤3中使树脂沉淀，收集上清液。
12.将上清液与2mkg恶性BCR抗体混合。
13.在室温孵育20分钟。
14.如步骤3中使树脂沉淀，弃去上清液，并且用1ml TBST洗涤10次，每次使树脂沉淀。
15.通过将树脂悬浮于1ml甘氨酸洗脱缓冲液(0.2M甘氨酸-HCl，pH 2.2，1mg/mlBSA)中来洗脱结合的噬菌体。
16.在室温孵育10分钟。
17.通过磁化1分钟使树脂沉淀。
18.小心地将上清液转移至新的微量离心管中，注意不要干扰沉淀的树脂。
19.立即用150μl的1M Tris-HCl，pH 9.1中和洗脱液。
20.通过将剩余的洗脱液添加至来自步骤1的20ml ER2738培养物(必须是早对数期(early-log)；不能晚)中扩增剩余的洗脱液，并且在37℃伴随剧烈震摇孵育4.5小时。
21.将培养物转移至离心管中，并且在4℃以12,000g旋转10分钟。将上清液转移至新管中，并再次旋转(弃去沉淀物)。
22.用移液管将上层80％的上清液移至新管中，并向其中添加1/6体积的20％PEG/2.5M NaCl。
23.允许噬菌体在4℃沉淀2小时或过夜。
24.在4℃，以12,000g rpm旋转PEG沉淀物15分钟
25.滗析并弃去上清液，短暂地重旋转，并且用移液管去除残留的上清液。
26.将沉淀物悬浮于1ml TBS中。将悬浮液转移至管中，并在4℃旋转5分钟以使残余细胞沉淀。
27.将上清液转移至新的微量离心管，用1/6体积20％PEG/2.5M NaCl再沉淀。
28.在冰上孵育15-60分钟。
29.在4℃以14,000rpm离心10分钟。
30.弃去上清液，短暂地重旋转，并且用微量移液管去除残留的上清液。
31.将沉淀物悬浮于200μl TBS中。
32.以14,000rpm离心1分钟，使任何剩余的不溶物质沉淀。
33.将上清液转移至新管中。这是扩增的洗脱液。
34.进行第二和第三轮淘选。
用于ELISA和测序的噬菌斑扩增：
1.将ER2738的过夜培养物以1:100在LB中稀释。将1ml稀释的培养物分配到96孔深孔板(#260251,Thermo Scientific)中。对于每个待表征的抗体，使用2个板。
2.从噬菌体板上穿刺一个蓝色的噬菌斑。
3.使用微孔板胶带密封器覆盖板。
4.将板在37℃伴随震摇孵育4.5-5小时。
5.将板在RT以250g离心10分钟。
6.小心地收集700mkl的上清液，并转移至新板。
7.这是扩增的噬菌体储备液，并且可以在4℃储存两天。
噬菌体ELISA测定：
1.ELISA板的孔用100μl的在0.1M NaHCO3，pH 8.6中的100μg/ml的恶性BCR抗体或阴性对照抗体包被。
2.在4℃孵育过夜
3.将每个板用TBST洗涤5次。
4.ELISA板的孔通过在PBST中的5％牛乳封闭。
5.在RT孵育1小时。
6.将每个板用TBST洗涤5次。
7.在单独的封闭板中，进行噬菌体上清液的四倍系列稀释。
8.使用多通道移液器，将来自每行稀释的噬菌体中的100μl转移至一行抗体包被的孔中。
9.在RT伴随搅拌孵育2小时。
10.将每个板用TBST洗涤5次。
11.将HRP缀合的抗M13单克隆抗体(GE Healthcare.#27-9421-01)在封闭缓冲液中稀释至制造商建议的最终稀释度。向每个孔中添加200μl稀释的缀合物。
12.在RT伴随搅拌孵育1小时。
13.向每个孔中添加50μl底物溶液，并且在室温伴随温和搅拌孵育10-60分钟。
14.使用设置在415nm的微孔板读数器读取板。对于每个噬菌体克隆，比较用阴性对照和恶性BCR抗体获得的信号。
噬菌体DNA的测序：
1.将500μl含噬菌体的上清液转移至新的微量离心管中。
2.添加200μl 20％PEG/2.5M NaCl。倒置几次混合，并且在室温静置10-20分钟。
3.在4℃以14,000rpm微量离心10分钟，并弃去上清液。噬菌体沉淀物可能不是可见的。
4.短暂地重旋转。小心地用移液管吸走任何残留的上清液并弃去。
5.通过剧烈敲击管，将沉淀物完全悬浮于100μl碘化物缓冲液中。
6.添加250μl乙醇。
7.在室温孵育10-20分钟。
8.在离心机中在4℃以14,000rpm离心10分钟。
9.弃去上清液。
10.沉淀物用0.5ml冰冷的70％乙醇洗涤。
11.将沉淀物悬浮于30μl TE缓冲液中。
12.使用5μl在TE缓冲液中的DNA作为测序的模板。
13.使用DNA测序的反向引物(GCAATGCGATTGATACTCCC(SEQ ID NO：41))。
淘选的结果在如下表中示出。为了展示，使用IgG1形式的全尺寸滤泡性淋巴瘤BCR。患者FL1如实施例1中描述。
表3示出了在显示的噬菌体浓度，使用患者FL1和FL5的BCR针对患者FL1的BCR进行的I-III轮淘选所产生的扩增噬菌体的结合的ELISA结果。结果还在图20中示出。
Figure BDA0002525200530000921
表4示出了使用患者FL1的BCR，在针对患者FL1的BCR的III轮淘选之后，来自个体噬菌斑的噬菌体结合的ELISA结果。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.063 2.024 1.313 1.305 1.132 0.683 0.908 0.718 0.142 0.379 0.225 0.098
B 0.054 0.053 0.117 0.073 1.013 0.068 1.135 0.436 0.1 0.062 0.537 0.695
C 1.015 0.054 0.495 0.743 0.639 0.456 0.076 0.213 0.061 0.728 0.626 0.639
D 0.055 0.783 0.808 0.522 0.754 0.43 0.513 0.443 0.499 0.27 0.147 0.519
E 1.444 0.682 0.564 0.592 0.08 0.42 0.519 0.088 0.111 0.368 0.316 0.055
F 0.871 0.371 0.627 0.604 0.491 0.159 0.371 0.128 0.316 0.241 0.12 0.647
G 0.794 0.909 0.573 0.453 0.484 0.435 0.136 0.379 0.598 0.517 0.525 0.501
H 0.079 1.229 0.205 0.415 1.459 0.36 0.231 0.12 0.075 0.522 0.409 0.091
表5示出了使用患者FL5的BCR，在针对患者FL1的BCR的III轮淘选之后，来自个体噬菌斑的噬菌体的结合的ELISA结果。
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A 0.081 0.076 0.056 0.074 0.108 0.073 0.088 0.124 0.088 0.063 0.064 0.074
B 0.059 0.066 0.077 0.102 0.117 0.063 0.079 0.067 0.097 0.062 0.093 0.211
C 0.121 0.085 0.091 0.161 0.074 0.091 0.058 0.091 0.059 0.068 0.093 0.204
D 0.073 0.123 0.097 0.088 0.098 0.101 0.083 0.08 0.071 0.066 0.064 0.196
E 0.067 0.134 0.101 0.068 0.067 0.086 0.092 0.067 0.058 0.141 0.095 0.061
F 0.082 0.276 0.118 0.109 0.064 0.08 0.059 0.059 0.065 0.118 0.068 0.092
G 0.179 0.188 0.106 0.129 0.087 0.143 0.063 0.106 0.108 0.106 0.227 0.127
H 0.102 0.083 0.118 0.15 0.133 0.076 0.08 0.13 0.06 0.119 0.117 0.149
对来自表4的阳性克隆进行扩增并测序。序列、表4中的位置和OD在下表6中示出。鉴定为结合患者FL1的BCR的肽也在实施例1中使用自分泌信号传导方法被鉴定为BCR配体。
表6：
Figure BDA0002525200530000931
在FL1患者BCR特异性的环肽被鉴定后，如表6中示出的，将该序列克隆到3代CAR慢病毒载体中。合成两个互补引物，编码侧接EcoRI和NheI克隆位点的选择的环肽。
引物FL1肽FW
Figure BDA0002525200530000941
引物FL1肽Rev
Figure BDA0002525200530000942
扩增后，将PCR产物克隆到pLV2-Fc-CAR载体EcoRI和NheI限制性位点处。
其他实施方案
本说明书中公开的所有特征可以以任何组合方式组合。本说明书中公开的每个特征可以由服务于相同、等同或相似目的的替代特征替代。因此，除非另外明确陈述，否则公开的每个特征仅是一系列通用等同或相似特征的一个实例。
根据以上描述，本领域技术人员可以容易地确定本发明的基本特征，并且在不脱离其精神和范围的情况下，可以对本发明进行各种改变和修改，以使其适应各种用途和条件。因此，其他实施方案落入权利要求内。
等同物
虽然本文已经描述和说明了数个发明性实施方案，但是本领域普通技术人员将容易想到用于进行功能和/或获得本文描述的结果和/或一个或更多个优势的各种其他装置和/或结构，并且这些变化和/或修改中的每一个都被认为在本文描述的发明性实施方案的范围内。更通常地，本领域的技术人员将容易理解，本文描述的所有参数、尺寸、材料和配置都意指是示例性的，并且实际的参数、尺寸、材料和/或配置将取决于使用发明性教导的具体一个应用或更多个应用。本领域技术人员将认识到或能够使用不超过常规的实验来确定本文描述的特定发明性实施方案的许多等同物。因此，应当理解，前述实施方案仅通过示例的方式呈现，并且在所附权利要求及其等同物的范围内，发明性实施方案可以以不同于具体描述和要求保护的方式实践。本公开内容的发明性实施方案针对本文描述的每个单独的特征、***、制品、材料、试剂盒和/或方法。此外，如果这样的特征、***、制品、材料、试剂盒和/或方法不是相互不一致的，则两个或更多个这样的特征、***、制品、材料、试剂盒和/或方法的任何组合被包括在本公开内容的发明性范围内。
如本文定义和使用的所有定义应该理解为控制字典定义、通过引用并入的文件中的定义和/或定义的术语的普通含义。
本文公开的所有参考文献、专利和专利申请关于其所引用的主题都通过引用并入，在一些情况下，这些参考文献、专利和专利申请可以包含整个文件。
