KR20220129015A - 조작된 t 세포, 이의 제조 및 응용 - Google Patents

조작된 t 세포, 이의 제조 및 응용 Download PDF

Info

Publication number
KR20220129015A
KR20220129015A KR1020227027043A KR20227027043A KR20220129015A KR 20220129015 A KR20220129015 A KR 20220129015A KR 1020227027043 A KR1020227027043 A KR 1020227027043A KR 20227027043 A KR20227027043 A KR 20227027043A KR 20220129015 A KR20220129015 A KR 20220129015A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
sequence
cell
polypeptide
complex
Prior art date
Application number
KR1020227027043A
Other languages
English (en)
Inventor
준 리
펭차오 장
인항 장
Original Assignee
펀다멘타 쎄라퓨틱스 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 펀다멘타 쎄라퓨틱스 인코포레이티드 filed Critical 펀다멘타 쎄라퓨틱스 인코포레이티드
Publication of KR20220129015A publication Critical patent/KR20220129015A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4621—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells immunosuppressive or immunotolerising
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4633—Antibodies or T cell engagers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/46434—Antigens related to induction of tolerance to non-self
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464411—Immunoglobulin superfamily
    • A61K39/464412—CD19 or B4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A61K39/464402—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A61K39/464416—Receptors for cytokines
    • A61K39/464417—Receptors for tumor necrosis factors [TNF], e.g. lymphotoxin receptor [LTR], CD30
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A61K2039/572—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2 cytotoxic response
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/10—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by the structure of the chimeric antigen receptor [CAR]
    • A61K2239/11—Antigen recognition domain
    • A61K2239/15—Non-antibody based
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/26—Universal/off- the- shelf cellular immunotherapy; Allogenic cells or means to avoid rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/27—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterized by targeting or presenting multiple antigens
    • A61K2239/28—Expressing multiple CARs, TCRs or antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/033—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a motif for targeting to the internal surface of the plasma membrane, e.g. containing a myristoylation motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/04—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing an ER retention signal such as a C-terminal HDEL motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/04—Immunosuppressors, e.g. cyclosporin, tacrolimus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
    • C12N2740/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

조작된 T 세포를 제공한다. 상기 세포 중 세포 표면 TCR/CD3 복합체 발현을 하향 조절하는 폴리펩티드를 도입하여 세포 표면 TCR/CD3 복합체의 발현을 낮춘다. 상기 조작된 T 세포는 암 치료와 같은 치료 목적으로 사용될 수 있다.

Description

조작된 T 세포, 이의 제조 및 응용
본 발명은 세포 면역 치료 분야에 속하는 것으로, 보다 상세하게는 조작된 T 세포, 이의 제조 및 응용에 관한 것이다.
종양 치료가 발달함에 따라 키메라 항원 수용체 T 세포(Chimeric antigen receptor-T, CAR-T) 면역치료법이 점차 주목 받는 치료 수단이 되고 있다. CAR-T 세포에 의해 발현되는 CAR은 일반적으로 세포외 항원 결합 도메인, 막횡단 도메인 및 세포내 신호 전달 도메인을 포함한다. 통상적으로 CAR-T 세포는 CAR 유전자에 의해 환자의 자가 T 세포로부터 형질도입 및 확장되고, 최종적으로 해당 환자 체내에 재주입된다. CAR-T 세포는 주요 조직적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC)의 제한을 받지 않고 종양 항원을 효과적으로 인식하고 특이적 항종양 면역 반응을 일으킬 수 있다. 현재 미국 FDA는 두 가지 자가 CAR-T 세포 제품 출시를 이미 승인했으며, 이는 각각 난치성 및 재발성 비호지킨 림프종(non-Hodgkin lymphoma)과 급성 림프구성 백혈병 치료를 위한 노바티스(Novartis)의 킴리아(Kymriah)와 카이트(Kite)의 예스카타(YesCAR-Ta)이다. 관련 임상 시험에서 입증된 바에 따르면, CAR-T는 완전한 맞춤형 생세포 약물로서 항종양 잠재력이 매우 높다(Maude S L, Laetsch T W, Buechner J, et al. Tisagenlecleucel in children and young adults with B-cell lymphoblastic leukemia[J]. New England Journal of Medicine, 2018, 378(5): 439-448；Park J H, Rivi
Figure pct00001
re I, Gonen M, et al. Long-term follow-up of CD19 CAR therapy in acute lymphoblastic leukemia[J]. New England Journal of Medicine, 2018, 378(5): 449-459；Schuster S J, Svoboda J, Chong E A, et al. Chimeric antigen receptor T cells in refractory B-cell lymphomas[J]. New England Journal of Medicine, 2017, 377(26): 2545-2554).
상술한 두 가지 CAR-T 약물의 제조 및 재주입 전략은 모두 환자의 자가 말초혈액을 채취하여 T 세포를 분리 획득하고 바이러스 벡터를 통해 CAR의 코딩 유전자를 T 세포의 게놈에 통합한 후 확장 배양하여 최종적으로 환자 체내에 재주입하는 것이다. 이처럼 완전한 맞춤형 CAR-T 세포 생산은 생산 주기가 길 뿐만 아니라 비용이 높고 재주입 치료에 있어서도 많은 불확정 요인을 가져온다. 예를 들어, 분리 획득된 T 세포 수량이 불충분하거나 기능 이상으로 인해 CAR-T 세포 제조가 실효되거나 세포 제조에서 환자 질병이 급속도로 진행되어 치료 창구를 잃게 되는 등의 경우가 있다. 따라서 CAR-T 분야에서 하나의 공통적인 기대는 건강한 기증자로부터 파생된 기성 형태(off-the-shelf)의 동종이계 CAR-T 세포로, 상술한 생산 및 치료 관련 문제를 효과적으로 방지하거나 해결하고 생산 비용을 크게 절감하는 것이다.
동종이계 CAR-T 세포를 제조하려면, 먼저 하나의 중대한 안전 문제, 즉 이식편대숙주병(graft-versus-host disease, GVHD)을 해결해야 한다. GVHD는 이식물 중 동종이계 반응성 T 세포가 숙주 동종이계 조직 항원을 인식하여 유도되는 수용자 정상 조직과 기관에 대한 면역 거부 반응이며, 심각할 경우 치명적일 수 있다. GVHD는 동종 T 세포 표면의 TCR(T cell receptor, T 세포 수용체)에 의해 매개된다. TCR은 모든 성숙한 T 세포 표면의 특징적인 마커이다. TCR은 비공유결합으로 세포 내에서 복수의 CD3 소단위체와 소포체(endoplasmic reticulum, ER)에서 결합하고 조립되며, 최종적으로 세포 표면에서 TCR-CD3 항원 인식 복합체의 형태로 존재한다.
일찍이 2012년, Provasi et al은 유전자 편집 기술을 이용해 동종이계 T 세포의 이식편대숙주병 문제를 해결하려는 시도를 보고하였다(Provasi E, Genovese P, Lombardo A, et al. Editing T cell specificity towards leukemia by zinc finger nucleases and lentiviral gene transfer[J]. Nature medicine, 2012, 18(5): 807). 그들은 아연-핑거 뉴클레아제(zinc-finger nucleases, ZFN)를 통해 공여자 T 세포의 TCR 유전자를 특이적으로 녹아웃시켜, TCR/CD3 복합체가 형성될 수 없도록 만들고 T 세포가 숙주 항원을 인식할 수 없게 하여 GVHD 반응을 제거하였다. 그 후 다른 여러 신규한 유전자 편집 기술, 예를 들어 TALEN(transcription activator-like effector nucleases)와 CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)도 실험실 수준에서 성공적인 보고가 있었다(Berdien B, Mock U, Atanackovic D, et al. TALEN-mediated editing of endogenous T-cell receptors facilitates efficient reprogramming of T lymphocytes by lentiviral gene transfer[J]. Gene therapy, 2014, 21(6): 539；Ren J, Zhao Y. Advancing chimeric antigen receptor T cell therapy with CRISPR/Cas9[J]. Protein & cell, 2017, 8(9): 634-643). 그러나 현재까지 동종이계 CAR-T의 임상 사례 보고는 매우 제한적이다(Qasim W, Zhan H, Samarasinghe S, et al. Molecular remission of infant B-ALL after infusion of universal TALEN gene-edited CAR T cells[J]. Science translational medicine, 2017, 9(374): eaaj2013). 유전자 편집 기반의 동종이계 CAR-T 임상 연구의 진행이 느린 주된 이유는 유전자 편집에 존재하는 안전성 위험(예를 들어, 비표적으로 인한 오류 유전자 편집), 유전자 편집으로 인한 T 세포의 체내 지속성 저하, 및 생산 제조 과정에서 장애(예를 들어, 공정 단계가 많아 T 세포에 대한 손상이 비교적 큰 문제 등) 때문일 수 있다.
비유전자 편집 기반의 동종이계 CAR-T 기술도 업계의 주목을 받고 있다. 이 기술은 1995년 보고서에서 파생된 것으로, 저자는 소포체 잔류 신호를 휴대한 특이성 항체의 세포 내 발현이 소포체 내에서 IL-2 수용체 단백질을 효과적으로 잔류시킬 수 있는 것을 발견하였다. 거의 세포 표면에 나타나지 않았으며, 유전자 편집과 유사한 기능 상실에 도달하였다(Richardson J H, Sodroski J G, Waldmann T A, et al. Phenotypic knockout of the high-affinity human interleukin 2 receptor by intracellular single-chain antibodies against the alpha subunit of the receptor[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1995, 92(8): 3137-3141). 이 기술은 최근 표면 TCR/CD3 복합체를 효과적으로 하향 조절할 수 있는 폴리펩티드 및 일반적인 규칙이 존재하는지 여부를 찾는 데에, 예를 들어 폴리펩티드에 포함된 항체가 TCR/CD3 복합체에서 어떤 단백질 또는 그 에피토프를 인식하는 데 가장 효과적인지를 찾는 데에 참고되었다. 그러나 연구 결과에 따르면, 상이한 표적의 항체, 동일한 표적의 상이한 항체 클론, 상이한 ER 잔류 신호, 상이한 링커 등 요인은 모두 이러한 항체 서열이 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 활성에 영향을 미칠 수 있다. 또한 활성이 있는 항체 서열은 상이한 공여자 T 세포에 대해 안정적인 하향 조절 활성이 부족했다(Kamiya T, Wong D, Png Y T, et al. A novel method to generate T-cell receptor-deficient chimeric antigen receptor T cells[J]. Blood advances, 2018, 2(5): 517-528；WO2019032916A1；US20180086831A1).
표면 TCR/CD3 복합체 하향 조절 또는 결실의 CAR-T 세포는 현재의 자가 CAR-T 세포 치료의 효능을 향상시킬 수도 있다. 환자의 자가 T 세포로부터 제조된 CAR-T 세포에는 환자 자신의 종양을 인식하는 TCR/CD3 복합체가 동시에 존재할 수 있으며, TCR/CD3 복합체와 CAR의 동시 활성화는 CD8+ T 세포의 고갈을 유발하는 것으로 알려져 있으며, 이는 CAR-T 세포의 치료 효과에 영향을 미친다(Yang Y, Kohler M E, Chien C D, et al. TCR engagement negatively affects CD8 but not CD4 CAR T cell expansion and leukemic clearance[J]. Science translational medicine, 2017, 9(417): eaag1209).
당업계에서는 상이한 공여자로부터의 T 세포에 대해 모두 그 표면 TCR/CD3 복합체를 고효율적으로 하향 조절할 수 있는 방법 및 세포가 시급하다. 당업계에서는 상이한 공여자로부터의 T 세포에 대해 치료용 단백질을 발현시킬 수 있을 뿐만 아니라 동시에 그 표면 TCR/CD3 복합체를 고효율적으로 하향 조절할 수 있는 방법 및 세포가 시급하다.
이를 위해, 본 발명은 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 고효율적으로 하향 조절하는 시약, 방법 및 세포를 제공한다.
본원의 제1양상은 조작된 T 세포를 제공한다. 상기 T 세포는 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드를 발현하고, 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드는 하나의 중쇄 가변 영역(VH) 및 하나의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1과 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열이고, 상기 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2와 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열이다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 VH에는 서열이 SEQ ID NO:9로 표시되는 HCDR2: INX1X2X3DVT가 포함된다. 여기에서 X1, X2 및 X3은 임의 아미노산이다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 VH에는 서열이 SEQ ID NO:15로 표시되는 HCDR3: AX4GX5X6YDYDGFVY가 포함된다. 여기에서 X4, X5 및 X6은 임의 아미노산이다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 VL에는 서열이 SEQ ID NO:22로 표시되는 LCDR3: QQWX7X8X9X10X11T가 포함된다. 여기에서 X7，X8, X9, X10 및 X11은 임의 아미노산이다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, X1은 프롤린, 트레오닌, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, X2는 티로신, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 시스테인, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린 또는 메티오닌이다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, X3은 아스파라긴, 글리신, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘이다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, X4는 아르기닌, 라이신 또는 히스티딘이다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, X5는 세린, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, X6은 티로신, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 시스테인, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 메티오닌, 라이신, 아르기닌, 아스파르트산 또는 글루탐산이다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, X7은 세린, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 히스티딘, 라이신 또는 아르기닌이다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, X8은 세린, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, X9는 아스파라긴, 글리신, 글루타민, 트레오닌, 티로신, 시스테인 또는 세린이다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, X10은 프롤린, 알라닌, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, X11은 류신, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 티로신, 시스테인, 알라닌, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, LCDR3은 SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34로부터 선택된다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, HCDR2는 SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14로부터 선택된다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, HCDR3은 SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21로부터 선택된다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 (1) SEQ ID NO:42, (2) 상기 HCDR2 및/또는 HCDR3을 함유한 SEQ ID NO:42 변이체, (3) (1) 또는 (2)와 95% 이상의 상동성을 갖는 서열로부터 선택되고, 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 (1) SEQ ID NO:43, (2) 상기 LCDR3의 SEQ ID NO:43 변이체, (3) (1) 또는 (2)와 95% 이상의 상동성을 갖는 서열로부터 선택된다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, HCDR2, HCDR3, LCDR3은 본원에 설명된 바와 같다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 폴리펩티드는 단일쇄 항체이다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드는 위치결정 서열 및 임의 선택된 신호 펩티드를 포함한다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 위치결정 서열은 소포체 잔류 서열, 골지체 잔류 서열, E3 유비퀴틴 연결효소 결합 서열, 프로테아좀 위치결정 서열 또는 리소좀 위치결정 서열로부터 선택되고, 상기 소포체 잔류 서열은 SEQ ID NO:35 내지 40 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성된다. 여기에서 X는 임의 아미노산이다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 위치결정 서열과 항체 사이에는 링커가 포함된다. 상기 링커는 SEQ ID NO:41로 표시된다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 신호 펩티드는 SEQ ID NO:44의 516 내지 537번째로 표시된다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 T 세포는 치료용 단백질을 더 발현한다. 바람직하게는 치료용 단백질은 키메라 항원 수용체이다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 T 세포는 상기 치료용 단백질의 발현 카세트 및 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 발현 카세트를 함유한다. 또는 상기 치료용 단백질의 코딩 서열 및 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 코딩 서열이 동일한 발현 카세트 내에 위치한다.
상기 치료용 단백질의 코딩 서열 및 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 코딩 서열이 동일한 발현 카세트 내에 위치한 실시방식에 있어서, 치료용 단백질의 코딩 서열과 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 코딩 서열 사이에는 연결 서열이 포함된다. 상기 연결 서열은 단일 백터 상에서 복수의 시스트론 발현을 가능하게 한다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 연결 서열은 2A 펩티드의 코딩 서열이다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 2A 펩티드는 F2A, P2A 또는 T2A 펩티드를 포함한다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체는 N 말단으로부터 C 말단까지 항종양 항원의 단일쇄 항체, 힌지 영역, 막횡단 영역 및 세포내 영역을 포함한다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체는 EGFRvIII, 메소텔린(mesothelin), GD2, Tn 항원, sTn 항원, Tn-O-글리코펩티드, sTn-O-글리코펩티드, PSMA, CD97, TAG72, CD44v6, CEA, EPCAM, KIT, IL-13Ra2, leguman, GD3, CD171, IL-11Ra, PSCA, MAD-CT-1, MAD-CT-2, VEGFR2, LewisY, CD24, PDGFR-β, SSEA-4, 엽산 수용체 α, ERBB, Her2/neu, MUC1, EGFR, NCAM, 에프린(ephrin) B2, CAIX, LMP2, sLe, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 엽산 수용체 β, TEM1/CD248, TEM7R, FAP, 레구메인(legumain), HPV E6 또는 E7, ML-IAP, CLDN6, TSHR, GPRC5D, ALK, 폴리시알산(polysialic acid), Fos-관련 항원, 호중구 엘라스타아제(neutrophil elastase), TRP-2, CYP1B1, 정자 단백질 17, β 인간 융모성 고나도트로핀(human chorionic gonadotropin), AFP, 티로글로불린, PLAC1, globoH, RAGE1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사 효소, 장 카르복실 에스테라제(intestinal carboxyl esterase), mut hsp 70-2, NA-17, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, NY-ESO-1, GPR20, Ly6k, OR51E2, TARP, GFRα4와 MHC 상에 제시된 이러한 항원 중 어느 하나의 폴리펩티드 단편, 및 CD5, CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD27, CD30, CD34, CD37, CD38, CD40, CD53, CD69, CD72, CD73, CD74, CD75, CD77, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85, CD86, CD123, CD135, CD138, CD179, CD269, Flt3, ROR1, BCMA, FcRn5, FcRn2, CS-1, CXCR4, CXCR5, CXCR7, IL-7/3R, IL7/4/3R 및 IL4R 종양 항원으로부터 선택된 하나 이상과 특이적으로 결합한다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 힌지 영역은 CD8α 힌지 영역, IgG1 Fc CH2CH3 힌지 영역, IgD 힌지 영역, CD28 세포외 힌지 영역, IgG4 Fc CH2CH3 힌지 영역 및 CD4 세포외 힌지 영역으로부터 선택될 수 있다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 막횡단 영역은 CD28 막횡단 영역, CD8 막횡단 영역, CD3ζ 막횡단 영역, CD134 막횡단 영역, CD137 막횡단 영역, ICOS 막횡단 영역 및 DAP10 막횡단 영역 중 하나 이상으로부터 선택된다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 세포내 영역은 CD28, CD134/OX40, CD137/4-1BB, LCK, ICOS, DAP10, CD3ζ 및 Fc310 중 하나 이상의 세포내 영역으로부터 선택된다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 키메라 항원 수용체는 신호 펩티드를 포함한다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 항종양 항원의 단일쇄 항체은 항CD19 단일쇄 항체이다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 힌지 영역은 CD8α 힌지 영역이다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 막횡단 영역은 CD8 막횡단 영역이다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 세포내 영역은 4-1BB 세포내 영역과 인간 CD3ζ 세포내 영역을 포함한다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 항CD19 단일쇄 항체의 경쇄 가변 영역 서열은 SEQ ID NO:44의 23 내지 129번째 아미노산을 포함하거나 이로 구성된다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 항CD19 단일쇄 항체의 중쇄 가변 영역 서열은 SEQ ID NO:44의 148 내지 267번째 아미노산을 포함하거나 이로 구성된다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 힌지 영역의 서열은 SEQ ID NO:44의 268 내지 312번째 아미노산을 포함하거나 이로 구성된다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 막횡단 영역의 서열은 SEQ ID NO:44의 313 내지 336번째 아미노산을 포함하거나 이로 구성된다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 4-1BB 세포내 영역은 SEQ ID NO:44의 337 내지 378번째 아미노산을 포함하거나 이로 구성된다. CD3ζ 세포내 영역은 SEQ ID NO:44의 379 내지 490번째 아미노산을 포함하거나 이로 구성된다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 키메라 항원 수용체의 신호 펩티드는 SEQ ID NO:44의 1 내지 22번째 아미노산 잔기를 포함하거나 이로 구성된다.
