JP2017530721A - 近接度に基づく結合パートナーの選択のための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本特許出願は、米国特許仮出願第62/066,105号(2014年10月20日出願)に対する優先権の利益を主張する。優先権出願の全開示は、参照によりその全文があらゆる目的のために本明細書に援用される。
本発明は、標的タンパク質またはポリペプチドの結合パートナーを同定するための方法を提供する。標的タンパク質は、別のポリペプチドまたはペプチド分子、例えば、細胞表面受容体、核内受容体およびその他のリガンド結合タンパク質と結合することのできるどんなタンパク質またはポリペプチドであってもよい。本方法は、標的タンパク質(例えば、細胞受容体)と候補結合パートナー(例えば、候補ポリペプチドリガンド)の共存発現および近接度に基づく選択形式に依拠する。本発明は、本発明者らによる細胞受容体のリガンドを同定するための一般的な系の生成に一部分基づいている。この系は、空間でのリガンドとその受容体が接近することである、近接度効果によって引き起こされる化学速度の促進を利用する。この系は、人工シグナル伝達経路を使用する。したがって、受容体−リガンド系の正確な化学的性質またはそのシグナル伝達の機構に依存しない。この方法は、分子がその自然環境にある場合に、受容体と相互作用する大型ライブラリーからの分子の自己分泌選択(autocrine selection)を可能にする。本明細書において詳述されるように、本発明は、リガンド−受容体結合活性を検出するための、新規で普遍的な方法を提供する。これは、下流のシグナル伝達機構が不明な状況において特に重要である。
別に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の属する分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味をもつ。以下の参考文献は、本発明で使用される用語の多くの一般的定義を当業者に提供する:Academic Press Dictionary of Science and Technology,Morris(Ed.),Academic Press(1st ed.,1992);Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology,Smith et al.(Eds.),Oxford University Press(revised ed.,2000);Encyclopaedic Dictionary of Chemistry,Kumar(Ed.),Anmol Publications Pvt.Ltd.(2002);Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,Singleton et al.(Eds.),John Wiley & Sons(3rd ed.,2002);Dictionary of Chemistry,Hunt(Ed.),Routledge(1st ed.,1999);Dictionary of Pharmaceutical Medicine,Nahler(Ed.),Springer−Verlag Telos(1994);Dictionary of Organic Chemistry,Kumar and Anandand(Eds.),Anmol Publications Pvt.Ltd.(2002);およびA Dictionary of Biology(Oxford Paperback Reference),Martin and Hine(Eds.),Oxford University Press(4th ed.,2000)。加えて、以下の定義が本発明の実践において読者を助けるために記載される。
本発明の方法は、発現した標的タンパク質(例えば、細胞受容体)および候補結合パートナーのライブラリー(例えば、候補ポリペプチドリガンド)を細胞区画、例えば細胞膜に固定し共存させる発現系を利用する。候補結合パートナーは、細胞内コンビナトリアルライブラリーを介して発現する。標的タンパク質と結合パートナーの相互作用は、細胞区画(例えば、細胞膜)での分子相互作用の発生を伝える酵素基質系を活性化させる。標的タンパク質および結合パートナーは、各々が融合しているか、または酵素−基質レポーター系の一成分だけを有するように発現する。細胞表面受容体およびペプチドリガンドを例として使用して、系は、リガンドと受容体が相互作用して反応体を近接させる場合にだけ機能する。受容体とそのリガンドの相互作用がそれらを近づけると、タンパク質分解反応によって、宿主細胞において検出可能な応答をもたらし得る活性化因子またはエフェクター分子が放出される。例えば、活性化因子は、核に入り核内のプロモーターと結合してレポーター遺伝子を活性化させるペプチドまたはポリペプチド転写因子であり得る。この発現系および結果として得られる選択形式から得られる多くの利点がある。例えば、この系は、多数の潜在的アゴニストの分子相互作用を、無傷の生細胞の生理学的に適切な環境で決定することを可能にする。その上、この系は、シグナル伝達の機構が不明であるかまたはリガンド自体が不明である受容体のリガンドの検索を可能にする。