除非明确指示相反情况，否则如本文在说明书和权利要求书中使用的不定冠词“一种/个(a)”和“一种/个(an)”应理解为意指“至少一种/个”。
如本文在说明书中和权利要求书中使用的短语“和/或”应该理解为意指如此连接的元件(即，联合地存在于一些情况下且分离地存在于其他情况下的元件)中的“一个或两个”。应该以相同方式解释使用“和/或”列出的多个元件，即，如此连接的元件中的“一个或更多个”。可以任选地存在除了由“和/或”条款具体识别(无论与所具体识别的那些元件是否有关)的元件之外的其他元件。因此，作为非限制性实例，在一种实施方案中，提及“A和/或B”在结合开放式语言(诸如“包括”)使用时可以指仅A(任选地包括除了B之外的元件)；在另一种实施方案中，仅B(任选地包括除了A之外的元件)；在又另一种实施方案中，A和B两者(任选地包括其他元件)等。
如本文在说明书中和权利要求书中使用的，“或”应该理解为具有与如上文定义的“和/或”相同的含义。例如，在分离清单中的项时，“或”或者“和/或”应该解释为包含性，即，包含多个元件或元件清单中的至少一个，而且包含多个元件或元件清单中的多于一个元件，且任选地包含额外未列项。仅明确指示相反情况的术语，诸如“……中的仅一个”或“确切地……中的一个”，或在用于权利要求书时，“由……组成”，将指包含多个元件或元件清单中的唯一一个元件。通常，如本文使用的术语“或”在前面具有排斥性术语(诸如“……中的任何一个”、“……中的一个”、“……中仅一个”或“……中唯一一个”)时应该仅解释为指示排斥性替代者(即，“一个或另一个但并非两个”)。“本质上由……组成”在权利要求书中使用时应具有如其在专利法领域中所使用的普通含义。
如本文在说明书中和权利要求书中使用的，短语“至少一个”在提及一个或更多个元件的清单时应该理解为意指选自元件清单中的元件中的任何一个或更多个的至少一个元件，但未必包含元件清单内具体列出的每一元件中的至少一个且不排斥元件清单中的任何元件组合。这个定义还允许可以任选地存在除了短语“至少一个”指的元件清单内具体鉴定的元件之外的元件(无论与具体鉴定的那些元件是否有关)。因此，作为非限制性实例，“A和B中的至少一个”(或等同地，“A或B中的至少一个”，或等同地，“A和/或B中的至少一个”)可以在一种实施方案中指至少一个(任选地包含一个以上)A，但不存在B(且任选地包含除了B之外的元件)；在另一种实施方案中，指至少一个(任选地包含多于一个)B，但不存在A(且任选地包含除了A之外的元件)；在又一实施方案中，指代至少一个(任选地包含一个以上)A和至少一个(任选地包含多于一个)B(且任选地包含其他元件)等。
还应该理解，除非明确指示相反的情况，否则在本文要求保护的包括多于一个步骤或动作的任何方法中，该方法的步骤或动作的顺序不必限于叙述该方法的步骤或动作的顺序。
序列表
<110> 欧科诊断学有限责任公司
<120> 针对癌症个体化疗法的制品和方法
<130> C1256.70030WO00
<140> 尚未分配
<141> 与此同时
<150> RU 2018134321
<151> 2018-10-01
<150> RU 2018112009
<151> 2018-04-04
<150> RU 2017134483
<151> 2017-10-04
<160> 44
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 1
Cys Ile Leu Asp Leu Pro Lys Phe Cys
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 2
Cys Met Pro His Trp Gln Asn His Cys
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 3
Cys Thr Thr Asp Gln Ala Arg Lys Cys
1 5
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 4
atggactgga cctggaggat cct 23
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 5
atggacatac tttgttccac gctc 24
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 6
atggagtttg ggctgagctg g 21
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 7
atgaaacacc tgtggttctt cct 23
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 8
atggggtcaa ccgccatcct c 21
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 9
atgtctgtct ccttcctcat cttc 24
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 10
ctctcaggac tgatgggaag cc 22
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<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 11
ggagacgagg gggaaaag 18
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 12
gcctgagttc cacgacacc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 13
cagggggaag accgatgg 18
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 14
gacatccaga tgacccagtc tcc 23
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 15
gatattgtga tgacccagac tcca 24
<210> 16
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 16
gaaattgtgt tgacacagtc tcca 24
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 17
cccctgttga agctctttgt 20
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 18
agatggcggg aagatgaag 19
<210> 19
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 19
cagtctgtgt tgacgcagcc gccctc 26
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 20
tctgtgctga ctcagccacc ctc 23
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 21
cagtctgtcg tgacgcagcc gccctc 26
<210> 22
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 22
tccgtgtccg ggtctcctgg acagtc 26
<210> 23
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 23
actcagccac cctcggtgtc agtg 24
<210> 24
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 24
tcctctgcct ctgcttccct ggga 24
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 25
cagcctgtgc tgactcagcc 20
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 26
gtgtggcctt gttggcttg 19
<210> 27
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 27
cgagggggca gccttggg 18
<210> 28
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 28
agtgaccgtg gggttggcct tggg 24
<210> 29
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 29
Ala Cys Ile Leu Asp Leu Pro Lys Phe Cys Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 30
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 30
Leu Glu Glu Lys Lys Gly Asn Tyr Val Val Thr Asp His Cys
1 5 10
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 31
Cys Ile Leu Asp Leu Pro Lys Phe Cys
1 5
<210> 32
<211> 27
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 32
Thr Gly Thr Ala Thr Thr Cys Thr Thr Gly Ala Thr Thr Thr Gly Cys
1 5 10 15
Cys Gly Ala Ala Gly Thr Thr Thr Thr Gly Cys
20 25
<210> 33
<211> 501