본 발명의 제2 양상은 조작된 T 세포를 제공한다. 상기 T 세포는 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드를 발현하는 것을 특징으로 한다. 상기 폴리펩티드는 항체나 그 항원 결합 단편, 또는 상기 항체나 그 항원 결합 단편과 적어도 90%의 서열 상동성을 가지며 상기 항체나 항원 결합 단편의 항원 결합 활성을 유지하는 돌연변이체를 포함한다. 여기에서 상기 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함한다.
상기 중쇄 가변 영역은, SEQ ID NO:3으로 표시되는 HCDR1: GYKFTSYV，SEQ ID NO:9로 표시되는 HCDR2: INX1X2X3DVT - 여기에서 X1, X2 및 X3은 임의 아미노산임 - , SEQ ID NO:15로 표시되는 HCDR3: AX4GX5X6YDYDGFVY - 여기에서 X4,X5 및 X6은 임의 아미노산임 - 의 HCDR을 갖는다.
상기 경쇄 가변 영역은,
SEQ ID NO:6으로 표시되는 LCDR1: SSVSY, SEQ ID NO:7로 표시되는 LCDR2: DTS, SEQ ID NO:22로 표시되는 LCDR3: QQWX7X8X9X10X11T - 여기에서 X7, X8, X9, X10 및 X11은 임의 아미노산임 - 의 LCDR를 갖는다.
바람직하게는, X1 내지 X11은 본원에 설명된 바와 같다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, LCDR3은 SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34로부터 선택된다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, HCDR2는 SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14로부터 선택된다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, HCDR3은 SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21로부터 선택된다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 (1) SEQ ID NO:42, (2) 상기 HCDR2 및/또는 HCDR3을 함유한 SEQ ID NO:42 변이체, (3) (1) 또는 (2)와 95% 이상의 상동성을 갖는 서열로부터 선택되고, 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 (1) SEQ ID NO:43, (2) 상기 LCDR3의 SEQ ID NO:43 변이체, (3) (1) 또는 (2)와 95% 이상의 상동성을 갖는 서열로부터 선택된다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 항체는 단일쇄 항체이다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드는 위치결정 서열 및 임의 선택된 신호 펩티드를 포함한다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 위치결정 서열은 소포체 잔류 서열, 골지체 잔류 서열, E3 유비퀴틴 연결효소 결합 서열, 프로테아좀 위치결정 서열 또는 리소좀 위치결정 서열로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 소포체 잔류 서열은 SEQ ID NO:35 내지 40 중 어느 하나를 포함하거나 이로 구성된다. 여기에서 X는 임의 아미노산이다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 위치결정 서열과 항체 사이에는 링커가 포함된다. 바람직하게는 상기 링커는 SEQ ID NO:41로 표시된다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 신호 펩티드는 SEQ ID NO:44의 516 내지 537번째로 표시된다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 T 세포는 치료용 단백질을 더 발현한다. 바람직하게는 상기 치료용 단백질은 키메라 항원 수용체이다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 T 세포는 상기 치료용 단백질의 발현 카세트 및 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 발현 카세트를 함유한다. 또는 상기 치료용 단백질의 코딩 서열 및 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 코딩 서열이 동일한 발현 카세트 내에 위치한다.
본 발명의 제3양상은 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 더 제공한다. 상기 항체의 HCDR1의 아미노산 서열은 GYKFTSYV이고, HCDR2의 아미노산 서열은 INX1X2X3DVT이고, HCDR3의 아미노산 서열은 AX4GX5X6YDYDGFVY이고, LCDR1의 아미노산 서열은 SSVSY이고, LCDR2의 아미노산 서열은 DTS이고, LCDR3의 아미노산 서열은 QQWX7X8X9X10X11T인 것을 특징으로 한다. 여기에서 X1 내지 X11는 제10항과 같고, HCDR2는 INPYNDVT가 아니고, HCDR3은 ARGSYYDYDGFVY가 아니고, LCDR3은 QQWSSNPLT가 아니다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, LCDR3은 SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34로부터 선택된다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, HCDR2는 SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14로부터 선택된다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, HCDR3은 SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21 로부터 선택된다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:42로 표시된다. 그러나 이의 HCDR2 및/또는 HCDR3의 서열은 본원의 제2 양상에 설명된 바와 같다. 상기 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:43으로 표시된다. 그러나 이의 LCDR3의 서열은 본원의 제2 양상에 설명된 바와 같다. 바람직하게는, HCDR2는 SEQ ID NO:9로 표시되며 INX1X2X3DVT 이고, 여기에서 X1，X2 및 X3은 임의 아미노산이다. HCDR3은 SEQ ID NO:15로 표시되며 AX4GX5X6YDYDGFVY 이고, 여기에서 X4，X5 및 X6은 임의 아미노산이다. LCDR 3은 SEQ ID NO:22로 표시되며 QQWX7X8X9X10X11T 이고, 여기에서 X7，X8，X9，X10 및 X11은 임의 아미노산이다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, X1 내지 X11은 본원에 설명된 바와 같다. 보다 바람직하게는 LCDR3은 SEQ ID NO:23, SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26, SEQ ID NO:27, SEQ ID NO:28, SEQ ID NO:29, SEQ ID NO:30, SEQ ID NO:31, SEQ ID NO:32, SEQ ID NO:33 및 SEQ ID NO:34로부터 선택된다. 보다 바람직하게는 HCDR2는 SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13 및 SEQ ID NO:14로부터 선택된다. 보다 바람직하게는 HCDR3은 SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 및 SEQ ID NO:21로부터 선택된다.
본 발명은 융합 단백질을 더 제공한다. 여기에는 위치결정 서열, 본원에 따른 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드 및 임의 선택된 신호 펩티드가 포함된다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 신호 펩티드는 SEQ ID NO:44의 516 내지 537번째로 표시된다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 위치결정 서열과 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드 사이에는 링커가 포함된다. 상기 링커는 바람직하게는 SEQ ID NO:41로 표시된다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 융합 단백질은 SEQ ID NO:44의 516 내지 804번째 또는 538 내지 804번째로 표시된다.
본 발명의 다른 일 양상은 핵산 분자를 제공한다. 이는 (1) 치료용 단백질의 코딩 서열 및 본원에 따른 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 코딩 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드; (2) 본원에 따른 융합 단백질의 코딩 서열; (3) 본원에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 코딩 서열; 및 (4) (1) 또는 (2) 또는 (3)의 상호적 서열 또는 단편으로부터 선택된다. 바람직하게는, 상기 치료용 단백질은 키메라 항원 수용체이다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 치료용 단백질의 코딩 서열 및 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 코딩 서열 사이에는 연결 서열이 포함된다. 상기 연결 서열은 단일 벡터 상에서 복수의 시스트론을 발현할 수 있도록 한다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 연결 서열은 2A 펩티드의 코딩 서열이다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 2A 펩티드는 F2A, P2A 또는 T2A 펩티드를 포함한다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 치료용 단백질 및 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 특징은 본원에 설명된 바와 같다.
본 발명의 다른 일 양상은 핵산 작제물을 제공한다. 상기 핵산 작제물은 본원에 따른 핵산 분자를 포함한다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 핵산 작제물은 상기 치료용 단백질의 발현 카세트 및 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 발현 카세트를 포함하거나, 또는 상기 핵산 작제물은 하나의 발현 카세트이다. 여기에서 상기 치료용 단백질의 코딩 서열 및 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 코딩 서열은 상기 발현 카세트 내에 위치한다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 핵산 작제물은 클로닝 벡터 또는 발현 벡터이다.
본 발명의 다른 일 양상은 렌티바이러스를 제공한다. 상기 렌티바이러스는 본원에 따른 핵산 분자, 핵산 작제물을 함유한다.
본 발명의 다른 일 양상은 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포는 본원에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 본원에 따른 융합 단백질의 임의 선택된 치료용 단백질을 포함, 발현 및/또는 분비한다. 상기 숙주 세포는 본원에 따른 핵산 분자, 핵산 작제물 및/또는 렌티바이러스를 포함한다.
본 발명의 다른 일 양상은 약학 조성물을 제공한다. 여기에는 본원에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 융합 단백질 및 임의 선택된 치료용 단백질, 핵산 분자, 핵산 작제물, 렌티바이러스 또는 세포가 함유된다.
본 발명의 다른 일 양상은 세포 표면 TCR 하향 조절의 T 세포 제조, 또는 암 치료용 T 세포 제조에서 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드 또는 이의 코딩 서열, 본원에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 융합 단백질 및 임의 선택된 치료용 단백질, 핵산 분자, 핵산 작제물, 렌티바이러스의 응용을 제공한다. 바람직하게는, 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드는 본원에 설명된 바와 같다.
도 1은 상이한 항체 서열을 함유한 폴리펩티드의 CAR-T 세포 표면 TCR 및 CD3 단백질 수준에 대한 영향을 도시한 것이다.
도 2는 상이한 항체 서열을 함유한 폴리펩티드의 CAR-T 세포 표면 TCR 및 CD3 단백질 수준에 대한 영향을 도시한 것이다.
도 3은 CTAB5 항체 서열을 포함한 폴리펩티드의 상이한 공여자 유래의 CAR-T 세포 표면 TCR 및 CD3 단백질 수준에 대한 영향을 도시한 것이다.
도 4는 CTAB5항체 서열을 포함한 폴리펩티드가 독립 발현될 때 T 세포 표면의 TCR 및 CD3 단백질 수준이 하향 조절되는 것을 도시한 것이다.
도 5a 내지 5g는 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드와 키메라 항원 수용체 공발현 하에서의 T 세포 하위집단 비율을 도시한 것이다.
도 6은 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드와 키메라 항원 수용체 공발현 하에서의 T 세포의 체외 확장을 도시한 것이다.
도 7은 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드와 키메라 항원 수용체 공발현 하에서의 T 세포의 세포 독성 활성을 도시한 것이다.
도 8은 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드와 키메라 항원 수용체 공발현 하에서의 T 세포의 IFN-γ 분비 능력을 도시한 것이다.
도 9는 점 돌연변이 폴리펩티드를 함유한 세포 라이브러리의 표면 마커 분포 및 세포 분비 시 사용되는 게이팅을 도시한 것이다.
도 10은 예시적 점 돌연변이 폴리펩티드가 CAR-T 세포 표면 TCR 및 CD3의 활성을 하향 조절하는 것을 도시한 것이다.
도 11은 예시적 점 돌연변이 폴리펩티드의 발현이 CAR-T 세포의 체외 확장을 강화시키는 것을 도시한 것이다.
도 12는 예시적 점 돌연변이 폴리펩티드의 발현이 CAR-T 세포의 세포 독성 활성에 영향을 미치지 않는 것을 도시한 것이다.
본 발명의 범위 내에서 본 발명의 상기 기술적 특징 및 하기(예를 들어 실시예)에서 구체적으로 설명하는 기술적 특징은 서로 결합되어 바람직한 기술적 특징을 구성할 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명은 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드를 발현함으로써, 세포 표면 TCR/CD3 복합체 발현이 하향 조절되는 조작된 T 세포를 제조한다. 본 발명의 방법을 채택해 제조하여 수득한 T 세포에 있어서, 상기 폴리펩티드를 발현하지 않은 대조군에 비해, TCR/CD3 복합체의 세포 표면에서의 발현 수준은 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 90%, 보다 바람직하게는 적어도 99% 또는 완전히 억제된다.
본원에서 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드는 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함한다. "항체"는 이러한 폴리펩티드를 의미하며, 여기에는 이를 표적 항원과 특이적으로 결합시키기에 충분한 면역 글로불린 서열 요소가 포함된다. 당업계에 공지된 바와 같이, 천연의 완전 항체는 사량체이며, 여기에는 2개의 동일한 중쇄 폴리펩티드와 2개의 동일한 경쇄 폴리펩티드가 포함된다. 각 중쇄는 아미노 말단의 가변 도메인 VH, 불변 도메인 CH1, 불변 도메인 CH2, 및 카르복시 말단의 불변 도메인 CH3의 적어도 4개 도메인을 포함한다. 각 경쇄는 아미노 말단의 가변 도메인 VL 및 카르복시 말단 불변 도메인 CL의 2개 도메인을 포함한다. 각 가변 도메인은 CDR1, CDR2 및 CDR3의 3개 "상보성 결정 영역", 및 FR1, FR2, FR3 및 FR4의 4개의 "프레임워크" 영역을 포함한다. "항원 결합 단편"은 항체 중 표적 항원과 특이적으로 결합할 수 있는 단편을 의미한다. 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Fab 단편, Fab' 단편, F(ab')2 단면, Fd' 단편, Fd 단편, Fv 단편, 이황화 결합의 Fv 단편, 단일쇄 항체(scFv), 분리된 CDR 또는 CDR군, 폴리펩티드-Fc 융합체, 단일 도메인 항체, 낙타류 항체, 차폐 항체, 소형 모듈 면역 약물, 이기능성 항체, 나노 항체, Humabody 항체를 포함한다. 단일쇄 항체는 항체 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역에서 짧은 펩티드(linker) 연결을 통해 형성된 항체이다.
바람직한 실시방식에 있어서, 본 발명의 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드는 TCR/CD3에 특이적으로 결합하는 항 TCR/CD3 항체이며, 보다 바람직하게는 항 TCR/CD3의 단일쇄 항체(scfv)이다. 본원의 항TCR 단일쇄 항체는 TCR1 및/또는 TCR2에 특이적으로 결합된다. 바람직하게는, 본원의 항TCR 단일쇄 항체는 모든 공지된 또는 미지의 TCR에 특이적으로 결합한다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, 항 TCR/CD3 항체는 UCHT1、OKT3、CTAB5、CTAB2、CTAB3또는 CTAB4로부터 선택된다. 바람직하게는 항 TCR/CD3 단일쇄 항체는 이러한 항 TCR/CD3 항체로부터 파생된다. 예시적으로, UCHT1 scfv의 VL 및 VH 서열은 각각 SEQ ID NO:45 및 46을 포함하거나 이로 구성된다. OKT3 scfv의 VL 및 VH 서열은 각각 SEQ ID NO:47 및 48을 포함하거나 이로 구성된다. 바람직한 실시방식에 있어서, 항TCR단일쇄 항체는 CTAB5로부터 유래된다.
바람직한 실시방식에 있어서, 상기 항TCR 항체의 중쇄 가변 영역은, SEQ ID NO:3으로 표시되는 HCDR1: GYKFTSYV, SEQ ID NO:9로 표시되는 HCDR 2: INX1X2X3DVT - 여기에서 X1, X2 및 X3은 임의 아미노산임 - , SEQ ID NO:15로 표시되는 HCDR3: AX4GX5X6YDYDGFVY - 여기에서 X4, X5 및 X6은 임의 아미노산임 - 의 HCDR을 갖는다. 상기 경쇄 가변 영역은, SEQ ID NO:6으로 표시되는 LCDR1: SSVSY, SEQ ID NO:7로 표시되는 LCDR2: DTS, SEQ ID NO:22로 표시되는 LCDR3: QQWX7X8X9X10X11T - 여기에서 X7, X8, X9, X10 및 X11은 임의 아미노산임 - 의 LCDR을 갖는다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, X1은 프롤린, 트레오닌, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, X2는 티로신, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 시스테인, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린 또는 메티오닌이다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, X3은 아스파라긴, 글리신, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘이다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, X4는 아르기닌, 라이신 또는 히스티딘이다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, X5는 세린, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, X6은 티로신, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 시스테인, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 메티오닌, 라이신, 아르기닌, 아스파르트산 또는 글루탐산이다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, X7은 세린, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 히스티딘, 라이신 또는 아르기닌이다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, X8은 세린, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, X9는 아스파라긴, 글리신, 글루타민, 트레오닌, 티로신, 시스테인 또는 세린이다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, X10은 프롤린, 알라닌, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, X11은 류신, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 티로신, 시스테인, 알라닌, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이다.
바람직하게는 LCDR3은 SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34로부터 선택된다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, HCDR2는 SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14로부터 선택된다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, HCDR3은 SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21로부터 선택된다.