本発明は、細胞で発現すると細胞膜に局在することのできるポリペプチドまたは抗体(例えば、一本鎖抗体)のコンビナトリアルライブラリーを提供する。ライブラリーは、各々、少なくとも1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010またはそれ以上の異なるポリペプチドまたは抗体配列を含むことができる。一般に、ライブラリーの各メンバーは、膜貫通ドメインと動作可能に連結された(operably liked)特定のまたは無作為化されたポリペプチドまたは抗体配列を含む。膜貫通ドメイン、例えば、本明細書中で例証されるPDGFR膜貫通領域は、発現したペプチドを細胞膜に繋留させる。PDGFR以外に、当技術分野で周知の多くのその他の膜貫通ドメイン、ならびにこれらの既知膜貫通タンパク質ドメインの変異体(例えば、保存的に修飾された変異体)も、本発明のリガンドライブラリーの構築に用いることができる。例えば、Remm et al.,Genome Res.10:1679−1689,2000;およびHubert et al.,Cell Adh.Migr.4:313−324,2010を参照されたい。
本発明は、宿主細胞集団の細胞膜に発現し局在することのできる、標的分子(例えば、標的受容体)の1またはそれ以上のリガンドを候補リガンドの大型の細胞内コンビナトリアルライブラリーから同定するための方法を提供する。これらの方法では、ライブラリーからの異なる候補リガンドと標的分子(例えば、表面受容体)が宿主細胞の細胞膜に共存する。標的分子(例えば、受容体)および候補リガンドは各々、酵素の一成分およびその酵素の同族のペプチド基質または認識配列に融合する。共存するリガンドが近くの標的分子(例えば、受容体)と結合すると、基質配列に融合していたエフェクター細胞(例えば、転写因子)は酵素反応の結果として放出される。その後、エフェクター分子は、人為的な細胞応答またはシグナル伝達経路を活性化させるとすぐに検出可能な応答、例えば、蛍光応答、発光応答またはその他のシグナルを導くことができる。
以下の実施例は、本発明をさらに例示するが、その範囲を制限しないために提供される。本発明のその他の変形形態は、当技術分野の当業者に直ちに明白であり、添付される特許請求の範囲に包含される。
細胞株。HEK293(ATCCカタログ番号CRL−1573)またはHEK293T(ATCCカタログ番号CRL−3216)細胞を、10%(vol/vol)FBS、ペニシリンおよびストレプトマイシンを含有するDMEM中で維持し、リポフェクタミン2000(Life technologies)を用いて遺伝子導入した。哺乳動物細胞抗生物質ジェネティシンおよびハイグロマイシンは、Invivogen製であった。ルシフェラーゼアッセイ試薬は、Promegaより入手した(E1500)。
本発明者らは、タンパク質分解反応が非効率であるために規定濃度で反応がゆっくりしか進行しない酵素−基質系を構築した。本発明者らは、TEVプロテアーゼと高度に特異的な切断部位を使用した。プロテアーゼを、リガンド構築物のPDGFR膜貫通(TM)ドメインのC末端に付加した(図1)。切断部位は、受容体の細胞質部分と人工のペプチド転写因子との間に位置した。切断後、転写因子は放出され、レポーター遺伝子の発現を活性化する(図1)。重要なことに、潜在的リガンドおよびその受容体は、両方とも細胞膜に固定されているので、それらの間の相互作用はいずれもそれらが付加されている細胞内反応体の接近を引き起こすことができ、シグナルの生成を促進することができる。
本方法を検証するため、本発明者らは、1回膜貫通タンパク質と複数回膜貫通タンパク質の両方を調査した。1回膜貫通受容体に関して、本発明者らは、本発明者らが以前にトロンボポエチン受容体(TpoR)に対して産生させたscFv抗体に加えて天然のトロンボポエチン(TPO)リガンドも調査した(Zhang et al.,Chemistry & biology 20:734−741,2013)。複数回膜貫通受容体に関して、本発明者らは、GLP−1 GPCR受容体によるペプチドの認識を調査した。
シグナルの強度を維持する一方で雑音を低下させるために、異なる効率でTEVによって切断することのできる4つのTEV基質配列を試験した。TEVプロテアーゼは、一般形E−X−X−Y−X−Q−G(配列番号2)またはE−X−X−Y−X−Q−S(配列番号3)の線状エピトープを認識し、切断はQとGの間またはQとSの間で起こる。最も効率のよい基質は、本発明者らが上記の実験の全てで使用したENLYFQS(配列番号4)(TEV1)であった。
機能性抗体またはペプチドの選択に通常使用される近接度に基づく反応には、蛍光活性化セルソーターなどの選択方法と組み合わせる上で、GFPまたはβラクタマーゼなどのレポーター遺伝子が理想的であり得る。その上、蛍光タンパク質は生細胞での動的細胞アッセイ(dynamic cell assays)に有用であり、単一の試料においてシグナル伝達活性の経時的評価を可能にする。図4に示されるように、本発明者らはtdTomatoをレポーター遺伝子として使用し、その発現を顕微鏡で観察した。ルシフェラーゼ・レポーター遺伝子を使用する結果と一致して、膜に繋留されたエキセンディン−4は、高い割合のtdTomato発現細胞を誘導したが、無関係のタンパク質(抗体)は、認識できる量の蛍光を生成できなかった。特に、弱められたTEV2およびTEV3切断部位は、非常に低いバックグラウンドを示した。