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(29)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 33
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Ala Ser Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro
35 40 45
Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro
50 55 60
Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ala Arg Thr Pro Glu Val Thr
65 70 75 80
Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn
85 90 95
Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg
100 105 110
Glu Glu Gln Tyr Gln Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val
115 120 125
Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser
130 135 140
Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys
145 150 155 160
Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp
165 170 175
Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe
180 185 190
Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu
195 200 205
Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe
210 215 220
Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly
225 230 235 240
Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr
245 250 255
Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Ser Thr Ser Gly
260 265 270
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Phe Trp Val
275 280 285
Leu Val Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr
290 295 300
Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu
305 310 315 320
His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg
325 330 335
Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg
340 345 350
Ser Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
355 360 365
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
370 375 380
Thr Leu Ala Lys Ile Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
385 390 395 400
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
405 410 415
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
420 425 430
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
435 440 445
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
450 455 460
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
465 470 475 480
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
485 490 495
Ala Leu Pro Pro Arg
500
<210> 34
<211> 607
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 34
Met Tyr Arg Met Gln Leu Leu Ser Cys Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Ala Gln Pro Ala Ile Ser Arg Glu Val Gln Leu
20 25 30
Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu
35 40 45
Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Asn Phe Ser Asn Phe Thr Met Asn Trp
50 55 60
Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Ser Asn Ile Ser
65 70 75 80
Arg Asn Gly Ser Asp Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe
85 90 95
Asn Ile Ser Arg Asp Asn Gly Asn Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn
100 105 110
Arg Leu Lys Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Asn Arg
115 120 125
Ser Asp Ser Gly Ser Asn Gln Arg Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
130 135 140
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly
145 150 155 160
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Glu Leu Met Gln
165 170 175
Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln Thr Ala Ser Ile Thr Cys
180 185 190
Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asp Lys Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln Lys
195 200 205
Ala Gly Gln Pro Leu Leu Leu Val Ile Tyr Gln Asp Asp Val Arg Pro
210 215 220
Ser Gly Ile Thr Glu Arg Phe Ser Gly Ser Asn Ser Gly Asn Thr Ala
225 230 235 240
Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Ala Met Asp Glu Ala Asp Tyr Phe
245 250 255
Cys Gln Ala Trp Asp Ser Asn Ile Tyr Val Phe Gly Ser Gly Thr Lys
260 265 270
Val Thr Val Leu Gly Gly Ala Leu Gly Leu Gly Gly Leu Ala Ser Glu
275 280 285
Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
290 295 300
Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
305 310 315 320
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
325 330 335
Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Tyr Trp Tyr Val
340 345 350
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
355 360 365
Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
370 375 380
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala
385 390 395 400
Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
405 410 415
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
420 425 430
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
435 440 445
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