일부 실시방식에 있어서, 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 중쇄 가변 영역 서열은 SEQ ID NO:42로 표시되는 서열을 포함하거나, SEQ ID NO:3으로 표시되는 HCDR1: GYKFTSYV, SEQ ID NO:9로 표시되는 HCDR2: INX1X2X3DVT - 여기에서 X1, X2 및 X3은 임의 아미노산임 - , SEQ ID NO:15로 표시되는 HCDR3: AX4GX5X6YDYDGFVY - 여기에서 X4, X5 및 X6은 임의 아미노산임 - 와 같은 HCDR의 SEQ ID NO:42의 변이체를 포함하거나, 이로 구성된다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, X1은 프롤린, 트레오닌, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, X2는 티로신, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 시스테인, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린 또는 메티오닌이다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, X3은 아스파라긴, 글리신, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘이다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, X4는 아르기닌, 라이신 또는 히스티딘이다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, X5는 세린, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, X6은 티로신, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 시스테인, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 메티오닌, 라이신, 아르기닌, 아스파르트산 또는 글루탐산이다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 경쇄 가변 영역 서열은 SEQ ID NO:43으로 표시되는 서열을 포함하거나, SEQ ID NO:6으로 표시되는 LCDR1: SSVSY, SEQ ID NO:7로 표시되는 LCDR2: DTS, SEQ ID NO:22로 표시되는 LCDR3: QQWX7X8X9X10X11T - 여기에서 X7, X8, X9, X10 및 X11은 임의 아미노산임 - 와 같은 LCDR의 SEQ ID NO:43의 변이체를 포함하거나, 이로 구성된다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, X7은 세린, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 히스티딘, 라이신 또는 아르기닌이다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, X8은 세린, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, X9는 아스파라긴, 글리신, 글루타민, 트레오닌, 티로신, 시스테인 또는 세린이다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, X10은 프롤린, 알라닌, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, X11은 류신, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 티로신, 시스테인, 알라닌, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이다.
일부 실시방식에 있어서, 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 중쇄 가변 영역 서열은 SEQ ID NO:42로 표시되는 서열을 포함하나, 여기에서 HCDR2는 SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14로부터 선택되고, 및/또는 HCDR3 SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21로부터 선택된다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 경쇄 가변 영역 서열은 SEQ ID NO:43으로 표시되는 서열을 포함하나, 여기에서 LCDR3은 SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34로부터 선택된다.
본원에서 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역 사이는 직접 연결되거나, 당업계에 공지된 링커 서열을 통해 연결할 수 있다. 예를 들어 전술한 바와 같은 G와 S를 함유한 링커 서열이 있다.
본 발명에서 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드는 상기 항체(특히, 본원에 따른 항TCR 항체) 또는 이의 항원 결합 단편과 70% 서열 상동성을 가지며 상기 항체 또는 항원 결합 단편의 항원 결합 활성을 유지하는 돌연변이체도 포함한다. 상기 돌연변이체는, 참조 서열과 적어도 70%, 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 85%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 바람직하게는 적어도 97% 서열 상동성을 가지며 참조 서열의 생물학적 활성(예를 들어 T 세포 활성화, TCR 결합)을 유지하는 아미노산 서열을 포함한다. 예를 들어 NCBI의 BLASTp를 채택하여 2개의 비교하는 서열 사이의 서열 상동성을 계산할 수 있다. 돌연변이체는 상기 아미노산 서열에서 하나 이상의 돌연변이(삽입, 결실 또는 치환)를 갖는 동시에 해당 참조 서열의 생물학적 활성을 유지하는 아미노산 서열에 더 포함된다. 상기 복수의 돌연변이는 통상적으로 1 내지 50개 이내를 의미하며, 예를 들어, 1 내지 20, 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 5 또는 1 내지 3개이다. 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. scFv의 경우, 돌연변이는 CDR 영역 내(전술한 CDR 영역 내의 돌연변이 포함)에서 발생할 수 있으며, FR 영역 내에서 발생할 수도 있다. 이는 돌연변이 후 참조 서열의 생물학적 활성이 유지되기만 하면 된다. 예를 들어, 당업계에서 성능이 유사하거나 비슷한 아미노산을 이용해 보존적 치환을 수행할 때, 통상적으로 단백질 또는 폴리펩티드의 기능은 바뀌지 않는다. "성능이 유사하거나 비슷한 아미노산"은 예를 들어, 유사 측쇄를 가진 아미노산 잔기의 패밀리를 포함한다. 이러한 패밀리에는 염기성 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어 라이신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어 아스파르트산, 글루탐산), 비하전 극성 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판),β-분지측쇄를 쇄를 가진 아미노산(예를 들어 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄를 가진 아미노산(예를 들어 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)이 포함된다. 따라서 본 발명의 폴리펩티드에서 동일 측쇄류의 다른 아미노산 잔기를 이용해 하나 이상의 부위를 치환하면, 실질적으로 그 활성에 영향을 미치지 않는다. 일부 실시방식에 있어서, 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드는 융합 단백질이며, 폴리펩티드를 하위 세포 구조에 안내할 수 있는 위치결정 서열을 더 포함한다. 상기 위치결정 서열은 폴리펩티드의 N 말단 또는 C 말단에 위치할 수 있다. 상기 하위 세포 구조는 골지체 또는 소포체, 리소좀, 세포막 또는 리소좀을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 위치결정 서열은 소포체 잔류 서열, 골지체 잔류 서열, E3 유비퀴틴 연결효소 결합 서열, 프로테아좀 위치결정 서열 또는 리소좀 위치결정 서열을 포함한다. 위치결정 서열과 이의 인접한 폴리펩티드는 직접 연결되거나, 당업계에 공지된 링커 서열을 통해 연결될 수 있다. 예를 들어 전술한 G와 S를 함유한 링커 서열이 있다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, 위치결정 서열과 이의 인접한 폴리펩티드(예를 들어, 항체 또는 이의 항원 결합 단편) 사이에는 서열 SEQ ID NO:41을 갖는다.
본원에서 "소포체 잔류 서열" 또는 "소포체 잔류 신호"는 일종의 짧은 펩티드 신호 서열이다. 소포체 잔류 서열은 골지체의 막 상에 상응하는 수용체가 있으며, 소포 회류를 통해 소포체로 회수될 수 있다. 본 발명에 적용되는 소포체 잔류 서열은 당업계에 공지된 소포체 잔류 서열일 수 있다. 소포체 잔류 서열은 인접 폴리펩티드의 C 말단에 위치할 수 있다. 상기 "소포체 잔류 서열" 또는 "골지체 잔류 서열"은 AEKDEL(SEQ ID NO:35), KDEL(SEQ ID NO:36), KKXX(SEQ ID NO:37), KXD(SEQ ID NO:38), KXE(SEQ ID NO:39) 또는 YQRL(SEQ ID NO:40)를 포함하거나 이로 구성되나 이에 한정되지 않는다. 여기에서 X는 임의 아미노산이다. 프로테아좀 위치결정 서열은 항체 서열을 통해 E3 유비퀴틴 연결효소 함유 표적 도메인 서열에 연결되며 E3 유비퀴틴 연결효소 단백질의 핵산 서열을 공발현시켜 구현한다. E3 유비퀴틴 연결효소 단백질은 고친화력으로 항체의 Fc 도메인에 결합하며, 유비퀴틴-단백질 복합체를 모집하여 항체와 결합하는 분자(예를 들어, 단백질와 펩티드)를 분해할 수 있다. E3 유비퀴틴 연결효소 단백질 표적 도메인 서열은 인간 면역글로불린 G(IgG) 불변 영역(Fc) 유전자(예를 들어 IgG1, IgG2 또는 IgG4)로부터 선택된 아미노산 서열을 코딩하고, 항체와 Fc 도메인을 포함한 융합 단백질을 형성하는 데 사용된다. 상기 "프로테아좀 위치결정 서열"은 PEST 모티프를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 "리소좀 위치결정 서열"은 KFERQ를 포함하나 이에 한정되지 않는다.
세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드는 신호 펩티드를 더 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 막단백질 신호 펩티드일 수 있으며, 예를 들어 항체 중쇄의 신호 펩티드, 항체 경쇄의 신호 펩티드, CD8 신호 펩티드, CD28 신호 펩티드 및 CD4 신호 펩티드가 있다. 예시적인 신호 펩티드 아미노산 서열은 SEQ ID NO:44의 516 내지 537번째 아미노산 잔기를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
상기 조작된 T 세포에서 치료용 폴리펩티드를 더 발현시킬 수 있다. 동종이계의 치료에 있어서, 이러한 T 세포는 이식편대숙주병을 효과적으로 방지한다. 자가 재주입의 치료에 있어서, 본 발명의 방법에 의해 제조된 T 세포는 TCR/CD3 복합체와 CAR의 동시 활성화로 인한 CD8+ T 세포 고갈을 방지함으로써 치료 효과를 향상시킨다.
본원에 언급된 "치료용 단백질" 또는 "치료용 폴리펩티드"는 세포(특히, T 세포)에서 발현된 후 상응하는 치료 활성을 나타내는 분자를 지칭한다. 이는 자연적이거나 자연 환경으로부터 분리된 물질이거나 제조된 물질일 수 있다. 이는 바이러스, 박테리아, 식물, 동물의 단백질 또는 폴리펩티드, 소분자 활성 펩티드, 항원 또는 이의 단편(예를 들어, 항원 에피토프, 항원 결정기), 항체 또는 이의 단편(예를 들어, 중쇄, 경쇄, Fab, Fv, scFv), 항원 수용체(예를 들어, 키메라 항원 수용체 CAR), 융합 단백질 또는 폴리펩티드 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
따라서 본 발명은 CAR-T 세포를 더 제공하며, 여기에는 관심 종양 항원을 표적화하는 키메라 항원 수용체(CAR) 및 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드가 포함된다. 본 발명은 CAR-T 세포를 더 제공하며, 여기에는 관심 종양 항원을 표적화하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 폴리뉴클레오티드가 포함된다.
본원에서 적합한 T 세포는 당업계에 공지된 다양한 T 세포일 수 있다. 특히 세포 면역요법에 일상적으로 사용되는 다양한 T 세포일 수 있다. 여기에는 말초 혈액 T 림프구, 세포 독성 살해 T 세포, 보조 T 세포, 억제/조절성 T 세포, γδ T 세포, 사이토카인 유도의 살해 세포와 종양 침윤 림프구 등, 및 상기 세포 중 어느 하나 이상의 혼합물이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 본원에서 CAR-T 세포는 적어도 키메라 항원 수용체를 발현하는 T 세포를 의미한다.
본원에서 키메라 항원 수용체는 당업계에 잘 알려진 의미로 일종의 인공적으로 변형된 수용체이다. 이는 종양 세포 표면 항원을 인식하는 특이적 분자(예를 들어 항체)를 면역 세포(예를 들어 T 세포) 상에 고정시켜 면역 세포가 종양 항원을 인식하고 종양 세포를 살해할 수 있다. 본원에 사용하기에 적합한 키메라 항원 수용체는 당업계에 공지된 다양한 CAR일 수 있다. 통상적으로, CAR은 종양 항원에 결합되는 폴리펩티드, 힌지 영역, 막횡단 영역 및 하나 이상의 세포내 신호 영역을 포함한다.
종양 항원에 결합하는 데 적용되는 폴리펩티드는 천연 폴리펩티드 또는 인공 합성 폴리펩티드일 수 있으며, 바람직하게는 인공 합성 폴리펩티드는 단일쇄 항체 또는 Fab 단편이다. 본원에 언급된 "종양 항원" 또는 "종양 표면 항원"은 종양 세포 표면에 발현된 종양 특이적 항원 및 종양 관련 항원을 포함한다. 종양 특이적 항원은 종양 세포 표면에 특이적으로 발현되며, 정상 조직에서 발현되지 않는다. 종양 관련 항원은 종양 세포 표면에서 과도하게 발현되며, 정상 조직에서는 저조하게 발현된다. 종양 관련 항원은 CD19와 같은 면역 세포의 표면 항원, 성장과 분화 신호에 관여하는 항원, 종양 혈관 성장에 관여하는 항원, 및 종양 지지 구조의 종양 기질과 세포외 기질 항원을 포함한다.
본원에서 관심 종양 항원에는 고형 종양 항원, 골수성 종양 항원, 및 비B세포 계통 혈액 종양의 항원이 포함되나 이에 한정되지 않는다. 적합한 고형 종양 항원에는 EGFRvIII, 메소텔린(mesothelin), GD2, Tn 항원, sTn 항원, Tn-O-글리코펩티드, sTn-O-글리코펩티드, PSMA, CD97, TAG72, CD44v6, CEA, EPCAM, KIT, IL-13Ra2, leguman, GD3, CD171, IL-11Ra, PSCA, MAD-CT-1, MAD-CT-2, VEGFR2, LewisY, CD24, PDGFR-β, SSEA-4, 엽산 수용체 α, ERBB(예를 들어 ERBB2), Her2/neu, MUC1, EGFR, NCAM, 에프린(ephrin) B2, CAIX, LMP2, sLe, HMWMAA, o-아세틸-GD2, 엽산 수용체 β, TEM1/CD248, TEM7R, FAP, 레구메인(legumain), HPV E6 또는 E7, ML-IAP, CLDN6, TSHR, GPRC5D, ALK, 폴리시알산(polysialic acid), Fos-관련 항원, 호중구 엘라스타아제(neutrophil elastase), TRP-2, CYP1B1, 정자 단백질 17, β 인간 융모성 고나도트로핀(human chorionic gonadotropin), AFP, 티로글로불린, PLAC1, globoH, RAGE1, MN-CA IX, 인간 텔로머라제 역전사 효소, 장 카르복실 에스테라제(intestinal carboxyl esterase), mut hsp 70-2, NA-17, NY-BR-1, UPK2, HAVCR1, ADRB3, PANX3, NY-ESO-1, GPR20, Ly6k, OR51E2, TARP, GFRα4와 MHC 상에 제시된 이러한 항원 중 어느 하나의 폴리펩티드 단편이 포함되나 이에 한정되지 않는다.적합한 B세포 항원에는 CD5, CD10, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD27, CD30, CD34, CD37, CD38, CD40, CD53, CD69, CD72, CD73, CD74, CD75, CD77, CD79a, CD79b, CD80, CD81, CD82, CD83, CD84, CD85, CD86, CD123, CD135, CD138, CD179, CD269, Flt3, ROR1, BCMA, FcRn5, FcRn2, CS-1, CXCR4, CXCR5, CXCR7, IL-7/3R, IL7/4/3R 및 IL4R이 포함되나 이에 한정되지 않는다.
바람직한 실시방식에 있어서, 본 발명의 종양 항원에 결합하는 폴리펩티드는 상기 어느 하나의 종양 항원의 단일쇄 항체와 특이적으로 결합한다. 본원에서 단일쇄 항체(scFv)는 항체 경쇄 가변영역(VL 영역) 아미노산 서열과 중쇄 가변영역(VH 영역) 아미노산 서열이 힌지 연결되어 형성되는 것으로 항원에 결합하는 능력을 갖는 항체 단편을 의미한다. 관심 단일쇄 항체는 관심 항체로부터 유래될 수 있다. 관심 항체는 인간-마우스 키메라 항체 및 인간화 항체를 포함하는 인간 항체일 수 있다. 항체는 분비형 또는 막 고정형일 수 있으며, 바람직하게는 막 고정형이다. 본원에서 특이적 결합은 항체 또는 그 항원 결합 단편과 그에 대한 항원 간의 반응을 의미한다. 일부 실시방식에 있어서, 특정 항원에 특이적으로 결합하는 항체(또는 특정 항원에 특이적인 항체)는 항체가 약 10-5M 미만, 예를 들어 약 10-6M, 10-7M, 10-8M, 10-9M 또는 10-10M 미만 또는 이하인 친화력(KD)으로 상기 항원에 결합하는 것을 의미한다.
본 발명에 적용하는 항종양 항원의 항체는 당업계에 공지된 각종 항종양 항원의 단일쇄 항체에서 유래할 수 있다. 단일쇄 항체는 관심 항체의 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역을 포함하거나, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역 및 선택적 링커로 구성될 수 있다. 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역 사이는 잘 알려진 링커로 연결될 수 있다. 본원에서 링커 또는 힌지는 상이한 단백질 또는 폴리펩티드 사이를 연결하는 폴리펩티드 단편이며, 그 목적은 연결된 단백질 또는 폴리펩티드를 각각의 공간적 형태로 유지하여 단백질 또는 폴리펩티드의 기능 또는 활성을 유지하는 것이다. 예시적인 링커는 G 및/또는 S를 함유한 링커를 포함한다. 통상적으로, 링커는 하나 이상의 앞뒤가 반복되는 모티프를 포함한다. 예를 들어 상기 모티프는 GGGS, GGGGS, SSSSG, GSGSA 및 GGSGG일 수 있다. 바람직하게는, 상기 모티프는 링커 서열에서 인접한 것이며, 반복되는 사이에는 아미노산 잔기가 삽입되지 않는다. 링커 서열은 1, 2, 3, 4 또는 5개 반복 모티프를 포함하여 구성될 수 있다. 링커의 길이는 3 내지 25개 아미노산 잔기일 수 있으며, 예를 들어 3 내지 15개, 5 내지 15개, 10 내지 20개 아미노산 잔기이다. 일부 실시방식에 있어서, 링커 서열은 폴리글리신(polyglycine) 링커 서열이다. 링커 서열 중 글리신(glycin)의 수는 특별히 제한되지 않는다. 통상적으로 2 내지 20이며, 예를 들어, 2 내지 15이며, 2 내지 10, 2 내지 8개이다. 글리신 및 세린(serine) 외에도 링커에는 기타 공지된 아미노산 잔기가 더 포함될 수 있다. 예를 들어 알라닌(A), 류신(L), 트레오닌(T), 글루탐산(E), 페닐알라닌(F), 아르지닌(R), 글루타민(Q) 등이 있다. 링커는 일반적으로 길이가 15 내지 20개 아미노산이다. 일부 실시방식에 있어서, 본 발명의 상이한 단백질 또는 폴리펩티드 사이는 (GGGS)n에 의해 연결되며, 여기에서 n은 1 내지 5의 정수이다. 일부 실시방식에 있어서, 본 발명의 단일쇄 항체의 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역 사이는 (GGGS)n에 의해 연결된다. 여기에서 n은 1 내지 5의 정수이다. 일부 실시방식에 있어서, 본 발명의 단일쇄 항체의 경쇄 가변 영역과 중쇄 가변 영역 사이는 GSTSGGGSGGGSGGGGSS(SEQ ID NO:41)에 의해 연결된다.