Claims (23)
- 標的ポリペプチドに結合する結合パートナーを同定するための方法であって、(a)第1の膜貫通ドメイン(TM)を含有する前記標的ポリペプチドを含む第1の融合分子を発現する第1の構築物、および、各々が第2の膜貫通ドメイン(TM)に結合した候補結合パートナーを含む、第2の融合分子群のコンビナトリアルライブラリーを発現する第2の構築物を生成する工程であって、前記融合分子群のうちの1つが酵素をさらに含み、他方の融合分子が前記酵素の基質配列および人工シグナル伝達経路の活性化因子をさらに含む、工程と、(b)前記第1の構築物および前記第2の構築物を宿主細胞において発現させて細胞集団を生成する工程であって、各々の細胞が細胞膜に共存する前記第1の融合分子および第2の融合分子を有する工程と、(c)前記人工シグナル伝達経路が活性化されている前記細胞集団から細胞を選択する工程と、(d)前記選択された細胞において前記第2の融合分子を同定する工程とを含み;それにより前記標的ポリペプチドの結合パートナーを同定する、方法。
- 前記第1の膜貫通ドメイン(TM)が、前記標的ポリペプチドの天然ドメインである、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の膜貫通ドメイン(TM)が、前記標的ポリペプチドに組換えによって融合している、請求項1に記載の方法。
- 前記酵素がそのN末端で前記第2の膜貫通ドメインに結合し、前記基質配列がそのN末端で前記第1の膜貫通ドメインに結合し、そのC末端で前記活性化因子に結合している、請求項1に記載の方法。
- 前記酵素による前記基質配列の切断の結果、前記第2の融合分子から前記活性化因子が放出される、請求項1に記載の方法。
- 前記標的ポリペプチドが細胞受容体であり、前記結合パートナーが前記受容体のリガンドである、請求項1に記載の方法。
- 前記細胞受容体が細胞表面受容体であり、前記第2の膜貫通ドメインがPDGFR膜貫通ドメインである、請求項6に記載の方法。
- 前記細胞受容体がGタンパク質共役受容体(GPCR)である、請求項6に記載の方法。
- 前記細胞受容体がTpoRまたはGLP1Rである、請求項6に記載の方法。
- 前記酵素がプロテアーゼであり、前記基質配列が前記プロテアーゼの切断部位を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記プロテアーゼがTEVプロテアーゼである、請求項10に記載の方法。
- 前記基質配列が、ENLYFQS(配列番号4)(TEV1)、ENFYFQS(配列番号5)(TEV2)、ENLYYQS(配列番号6)(TEV3)、またはENLFFQS(配列番号7)(TEV4)を含む、請求項11に記載の方法。
- 前記候補結合パートナーがペプチドまたは抗体である、請求項1に記載の方法。
- 前記候補結合パートナーが、リンカー配列を介して前記第2の膜貫通ドメインに結合している、請求項1に記載の方法。
- 前記リンカー配列が、3、5、6、8、10、またはそれ以上のGGGGS(配列番号1)のタンデムリピートを含む、請求項14に記載の方法。
- 前記活性化因子が転写因子であり、前記人工シグナル伝達経路が、前記転写因子によって認識される転写調節配列の制御下でのレポーター遺伝子の発現である、請求項1に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子がレンチウイルスベクターを介して前記宿主細胞に導入される、請求項16に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子が、前記融合分子の発現の前に前記宿主細胞に導入される、請求項16に記載の方法。
- 前記転写因子がGLA4−V16であり、前記転写調節配列がGAL4 UASおよび前記アデノウイルス後期プロモーターを含む、請求項16に記載の方法。
- 前記レポーター遺伝子がルシフェラーゼluc2P遺伝子またはtdTomatoレポーター遺伝子である、請求項16に記載の方法。
- 前記宿主細胞がHEK293またはHEK293T細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記宿主細胞が前記第1の融合分子を安定して発現する、請求項1に記載の方法。
- 前記第2の融合分子がレンチウイルスベクターを介して前記宿主細胞で発現する、請求項22に記載の方法。
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- 2017-04-18 IL IL251771A patent/IL251771A0/en unknown
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