450 455 460
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
465 470 475 480
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
485 490 495
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
500 505 510
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys
515 520 525
Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln
530 535 540
Gly Asp Leu Asn Ala Val Gly Gln Asp Thr Ala Val Gly Gln Asp Thr
545 550 555 560
Gln Glu Val Ile Val Val Pro His Ser Leu Pro Phe Lys Val Val Val
565 570 575
Ile Ser Ala Ile Leu Ala Leu Val Val Leu Thr Ile Ile Ser Leu Ile
580 585 590
Ile Leu Ile Met Leu Trp Gln Lys Lys Pro Arg Ile Gly Ile Arg
595 600 605
<210> 35
<211> 28
<212> PRT
<213> 智人(Homo Sapiens)
<400> 35
Gly Lys Gly Arg Asp Glu Pro Asn Met Asn Pro Lys Leu Asp Leu Pro
1 5 10 15
Asn Arg Pro Glu Thr Ser Phe Leu Trp Phe Thr Asn
20 25
<210> 36
<211> 28
<212> PRT
<213> 缓症链球菌(Streptococcus mitis)
<400> 36
Lys Gln Ser Lys Ile Val Ser Val Val Pro Asn Ile Leu Asp Leu Pro
1 5 10 15
Lys Phe Glu Gly Thr Thr Glu Trp Ile Asp Val Asn
20 25
<210> 37
<211> 28
<212> PRT
<213> 杰氏肺囊虫(Pneumocystis jirovecii)
<400> 37
Tyr Ser Ser Ile Asp Ser Ile Phe Tyr Glu Gly Ile Leu Asp Leu Pro
1 5 10 15
Lys Phe Arg Tyr Phe Ile Ser Gly Lys Asp Ile Ser
20 25
<210> 38
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(8)
<223> n是a、c、g、t或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> k是g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(11)
<223> n是a、c、g、t或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> k是g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223> n是a、c、g、t或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> k是g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> n是a、c、g、t或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> k是g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(20)
<223> n是a、c、g、t或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> k是g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(23)
<223> n是a、c、g、t或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> k是g或t
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(26)
<223> n是a、c、g、t或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> k是g或t
<400> 38
gcttgtnnkn nknnknnknn knnknnktgc ggtggaggt 39
<210> 39
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(8)
<223> n是a、c、g、t或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> m是a或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(11)
<223> n是a、c、g、t或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> m是a或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(14)
<223> n是a、c、g、t或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> m是a或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(17)
<223> n是a、c、g、t或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> m是a或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(20)
<223> n是a、c、g、t或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (21)..(21)
<223> m是a或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (22)..(23)
<223> n是a、c、g、t或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (24)..(24)
<223> m是a或c
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(26)
<223> n是a、c、g、t或u
<220>
<221> misc_feature
<222> (27)..(27)
<223> m是a或c
<400> 39
cgaacannmn nmnnmnnmnn mnnmnnmacg ccacctcca 39
<210> 40
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(9)
<223> Xaa可以是任何天然存在的氨基酸
<400> 40
Ala Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Gly Gly Gly
1 5 10
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 41
gcaatgcgat tgatactccc 20
<210> 42
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多肽
<400> 42
Ile Leu Asp Leu Pro Lys Phe
1 5
<210> 43
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 43
tcacgaattc ggcttgtatt cttgatttgc cgaagttttg cggtggaggt tcggctagc 59
<210> 44
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 合成多核苷酸
<400> 44
gctcgctagc cgaacctcca ccgcaaaact tcggcaaatc aagaataca 49

Claims (219)

1.一种治疗受试者中的淋巴瘤的方法，所述方法包括：
鉴定在所述受试者的淋巴瘤细胞中表达的独特的B细胞受体；
使所述独特的B细胞受体在细胞中表达；
使所述细胞与来自文库的推定的独特的B细胞受体配体接触；
检测所述独特的B细胞受体与推定的独特的B细胞受体配体的结合，从而鉴定独特的B细胞受体配体；以及
向所述受试者施用治疗有效量的与治疗剂偶联的所述B细胞受体配体。
2.一种治疗受试者中的淋巴瘤的方法，所述方法包括：
鉴定在所述受试者的淋巴瘤细胞中表达的独特的B细胞受体；
使独特的B细胞受体与来自文库的推定的独特的B细胞受体配体接触；
检测所述独特的B细胞受体与推定的独特的B细胞受体配体的结合，从而鉴定独特的B细胞受体配体；以及
向所述受试者施用治疗有效量的与治疗剂偶联的所述B细胞受体配体。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述推定的独特的B细胞受体配体包括肽、环肽、类肽、环类肽、多糖、脂质或小分子。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述独特的B细胞受体和所述推定的独特的B细胞受体配体在T细胞中共表达。
5.根据权利要求权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述细胞包含含有所述推定的独特的B细胞受体配体的CAR。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述检测方法包括鉴定所述T细胞的活化。