종양 항원의 단일쇄 항체가 항CD19 단일쇄 항체인 실시방안에 있어서, 관심 종양 항원은 CD19이고, 관심 단일쇄 항체은 CD19에 특이적으로 결합하는 단일쇄 항체이다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, 항CD19 단일쇄 항체는 FMC63에서 유래된다. 예시적으로, 항CD19 단일쇄 항체의 경쇄 가변 영역 서열은 SEQ ID NO:44의 23 내지 129번째 아미노산을 포함하거나 이로 구성된다. 항CD19 단일쇄 항체의 중쇄 가변 영역 서열은 SEQ ID NO:44의 148 내지 267번째 아미노산을 포함하거나 이로 구성된다. 여기에서 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역은 G와 S를 함유한 링커 서열에 의해 연결된다.
힌지 영역, 막횡단 영역 및 세포내 신호 영역과 같은 CAR에 포함된 다른 부분은 다양한 CAR을 구성하는데 통상적으로 사용되는 힌지 영역, 막횡단 영역 및 세포내 신호 영역일 수 있다.
본원에서 힌지 영역은 면역글로불린 중쇄 CH1와 CH2 기능 영역 사이의 영역을 말한다. 해당 영역은 프롤린(proline)이 풍부하고 α 나선을 형성하지 않으며 연장되고 어느 정도 왜곡되기 쉬워 항체의 항원 결합 부위와 에피토프(epitope) 간의 상보적 결합에 유리하다. 본 발명의 CAR에 적용되는 힌지 영역은 당업계에 공지된 것이다. 본원에 적용되는 힌지 영역은 CD8α 힌지 영역, IgG1 Fc CH2CH3 힌지 영역, IgD 힌지 영역, CD28 세포외 힌지 영역, IgG4 Fc CH2CH3 힌지 영역 및 CD4 세포외 힌지 영역으로부터 선택될 수 있다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, 힌지 영역은 인간 CD8α 힌지 영역이다. 상기 CD8α 힌지 영역은 당업계에 공지된 CD8α 폴리펩티드 사슬에서 유래될 수 있다. 예시적으로, 인간 CD8α 힌지 영역의 서열은 SEQ ID NO:44의 268 내지 312번째 아미노산을 포함하거나 이로 구성된다.
본원에서 막횡단 영역은 CD28 막횡단 영역, CD8 막횡단 영역, CD3ζ 막횡단 영역, CD134 막횡단 영역, CD137 막횡단 영역, ICOS 막횡단 영역 및 DAP10 막횡단 영역 중 하나 이상으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 본원에 사용되는 키메라 항원 수용체의 막횡단 영역은 CD8 막횡단 영역이다. 예시적인 막횡단 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:44의 313 내지 336번째 아미노산 잔기를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
본원에서 세포내 신호영역은 CD28, CD134/OX40, CD137/4-1BB, LCK, ICOS, DAP10, CD3ζ 및 Fc310/ 중 어느 하나 이상의 세포내 신호 영역으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 4-1BB 세포내 신호영역 및 CD3ζ 세포내 신호이다. 본원의 예시적인 세포내 신호 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:44 제337-490위치 아미노산 잔기로 표시될 수 있다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 4-1BB 세포내 영역은 SEQ ID NO:44의 337 내지 378번째 아미노산을 포함하거나 이로 구성된다. CD3ζ 세포내 영역은 SEQ ID NO:44의 379 내지 490번째 아미노산을 포함하거나 이로 구성된다.
치료용 단백질은 예를 들어 키메라 항원 수용체가 신호 펩티드를 더 포함할 수 있다. 신호 펩티드는 새로 합성된 단백질이 분비 경로로 전이되도록 안내하는 짧은 펩타이드 사슬(길이 5 내지 30개 아미노산)이며, 주로 새로 합성된 폴리펩티드 사슬 중 단백질의 막횡단 전이(위치결정)를 안내하는데 사용되는 N-말단의 아미노산 서열을 의미한다. 신호 펩티드는 CD8 신호 펩티드, CD28 신호 펩티드, CD4 신호 펩티드와 같은 막단백질 신호 펩티드일 수 있다. 예시적인 신호 펩티드 아미노산 서열은 SEQ ID NO:44 1 내지 22번째 아미노산 잔기를 포함하거나 이로 구성될 수 있다.
따라서 하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 CAR은 N 말단으로부터 C 말단까지 임의 선택된 항종양 항원의 단일쇄 항체, 힌지 영역, 막횡단 영역 및 하나 이상의 세포내 영역을 포함한다. 예시적인 키메라 항원 수용체의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:44의 23 내지 490번째 아미노산 잔기를 포함하거나 이로 구성되며, 또는 SEQ ID NO:44의 1 내지 490번째 아미노산 잔기를 포함하거나 이로 구성된다.
본원의 키메라 항원 수용체를 형성하는 상기 각 부분, 예를 들어 신호 펩티드, 단일쇄 항체의 경쇄 가변영역과 중쇄 가변영역, 힌지 영역, 막횡단 영역 및 세포내 신호 영역 등은 서로 직접 연결되거나, 또는 당업계에 공지된 전술한 G 및 S 함유 링커 서열과 같은 링커 서열에 의해 연결될 수 있다. 본 발명의 치료용 단백질 및 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드 사이는 직접 연결하거나, 링커 서열을 통해 연결할 수 있다. 예를 들어 전술한 G와 S를 함유한 링커 서열이 있다. 또는 치료용 단백질 및 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드 사이는 단일 벡터 상에 복수의 폴리시스트론을 발현할 수 있는 연결 서열을 더 포함하며, 예를 들어 2A 펩티드가 있다. 당업계에 공지된 바와 같이, 2A 펩티드는 리보솜 스키핑(ribosome skipping)을 유도할 수 있는 짧은 펩티드이며, 여기에는 F2A, P2A, T2A 펩티드 등이 포함된다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, 2A 펩티드의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:44의 494 내지 515번째 아미노산을 포함하거나 이로 구성된다. 2A 펩티드는 일반적인 G 및 S 함유 링커에 의해 양측의 폴리펩티드와 연결될 수도 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 DNA 또는 RNA의 형태일 수 있다. DNA 형태에는 cDNA, 게놈 DNA 또는 인공 합성 DNA가 포함된다. DNA는 단일쇄 또는 이중쇄일 수 있다. DNA는 코딩 가닥 또는 비코딩 가닥일 수 있다. 본 발명은 폴리펩티드 또는 단백질의 폴리뉴클레오티드를 코딩하는 축퇴성 변이체도 포함한다. 즉, 동일한 아미노산 서열이나 뉴클레오티드 서열이 다른 폴리뉴클레오티드를 코딩한다.
본원에 따른 폴리뉴클레오티드는 코돈 최적화를 거쳐 변경된 서열을 포함한다. 이는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 아미노산 서열이 변하지 않기만 하면 된다. 코돈 최적화를 거친 서열은 구체적인 물종에 대해 보다 적합한 발현성을 나타낸다. 당업계에는 폴리뉴클레오티드 서열에 대한 코돈 최적화의 방법이 공지되어 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 치료용 단백질, 예를 들어 CAR의 코딩 서열 및 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 코딩 서열이거나, 치료용 단백질의 발현 카세트 및 해당 단백질과 폴리펩티드의 발현 카세트일 수 있다. 본원에서 코딩 서열은 핵산 서열 중 그 단백질 산물(예를 들어 CAR, 단일쇄 항체, 힌지 영역, 막횡단 영역, 세포내 신호 영역 또는 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드 등)을 직접 결정하는 아미노산 서열의 부분을 의미한다. 코딩 서열의 경계는 일반적으로 mRNA의 5' 말단 오픈 리딩 프레임 상류에 바로 인접한 리보솜 결합 부위(원핵 세포에 대해)와 mRNA의 3' 말단 오픈 리딩 프레임 하류에 바로 인접한 전사 종결 서열에 의해 결정된다. 코딩 서열은 DNA, cDNA 및 재조합 핵산 서열을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 본원에서 발현 카세트는 관심 유전자 발현에 필요한 완전한 요소를 의미하며, 프로모터, 유전자 코딩 서열 및 PolyA 테일링 신호 서열을 포함한다. 본원에 따른 폴리뉴클레오티드는 독립적인 2개의 핵산 분자일 수 있다. 여기에는 각각 치료용 단백질의 코딩 서열과 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 코딩 서열이 포함된다. 예를 들어 각각 치료용 단백질의 발현 카세트와 폴리펩티드의 발현 카세트이다. 또는 상기 치료용 단백질 함유 코딩 서열과 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 코딩 서열은 링커에 의해 하나의 핵산 분자로 연결될 수 있다. 예를 들어 치료용 단백질의 코딩 서열과 폴리펩티드의 코딩 서열은 동일한 발현 카세트 내에 있거나, 2개의 발현 카세트가 적합한 링커에 의해 동일한 핵산 분자로 연결된다. 일부 실시방식에 있어서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 치료용 단백질의 코딩 서열 및 폴리펩티드의 코딩 서열이 동일한 발현 카세트에 있는 핵산 분자이며, 여기에는 프로모터, 상기 치료용 단백질 및 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 및 PolyA 테일링 신호가 포함된다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 임의 선택된 소포체 잔류 서열의 코딩 서열을 더 포함한다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 코딩 서열 또는 발현 카세트는 T 세포의 게놈에 통합된다. 따라서 이러한 실시방식에서 본원에 기재된 T 세포의 게놈에는 본원에 기재된 치료용 단백질과 폴리펩티드를 코딩하는 발현 카세트가 안정적으로 통합된다.
하나 이상의 실시방식에 있어서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 항종양 항원 단일쇄 항체, 인간 CD8α 힌지 영역, 인간 CD8 막횡단 영역, 4-1BB 세포내 영역, 인간 CD3ζ 세포내 영역, F2A 펩티드, 항체 폴리펩티드 및 소포체 잔류 서열의 코딩 서열을 포함한다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 (1) 본원에 따른 치료용 단백질의 코딩 서열 및 본원에 따른 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 코딩 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드; (2) 본원에 따른 융합 단백질의 코딩 서열; 및 (3) (1) 또는 (2)의 상보적 서열 또는 단편의 핵산 서열을 포함하거나 이로 구성된다. 하나 이상의 실시방식에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:51을 포함하거나 이로 구성된다.
본 발명은 핵산 작제물을 더 언급한다. 상기 핵산 작제물은 본원에 따른 폴리뉴클레오티드, 및 이러한 서열과 작동성으로 연결된 하나 이상의 조절 서열을 포함한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 다양한 방식으로 조작되어 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드 또는 단백질(치료용 단백질 및/또는 하향 조절된 폴리펩티드)의 발현을 보장할 수 있다. 핵산 작제물을 벡터에 삽입하기 전에 발현 벡터의 상이함 또는 요건에 따라 핵산 작제물을 조작할 수 있다. 재조합 DNA 방법을 이용해 폴리뉴클레오티드 서열을 변경하는 기술을 당업계에 공지된 것이다.
조절 서열은 적절한 프로모터 서열일 수 있다. 프로모터 서열은 통상적으로 발현할 단백질의 코딩 서열과 작동 가능하도록 연결된다. 프로모터는 선택된 숙주 세포에서 전사 활성을 나타내는 임의 뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 돌연변이, 절두된 및 하이브리드 프로모터를 포함한다. 또한 상기 숙주 세포와 상동성 또는 이종성인 세포외 또는 세포내 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로부터 수득할 수 있다. 조절 서열은 적합한 전사 종결자 서열일 수도 있으며, 숙주 세포에 의해 인식되어 전사를 종결시키는 서열이 있다. 종결자 서열은 상기 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 3' 말단에 작동 가능하도록 연결된다. 선택된 숙주 세포에서 기능하는 임의의 종결자는 모두 본 발명에 사용될 수 있다. 조절 서열은 숙주 세포 번역에 중요한 mRNA의 비번역 영역인 적합한 선도 서열일 수도 있다. 선도 서열은 상기 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 5' 말단에 작동 가능하도록 연결된다. 선택된 숙주 세포에서 기능하는 임의의 종결자는 모두 본 발명에 사용될 수 있다.
일부 실시방식에 있어서, 상기 핵산 작제물은 벡터이다. 벡터는 클로닝 벡터, 발현 벡터 또는 상동 재조합 벡터일 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 많은 유형의 벡터, 예를 들어 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스 및 코스미드로 클로닝될 수 있다. 클로닝 벡터는 본 발명의 치료용 단백질과 폴리펩티드의 코딩 서열, 예를 들어 치료용 단백질의 코딩 서열과 폴리펩티드의 코딩 서열을 포함한 하나의 핵산 분자를 제공하는 데 사용될 수 있다. 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 통상적으로 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 프로모터에 조작 가능하도록 연결하고 작제물을 발현 벡터에 혼입함으로써 본 발명의 폴리뉴클레오티드 발현을 구현한다. 상기 벡터는 진핵 세포의 복제와 통합에 적합할 수 있다. 전형적인 클로닝 벡터는 원하는 핵산 서열 발현을 조절하는 데 사용할 수 있는 전사 및 번역 종결자, 개시 서열 및 프로모터를 포함한다. 바이러스 벡터 기술은 당업계에 공지된 것이다. 예를 들어 Sambrook 등(2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York) 및 기타 바이러스학과 분자 생물학 매뉴얼에 설명되어 있다. 벡터로 사용될 수 있는 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노 연관 바이러스, 헤르페스바이러스 및 렌티바이러스를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 상동 재조합 벡터는 본원에 기재된 발현 카세트를 숙주 게놈에 통합하기 위해 사용된다.
통상적으로 적합한 벡터에는 적어도 하나의 유기체에서 작용하는 복제 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 효소 부위 및 하나 이상의 선택 가능한 마커가 포함된다. 예를 들어, 일부 실시방식에 있어서, 본 발명은 렌티바이러스 벡터를 사용한다. 상기 렌티바이러스 벡터는 복제 개시 부위, 3'LTR, 5'LTR, 본원에 따른 폴리뉴클레오티드, 임의 선택된 선택적 마커를 포함한다.
적합한 프로모터의 일 예시는 전초기 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터 서열이다. 상기 프로모터 서열은 그에 작동 가능하도록 연결된 임의 폴리뉴클레오티드 서열의 높은 수준 발현을 구동할 수 있는 강력한 구성적 프로모터 서열이다. 적합한 프로모터의 다른 예시는 연장 성장인자-1α(EF-1α)이다. 그러나 다른 구성형 프로모터 서열을 사용할 수도 있다. 여기에는 유인원 바이러스 40(SV40) 초기 프로모터, 마우스 유방암 바이러스(MMTV), 인간 면역결핍 바이러스(HIV) 장말단 반복(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, EB 바이러스 전초기 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 및 인간 유전자 프로모터가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헴 프로모터 및 크레아틴 키나아제 프로모터가 있으며 이에 한정되지 않는다.
치료용 단백질, 폴리펩티드 또는 그 일부의 발현을 평가하기 위해, 바이러스 벡터를 통해 형질감염 또는 감염되려는 세포 집단으로부터 발현 세포를 동정 및 선택하기 용이하도록, 세포에 도입되는 발현 벡터는 선택 가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자 중 어느 하나 또는 둘을 포함할 수도 있다. 다른 측면에서, 선택 가능한 마커는 DNA의 별도의 조각에 휴대되어 공-형질감염 과정에 사용될 수 있다. 선택 가능한 마케와 리포터 유전자는 숙주 세포에서 발현이 용이하도록 이들 둘의 측면에 모두 적당한 조절 서열을 가질 수 있다.유용한 선택 가능한 마커는 예를 들어 neo와 같은 항생제 저항 유전자를 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 동정하고 조절 서열의 기능성을 평가하는 데 사용된다. DNA가 수용체 세포에 도입된 후, 리포터 유전자의 발현은 적절한 시기에 측정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시페라아제(luciferase), β-갈락토시다아제(β-galactosidase), 클로람페니콜아세틸 전달효소(chloramphenicol acetyltransferase), 분비된 알칼라인 포스파타제(secreted alkaline phosphatase) 또는 녹색 형광 단백질 유전자를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다. 적합한 발현 시스템은 공지된 것이며 공지된 기술을 이용해 제조하거나 상업적으로 획득할 수 있다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오티드는 일반적으로 PCR 증폭 방법에 의해 수득될 수 있다. 구체적으로 본원에 개시된 뉴클레오티드 서열, 특히 오픈리딩프레임 서열에 따라 설계할 수 있으며, 시판되는 cDNA 라이브러리 또는 당업자에게 공지된 통상적인 방법으로 제조된 cDNA 라이브러리를 템플릿으로 사용하여 관련 서열을 증폭시킬 수 있다. 서열이 비교적 길면 종종 2회 이상의 PCR 증폭을 수행한 후 다시 증폭된 단편을 정확한 순서로 함께 조립해야 한다. 또는 본원에 기재된 핵산 분자로 직접 합성할 수도 있다.
유전자를 세포에 도입하고 유전자를 세포에 발현시키는 방법은 당업계에서 공지된 것이다. 벡터는 당업계에서 임의 방법을 통해 용이하게 숙주 세포, 예를 들어 포유 동물, 박테리아, 효모 또는 곤충 세포에 도입할 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적 또는 생물학적 수단을 통해 숙주 세포에 전달할 수 있다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하는 물리적 방법에는 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 충격, 미세주입, 전기천공법 등이 포함된다. 관심 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하는 생물학적 방법에는 DNA와 RNA 벡터를 사용하는 방법이 포함된다. 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하는 화학적 수단에는 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미소구체, 비드와 같은 콜로이드 분산 시스템, 및 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포솜을 포함한 지질 기반 시스템이 포함된다.
폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 도입하는 생물학적 방법에는 바이러스 벡터, 특히 레트로바이러스 벡터의 사용이 포함되며, 이는 포유동물, 예를 들어 인간 세포에 유전자를 삽입하는 데 가장 널리 사용되는 방법이다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 단순 헤르페스바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노 연관 바이러스 등으로부터 유래될 수 있다. 포유 동물 세포에 유전자를 전달하기 위한 많은 바이러스 기반 시스템이 개발되었다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫폼을 제공한다. 당업계에 공지된 기술을 사용하여 선택된 유전자를 벡터에 삽입하고 레트로바이러스 입자에 패키징할 수 있다. 상기 재조합 바이러스는 이어서 분리되어 생체내 또는 생체외 대상 세포에 전달될 수 있다. 많은 레트로바이러스 시스템이 당업계에 알려져 있다. 렌티바이러스는 레트로바이러스과 아래의 속이다. 렌티바이러스 벡터는 비교적 복잡한 레트로바이러스 벡터이다. 렌티바이러스 패키징에 사용되는 시약은 당업계에 공지된 것이며, 예를 들어 종래의 렌티바이러스 벡터 시스템은 pRsv-REV, pMDlg-pRRE, pMD2G 및 표적 간섭 플라스미드를 포함한다. 일 실시방식에 있어서, 렌티바이러스 벡터 pWPXL을 사용한다.