7.根据权利要求6所述的方法，其中鉴定所述T细胞的活化包括测量CD69或CD25的表达。
8.根据权利要求2或3所述的方法，其中通过噬菌体展示使所述独特的B细胞受体与来自文库的推定的独特的B细胞受体配体接触。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述文库包括与噬菌体连接的推定的B细胞受体配体的文库。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其中所述独特的B细胞受体被附接至固体支持物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中使独特的B细胞受体与来自文库的推定的独特的B细胞受体配体接触包括用与噬菌体连接的推定的B细胞受体配体的文库淘选被附接至固体支持物的独特的B细胞受体一轮或更多轮。
12.根据权利要求11所述的方法，其中每一轮淘选包括阴性选择。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中所述受试者被确定为患有淋巴瘤。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述受试者被确定为具有与淋巴瘤相关的一个或更多个单核苷酸多态性(SNP)。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中鉴定独特的B细胞受体包括：
从活检物获得细胞；
从所述细胞提取RNA；
由所提取的RNA合成cDNA；以及
对所述cDNA进行测序。
16.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中鉴定独特的B细胞受体包括对循环无细胞DNA进行克隆和测序。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述方法在3周或更少时间内进行。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述治疗剂包括放射性同位素。
19.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中偶联有治疗剂的B细胞受体配体包括治疗性CAR。
20.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述治疗剂包括化学疗法。
21.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述治疗剂包括免疫疗法。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中将所述B细胞受体或其片段与所述治疗剂伴随施用至所述受试者。
23.一种治疗受试者中的淋巴瘤的方法，所述方法包括：
鉴定在所述受试者的淋巴瘤细胞中表达的独特的B细胞受体；
使所述独特的B细胞受体和来自文库的推定的独特的B细胞受体配体在细胞中共表达；
检测所述独特的B细胞受体与推定的独特的B细胞受体配体的结合，从而鉴定独特的B细胞受体配体；以及
向所述受试者施用治疗有效量的与治疗剂偶联的所述B细胞受体配体。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述独特的B细胞受体和所述推定的独特的B细胞受体配体在T细胞中共表达。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述T细胞包含含有所述推定的独特的B细胞受体配体的CAR。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述检测方法包括鉴定所述T细胞的活化。
27.根据权利要求26所述的方法，其中鉴定所述T细胞的活化包括测量CD69或CD25的表达。
28.根据权利要求23-27中任一项所述的方法，其中所述受试者被确定为患有淋巴瘤。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述受试者被确定为具有与淋巴瘤相关的一个或更多个单核苷酸多态性(SNP)。
30.根据权利要求23-29中任一项所述的方法，其中鉴定独特的B细胞受体包括：
从活检物获得细胞；
从所述细胞提取RNA；
由所提取的RNA合成cDNA；以及
对所述cDNA进行测序。
31.根据权利要求23-29中任一项所述的方法，其中鉴定独特的B细胞受体包括对循环无细胞DNA进行克隆和测序。
32.根据权利要求23-31中任一项所述的方法，其中所述方法在3周或更少时间内进行。
33.根据权利要求23-32中任一项所述的方法，其中所述治疗剂包括放射性同位素。
34.根据权利要求23-32中任一项所述的方法，其中偶联有治疗剂的B细胞受体配体包括治疗性CAR。
35.根据权利要求23-32中任一项所述的方法，其中所述治疗剂包括化学疗法。
36.根据权利要求23-32中任一项所述的方法，其中所述治疗剂包括免疫疗法。
37.根据权利要求23-36中任一项所述的方法，其中所述推定的B细胞受体配体结构域包含来自环肽文库的多肽。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述推定的B细胞受体配体结构域还包含Fc区。
39.根据权利要求23-38中任一项所述的方法，其中将所述B细胞受体或其片段与所述治疗剂伴随施用至所述受试者。
40.一种鉴定B细胞受体配体的方法，所述方法包括：
向T细胞的群体提供编码嵌合抗原受体(CAR)的文库和B细胞受体的核酸分子，其中所述文库中的每一个CAR包含不同的推定的B细胞受体配体结构域；
使所述B细胞受体和所述CAR的文库在T细胞中共表达；
测量所述T细胞的活化，其中如果表达所述B细胞受体和所述CAR的T细胞被活化，则来自所述CAR的文库的CAR的推定的B细胞受体配体结构域包含所述B细胞受体的配体；以及
从活化的T细胞中分离编码所述CAR的核酸分子；以及
对来自所述活化的T细胞的编码所述CAR的核酸分子的推定的B细胞受体配体结构域进行测序；
从而鉴定B细胞受体配体。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述B细胞受体来自癌细胞。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述癌细胞是淋巴瘤细胞，例如来自被确定为患有淋巴瘤的患者的淋巴瘤细胞。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述淋巴瘤细胞从来自患者的肿瘤获得。
44.根据权利要求43所述的方法，其中所述患者被确定为具有与淋巴瘤相关的一个或更多个单核苷酸多态性(SNP)。
45.根据权利要求40-44中任一项所述的方法，其中所述推定的B细胞受体配体结构域包含30个氨基酸或更少氨基酸的多肽。
46.根据权利要求40-45中任一项所述的方法，其中所述推定的B细胞受体配体结构域包含来自环肽文库的多肽。
47.根据权利要求46所述的方法，其中所述推定的B细胞受体配体结构域还包含Fc区。
48.根据权利要求40-47中任一项所述的方法，其中所述CAR包含跨膜结构域。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述跨膜结构域包括T细胞受体的α链、β链或δ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和/或CD154。
50.根据权利要求40-49中任一项所述的方法，其中所述CAR包含胞内区域。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述胞内区域包括MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD25/CD18)、4-29B(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD423、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD129、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244,304)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD123、与CD83特异性结合的配体和/或CD3δ。
52.根据权利要求40-51中任一项所述的方法，其中所述CAR包含铰链结构域。
53.根据权利要求40-52中任一项所述的方法，其中T细胞活化通过CD69或CD25的表达的增加来测量。
54.根据权利要求40-52中任一项所述的方法，其中T细胞活化通过在Jun、NF-κB和/或Rel的控制下的荧光蛋白报告物基因的表达的增加来测量。
55.根据权利要求40-54中任一项所述的方法，所述方法还包括用所述B细胞受体配体治疗患有淋巴瘤的受试者，其中：
所述B细胞受体在来自所述受试者的肿瘤中表达；以及
使所述B细胞受体配体与治疗剂偶联。
56.一种治疗淋巴瘤的方法，所述方法包括：
向受试者施用治疗有效剂量的与治疗剂偶联的B细胞受体配体，
其中所述B细胞受体配体包含推定的B细胞受体配体结构域，并且其中含有所述推定的B细胞受体配体结构域的CAR在与淋巴瘤细胞的B细胞受体共表达时活化T细胞。
57.根据权利要求56所述的方法，其中所述治疗剂包括放射性同位素。
58.根据权利要求56所述的方法，其中偶联有治疗剂的B细胞受体配体包括治疗性CAR。
59.根据权利要求56所述的方法，其中所述治疗剂包括化学疗法。
60.根据权利要求56所述的方法，其中所述治疗剂包括免疫疗法。
61.根据权利要求56-60中任一项所述的方法，其中所述推定的B细胞受体配体结构域包含30个氨基酸或更少氨基酸的多肽。
62.根据权利要求56-61中任一项所述的方法，其中所述推定的B细胞受体配体结构域包含来自环肽文库的多肽。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述推定的B细胞受体配体结构域还包含Fc区。
64.根据权利要求56-63中任一项所述的方法，其中含有所述推定的B细胞受体配体结构域的所述CAR或所述治疗性CAR包含跨膜结构域。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述跨膜结构域包括T细胞受体的α链、β链或δ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和/或CD154。
66.根据权利要求56-65中任一项所述的方法，其中含有所述推定的B细胞受体配体结构域的所述CAR或所述治疗性CAR包含胞内区域。
67.根据权利要求66所述的方法，其中所述胞内区域包括MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD25/CD18)、4-29B(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD423、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD129、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244,304)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD123、与CD83特异性结合的配体和/或CD3δ。
68.根据权利要求56-67中任一项所述的方法，其中含有所述推定的B细胞受体配体结构域的所述CAR或所述治疗性CAR包含铰链结构域。
69.根据权利要求56-68中任一项所述的方法，其中T细胞活化通过CD69或CD25的表达的增加来测量。
70.根据权利要求56-69中任一项所述的方法，其中将所述B细胞受体或其片段与所述治疗剂伴随施用至所述受试者。
71.一种治疗受试者中的淋巴瘤的方法，所述方法包括：
鉴定在所述受试者的淋巴瘤细胞中表达的独特的B细胞受体；
使所述独特的B细胞受体和来自嵌合抗原受体(CAR)的文库的CAR在T细胞中共表达，其中所述文库中的每一个CAR包含不同的推定的B细胞受体配体结构域；
通过鉴定活化的T细胞来鉴定B细胞受体配体，其中如果表达所述B细胞受体和所述CAR的T细胞被活化，则来自所述CAR的文库的CAR的推定的B细胞受体配体结构域包含所述独特的B细胞受体的配体；以及
向所述受试者施用治疗有效剂量的与治疗剂偶联的所述B细胞受体配体。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述受试者被确定为患有淋巴瘤。
73.根据权利要求72所述的方法，其中所述受试者被确定为具有与淋巴瘤相关的一个或更多个单核苷酸多态性(SNP)。
74.根据权利要求71-73中任一项所述的方法，其中鉴定独特的B细胞受体包括：
从活检物获得细胞；
从所述细胞提取RNA；
由所提取的RNA合成cDNA；以及
对所述cDNA进行测序。
75.根据权利要求71-73中任一项所述的方法，其中鉴定独特的B细胞受体包括对循环无细胞DNA进行克隆和测序。
76.根据权利要求71-75中任一项所述的方法，所述方法还包括制备与治疗剂偶联的所述B细胞受体配体。
77.根据权利要求71-76中任一项所述的方法，其中所述方法在3周或更少时间内进行。
78.根据权利要求71-77中任一项所述的方法，其中所述T细胞通过所述CAR的基于自分泌的活化而被活化。
79.根据权利要求71-78中任一项所述的方法，其中鉴定B细胞受体配体还包括：
从活化的T细胞中分离编码所述CAR的核酸分子；以及
对来自所述活化的T细胞的编码所述CAR的核酸分子的推定的B细胞受体配体结构域进行测序。
80.根据权利要求71-79中任一项所述的方法，其中所述治疗剂包括放射性同位素。
81.根据权利要求71-79中任一项所述的方法，其中偶联有治疗剂的B细胞受体配体包括治疗性CAR。
82.根据权利要求71-79中任一项所述的方法，其中所述治疗剂包括化学疗法。
83.根据权利要求71-79中任一项所述的方法，其中所述治疗剂包括免疫疗法。
84.根据权利要求71-83中任一项所述的方法，其中所述推定的B细胞受体配体结构域包含30个氨基酸或更少氨基酸的多肽。
85.根据权利要求71-83中任一项所述的方法，其中所述推定的B细胞受体配体结构域包含来自环肽文库的多肽。
86.根据权利要求85所述的方法，其中所述推定的B细胞受体配体结构域还包含Fc区。
87.根据权利要求71-86中任一项所述的方法，其中含有所述推定的B细胞受体配体结构域的所述CAR或所述治疗性CAR包含跨膜结构域。
88.根据权利要求87所述的方法，其中所述跨膜结构域包括T细胞受体的α链、β链或δ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和/或CD154。
89.根据权利要求71-88中任一项所述的方法，其中含有所述推定的B细胞受体配体结构域的所述CAR或所述治疗性CAR包含胞内区域。
90.根据权利要求89所述的方法，其中所述胞内区域包括MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD25/CD18)、4-29B(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD423、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD129、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244,304)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD123和/或与CD83特异性结合的配体。
91.根据权利要求71-90中任一项所述的方法，其中含有所述推定的B细胞受体配体结构域的所述CAR或所述治疗性CAR包含铰链结构域。
92.根据权利要求71-90中任一项所述的方法，其中T细胞活化通过CD69或CD25的表达的增加来测量。
93.根据权利要求71-91中任一项所述的方法，其中将所述B细胞受体或其片段与所述治疗剂伴随施用至所述受试者。
94.一种治疗受试者中的淋巴瘤的方法，所述方法包括：
鉴定在所述受试者的淋巴瘤细胞中表达的独特的B细胞受体；
使所述独特的B细胞受体和来自文库的推定的独特的B细胞受体配体在细胞中共表达；
通过检测方法鉴定所述独特的B细胞受体配体，其中如果推定的独特的B细胞受体配体与所述独特的B细胞受体相互作用，则所述推定的独特的B细胞受体配体是独特的B细胞受体配体；以及
向所述受试者施用治疗有效量的与治疗剂偶联的所述B细胞受体配体。
95.根据权利要求94所述的方法，其中所述独特的B细胞受体和推定的独特的B细胞受体配体在T细胞中共表达。
96.根据权利要求94或95所述的方法，其中细胞包含含有所述推定的独特的B细胞受体配体的CAR。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述检测方法包括鉴定所述T细胞的活化。
98.根据权利要求97所述的方法，其中鉴定所述T细胞的活化包括测量CD69或CD25的表达。
99.根据权利要求94-98中任一项所述的方法，其中所述受试者被确定为患有淋巴瘤。
100.根据权利要求99所述的方法，其中所述受试者被确定为具有与淋巴瘤相关的一个或更多个单核苷酸多态性(SNP)。
101.根据权利要求94-100中任一项所述的方法，其中鉴定独特的B细胞受体包括：
从活检物获得细胞；
从所述细胞提取RNA；
由所提取的RNA合成cDNA；以及
对所述cDNA进行测序。
102.根据权利要求94-100中任一项所述的方法，其中鉴定独特的B细胞受体包括对循环无细胞DNA进行克隆和测序。
103.根据权利要求94-102中任一项所述的方法，其中所述方法在3周或更少时间内进行。
104.根据权利要求94-103中任一项所述的方法，其中所述治疗剂包括放射性同位素。
105.根据权利要求94-103中任一项所述的方法，其中偶联有治疗剂的B细胞受体配体包括治疗性CAR。
106.根据权利要求94-103中任一项所述的方法，其中所述治疗剂包括化学疗法。
107.根据权利要求94-103中任一项所述的方法，其中所述治疗剂包括免疫疗法。
108.根据权利要求94-107中任一项所述的方法，其中所述推定的B细胞受体配体结构域包含来自环肽文库的多肽。
109.根据权利要求108所述的方法，其中所述推定的B细胞受体配体结构域还包含Fc区。
110.根据权利要求94-109中任一项所述的方法，其中将所述B细胞受体或其片段与所述治疗剂伴随施用至所述受试者。
111.一种嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体(CAR)包含：
推定的B细胞受体配体结构域，所述推定的B细胞受体配体结构域包含来自环肽文库的多肽；
跨膜结构域；和
胞内区域。
112.根据权利要求111所述的CAR，其中所述CAR在与B细胞受体共表达时活化T细胞，其中所述B细胞受体的B细胞受体配体包含所述推定的B细胞受体配体结构域。
113.根据权利要求111或112所述的CAR，其中所述跨膜结构域包括T细胞受体的α链、β链或δ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和/或CD154。
114.根据权利要求111-113中任一项所述的CAR，其中所述胞内区域包括MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD25/CD18)、4-29B(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD423、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD129、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244,304)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD123和/或与CD83特异性结合的配体。
115.根据权利要求111-114中任一项所述的CAR，其中所述CAR包含铰链结构域。
116.根据权利要求111-115中任一项所述的CAR，其中所述B细胞受体配体包含SEQ IDNO:1-3中任一个的氨基酸序列。
117.一种治疗受试者中的癌症的方法，所述方法包括伴随施用：
表达CAR的T细胞，其中所述CAR包含以癌症特异性方式特异性结合癌症特异性抗原的抗原结合结构域；和
疫苗，所述疫苗包含表达所述癌症特异性抗原或其癌症特异性片段的多肽或核酸。
118.根据权利要求117所述的方法，其中所述癌症特异性抗原是B细胞受体。
119.根据权利要求118所述的方法，其中所述癌症是淋巴瘤。