따라서 일부 실시방식에 있어서, 본 발명은 T 세포를 활성화하기 위한 렌티바이러스를 더 제공한다. 해당 바이러스는 본원에 따른 레트로바이러스 벡터 및 상응하는 패키징 유전자, 예를 들어 gag, pol, vsvg 및/또는 rev를 포함한다.
본원에서, 숙주 세포는 본원에 따른 항체 및/또는 융합 단백질 및 임의 선택된 치료용 폴리펩티드를 포함, 발현 및/또는 분비한다. 본원에서, 세포에 폴리펩티드와 같은 특정 분자가 함유 또는 포함, 발현, 분비된다고 언급될 경우, "함유"는 상기 분자가 상기 세포 내 또는 표면 상에 함유됨을 의미하고, "발현"은 상기 세포가 상기 분자를 생성함을 의미하고, "분비"는 상기 세포가 발현된 분자를 세포외로 분비함을 의미한다. 숙주 세포는 궁극적으로 질병 치료 목적으로 사용되는 T 세포뿐만 아니라, 본 발명에 따른 단백질의 코딩 서열을 제공하거나 본원에 기재된 벡터를 제공하기 위해 대장균 세포와 같이 CAR-T 세포를 생산하는 과정에서 사용되는 다양한 세포를 포함한다. 일부 실시방식에 있어서, 본원은 본원에 따른 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드를 안정적으로 발현하는 CAR-T 세포를 제공한다.
본 발명에 적용되는 T 세포는 각종 출처의 다양한 유형의 T 세포일 수 있다. 예를 들어, T 세포는 건강한 개체의 PBMC에서 유래할 수 있다. 일부 실시방식에 있어서, T 세포를 획득한 후, 먼저 적정량(예를 들어, 30 내지 80ng/ml, 예를 들어 50ng/ml)의 CD3 항체를 이용해 자극 활성화시킨 후, 적정량(예를 들어 30 내지 80IU/ml, 예를 들어 50IU/ml)을 함유한 IL2 배지에서 배양하여 준비한다.
따라서 일부 실시방식에 있어서, 본 발명은 유전자 변형된 T 세포를 제공한다. 상기 유전자 변형된 T 세포는 본원에 따른 폴리뉴클레오티드를 함유하거나, 본원에 따른 렌티바이러스 벡터를 함유하거나, 본원에 따른 렌티바이러스를 감염시키거나, 본원에 따른 법을 채택하여 제조하거나, 본원에 따른 치료용 단백질과 폴리펩티드를 안정적으로 발현시킨다.
본 발명의 T 세포(예를 들어, CAR-T 세포)는 견고한 생체내 T 세포 확장을 거치고 혈액 및 골수에서 높은 수준으로 연장된 시간 동안 지속되어 특이적 기억 T 세포를 형성할 수 있다. 임의의 구체적인 이론에 얽매이지 않고, 대리 항원을 발현하는 표적 세포에 직면하고 후속적인 제거 후, 본 발명의 T 세포는 생체내에서 중심 기억 유사 상태로 분화될 수 있다.
본원은 T 세포 배양물을 더 포함하며, 상기 배양물은 본원에 설명된 T 세포 및 적합한 배지를 포함한다. 배지는 당업계에서 일반적으로 T 세포 배양에 사용하는 배지일 수 있다.
본원은 약학 조성물을 더 제공한다. 상기 약학 조성물에는 본원에 따른 T 세포 및 약학적으로 허용 가능한 부형제가 포함된다. 본원에서 약학적으로 허용 가능한 부형제는 약리학 및/또는 생리학적으로 피험자와 활성 성분과 상용성이 있는 담체, 희석제 및/또는 부형제를 의미하며, 여기에는 pH 조절제, 계면활성제, 탄수화물, 보조제, 항산화제, 킬레이트제, 이온 강도 향상제 및 방부제가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 보다 구체적으로, 적합한 약학적으로 허용 가능한 부형제는 T 세포(예를 들어, CAR-T 세포)의 투여를 위해 당업계에서 통상적으로 사용되는 부형제일 수 있다.
일반적으로, 약학 조성물은 치료적 유효량의 T 세포를 함유한다. 치료적 유효량은 피험자에게서 질병 또는 병증을 치료, 예방, 경감 및/또는 완화할 수 있는 용량을 의미한다. 치료적 유효량은 환자의 연령, 성별, 질병 및 그 중증도, 환자의 기타 신체적 조건 등과 같은 요인에 따라 결정될 수 있다. 본원에서 피험자 또는 환자는 통상적으로 포유동물, 특히 사람을 의미한다.
본원은 키트를 더 제공한다. 상기 키트는 본원에 따른 핵산 작제물을 함유한다. 키트는 상기 핵산 작제물을 세포 내로 형질감염시키기에 적합한 다양한 시약, 및 상기 재조합 발현 벡터를 세포 내로 형질감염시키도록 당업자에게 지시하기 위한 임의 지침서를 포함할 수 있다.
본 발명은 세포요법을 더 포함한다. 여기에서 T 세포는 유전자 변형되어 본원에 따른 치료용 단백질과 폴리펩티드를 발현하며, 대상체에게 T 세포를 투여한다. 예를 들어 투여하는 CAR-T 세포는 수용자의 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. CAR-T 세포로 인한 항종양 면역 반응은 능동적 또는 수동적 면역 반응일 수 있다. 또한 CAR 매개의 면역 반응은 입양 면역요법 단계의 일부일 수 있다. 여기에서 CAR-T 세포는 CAR 중의 항원 결합 부분에 특이적인 면역 반응을 유도한다.
따라서 본 발명의 CAR, 폴리펩티드, 이들의 코딩 서열, 핵산 작제물, 발현 벡터, 바이러스 또는 CAR-T 세포 치료에 사용하기 적합한 질병은 CAR에 포함된 종양 항원 단일쇄 항체와 관련이 있다. 따라서 본원에 기재된 질병에는 전술한 종양 항원과 관련된 다양한 암이 포함된다. 여기에는 고형 종양과 혈액 종양이 포함되며, 예를 들어 선암종, 폐암, 결장암, 대장암, 유방암, 난소암, 자궁경부암, 위암, 담관암, 담낭암, 식도암, 췌장암 및 전립선암 등과 같은 고형 종양, 및 B세포 림프종, 외투 세포 림프종, 급성 림프구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 털세포 백혈병 및 급성 골수성 백혈병 등과 같은 백혈병과 림프종이 있다. 종양 항원이 CD19인 실시방식에 있어서, 본원에 따른 CD19 단일쇄 항체를 포함하는 CAR, 폴리펩티드, 이들의 코딩 서열, 핵산 작제물, 발현 벡터, 바이러스 또는 CAR-T 세포 치료를 채택하는 질병은 바람직하게는 CD19 매개의 질병일 수 있다. 예를 들어, 급성/만성 B계통 림프구성 백혈병, 비호지킨 림프종, 미만성 거대 B 세포 림프종, 여포성 림프종 및 외투 세포 림프종 등이 있다.
본 발명의 T 세포는 독립적으로 투여되거나 약학 조성물로 투여될 수 있다. 본 발명의 세포 또는 약학 조성물은 질병의 치료(또는 예방)에 적합한 방식으로 투여할 수 있다. 투여 수량과 빈도는 환자의 증상, 환자 질병의 유형과 중증도 등 다양한 요인에 의해 결정된다. 조성물의 투여는 주사, 수액, 삽입 또는 이식 등 임의 용이한 방식으로 수행할 수 있다. 본원에 설명된 조성물은 환자에게 피하, 피내, 종양내, 결절내, 척수내, 근육내, 정맥내 주사 또는 복강내로 투여될 수 있다. 일 실시방식에 있어서, 본 발명의 T 세포 조성물은 피내 또는 피하 주사로 환자에게 투여된다. 다른 일 실시방식에 있어서, 본 발명의 T 세포 조성물은 바람직하게는 정맥주사에 의해 투여된다. T 세포의 조성물은 종양, 림프절 또는 감염 부위에 직접 주사될 수 있다.
본 발명의 일부 실시방식에 있어서, 본 발명의 T 세포 또는 이의 조성물은 당업계에 공지된 기타 요법과 결합할 수 있다. 상기 용법에는 화학요법, 방사선 요법 및 면역억제제가 포함되나 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, 당업계에 공지된 종양 항원 매개의 질환을 치료하는 방사선 요법 또는 화학요법 제제와 함께 치료를 수행할 수 있다.
본원에서 "항종양 효과"는 일종의 생물학적 효과이다. 이는 종양 부피의 감소, 종양 세포 수의 감소, 전이 수의 감소, 기대 수명의 증가 또는 암 관련 각종 생리적 증상과 관련된 개선으로 나타날 수 있다.
본 발명은 항CD19 항체(구체적으로 클로닝 번호 FMC63의 scFV 유래)의 유전자 서열을 예로 들어 설명한다. 또한 NCBI GenBank 데이터베이스에서 인간 CD8α 힌지 영역, 인간 CD8 막횡단 영역, 4-1BB 세포내 영역, 인간 CD3ζ 세포내 영역 및 항TCR단일쇄 항체 등 서열 정보를 검색하며, 전체 유전자에서 키메라 항원 수용체의 유전자 단편을 합성하고, 렌티바이러스 벡터에 삽입한다. 재조합 플라스미드는 293T 세포에 바이러스를 패키징하고 T 세포를 감염시키며 T 세포가 상기 키메라 항원 수용체를 발현하도록 한다. 본 발명은 렌티바이러스 형질전환 방법을 기반으로 키메라 항원 수용체 유전자 변형의 T 림프구의 형질전환 방법을 구현한다. 상기 방법은 형질전환 효율이 높고, 외인성 유전자가 안정적으로 발현되며, 시험관 내에서 배양된 T 림프구가 임상 수준에 도달하는 시간을 단축시키는 장점 등이 있다. 상기 형질전환 T 림프구 표면에는 형질전환된 핵산이 전사 및 번역에 의해 그 위에 발현된다. 본 발명에 의해 제조된 CAR-T 세포는 특이적 종양 세포에 대한 강력한 사멸 기능을 가진다. 효과 표적비가 2.5 대 1일 때, 상이한 항TCR 클로닝 단일쇄 항체를 함유한 CAR-T 세포의 사멸 효율은 모두 98%를 초과한다.
예시적 실시방식
1. 조작된 T 세포로서,
상기 T 세포는 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드를 발현하고, 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드는 하나의 중쇄 가변 영역(VH) 및 하나의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1과 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열이고, 상기 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2와 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 T 세포.
2. 실시방식 1에 따른 T 세포에 있어서,
상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 VH에는 서열이 SEQ ID NO:9로 표시되는 HCDR2: INX1X2X3DVT가 포함되고, 여기에서 X1, X2 및 X3은 임의 아미노산이고; 또는
상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 VH에는 서열이 SEQ ID NO:15로 표시되는 HCDR3: AX4GX5X6YDYDGFVY가 포함되고, 여기에서 X4, X5 및 X6은 임의 아미노산이고; 또는
상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 VL에는 서열이 SEQ ID NO:22로 표시되는 LCDR3: QQWX7X8X9X10X11T가 포함되고, 여기에서 X7, X8, X9, X10 및 X11은 임의 아미노산인 것을 특징으로 하는 T 세포.
3. 실시방식 2에 있어서,
상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드는,
상기 서열 SEQ ID NO:9로 표시되는 HCDR2에 있어서, X1 아미노산은 프롤린, 트레오닌, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이고, X2 아미노산은 티로신, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 시스테인, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린 또는 메티오닌이고, X3 아미노산은 아스파라긴, 글리신, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘이고,
상기 서열 SEQ ID NO:15로 표시되는 HCDR3에 있어서, X4 아미노산은 아르기닌, 라이신 또는 히스티딘이고, X5 아미노산은 세린, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이고, X6 아미노산은 티로신, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 시스테인, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 메티오닌, 라이신, 아르기닌, 아스파라긴 또는 글루탐산이고,
상기 서열 SEQ ID NO:22로 표시되는 LCDR3에 있어서, X7 아미노산은 세린, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 히스티딘, 라이신 또는 아르기닌이고, X8 아미노산은 세린, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이고, X9 아미노산은 아스파라긴, 글리신, 글루타민, 트레오닌, 티로신, 시스테인 또는 세린이고, X10 아미노산은 프롤린, 알라닌, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이고, X11 아미노산은 류신, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 티로신, 시스테인, 알라닌, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판인 것을 특징으로 하는 T 세포.
4. 실시방식 1 내지 3 중 어느 하나에 있어서,
상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드는 하기 그룹 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 T 세포:
(1) SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34의 LCDR3 서열 중 하나,
(2) SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14의 HCDR2 서열 중 하나,
(3) SEQ ID NO:16, SEQ ID NO:17, SEQ ID NO:18, SEQ ID NO:19, SEQ ID NO:20 및 SEQ ID NO:21의 HCDR3 서열 중 하나.
5. 실시방식 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서,
상기 폴리펩티드는 단일쇄 항체인 것을 특징으로 하는 T 세포.
6. 실시방식 1 내지 5 중 어느 하나에 있어서,
상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드는 위치결정 서열 및 임의 선택된 신호 펩티드를 포함하고, 바람직하게는,
상기 위치결정 서열은 소포체 잔류 서열, 골지체 잔류 서열, E3 유비퀴틴 연결효소 결합 서열, 프로테아좀 위치결정 서열 또는 리소좀 위치결정 서열로부터 선택되고, 상기 소포체 잔류 서열은 SEQ ID NO:35 내지 40 중 어느 하나로 표시되는 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 여기에서 X는 임의 아미노산이고,
상기 위치결정 서열과 항체 사이에는 링커가 포함되고, 상기 링커는 바람직하게는 SEQ ID NO:41로 표시되고,
상기 신호 펩티드는 SEQ ID NO:44의 516 내지 537번째로 표시되는 것을 특징으로 하는 T 세포.
7. 실시방식 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서,
치료용 단백질을 더 발현하고, 바람직하게는 치료용 단백질은 키메라 항원 수용체인 T 세포.
8. 실시방식 7에 있어서,
상기 T 세포는 상기 치료용 단백질의 발현 카세트 및 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 발현 카세트를 함유하거나, 상기 치료용 단백질의 코딩 서열 및 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 코딩 서열이 동일한 발현 카세트 내에 위치하는 것을 특징으로 하는 T 세포.
9. 조작된 T 세포로서,
상기 T 세포는 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드를 발현하고, 상기 폴리펩티드는 항체나 그 항원 결합 단편, 또는 상기 항체나 그 항원 결합 단편과 적어도 90%의 서열 상동성을 가지며 상기 항체나 항원 결합 단편의 항원 결합 활성을 유지하는 돌연변이체를 포함하고, 여기에서 상기 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고,
상기 중쇄 가변 영역은,
SEQ ID NO:3으로 표시되는 HCDR1: GYKFTSYV,
SEQ ID NO:9로 표시되는 HCDR 2: INX1X2X3DVT - 여기에서 X1, X2 및 X3은 임의 아미노산임 - ,
SEQ ID NO:15로 표시되는 HCDR3： AX4GX5X6YDYDGFVY , 여기에서 X4, X5 및 X6은 임의 아미노산임 - 의 HCDR을 가지며,
상기 경쇄 가변 영역은,
SEQ ID NO:6으로 표시되는 LCDR1: SSVSY,
SEQ ID NO:7로 표시되는 LCDR2: DTS,
SEQ ID NO:22로 표시되는 LCDR3: QQWX7X8X9X10X11T - 여기에서 X7, X8, X9, X10 및 X11은 임의 아미노산임 - 의 LCDR을 갖는 것을 특징으로 하는 T 세포.
10. 실시방식 9에 있어서,
상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드는,
X1은 프롤린, 트레오닌, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이고,
X2는 티로신, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 시스테인, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린 또는 메티오닌이고,
X3은 아스파라긴, 글리신, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘이고,
X4는 아르기닌, 라이신 또는 히스티딘이고,
X5는 세린, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이고,
X6은 티로신, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 시스테인, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 메티오닌, 라이신, 아르기닌, 아스파르트산 또는 글루탐산이고,
X7은 세린, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 히스티딘, 라이신 또는 아르기닌이고,
X8은 세린, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이고,
X9는 아스파라긴, 글리신, 글루타민, 트레오닌, 티로신, 시스테인 또는 세린이고,
X10은 프롤린, 알라닌, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이고,
X11은 류신, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 티로신, 시스테인, 알라닌, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판인 것으로부터 선택된 하나 이상의 특징을 구비하는 것을 특징으로 하는 T 세포.
11. 실시방식 9 또는 10에 있어서,
상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드는,
(1) LCDR3은 SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34로부터 선택되고,
(2) HCDR2는 SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14로부터 선택되고,
(3) HCDR3은 SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21로부터 선택되는 것으로부터 선택된 하나 이상의 특징을 구비하는 것을 특징으로 하는 T 세포.
12. 실시방식 9 내지 11 중 어느 한 항에 있어서,
중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은,
(1) SEQ ID NO:42,
(2) HCDR2 및/또는 HCDR3의 서열의 실시방식 10 또는 11에 따른 SEQ ID NO:42 변이체,
(3) (1) 또는 (2)와 95% 이상의 상동성을 갖는 서열로부터 선택되고, 및/또는
경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은,
(1) SEQ ID NO:43,
(2) LCDR3의 서열의 실시방식 10 또는 11에 따른 SEQ ID NO:43 변이체,
(3) (1) 또는 (2)와 95% 이상의 상동성을 갖는 서열로부터 선택되는 T 세포.
13. 실시방식 9 내지 12 중 어느 하나에 있어서,
상기 항체는 단일쇄 항체인 것을 특징으로 하는 T 세포.