120.根据权利要求117-119中任一项所述的方法，其中所述多肽或核酸包含重链可变区或轻链可变区或其片段。
121.根据权利要求117所述的方法，其中所述癌症特异性抗原在所述癌症中表达，并且包含体细胞突变。
122.根据权利要求121所述的方法，其中所述受试者的非癌细胞没有所述体细胞突变。
123.根据权利要求121或122所述的方法，其中所述突变是点突变、剪接位点突变、移码突变、读通突变或基因融合突变。
124.根据权利要求121-123中任一项所述的方法，其中所述体细胞突变包括EGFRvIII、PSCA、BCMA、CD30、CEA、CD22、L1CAM、ROR1、ErbB、CD123、IL13Rα2、间皮素、FRα、VEGFR、c-Met、5T4、CD44v6、B7-H4、CD133、CD138、CD33、CD28、GPC3、EphA2、CD19、ACVR2B、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、MYCN、BCR、HER2、NY-ESO1、MUC1或MUC16中的突变。
125.根据权利要求121-124中任一项所述的方法，其中所述癌症包括肿瘤。
126.根据权利要求121-125中任一项所述的方法，其中所述多肽或核酸包含所述体细胞突变。
127.根据权利要求121-126中任一项所述的方法，其中所述伴随施用在所述受试者中发生至少两次、至少三次、至少四次、至少五次、至少六次、至少七次、至少八次、至少九次或至少十次。
128.根据权利要求121-127中任一项所述的方法，其中所述表达CAR的T细胞在所述疫苗之前施用。
129.根据权利要求121-127中任一项所述的方法，其中所述表达CAR的T细胞在所述疫苗之后施用。
130.根据权利要求121-129中任一项所述的方法，所述方法还包括鉴定所述受试者中的所述癌症特异性抗原。
131.根据权利要求130所述的方法，其中鉴定所述癌症特异性抗原包括：
(i)从受试者获得癌细胞；
(ii)从所述细胞提取DNA；以及
(iii)对所述DNA进行测序。
132.根据权利要求131所述的方法，其中鉴定所述癌症特异性抗原还包括将从所述癌细胞获得的DNA序列与从非癌细胞获得的同一基因的DNA序列进行比较。
133.根据权利要求130或131所述的方法，其中所述DNA是从肿瘤细胞分离的。
134.根据权利要求130所述的方法，其中鉴定所述癌症特异性抗原包括对所述受试者的循环无细胞DNA进行分离和测序。
135.根据权利要求130所述的方法，其中鉴定所述癌症特异性抗原包括：
(i)从受试者获得癌细胞；
(ii)从所述细胞提取RNA；
(iii)由所提取的RNA合成cDNA；以及
(iv)对所述cDNA进行测序。
136.根据权利要求135所述的方法，其中鉴定所述癌症特异性抗原还包括将从所述癌细胞获得的cDNA序列与从非癌细胞获得的同一基因的cDNA序列进行比较。
137.根据权利要求121-136中任一项所述的方法，其中所述疫苗包含具有重叠序列的两种或更多种多肽，每一种多肽表达所述癌症特异性抗原的片段。
138.根据权利要求121-137中任一项所述的方法，所述方法还包括通过以下提供表达CAR的T细胞：
(i)鉴定以癌症特异性方式特异性结合所述癌症特异性抗原的抗原结合结构域；以及
(ii)使含有所述抗原结合结构域的CAR在T细胞中表达。
139.根据权利要求121-138中任一项所述的方法，其中所述多肽被缀合至KLH。
140.根据权利要求121-139中任一项所述的方法，其中所述疫苗通过静脉内施用、腹膜内施用、经粘膜施用、口服施用、皮下施用、肺部施用、鼻内施用、皮内施用或肌内施用来施用。
141.根据权利要求121-140中任一项所述的方法，其中所述疫苗被瘤内施用。
142.根据权利要求121-141中任一项所述的方法，其中所述表达CAR的T细胞通过静脉内施用来施用。
143.根据权利要求121-142中任一项所述的方法，其中所述CAR包含跨膜结构域。
144.根据权利要求143所述的方法，其中所述跨膜结构域包括T细胞受体的α链、β链或δ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和/或CD154。
145.根据权利要求121-144中任一项所述的方法，其中所述CAR包含胞内区域。
146.根据权利要求145所述的方法，其中所述胞内区域包括MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD25/CD18)、4-29B(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD423、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD129、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244,304)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD123、与CD83特异性结合的配体和/或CD3δ。
147.根据权利要求121-146中任一项所述的方法，其中所述CAR包含铰链结构域。
148.根据权利要求121-147中任一项所述的方法，所述方法还包括施用TLR9激动剂。
149.根据权利要求148所述的方法，其中所述癌症特异性抗原是OX40。
150.一种用于治疗受试者中的癌症的组合物，所述组合物包含：
表达CAR的T细胞，其中所述CAR包含以癌症特异性方式特异性结合癌症特异性抗原的抗原结合结构域；和
表达所述癌症特异性抗原或其癌症特异性片段的多肽或核酸。
151.根据权利要求150所述的组合物，其中所述癌症特异性抗原是B细胞受体。
152.根据权利要求150或151所述的组合物，其中所述多肽或核酸包含重链可变区或轻链可变区或其片段。
153.根据权利要求150所述的组合物，其中所述癌症特异性抗原在所述癌症中表达，并且包含体细胞突变。
154.根据权利要求153所述的组合物，其中所述受试者的非癌细胞没有所述体细胞突变。
155.根据权利要求153或154所述的组合物，其中所述突变是点突变、剪接位点突变、移码突变、读通突变或基因融合突变。
156.根据权利要求153-155中任一项所述的组合物，其中所述体细胞突变包括EGFRvIII、PSCA、BCMA、CD30、CEA、CD22、L1CAM、ROR1、ErbB、CD123、IL13Rα2、间皮素、FRα、VEGFR、c-Met、5T4、CD44v6、B7-H4、CD133、CD138、CD33、CD28、GPC3、EphA2、CD19、ACVR2B、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、MYCN、BCR、HER2、NY-ESO1、MUC1或MUC16中的突变。
157.根据权利要求153-156中任一项所述的组合物，其中所述多肽或核酸包含所述体细胞突变。
158.根据权利要求150-157中任一项所述的组合物，其中疫苗包含具有重叠序列的两种或更多种多肽，每一种多肽表达所述癌症特异性抗原的片段。
159.根据权利要求150-158中任一项所述的组合物，其中所述多肽被缀合至KLH。
160.根据权利要求150-159中任一项所述的组合物，其中所述CAR包含跨膜结构域。
161.根据权利要求160所述的组合物，其中所述跨膜结构域包括T细胞受体的α链、β链或δ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137和/或CD154。
162.根据权利要求150-161中任一项所述的组合物，其中所述CAR包含胞内区域。
163.根据权利要求162所述的组合物，其中所述胞内区域包括MHC I类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)、活化NK细胞受体、BTLA、Toll配体受体、OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD25/CD18)、4-29B(CD137)、B7-H3、CDS、ICAM-1、ICOS(CD278)、GITR、BAFFR、LIGHT、HVEM(LIGHTR)、KIRDS2、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD423、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD129、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244,304)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Lyl08)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD123、与CD83特异性结合的配体和/或CD3δ。
164.根据权利要求150-163中任一项所述的组合物，其中所述CAR包含铰链结构域。
165.根据权利要求150-164中任一项所述的组合物，所述组合物还包括施用TLR9激动剂。
166.根据权利要求165所述的组合物，其中所述癌症特异性抗原是OX40。
167.一种用于治疗受试者中的淋巴瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的表达第一CAR的CART细胞，其中：
(i)所述第一CAR包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含结合在所述受试者的淋巴瘤细胞中表达的独特的B细胞受体的来自环肽文库的多肽，
(ii)所述抗原结合结构域通过以下鉴定
(a)鉴定在所述受试者的淋巴瘤细胞中表达的所述独特的B细胞受体；
(b)使所述独特的B细胞受体和来自CAR的文库的第二CAR在T细胞中共表达，其中所述文库中的每一个CAR包含含有来自所述环肽文库的多肽的不同的推定的配体结构域；和
(c)通过鉴定活化的T细胞来鉴定所述第一CAR的抗原结合结构域，其中如果表达所述B细胞受体和所述第二CAR的T细胞被活化，则来自CAR的文库的所述第二CAR的推定的B细胞受体配体结构域包含所述第一CAR的抗原结合结构域；以及
(iii)所述第一CAR比对照具有更高的特异性和/或活性。
168.根据权利要求167所述的方法，其中所述对照包括CART细胞。
169.根据权利要求168所述的方法，其中由所述CART细胞表达的CAR的抗原结合结构域结合除了B细胞受体之外的配体。