14. 실시방식 9 내지 12 중 어느 하나에 있어서,
상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드는 위치결정 서열 및 임의 선택된 신호 펩티드를 포함하고, 바람직하게는,
상기 위치결정 서열은 소포체 잔류 서열, 골지체 잔류 서열, E3 유비퀴틴 연결효소 결합 서열, 프로테아좀 위치결정 서열 또는 리소좀 위치결정 서열로부터 선택되고, 상기 소포체 잔류 서열은 SEQ ID NO:35 내지 40 중 어느 하나로 표시되는 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 여기에서 X는 임의 아미노산이고,
상기 위치결정 서열과 항체 사이에는 링커가 포함되고, 바람직하게는 상기 링커는 SEQ ID NO:41로 표시되고,
상기 신호 펩티드는 SEQ ID NO:44의 516 내지 537번째로 표시되는 것을 특징으로 하는 T 세포.
15. 실시방식 9 내지 14 중 어느 하나에 있어서,
치료용 단백질을 더 발현하고, 바람직하게는 치료용 단백질은 키메라 항원 수용체인 T 세포.
16. 실시방식 15에 있어서,
상기 T 세포는 상기 치료용 단백질의 발현 카세트 및 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 발현 카세트를 함유하거나, 상기 치료용 단백질의 코딩 서열 및 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 코딩 서열이 동일한 발현 카세트 내에 위치하는 것을 특징으로 하는 T 세포.
17. 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 있어서,
상기 항체의 HCDR1의 아미노산 서열은 GYKFTSYV이고, HCDR2의 아미노산 서열은 INX1X2X3DVT 이고, HCDR3의 아미노산 서열은 AX4GX5X6YDYDGFVY 이고, LCDR1의 아미노산 서열은 SSVSY이고, LCDR2의 아미노산 서열은 DTS이고, LCDR3의 아미노산 서열은 QQWX7X8X9X10X11T이고, 여기에서 X1 내지 X11은 실시방식 10과 같고, HCDR2는 INPYNDVT가 아니고, HCDR3은 ARGSYYDYDGFVY가 아니고, LCDR3은 QQWSSNPLT가 아니고,
바람직하게는, 상기 항체의 LCDR3, HCDR2 및 HCDR3은 실시방식 11과 같은 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
18. 실시방식 17에 있어서,
상기 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:42로 표시되나, 이의 HCDR2 및/또는 HCDR3의 서열은 실시방식 10 또는 11과 같고,
상기 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:43으로 표시되나, 이의 LCDR3의 서열은 실시방식 10 또는 11과 같은 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
19. 융합 단백질로서,
위치결정 서열, 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드 및 임의 선택된 신호 펩티드를 포함하고, 바람직하게는, 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드는 실시방식 9 내지 18 중 어느 하나와 같고, 바람직하게는,
상기 신호 펩티드는 SEQ ID NO:44의 516 내지 537번째로 표시되고,
상기 위치결정 서열과 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드 사이에는 링커가 포함되고, 바람직하게는 상기 링커는 SEQ ID NO:41로 표시되고,
상기 융합 단백질은 SEQ ID NO:44의 516 내지 804번째로 표시되거나, SEQ ID NO:44의 538 내지 804번째로 표시되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
20. 핵산 분자로서,
상기 핵산 분자는,
(1) 치료용 단백질의 코딩 서열 및 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 코딩 서열을 포함하는 핵산 분자;
(2) 실시방식 19에 따른 융합 단백질의 코딩 서열;
(3) 실시방식 17 또는 18에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 코딩 서열; 및
(4) (1), (2) 또는 (3)의 상보적 서열 또는 단편으로부터 선택되고,
바람직하게는 상기 치료용 단백질은 키메라 항원 수용체이고, 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드는 실시방식 9 내지 14와 같은 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
21. 핵산 작제물로서,
상기 핵산 작제물은 실시방식 20에 따른 핵산 분자를 포함하고,
바람직하게는 상기 핵산 작제물은 상기 치료용 단백질의 발현 카세트 및 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 발현 카세트를 포함하거나, 또는 상기 핵산 작제물은 하나의 발현 카세트이고, 여기에서 상기 치료용 단백질의 코딩 서열 및 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 코딩 서열은 상기 발현 카세트 내에 위치하거나; 또는
상기 핵산 작제물은 클로닝 벡터 또는 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 핵산 작제물.
22. 렌티바이러스로서,
상기 렌티바이러스는 실시방식 20에 따른 핵산 분자 또는 실시방식 21에 따른 핵산 작제물을 함유하는 것을 특징으로 하는인 렌티바이러스.
23. 숙주 세포로서,
상기 숙주 세포는 실시방식 17 또는 18에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 실시방식 19에 따른 융합 단백질과 임의 선택된 치료용 단백질을 포함, 발현 및/또는 분비하고, 바람직하게는 상기 숙주 세포는 실시방식 20에 따른 핵산 분자, 실시방식 21에 따른 핵산 작제물 및/또는 실시방식 22에 따른 렌티바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
24. 약학 조성물로서,
실시방식 9 내지 16항 중 어느 하나에 따른 T 세포, 실시방식 17 또는 18에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 실시방식 19에 따른 융합 단백질, 실시방식 20에 따른 핵산 분자, 실시방식 21에 따른 핵산 작제물 및/또는 실시방식 22에 따른 렌티바이러스, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 약학 조성물.
25. 세포 표면 TCR 하향 조절 T 세포의 제조 또는 암 치료용 T 세포의 제조에서 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드 또는 이의 코딩 서열, 실시방식 20에 따른 핵산 분자, 실시방식 21에 따른 핵산 작제물 및/또는 실시방식 22에 따른 렌티바이러스의 응용으로서,
상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드는 실시방식 9 내지 14에 따른 응용.
본 발명은 이하의 실험 실시예를 참조하여 보다 상세하게 설명한다. 달리 명시되지 않는 한, 이러한 실시예는 제한의 목적이 아닌 설명의 목적으로만 제공된다. 따라서 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것으로 해석되어서는 안 되며, 본원에서 제공하는 시사점을 기반으로 수행한 임의 및 모든 변형을 보호 범위에 포함하는 것으로 해석되어야 한다. 실시예에 사용된 방법과 시약은 달리 명시되지 않는 한 당업계에서 일반적으로 사용하는 방법과 시약이다.
실시예
실시예 1 - 벡터 구성
1. NCBI 웹사이트 데이터베이스에서 인간 CD8α 힌지 영역, 인간 CD8 막횡단 영역, 4-1BB 세포내 영역, 인간 CD3ζ 세포내 영역, 항인간 CD19 항체(클론 FMC63)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역, 대조군 항인간 TCR/CD3 항체(클론 UCHT1 및 OKT3)의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자 서열 정보를 검색한다. 나머지 항체 서열은 독점적인 항인간 TCR/CD3 항체 클론에서 유래한다. 모든 관련된 아미노산 서열은 웹사이트 https://www.thermofisher.com/order/geneartgenes 상에서 코돈 최적화를 수행하여, 코딩 아미노산 서열이 변하지 않은 상태에서 인간 세포 발현에 보다 적합하도록 보장한다.
2. 중첩 PCR을 사용하여 상술한 서열을 항CD19-scFv 유전자, 인간 CD8 힌지 영역 유전자, 인간 CD8 막횡단 영역 유전자, 4-1BB 세포내 영역 유전자, 인간 CD3ζ 세포내 영역, F2A 및 CD3-scFv 유전자, 소포체 잔류 서열(AEKDEL)에 따라 순차적으로 연결하여, 완전한 유전자 서열 정보를 형성한다. 이의 신호 펩티드 코딩 서열을 포함하는 서열은 SEQ ID NO:51의 1 내지 66번째 잔기 또는 1546 내지 1611번째 잔기로 표시되며, 아미노산 서열은 SEQ ID NO:44의 1 내지 22번째 잔기 및 516 내지 537번째 잔기로 표시된다.
3. 상기 CAR 분자의 클레오티드 서열은 렌티바이러스 플라스미드 pWPXL(Addgene)의 BamHI/EcoRI 부위에 심리스 클로닝되고, 수용능 대장균(Stbl3)으로 형질전환된다.
4. 재조합 플라스미드를 GENEWIZ(州金唯智生物科技有限公司)에 이송하여 시퀀싱을 수행하고, 시퀀싱 결과를 피팅된 서열과 비교하여 서열 정확성을 검증한다. 시퀀싱 프라이머는 이하와 같다.
센스 서열: TCAAGCCTCAGACAGTGGTTC(SEQ ID NO:49)
안티센스 서열: CCAGTCAATCTTTCACAAATTTTG(SEQ ID NO:50).
실시예 2: 바이러스 패키징
시퀀싱 정확성 검증 후, 플라스미드를 Qiagen사의 플라스미드 정제 키트를 이용하여 플라스미드를 추출 및 정제하고, 인산칼슘법을 채택해 정제된 플라스미드를 293T 세포에 형질감염시키며, 렌티바이러스 패키징 실험을 수행한다(Molecular Therapy-Methods & Clinical Development, 2016, 3: 16017). 여기에서 제조된 렌티바이러스 벡터는, 대조군(CAR19-F2A-GFP), 샘플 1(CAR19-F2A-UCHT1 scfv-AEKDEL), 샘플 2(CAR19-F2A-OKT3 scfv-AEKDEL), 샘플 3(CAR19-F2A-CTAB5 scfv-AEKDEL), 샘플 4(CAR19-F2A-CTAB2 scfv-AEKDEL), 샘플 5(CAR19-F2A-CTAB3 scfv-AEKDEL), 샘플 6(CAR19-F2A-CTAB4 scfv-AEKDEL), 샘플 7(CTAB5 scfv-AEKDEL)이다.
실시예 3 - PBMC 및 T 세포의 분리
말초 혈액 PBMC의 분리, T 세포 분리 활성화, 렌티바이러스 형질도입, 체외 배양
HBV, HCV 및 HIV 검사가 음성인 건강한 공여자를 선별하고, 주정중피정맥에서 혈액을 채취하여 Ficoll 밀도구배 원심분리로 PBMC 백막층을 분리한다. 전혈 유세포 분석에 따라 CD3+T 세포 백분율을 검출하고 CD3+T 세포 수를 계산한다. DynaBeads CD3/CD28과 CD3+T 세포 비율이 3:1이 ?瀕돈? 사용량 자성 비드를 흡인하고, 백막층 세포와 30분간 배양하여 CD3+T 세포를 분리한다. CD3+T 세포는 Dynabeads CD3/CD28(Life Technology)를 거쳐 24시간 활성화시킨 후 CD25+CD69+T 세포 비율을 유세포 분석으로 검출한다.
실시예 4 - 렌티바이러스 형질도입 및 T 세포 배양
CD3+T 활성화 후, 렌티바이러스 형질도입을 수행한다. Novonectin으로 24웰 플레이트에 코팅하고 37℃에서 2시간 동안 배양하며, 세포 현탁액을 각각 앞서 제조하여 수득한 다양한 렌티바이러스(MOI=3), Tscm(2U/ml, Novoprotein사)와 형질도입 시스템으로 구성하여 코팅된 24웰 플레이트에 넣는다. 세포 밀도는 1.0E+06/ml로 조정하고 500g에서 30분간 원심분리하며 원심분리 후 37℃ 및 5% CO2의 배양상자에서 48시간 동안 정치하여 배양한다. 렌티바이러스 형질감염이 완료된 후 5% FBS를 함유하는 Xvivo15 배양액에서 배양하고, 격일로 Tscm(최종 농도 2U/ml)을 보충하며 계수한다. 또한 세포 밀도를 0.5E+06/ml로 조정하고, 8 내지 10일까지 배양하여 세포를 수집한다.
실시예 5 - CAR 양성률 및 CAR-T 세포 TCR 또는 CD3 평균 형광 강도
5.0E+05 세포를 계수 및 수집하고, 세포를 2회 세척한 후 100ul의 4% BSA 함유 완충액에 재현탁시킨다. 8ul의 항인간 TCR 또는 CD3 항체를 세포의 각 튜브에 추가하고 균일하게 와류 혼합하며 4℃에서 30분 동안 배양한다. 염색 및 배양 완료 후, 세포를 반복적으로 세척하고, 형광 표지된 항CAR19 항체 또는 Protein L을 500x로 희석하며, 세포를 튜브당 200ul로 재현탁하고, 균일하게 와류 혼합하여 4℃에서 30분 동안 배양한다. 세포를 반복적으로 세척하고, 4% BSA를 포함하는 완충액 500ul에 재현탁하며, 각 튜브에 7AAD 염료 4ul를 첨가하여 균일하게 와류 혼합하고, 암실에서 10분 동안 실온에서 배양한다. 마지막으로, 샘플을 유세포 분석기 튜브로 옮기고 Calibr 유세포 분석기에서 CAR19 형질감염 효율 및 CAR19+ T 세포 집단의 TCR 또는 CD3 표면 수준을 측정한다.
먼저 2개의 광범위하게 사용되는 항인간 TCR/CD3 마우스 유래 항체(OKT3 및 UCTH1)를 평가한다. 임상 적용에서 마우스 유래 서열로 인한 거부 반응을 피하기 위해, 인간화 개조를 수행하고 세포 수준에서 테스트하였다. 그 결과는 도 1 및 표 1과 같다. 인간화 UCHT1 항체 서열을 포함하는 폴리펩티드의 발현은 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 일정한 활성을 갖는다. 형질도입 양성 세포(CAR+)에서, TCR- 및 CD3- 집단의 비중은 각각 48.22% 및 45.8%였다. 특허 US20180086831A1도 UCHT1 항체 서열을 테스트하였다. 도 5는 상이한 공여자로부터 유래된 T 세포의 경우 TCR/CD3 복합체의 표면 하향 조절 수준 차이가 비교적 큰 것을 보여준다. 공여자 1의 경우, 형질감염된 양성 세포에서 TCR-집단의 비중은 17.1/(17.1+14.1)*100%=54.8%이며, 이는 본 발명에서 획득한 결과에 가깝다. 그러나 공여자 2의 경우 형질감염된 양성 세포에서 TCR-집단의 비중은 42.5/(42.5+6.79)*100%=86.2%이며, 공여자 1과 비교적 큰 차이를 보였다.
인간화 OKT3 서열을 함유한 폴리펩티드는 세포 표면 TCR/CD3 복합체 하향 조절 활성이 UCTH1 서열을 함유한 폴리펩티드보다 높다(도 1 및 표 1). CAR+ 세포에서 TCR- 및 CD3- 집단의 비중은 각각 70.62% 및 66.09%로 증가하였다. 그러나 TCR/CD3+ 집단의 비중은 여전히 비교적 높다. 이는 CAR-T 세포의 정제에 큰 어려움을 가져오며, 임상 적용에 큰 위험을 초래한다. 다른 3가지 항 TCR/CD3 항체 서열을 함유한 폴리펩티드(도 2 및 표 1)는 OKT3 서열을 함유한 폴리펩티드와 활성이 유사하며, CAR+TCR-/CAR+의 비중은 48.81%에서 68.95% 사이였다.
예상 외로, 항체 CTAB5 서열을 함유한 폴리펩티드는 세포 표면 TCR/CD3 복합체의 수준을 하향 조절하는 데 가장 효과적이었다. 최대 88.09%의 CAR+ 세포는 모두 표면 TCR을 발현하지 않았다. 최대 85.89%의 CAR+ 세포는 모두 표면 CD3을 발현하지 않았다(도 1 및 표 1)
Figure pct00002
실시예 6 - 다른 공여자 T 세포의 CAR 양성 비율 및 CAR-T 세포의 표면 TCR 또는 CD3 단백질 수준
실시예 3과 실시예 4의 방법에 따라 상이한 공여자 유래의 CTAB5서열 폴리펩티드를 함유한 CAR-T 세포를 제조하고, 실시예 5의 방법에 따라 CAR19 형질감염 효율 및 CAR19+ T 세포 집단의 TCR 또는 CD3 평균 형광 강도를 유세포 분석으로 검출한다.
결과는 도 3에 도시된 바와 같이, CTAB5 서열을 발현하는 폴리펩티드는 상이한 공여자 CAR-T 세포에서 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 안정적으로 하향 조절하는 능력을 나타낸다. 계산 결과는 표 2와 같으며, 형질감염 양성 세포(CAR+)에서 TCR 음성 집단의 비중은 상이한 공여자 사이에서 모두 85% 이상이었다. 이는 CTAB5 서열을 함유한 폴리펩티드가 광범위한 공여자 T에 적합함을 나타낸다.
Figure pct00003
실시예 7 - CTAB5 항체 서열을 함유한 폴리펩티드의 발현은 T 세포 표면의 TCR 및 CD3 수준을 높은 효율로 하향 조절 가능
CTAB5 항체 서열을 함유한 폴리펩티드의 활성을 확인하기 위해, 실시예 2에 따라 CTAB5 서열을 함유한 폴리펩티드만 발현하고 치료용 단백질은 발현하지 않는 렌티바이러스 벡터를 제조한다. 실시예 3 및 실시예 4의 방법에 따라 대응하는 T 세포를 제조하고, 실시예 5의 방법에 따라 그 표면의 TCR 또는 CD3 수준을 유세포 분석으로 검출하였다.
결과는 도 4에 도시된 바와 같이, CTAB5 항체 서열을 함유한 폴리펩티드는 단독으로 발현될 때, TCR 및 CD3의 표면 발현을 여전히 높은 효율로 억제할 수 있다.
실시예 8 - 세포 표현형 분석
각 군의 CAR-T 세포를 계수하고, 1.0E+06 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 무균 4% BSA로 재현탁하여 2회 세척한 다음, 200ul의 4% BSA로 세포를 재현탁한다. 각 샘플에 CD4(AmCyan), CD8(APC-Cy7), CD45RA(PE-Cy7) 및 CCR7(BV421)에서 필요한 항인간 항체를 첨가한다. 각 항체는 각각 5ul를 넣고 볼텍스 믹서로 섞어 4℃에서 30분간 배양한다. 염색 배양 완료 후, 세포를 반복적으로 세척하고, 4% BSA를 포함하는 완충액 500ul에 세포를 재현탁하며, 각 튜브에 7AAD 염료 4ul를 첨가하여 균일하게 와류 혼합하고, 암실에서 10분 동안 실온에서 배양한다. 샘플을 유세포 분석 튜브로 옮기고, FACS Calibr 유세포 분석기에서 각 군의 T 세포의 CCR7 및 CD45RA의 발현을 검출하며, T 세포의 면역 표현형을 분석하였다.
결과는 도 5a 내지 5g에 도시된 바와 같다. 각 군에서 CAR+CD8+T 및 CAR+CD4+T의 비율은 모두 정상이며 군 사이에 현저한 차이가 없었다. 여기에는 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 데 가장 효과적인 CTAB5 항체 서열을 함유하는 폴리펩티드 세포군이 포함되었다.
실시예 9 - T 세포 생체외 확장 분석
각 군 렌티바이러스 벡터로 T 세포를 형질감염시키고, 격일로 T 세포를 계수한다. T 세포를 8일째까지 체외 배양하고, 세포 증식 배수를 계산하였다(8일째의 세포수/형질감염에 사용된 세포수).
결과는 도 6에 도시된 바와 같다. 각 군 TCR/CD3 복합체 표면 발현이 하향 조절된 T 세포의 확장 능력은 대조군에 비해 약화되지 않고 오히려 모두 상이한 정도로 증가하였다.
실시예 10 - T 세포의 종양 표적 세포에 대한 사멸
NC-T 세포(렌티바이러스 형질감염 미수행 T 세포) 및 각 군 CAR-T 세포를 계수 및 수집하고, T 세포 배양액 X-VIVO15(Tscm 미함유)를 사용하여 세포 밀도를 5.0E+07/mL로 조정한다. 표적 세포를 계수 및 수집하고, RPMI 1640(FBS 미함유)으로 세포 밀도를 5.0E+06/mL로 조정한다. 1.5ml 원심분리기 튜브에서 밀도가 조정된 상술한 이펙터 세포를 각각 표적 세포와 상이한 효과 표적비(1:1, 2.5:1, 5:1, 10:1, 20:1)로 혼합하고, X-VIVO15를 이용해 총 부피를 200ul로 보충한다. 96웰 V형 플레이트로 옮기고 37℃ 및 5% CO2에서 24시간 동안 배양한 후, 부드럽게 피펫팅하여 각 웰의 세포를 균일하게 혼합하고 100ul의 세포 현탁액을 흰색 벽 고체 바닥의 96웰 플레이트에 옮긴다. ONE-Glo™ Luciferase 기질 80μL를 첨가하고, 피펫팅하여 균일하게 교반한 후, 실온으로 10분간 암실에서 배양한 다음, Luminoskan Ascent 화학발광 분석기로 형광 강도를 검출한다.
결과는 표 3 및 도 7에 도시된 바와 같다. CTAB3 항체 서열을 함유한 폴리펩티드를 발현하는 세포를 제외하고, 다른 각 군은 높은 효율로 종양 표적 세포를 사멸시키는 능력을 갖는다.
Figure pct00004
실시예 11 - T 세포의 IFN-γ 분비 능력
각 군의 렌티바이러스가 형질감염된 T 세포를 8일째까지 생체외 배양하고, TCR 의존성 T 세포 활성화 항체 OKT3를 최종 농도 각각 50ng/ml, 100ng/ml, 150ng/ml 및 200ng/ml로 첨가한다. X-VIVO15 배양액을 이용해 각 군의 CAR-T 세포 샘플을 적절한 배수로 희석하고, 필요에 따라 상응하는 수량의 막대를 꺼내 각 웰에 100ul 희석액 RD1-51를 첨가하며, 희석된 샘픔을 균일하게 혼합하고, 100ul를 취하여 홀에 넣는다(15분 이내에 완료). 밀봉막을 덮고 실온에서 2시간 동안 배양한다. 배양 완료 후, 웰의 용액을 완전히 제거하고 세척액을 첨가하여 1분간 정치한다. 해당 단계를 반복하여 총 4회 세척한다. 각 웰에 인간 IFN-γ 커플링 시약 200ul를 첨가하고, 새로운 밀봉막으로 덮어 실온에서 2시간 동안 배양한다. 각 웰에 기질용액 200ul를 첨가하고 실온의 암실에서 30분간 배양한다. 배양 완료 후, 각 웰에 정지 용액 50ul를 넣고 충분히 혼합한 후 마이크로플레이트 리더에서 검출한다(파장 450nm, 보정 파장 570nm/540nm로 설정함).
결과는 표 4 및 도 8에 도시된 바와 같다. 모든 실험군은 대조군에 비해, IFN-γ 분비가 하향 조절되었다. 여기에서 CTAB5항체 서열을 함유한 세포 IFN-γ 분비 능력은 비교적 낮은 수준이었다. 이는 해당 세포의 세포 표면에 기능성의 TCR/CD3 복합체가 존재하지 않음을 의미하며, 이는 전술한 실험 결과와 완전히 일치다.
Figure pct00005
실시예 12 - 돌연변이 라이브러리의 제조 및 스크리닝
1) 표적 TCR/CD3 항체 서열을 선택하고 아미노산 점 돌연변이를 수행하여 TCR/CD3 복합체 발현을 보다 효과적으로 하향 조절하거나, 그 MHC-I 에피토프를 제거하거나, T 세포 확장 등을 촉진할 수 있는 적용 이점 등이 있는 돌연변이체를 찾는다. 돌연변이 라이브러리의 영역 1은 표적 scfv의 경쇄(SEQ ID NO:43의 90 내지 95번째 아미노산)에 위치하고, 영역 2는 표적 scfv의 중쇄(SEQ ID NO:42의 50 내지 55번째 아미노산)에 위치하고, 영역 3은 표적 scfv의 중쇄(SEQ ID NO:42의 97 내지 101번째 아미노산)에 위치한다.
2) NNK 축퇴성 프라이머는 상술한 돌연변이 라이브러리의 구축을 수행하도록 설계된다. 실시예 1 및 실시예 2의 방법에 따라 렌티바이러스 표적 돌연변이체 라이브러리를 제조한다.
3) 실시예 3 및 실시예 4의 방법에 따라 표적 돌연변이 T 세포 라이브러리를 제조한다.
4) 실시예 5의 방법에 따라 표적 돌연변이 T 세포 라이브러리의 TCR 및 CD3의 발현 상황을 검출한다. 결과는 도 9에 도시된 바와 같으며, 표적 돌연변이 라이브러리 세포는 TCR 및 CD3 발현을 하향 조절하는 능력을 나타낸다.
5) TCR을 하향 조절하는 능력이 가장 강한 T 세포 클론 하위 집단을 유세포 분석으로 선별하고, 게놈 고처리량 시퀀싱을 수행한다. 표 5는 라이브러리 중 예시적인 23개 돌연변이체를 나타낸다. 이어서 그 중 3개를 선택하여 세포 표면 TCR/CD3 복합체의 발현을 하향 조절하고 표적 세포를 효과적으로 사멸시킬 수 있음을 확인한다.
6) 선택한 3개 돌연변이체는 돌연변이체 1, VL-CDR3(SEQ ID NO:23); 돌연변이체 2, VL-CDR3(SEQ ID NO:24); 돌연변이체 3, VH-CDR3(SEQ ID NO:17)이다.상응하는 점 돌연변이 플라스미드를 구축한다.
Figure pct00006
7) 상술한 실시예의 방법에 따라 선택한 3개 돌연변이체 관련 CAR-T 지표를 검출하였으며, 그 결과를 도 10 내지 12에 도시하였다.
도 10에 도시된 바와 같이, 돌연변이체 1, 돌연변이체 2 및 돌연변이체 3은 돌연변이되지 않은 대조군과 동일한 정도로 세포 표면에서 TCR 및 CD3의 발현을 하향 조절하는 능력을 나타냈다. 도 11에 도시된 바와 같이, 돌연변이체 1, 2 및 3은 모두 CAR-T 세포의 확장 효율을 향상시킬 수 있다. 따라서 생산 주기가 단축될 수 있으며, 최종 제품의 건조도를 향상시킬 수 있다. 또한 생체내 종양 억제 활성 및 지속성을 강화할 수 있으며, 약품의 단위 생산 비용을 낮추고 제품 품질을 향상시킬 수 있다. 도 12에 도시된 바와 같이, 돌연변이체는 돌연변이되지 않은 대조군과 동등한 종양 세포 사멸 능력을 나타냈다.
본 발명에 언급된 모든 문헌은 각 문헌이 참조를 위해 개별 인용된 것과 같이 본 출원에 모두 참조로 인용되었다. 또한 본 발명의 상술한 내용을 읽은 후, 본 발명이 속한 기술분야의 당업자는 본 발명에 다양한 변경 또는 수정을 가할 수 있고, 이러한 등가 형태는 본 출원에 첨부된 특허청구범위에 의해 정의된 범위에 속한다는 것을 이해해야 한다.
본원 서열
Figure pct00007
SEQUENCE LISTING <110> FUNDAMENTA THERAPEUTICS INC. <120> ENGINEERED T CELLS, AND PREPARATION AND USE THEREOF <130> 198068 <150> CN 202010022475.6 <151> 2020-01-09 <160> 51 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 1 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val His Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Ser Gly Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 2 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VL <400> 2 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Ser Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 3 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR1 <400> 3 Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr Val 1 5 <210> 4 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 <400> 4 Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr 1 5 <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 <400> 5 Ala Lys Gly Ser Gly Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr 1 5 10 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR1 <400> 6 Ser Ser Val Ser Tyr 1 5 <210> 7 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR2 <400> 7 Asp Thr Ser 1 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 <400> 8 Gln Gln Trp Ser Gly Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 general <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> The 'Xaa' at location 3 stands for any amino acid. <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> The 'Xaa' at location 4 stands for any amino acid. <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> The 'Xaa' at location 5 stands for any amino acid. <400> 9 Ile Asn Xaa Xaa Xaa Asp Val Thr 1 5 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 mutant <400> 10 Ile Asn Val Tyr Asn Asp Val Thr 1 5 <210> 11 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 mutant <400> 11 Ile Asn Pro Ala Asn Asp Val Thr 1 5 <210> 12 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 mutant <400> 12 Ile Asn Pro Tyr Lys Asp Val Thr 1 5 <210> 13 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 mutant <400> 13 Ile Asn Pro Leu Asn Asp Val Thr 1 5 <210> 14 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR2 mutant <400> 14 Ile Asn Asn Tyr Asn Asp Val Thr 1 5 <210> 15 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 general <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> The 'Xaa' at location 2 stands for any amino acid. <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> The 'Xaa' at location 4 stands for any amino acid. <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> The 'Xaa' at location 5 stands for any amino acid. <400> 15 Ala Xaa Gly Xaa Xaa Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr 1 5 10 <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 mutant <400> 16 Ala Arg Gly Ser Gly Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr 1 5 10 <210> 17 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 mutant <400> 17 Ala Lys Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr 1 5 10 <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 mutant <400> 18 Ala Arg Gly Ser Trp Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr 1 5 10 <210> 19 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 mutant <400> 19 Ala Arg Gly Ser Gly Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr 1 5 10 <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 mutant <400> 20 Ala Arg Gly Ser Arg Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr 1 5 10 <210> 21 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> HCDR3 mutant <400> 21 Ala Arg Gly Val Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr 1 5 10 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 general <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> The 'Xaa' at location 4 stands for any amino acid. <220> <221> misc_feature <222> (5)..(5) <223> The 'Xaa' at location 5 stands for any amino acid. <220> <221> misc_feature <222> (6)..(6) <223> The 'Xaa' at location 6 stands for any amino acid. <220> <221> misc_feature <222> (7)..(7) <223> The 'Xaa' at location 7 stands for any amino acid. <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> The 'Xaa' at location 8 stands for any amino acid. <400> 22 Gln Gln Trp Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Thr 1 5 <210> 23 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 mutant <400> 23 Gln Gln Trp Ser Gly Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 24 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 mutant <400> 24 Gln Gln Trp Ser Arg Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 mutant <400> 25 Gln Gln Trp Ser Ser Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 26 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 mutant <400> 26 Gln Gln Trp Phe Ser Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 27 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 mutant <400> 27 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Thr Thr 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 mutant <400> 28 Gln Gln Trp Ser Trp Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 29 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 mutant <400> 29 Gln Gln Trp Ser Ala Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 mutant <400> 30 Gln Gln Trp Ser Leu Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 mutant <400> 31 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Ser Thr 1 5 <210> 32 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 mutant <400> 32 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Val Leu Thr 1 5 <210> 33 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 mutant <400> 33 Gln Gln Trp Ser Ser Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 34 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LCDR3 mutant <400> 34 Gln Gln Trp Ser Val Asn Pro Leu Thr 1 5 <210> 35 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Retention sequence 1 <400> 35 Ala Glu Lys Asp Glu Leu 1 5 <210> 36 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Retention sequence 2 <400> 36 Lys Asp Glu Leu 1 <210> 37 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Retention sequence 3 <220> <221> misc_feature <222> (3)..(3) <223> The 'Xaa' at location 3 stands for any amino acid. <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> The 'Xaa' at location 4 stands for any amino acid. <400> 37 Lys Lys Xaa Xaa 1 <210> 38 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Retention sequence 4 <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> The 'Xaa' at location 2 stands for any amino acid. <400> 38 Lys Xaa Asp 1 <210> 39 <211> 3 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Retention sequence 5 <220> <221> misc_feature <222> (2)..(2) <223> The 'Xaa' at location 2 stands for any amino acid. <400> 39 Lys Xaa Glu 1 <210> 40 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Retention sequence 6 <400> 40 Tyr Gln Arg Leu 1 <210> 41 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker <400> 41 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Ser 20 <210> 42 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VH <400> 42 Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val His Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 120 <210> 43 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> VVL <400> 43 Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80 Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95 Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 44 <211> 804 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> expression frame <400> 44 Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 1 5 10 15 Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser 20 25 30 Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser 35 40 45 Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys 50 55 60 Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val 65 70 75 80 Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 85 90 95 Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln 100 105 110 Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile 115 120 125 Lys Gly Ser Thr Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Gly Ser Ser Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Ala Leu Val Lys 145 150 155 160 Pro Thr Gln Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Phe Ser Gly Phe Ser Leu 165 170 175 Ser Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu 180 185 190 Glu Trp Leu Ala Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser 195 200 205 Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln 210 215 220 Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr 225 230 235 240 Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr 245 250 255 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala 260 265 270 Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser 275 280 285 Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr 290 295 300 Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala 305 310 315 320 Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys 325 330 335 Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met 340 345 350 Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe 355 360 365 Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg 370 375 380 Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn 385 390 395 400 Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg 405 410 415 Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro 420 425 430 Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala 435 440 445 Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His 450 455 460 Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp 465 470 475 480 Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Val Lys Gln 485 490 495 Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn 500 505 510 Pro Gly Pro Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu 515 520 525 Leu Leu Trp Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser 530 535 540 Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys 545 550 555 560 Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser 565 570 575 Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser 580 585 590 Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser 595 600 605 Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys 610 615 620 Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu 625 630 635 640 Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 645 650 655 Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro 660 665 670 Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr 675 680 685 Ser Tyr Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu 690 695 700 Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu 705 710 715 720 Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr 725 730 735 Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val His 740 745 750 Tyr Cys Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp 755 760 765 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly 770 775 780 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu 785 790 795 800 Lys Asp Glu Leu <210> 45 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> UCHT1-VL <400> 45 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 46 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> UCHT1-VH <400> 46 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Thr Thr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 47 <211> 106 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OKT3-VL <400> 47 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30 Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45 Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr 100 105 <210> 48 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> OKT3-VH <400> 48 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 49 tcaagcctca gacagtggtt c 21 <210> 50 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 50 ccagtcaatc tttcacaaat tttg 24 <210> 51 <211> 2415 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleic acid <400> 51 atggatatga gggtgcctgc ccagctgctg ggcctgctgc tgctgtggct gaggggcgct 60 aggtgtgaca tccagatgac ccagagccct tcctccctga gcgcctccgt gggcgataga 120 gtgacaatca catgtagagc ctcccaggac atcagcaagt acctgaactg gtaccagcag 180 aagcccggca aggcccccaa gctgctgatc taccacacct ccagactgca cagcggcgtg 240 cctagcaggt tcagcggctc cggcagcggc accgacttta cactgaccat cagctccctg 300 cagcctgagg atttcgccac ctactactgt cagcagggca atacactgcc ctacaccttt 360 ggccagggca ccaagctgga gatcaaggga tccaccagcg gcggaggaag cggcggaggt 420 agcggaggag gcggaagctc ccaggtgaca ctgaaggaga gcggccctgc cctggtgaag 480 cctacacaga cactgacact gacgtgtacc ttctccggct tcagcctgtc cgattacggc 540 gtgagctgga tcagacagcc tcctggcaag gccctggagt ggctggccgt gatctggggc 600 agcgagacca cctactacaa ttccgccctg aagagcaggc tgaccatctc caaggacacc 660 tccaagaacc aggtggtgct gaccatgacc aatatggatc ctgtggacac cgccacatac 720 tactgtgcca agcactacta ctacggcggc agctacgcca tggattactg gggccagggc 780 accctggtga ccgtgagctc caccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 840 accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 900 gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc 960 gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc tttactgcaa acggggcaga 1020 aagaaactcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 1080 gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg 1140 aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 1200 gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 1260 cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 1320 cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1380 ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1440 gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc ggctccggag taaagcaaac actgaacttt 1500 gaccttctca agttggctgg agacgttgag tccaatcctg ggcccatgga catgagagtg 1560 cccgctcaac tgctgggact gctgctgctt tggctgagag gcgccagatg ccaaattgtg 1620 ctgacacaga gccccgccat catgtctgct agccctggcg agaaagtgac catgacctgt 1680 agcgccacaa gcagcgtgtc ctacatgcac tggtatcagc agaagtccgg cacaagcccc 1740 aagcggtgga tctacgatac aagcaagctg gcctctggcg tgcccgctag attttctggc 1800 tctggcagcg gcaccagcta cagcctgaca atcagcagca tggaagccga ggatgccgcc 1860 acctactact gccagcagtg gtccagcaat cccctgacat ttggagccgg caccaagctg 1920 gaactgaaag gcggcggagg atctggcgga ggtggaagtg gcggaggcgg atctgaagtt 1980 cagctgcagc agagcggacc cgagcttgtg aaacctggcg cctctgtgaa gatgagctgc 2040 aaggccagcg gctacaagtt cacctcctac gtgatgcact gggtcaagca gaaaccaggc 2100 cagggcctcg agtggatcgg ctacatcaac ccctacaacg acgtgaccaa gtacaacgag 2160 aagttcaagg gcaaagccac actgaccagc gacaagagca gcagcaccgc ctacatggaa 2220 ctgagcagcc tgacctctga ggacagcgcc gtgcactatt gtgccagggg cagctactac 2280 gactacgacg gctttgtgta ttggggccag ggcaccctgg ttacagtttc tgctggtggc 2340 ggcggtagcg gaggtggtgg ttctggtggt ggtggatctg gcggcggagg ttctgccgag 2400 aaggatgaac tgtga 2415

Claims (25)

  1. 조작된 T 세포로서,
    상기 T 세포는 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드를 발현하고, 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드는 하나의 중쇄 가변 영역(VH) 및 하나의 경쇄 가변 영역(VL)을 포함하고, 상기 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:1 또는 SEQ ID NO:1과 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열이고, 상기 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:2 또는 SEQ ID NO:2와 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는, 조작된 T 세포.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 VH에는 서열이 SEQ ID NO:9로 표시되는 HCDR2: INX1X2X3DVT가 포함되고, 여기에서 X1, X2 및 X3은 임의 아미노산이고; 또는
    상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 VH에는 서열이 SEQ ID NO:15로 표시되는 HCDR3: AX4GX5X6YDYDGFVY가 포함되고, 여기에서 X4, X5 및 X6은 임의 아미노산이고; 또는
    상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 VL에는 서열이 SEQ ID NO:22로 표시되는 LCDR3: QQWX7X8X9X10X11T가 포함되고, 여기에서 X7, X8, X9, X10 및 X11은 임의 아미노산인 것을 특징으로 하는 T 세포.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드는 하기 특징 중 하나 이상을 구비하는 것을 특징으로 하는 T 세포:
    상기 서열 SEQ ID NO:9로 표시되는 HCDR2에 있어서, X1 아미노산은 프롤린, 트레오닌, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이고, X2 아미노산은 티로신, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 시스테인, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린 또는 메티오닌이고, X3 아미노산은 아스파라긴, 글리신, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘임;
    상기 서열 SEQ ID NO:15로 표시되는 HCDR3에 있어서, X4 아미노산은 아르기닌, 라이신 또는 히스티딘이고, X5 아미노산은 세린, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이고, X6 아미노산은 티로신, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 시스테인, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 메티오닌, 라이신, 아르기닌, 아스파라긴 또는 글루탐산임; 및
    상기 서열 SEQ ID NO:22로 표시되는 LCDR3에 있어서, X7 아미노산은 세린, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 히스티딘, 라이신 또는 아르기닌이고, X8 아미노산은 세린, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이고, X9 아미노산은 아스파라긴, 글리신, 글루타민, 트레오닌, 티로신, 시스테인 또는 세린이고, X10 아미노산은 프롤린, 알라닌, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판이고, X11 아미노산은 류신, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 티로신, 시스테인, 알라닌, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판임.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드는 하기 그룹 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 T 세포:
    (1) SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34의 LCDR3 서열 중 하나;
    (2) SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14의 HCDR2 서열 중 하나;
    (3) SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21의 HCDR3 서열 중 하나.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 폴리펩티드는 단일쇄 항체인 것을 특징으로 하는 T 세포.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드는 위치결정 서열 및 임의 선택된 신호 펩티드를 포함하고, 바람직하게는,
    상기 위치결정 서열은 소포체 잔류 서열, 골지체 잔류 서열, E3 유비퀴틴 연결효소 결합 서열, 프로테아좀 위치결정 서열 또는 리소좀 위치결정 서열로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 소포체 잔류 서열은 SEQ ID NO:35 내지 40 중 어느 하나로 표시되는 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 여기에서 X는 임의 아미노산이고,
    상기 위치결정 서열과 항체 사이에는 링커가 포함되고, 상기 링커는 바람직하게는 SEQ ID NO:41로 표시되고,
    상기 신호 펩티드는 SEQ ID NO:44의 516 내지 537번째로 표시되는 것을 특징으로 하는 T 세포.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료용 단백질을 더 발현하고, 바람직하게는 치료용 단백질은 키메라 항원 수용체인 T 세포.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 T 세포는 상기 치료용 단백질의 발현 카세트 및 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 발현 카세트를 함유하거나, 상기 치료용 단백질의 코딩 서열 및 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 코딩 서열이 동일한 발현 카세트 내에 위치하는 것을 특징으로 하는 T 세포.