170.根据权利要求168或169所述的方法，其中所述抗原结合结构域结合CD-19。
171.根据权利要求167-170中任一项所述的方法，其中所述第一CAR和所述第二CAR是相同的CAR。
172.根据权利要求169-170中任一项所述的方法，其中所述第一CAR和所述第二CAR是不同的CAR。
173.根据权利要求169-172中任一项所述的方法，其中活性包括相对于对照的对表达所述独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性。
174.根据权利要求173所述的方法，其中按照通过裂解％测量的，在1:1-10:1的效应物:靶比，所述CART对表达所述独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性比所述对照高0％-10％。
175.根据权利要求173所述的方法，其中按照通过裂解％测量的，在10:1或更高的效应物:靶比，所述CART对表达所述独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性比所述对照高至少10％。
176.根据权利要求173-175中任一项所述的方法，其中所述对照包含含有结合在表达所述独特的B细胞受体的细胞上表达的除了B细胞受体之外的配体的抗原结合结构域的CAR。
177.根据权利要求169-176中任一项所述的方法，其中特异性包括对不表达所述独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性。
178.根据权利要求177所述的方法，其中按照通过裂解％测量的，所述CART对不表达所述独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性小于10％。
179.根据权利要求177所述的方法，其中在小于10:1的效应物:靶比，所述CART对不表达所述独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性比结合在所述细胞上表达的配体的对照的细胞毒性低0％-10％。
180.根据权利要求177所述的方法，其中在10:1或更高的效应物:靶比，所述CART对不表达所述独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性比结合在所述细胞上表达的配体的对照的细胞毒性低至少15％。
181.根据权利要求169-180中任一项所述的方法，其中所述治疗导致细胞因子释放综合征(CRS)相对于用对照治疗的受试者降低。
182.一种用于治疗受试者群体中的淋巴瘤的方法，所述方法包括：
选择患有淋巴瘤的受试者；以及
向每一个受试者施用治疗有效量的CART细胞，所述CART细胞表达对每一个受试者的淋巴瘤细胞上表达的B细胞受体独特的第一CAR，其中：
(i)所述第一CAR包含抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包含结合在每一个受试者的淋巴瘤细胞中表达的独特的B细胞受体的来自环肽文库的多肽，
(ii)所述抗原结合结构域通过以下鉴定：
(a)鉴定在所述受试者的淋巴瘤细胞中表达的所述独特的B细胞受体；
(b)使所述独特的B细胞受体和来自CAR的文库的第二CAR在T细胞中共表达，其中所述文库中的每一个CAR包含含有来自所述环肽文库的多肽的不同的推定的配体结构域；和
(c)通过鉴定活化的T细胞来鉴定所述第一CAR的抗原结合结构域，其中如果表达所述B细胞受体和所述第二CAR的T细胞被活化，则来自所述CAR的文库的第二CAR的推定的B细胞受体配体结构域包含所述第一CAR的抗原结合结构域；以及
(iii)所述第一CAR比对照具有更高的特异性和/或活性。
183.根据权利要求182所述的方法，其中所述对照包括CART细胞。
184.根据权利要求183所述的方法，其中由所述CART细胞表达的CAR的抗原结合结构域结合除了B细胞受体之外的配体。
185.根据权利要求182或183所述的方法，其中所述抗原结合结构域结合CD-19。
186.根据权利要求182-185中任一项所述的方法，其中所述第一CAR和所述第二CAR是相同的CAR。
187.根据权利要求182-185中任一项所述的方法，其中所述第一CAR和所述第二CAR是不同的CAR。
188.根据权利要求182-187中任一项所述的方法，其中活性包括相对于对照的对表达所述独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性。
189.根据权利要求188所述的方法，其中按照通过裂解％测量的，在1:1-10:1的效应物:靶比，所述CART对表达所述独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性比所述对照高0％-10％。
190.根据权利要求188所述的方法，其中按照通过裂解％测量的，在10:1或更高的效应物:靶比，所述CART对表达所述独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性比所述对照高至少10％。
191.根据权利要求188-190中任一项所述的方法，其中所述对照包含含有结合在表达所述独特的B细胞受体的细胞上表达的除了B细胞受体之外的配体的抗原结合结构域的CAR。
192.根据权利要求182-191中任一项所述的方法，其中特异性包括对不表达所述独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性。
193.根据权利要求192所述的方法，其中按照通过裂解％测量的，所述CART对不表达所述独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性小于10％。
194.根据权利要求192所述的方法，其中在小于10:1的效应物:靶比，所述CART对不表达所述独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性比结合在所述细胞上表达的配体的对照的细胞毒性低0％-10％。
195.根据权利要求192所述的方法，其中在10:1或更高的效应物:靶比，所述CART对不表达所述独特的B细胞受体的细胞的细胞毒性比结合在所述细胞上表达的配体的对照的细胞毒性低至少15％。
196.一种快速鉴定对B细胞淋巴瘤特异性的个体化抗体结合配体，例如B细胞受体配体的方法，所述方法包括：
鉴定来自B细胞淋巴瘤细胞的B细胞受体，
向T细胞的群体提供编码嵌合抗原受体(CAR)的文库和所述B细胞受体的核酸分子，其中所述文库中的每一个CAR包含不同的推定的B细胞受体配体结构域；
使所述B细胞受体和所述CAR的文库在T细胞中共表达；
测量所述T细胞的活化，其中如果表达所述B细胞受体和所述CAR的T细胞被活化，则来自所述CAR的文库的CAR的推定的B细胞受体配体结构域包含所述B细胞受体的配体；以及
从活化的T细胞中分离编码所述CAR的核酸分子；以及
对来自所述活化的T细胞的编码所述CAR的核酸分子的推定的B细胞受体配体结构域进行测序；
从而鉴定B细胞受体配体。
197.根据权利要求196所述的方法，其中所述B细胞受体配体在4周内、3周内、2周内或1周内被鉴定出。
198.根据权利要求197所述的方法，其中所述B细胞受体配体在3周内被鉴定出。
199.根据权利要求196-198中任一项所述的方法，其中所述B细胞淋巴瘤细胞从来自患者的肿瘤获得。
200.根据权利要求196-199中任一项所述的方法，其中所述推定的B细胞受体配体结构域包含30个氨基酸或更少氨基酸的多肽。
201.根据权利要求196-200中任一项所述的方法，其中所述推定的B细胞受体配体结构域包含来自环肽文库的多肽。
202.根据权利要求201所述的方法，其中所述推定的B细胞受体配体结构域还包含Fc区。
203.根据权利要求196-202中任一项所述的方法，其中T细胞活化通过CD69或CD25的表达的增加来测量。
204.根据权利要求196-202中任一项所述的方法，其中T细胞活化通过在Jun、NF-κB和/或Rel的控制下的荧光蛋白报告物基因的表达的增加来测量。
205.根据权利要求196-204中任一项所述的方法，所述方法还包括用所述B细胞受体配体治疗患有淋巴瘤的受试者，其中所述B细胞受体配体与治疗剂偶联。
206.一种治疗受试者中的淋巴瘤的方法，所述方法包括：
鉴定在所述受试者的淋巴瘤细胞中表达的独特的B细胞受体；
使所述独特的B细胞受体与噬菌体展示文库接触，其中所述噬菌体展示文库包括与噬菌体连接的推定的独特的B细胞受体配体的文库；
检测所述独特的B细胞受体与推定的独特的B细胞受体配体的结合，从而鉴定独特的B细胞受体配体；以及
向所述受试者施用治疗有效量的与治疗剂偶联的所述B细胞受体配体。
207.根据权利要求206所述的方法，其中所述推定的独特的B细胞受体配体包括肽、环肽、类肽、环类肽、多糖、脂质或小分子。
208.根据权利要求206或207所述的方法，其中所述独特的B细胞受体被附接至固体支持物。
209.根据权利要求197所述的方法，其中使独特的B细胞受体与来自文库的推定的独特的B细胞受体配体接触包括用与噬菌体连接的推定的B细胞受体配体的文库淘选被附接至固体支持物的独特的B细胞受体一轮或更多轮。
210.根据权利要求198所述的方法，其中每一轮淘选包括阴性选择。
211.根据权利要求195-200中任一项所述的方法，其中所述受试者被确定为患有淋巴瘤。
212.根据权利要求200所述的方法，其中所述受试者被确定为具有与淋巴瘤相关的一个或更多个单核苷酸多态性(SNP)。
213.根据权利要求195-200中任一项所述的方法，其中鉴定独特的B细胞受体包括：
从活检物获得细胞；
从所述细胞提取RNA；
由所提取的RNA合成cDNA；以及
对所述cDNA进行测序。
214.根据权利要求195-202中任一项所述的方法，其中鉴定独特的B细胞受体包括对循环无细胞DNA进行克隆和测序。
215.根据权利要求195-203中任一项所述的方法，其中所述方法在3周或更少时间内进行。
216.根据权利要求195-204中任一项所述的方法，其中所述治疗剂包括放射性同位素。
217.根据权利要求195-204中任一项所述的方法，其中偶联有治疗剂的B细胞受体配体包括治疗性CAR。
218.根据权利要求195-204中任一项所述的方法，其中所述治疗剂包括化学疗法。
219.根据权利要求195-204中任一项所述的方法，其中所述治疗剂包括免疫疗法。
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