  9. 조작된 T 세포로서,
    상기 T 세포는 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드를 발현하고, 상기 폴리펩티드는 항체나 그 항원 결합 단편, 또는 상기 항체나 그 항원 결합 단편과 적어도 90%의 서열 상동성을 가지며 상기 항체나 항원 결합 단편의 항원 결합 활성을 유지하는 돌연변이체를 포함하고, 여기에서 상기 항체는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 포함하고,
    상기 중쇄 가변 영역은,
    SEQ ID NO:3으로 표시되는 HCDR1: GYKFTSYV,
    SEQ ID NO:9로 표시되는 HCDR 2: INX1X2X3DVT- 여기에서 X1, X2 및 X3은 임의 아미노산임 - ,
    SEQ ID NO:15로 표시되는 HCDR 3: AX4GX5X6YDYDGFVY- 여기에서 X4, X5 및 X6은 임의 아미노산임 - 의 HCDR을 가지며,
    상기 경쇄 가변 영역은,
    SEQ ID NO:6으로 표시되는 LCDR1: SSVSY,
    SEQ ID NO:7로 표시되는 LCDR2: DTS,
    SEQ ID NO:22로 표시되는 LCDR3: QQWX7X8X9X10X11T - 여기에서 X7, X8, X9, X10 및 X11은 임의 아미노산임 - 의 LCDR을 갖는 것을 특징으로 하는, 조작된 T 세포.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드는 하기 특징 중 하나 이상을 구비하는 것을 특징으로 하는 T 세포:
    X1은 프롤린, 트레오닌, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판임;
    X2는 티로신, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 시스테인, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린 또는 메티오닌임;
    X3은 아스파라긴, 글리신, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 라이신, 아르기닌 또는 히스티딘임;
    X4는 아르기닌, 라이신 또는 히스티딘임;
    X5는 세린, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판임;
    X6은 티로신, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 시스테인, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 메티오닌, 라이신, 아르기닌, 아스파르트산 또는 글루탐산임;
    X7은 세린, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 히스티딘, 라이신 또는 아르기닌임;
    X8은 세린, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 트레오닌, 티로신, 시스테인, 라이신, 아르기닌, 히스티딘, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판임;
    X9는 아스파라긴, 글리신, 글루타민, 트레오닌, 티로신, 시스테인 또는 세린임;
    X10은 프롤린, 알라닌, 류신, 이소류신, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판임;
    X11은 류신, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 티로신, 시스테인, 알라닌, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌 또는 트립토판임.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서,
    상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드는 하기 특징 중 하나 이상을 구비하는 것을 특징으로 하는 T 세포:
    （1）LCDR3은 SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33，SEQ ID NO:34로부터 선택됨;
    （2）HCDR2는 SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14로부터 선택됨; 및
    （3）HCDR3은 SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21로부터 선택됨.
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은,
    (1) SEQ ID NO:42,
    (2) HCDR2 및/또는 HCDR3의 서열의 제10항 또는 제11항에 따른 SEQ ID NO:42 변이체,
    (3) (1) 또는 (2)와 95% 이상의 상동성을 갖는 서열로부터 선택되고, 및/또는
    경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은,
    (1) SEQ ID NO:43,
    (2) LCDR3의 서열의 제10항 또는 제11항에 따른 SEQ ID NO:43 변이체,
    (3) (1) 또는 (2)와 95% 이상의 상동성을 갖는 서열로부터 선택되는 T 세포.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 항체는 단일쇄 항체인 것을 특징으로 하는 T 세포.
  14. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드는 위치결정 서열 및 임의 선택된 신호 펩티드를 포함하고, 바람직하게는,
    상기 위치결정 서열은 소포체 잔류 서열, 골지체 잔류 서열, E3 유비퀴틴 연결효소 결합 서열, 프로테아좀 위치결정 서열 또는 리소좀 위치결정 서열로부터 선택되고, 바람직하게는 상기 소포체 잔류 서열은 SEQ ID NO:35 내지 40 중 어느 하나로 표시되는 서열을 포함하거나 이로 구성되고, 여기에서 X는 임의 아미노산이고,
    상기 위치결정 서열과 항체 사이에는 링커가 포함되고, 바람직하게는 상기 링커는 SEQ ID NO:41로 표시되고,
    상기 신호 펩티드는 SEQ ID NO:44의 516 내지 537번째로 표시되는 것을 특징으로 하는 T 세포.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    치료용 단백질을 더 발현하고, 바람직하게는 상기 치료용 단백질은 키메라 항원 수용체인 T 세포.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 T 세포는 상기 치료용 단백질의 발현 카세트 및 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 발현 카세트를 함유하거나, 상기 치료용 단백질의 코딩 서열 및 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 코딩 서열이 동일한 발현 카세트 내에 위치하는 것을 특징으로 하는 T 세포.
  17. 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로서,
    상기 항체의 HCDR1의 아미노산 서열은 GYKFTSYV이고, HCDR2의 아미노산 서열은 INX1X2X3DVT이고, HCDR3의 아미노산 서열은 AX4GX5X6YDYDGFVY이고, LCDR1의 아미노산 서열은 SSVSY이고, LCDR2의 아미노산 서열은 DTS이고, LCDR3의 아미노산 서열은 QQWX7X8X9X10X11T이고, 여기에서 X1 내지 X11은 제10항과 같고, HCDR2는 INPYNDVT가 아니고, HCDR3은 ARGSYYDYDGFVY가 아니고, LCDR3은 QQWSSNPLT가 아니고,
    바람직하게는, 상기 항체의 LCDR3, HCDR2 및 HCDR3은 제11항과 같은 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 항체의 중쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:42로 표시되나, 이의 HCDR2 및/또는 HCDR3의 서열은 제10항 또는 제11항과 같고,
    상기 항체의 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO:43으로 표시되나, 이의 LCDR3의 서열은 제10항 또는 제11항과 같은 것을 특징으로 하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  19. 융합 단백질으로서,
    위치결정 서열, 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드 및 임의 선택된 신호 펩티드를 포함하고, 바람직하게는, 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드는 제9항 내지 제18항 중 어느 한 항과 같고, 바람직하게는,
    상기 신호 펩티드는 SEQ ID NO:44의 516 내지 537번째로 표시되고,
    상기 위치결정 서열과 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드 사이에는 링커가 포함되고, 바람직하게는 상기 링커는 SEQ ID NO:41로 표시되고,
    상기 융합 단백질은 SEQ ID NO:44의 516 내지 804번째로 표시되거나, SEQ ID NO:44의 538 내지 804번째로 표시되는 것을 특징으로 하는 융합 단백질.
  20. 핵산 분자로서,
    상기 핵산 분자는,
    (1) 치료용 단백질의 코딩 서열 및 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 코딩 서열을 함유한 핵산 분자;
    (2) 제19항에 따른 융합 단백질의 코딩 서열;
    (3) 제17항 또는 제18항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 코딩 서열; 및
    (4) (1), (2) 또는 (3)의 상보적 서열 또는 단편으로부터 선택되고,
    바람직하게는 상기 치료용 단백질은 키메라 항원 수용체이고, 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드는 제9항 내지 제14항과 같은 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  21. 핵산 작제물로서,
    상기 핵산 작제물은 제20항에 따른 핵산 분자를 포함하고,
    바람직하게는 상기 핵산 작제물은 상기 치료용 단백질의 발현 카세트 및 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 발현 카세트를 함유하거나, 또는 상기 핵산 작제물은 하나의 발현 카세트이고, 여기에서 상기 치료용 단백질의 코딩 서열 및 상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드의 코딩 서열은 상기 발현 카세트 내에 위치하거나; 또는
    상기 핵산 작제물은 클로닝 벡터 또는 발현 벡터인 것을 특징으로 하는 핵산 작제물.
  22. 렌티바이러스로서,
    상기 렌티바이러스는 제20항에 따른 핵산 분자 또는 제21항에 따른 핵산 작제물을 함유하는 것을 특징으로 하는 렌티바이러스.
  23. 숙주 세포로서,
    상기 숙주 세포는 제17항 또는 제18항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제19항에 따른 융합 단백질과 임의 선택된 치료용 단백질을 포함, 발현 및/또는 분비하고, 바람직하게는 상기 숙주 세포는 제20항에 따른 핵산 분자, 제21항에 따른 핵산 작제물 및/또는 제22항에 따른 렌티바이러스를 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
  24. 약학 조성물로서,
    제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 T 세포, 제17항 또는 제18항에 따른 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 제19항에 따른 융합 단백질, 제20항에 따른 핵산 분자, 제21항에 따른 핵산 작제물 및/또는 제22항에 따른 렌티바이러스, 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 함유하는 약학 조성물.
  25. 세포 표면 TCR 하향 조절 T 세포의 제조 또는 암 치료용 T 세포의 제조에서 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드 또는 이의 코딩 서열, 제20항에 따른 핵산 분자, 제21항에 따른 핵산 작제물 및/또는 제22항에 따른 렌티바이러스의 응용으로서,
    상기 세포 표면 TCR/CD3 복합체를 하향 조절하는 폴리펩티드는 제9항 내지 제14항에 따른 것인 응용.
KR1020227027043A 2020-01-09 2021-01-08 조작된 t 세포, 이의 제조 및 응용 KR20220129015A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010022475.6 2020-01-09
CN202010022475.6A CN113088495A (zh) 2020-01-09 2020-01-09 工程改造的t细胞、其制备及应用
PCT/CN2021/070820 WO2021139755A1 (zh) 2020-01-09 2021-01-08 工程改造的t细胞、其制备及应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20220129015A true KR20220129015A (ko) 2022-09-22

Family

ID=76663664

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020227027043A KR20220129015A (ko) 2020-01-09 2021-01-08 조작된 t 세포, 이의 제조 및 응용

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20230346933A1 (ko)
EP (1) EP4089165A4 (ko)
JP (1) JP2023509765A (ko)
KR (1) KR20220129015A (ko)
CN (1) CN113088495A (ko)
AU (1) AU2021206752A1 (ko)
WO (1) WO2021139755A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2023542312A (ja) * 2020-09-13 2023-10-06 山東博安生物技術股▲ふん▼有限公司 受容体ｔａｃ技術による膜結合タンパク質の下方制御

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2018248A1 (en) * 1989-06-07 1990-12-07 Clyde W. Shearman Monoclonal antibodies against the human alpha/beta t-cell receptor, their production and use
CA2735193A1 (en) * 2008-08-26 2010-03-11 Macrogenics, Inc. T-cell receptor antibodies and methods of use thereof
UY34317A (es) * 2011-09-12 2013-02-28 Genzyme Corp Anticuerpo antireceptor de célula T (alfa)/ß
LT2794658T (lt) * 2011-12-19 2017-05-10 Synimmune Gmbh Bispecifinė antikūno molekulė
CN111925437A (zh) * 2013-03-14 2020-11-13 宏观基因有限公司 与表达激活受体的免疫效应细胞具有免疫反应性的双特异性分子
JP6895380B2 (ja) * 2015-02-06 2021-06-30 ナショナル ユニバーシティ オブ シンガポール 治療免疫細胞の有効性を改良するための方法
CA2937157A1 (en) * 2016-07-25 2018-01-25 Ucl Business Plc Protein-based t-cell receptor knockdown
WO2019032916A1 (en) 2017-08-10 2019-02-14 National University Of Singapore CHIMERIC ANTIGEN RECEPTOR T CELL LYMPHOCYTES WITH LYMPHOCYTE T-RECEPTOR DEFICIENTS AND METHODS OF USE THEREOF
US20220265709A1 (en) * 2018-06-19 2022-08-25 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Engineered cells and uses thereof
CN109370992A (zh) * 2018-09-28 2019-02-22 深圳市菲鹏生物治疗股份有限公司 一种通用型car-t细胞的纯化方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20230346933A1 (en) 2023-11-02
WO2021139755A1 (zh) 2021-07-15
AU2021206752A1 (en) 2022-09-01
EP4089165A1 (en) 2022-11-16
CN113088495A (zh) 2021-07-09
EP4089165A4 (en) 2024-02-28
JP2023509765A (ja) 2023-03-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3674328B1 (en) Chimeric antigen receptor (car) binding to bcma, and uses thereof
CN114144430B (zh) Cd7-car-t细胞及其制备和应用
CN107531801B (zh) 用于分选/清除工程化的免疫细胞的mAb驱动的嵌合抗原受体***
CN108373504B (zh) Cd24特异性抗体和抗cd24-car-t细胞
CN107903324B (zh) 一种结合人cd19和cd3的双特异性抗体
CN110662771A (zh) 一种结合bcma的嵌合抗原受体(car)及其应用
US11957717B2 (en) Anti-human MSLN antibody and MSLN-targeting immune effector cell
EP3293199A1 (en) Chimeric antigen receptors
US20220089678A1 (en) Anti-bcma chimeric antigen receptors
KR20220018479A (ko) 동종이계 car-t 세포, 이의 제조 및 응용
CN110078830A (zh) 一种在共刺激结构域上携带重复活化基序的嵌合抗原受体t细胞
KR20220129015A (ko) 조작된 t 세포, 이의 제조 및 응용
CN109970859B (zh) Glypican-3特异性抗体及其特异性CAR-T细胞
CN116284389A (zh) 抗afp/hla02 tcr样抗体及其用途
CN113005088B (zh) 工程改造的t细胞、其制备及应用
CN115698285A (zh) 具有cd2激活的嵌合抗原受体
CN114685683A (zh) 靶向gd2的car-t细胞及其制备和应用
CN113527507A (zh) 靶向cd22的嵌合抗原受体及其制法和应用
WO2023273762A1 (zh) 介导细胞内有效滞留cd3的空间构象表位及其应用
CN113832174A (zh) 同种异体t细胞及其制备和应用
CN115717125A (zh) 同种异体t细胞、其制备及应用
CN110577604A (zh) 携带gitr共刺激信号靶向egfr的嵌合抗原受体t细胞
CN112300997A (zh) 通用型car-t细胞及其制备和应用