CN111996294A - 一种定量检测鳗鲡疱疹病毒的引物对和试剂盒 - Google Patents

一种定量检测鳗鲡疱疹病毒的引物对和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种定量检测鳗鲡疱疹病毒的引物对和试剂盒，属于分子生物学技术领域。本发明所提供的引物对基于鳗鲡疱疹病毒囊膜蛋白ORF49基因；使用本发明所提供的鳗鲡疱疹病毒定量检测试剂盒，可针对鳗鲡疱疹病毒可潜伏感染的特性，实现疑似鳗鲡疱疹病毒病病样的快速、准确定量检测，具有灵敏度高、特异性强、重复性好等特点，提高无症状鳗鲡中鳗鲡疱疹病毒的检出率，对生产中鳗鲡“脱黏败血综合征”的防控具有重要意义。

Description

一种定量检测鳗鲡疱疹病毒的引物对和试剂盒
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种定量检测鳗鲡疱疹病毒的引物对和试剂盒。
背景技术
鳗鲡疱疹病毒（Anguillid herpesvirus, AngHV）是养殖鳗鲡的一种重要病毒性病原，由Sano等首次从日本养殖的日本鳗鲡（Anguilla japonica）体内分离。此后，从世界多地的不同品种鳗鲡体内分离出鳗鲡疱疹病毒，血清学和基因序列分析表明，亚洲和欧洲分离的鳗鲡疱疹病毒为同一病毒株。前期研究中，课题组用PCR法从福建省养殖的鳗鲡体内检测出鳗鲡疱疹病毒，并利用鳗鲡卵巢细胞系（Eel ovary cell line, EO）从鳗鲡“脱黏败血综合征”病料中分离出鳗鲡疱疹病毒，这是我国大陆首次分离出该病毒。
鳗鲡“脱黏败血综合征”是幼鳗养殖阶段的主要疫病，病鳗常呈现“脱黏”、“红头”、“败血”等症状，具有发病率高、传染性强、死亡量大等特点；若成鳗发病，则发病急、病症严重，多呈现“败血”症状，引起大量死亡，给养殖业者造成严重的经济损失。攻毒实验和流行病学分析表明，鳗鲡疱疹病毒就是鳗鲡“脱黏败血综合征”的致病病原。流行病学调查表明，鳗鲡疱疹病毒可潜伏感染，其致病性与环境、水温等密切相关，水温低时一般不发病，而水温升高时，发病率也升高。
鳗鲡疱疹病毒属于疱疹病毒目(Herpesvirales)、鱼类疱疹病毒亚科（Alloherpesviridae）、鲤疱疹病毒属（Cyprinivirus），其基因组为线性双链DNA，基因组全长248 kb，含136个开放阅读框（ORF），由一段独特的长序列以及两侧11 kb末端重复序列组成。基因序列分析表明，鳗鲡疱疹病毒与鱼类疱疹病毒亚科的其他病毒序列和基因序列的同源性均较低，仅有19％~58％。
目前，已建立的鳗鲡疱疹病毒检测方法中原位杂交法操作复杂，且需要使用同位素标记，对操作人员的健康可能存在安全隐患；免疫过氧化物酶单层试验和免疫间接荧光抗体试验均需要鳗鲡疱疹病毒的抗体，不易获得；常用的PCR法无法对病毒进行准确定量，且扩增后必须进行琼脂糖电泳才可以观察扩增结果，操作步骤多，需时久。随着分子生物学技术的发展，qPCR法因其快速、灵敏、准确等特点被广泛用于病原检测。本发明拟针对鳗鲡疱疹病毒可潜伏感染的特性，提供一种利用SYBR Green qPCR法定量检测鳗鲡疱疹病毒的引物和试剂盒，区别于TaqMan探针法，具有特异性强、灵敏度高、成本低、操作简单等优点，为快速、准确的定量检测鳗鲡疱疹病毒提供了新的检测手段，提高无症状鳗鲡中鳗鲡疱疹病毒的阳性检出率，有利于鳗鲡“脱黏败血综合征”的提前预防。
发明内容
本发明的目的是提供一种定量检测鳗鲡疱疹病毒的引物对和试剂盒，试剂盒可用于鳗鲡组织和细胞样品中鳗鲡疱疹病毒的快速、定量检测，具有特异性强、灵敏度高、重复性好等特点。
本发明解决其技术问题所采用的方案是：提供一种用于定量检测鳗鲡疱疹病毒的特异性引物对，所述引物对是通过从设计的10对引物中优选获得，针对的靶标基因为鳗鲡疱疹病毒ORF49，所述引物序列为：
AngHV_qF: 5´-CCGTGGTGGTGCCTCTTATCTACA-3´
AngHV_qR: 5´-TCCTCCGCGGCGTCCACAG-3´
本发明还提供一种用于定量检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒，包含上述引物对、含有鳗鲡疱疹病毒ORF49基因的阳性质粒标准品、阴性对照品，SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ ( TliRNaseH Plus)(2×)和ROX Reference DyeⅡ(50×)（购自TaKaRa公司）。
上述试剂盒中阳性质粒标准品浓度为1×109 拷贝/μL，阴性对照品为灭菌ddH2O。
上述试剂盒所采用的定量检测鳗鲡疱疹病毒方法为qPCR法，包括以下步骤：
（1）建立qPCR反应标准曲线：阳性质粒标准品按10倍比稀释为108~101拷贝/μL 8个浓度梯度，作为模板，以鳗鲡疱疹病毒qPCR检测的特异性引物对进行qPCR扩增，以模板拷贝数的对数为横坐标，对应的Ct值为纵坐标，制作标准曲线；
（2）将样品DNA稀释至标准曲线范围内，以鳗鲡疱疹病毒qPCR检测的特异性引物对为引物，进行qPCR反应，得到样品Ct值，根据标准曲线计算样品中病毒拷贝数；
（3）结果判定：Ct值＜35，且出现典型扩增曲线，则判断为阳性；阴性对照无典型扩增曲线，若阴性对照有扩增，则此次实验结果无效。
所述qPCR的反应体系和条件为：反应体系：2×Mix 10 μL，上下游引物(10 μM/μL)各0.8 μL，Dye II 0.4 μL , DNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。扩增条件：95 ℃预变性30 s；95℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。
上述qPCR检测方法所使用的荧光染料为SYBR Green。
对建立的qPCR方法进行灵敏性、特异性和重复性检测，并分别用PCR和qPCR两种方法对前期收集的疑似患“脱黏败血综合征”的鳗鲡组织样本进行检测，比较两种检测方法的阳性检出率。
上述的一种鳗鲡疱疹病毒的qPCR检测方法，建立的标准曲线中质粒拷贝数与Ct值的线性关系为y = -3.2859x + 37.427，相关系数R2为0.999，扩增效率为100.855%。
上述的一种鳗鲡疱疹病毒的qPCR检测方法，所述鳗鲡疱疹病毒的qPCR检测方法对鳗鲡疱疹病毒的最低检出拷贝数为10个。
上述的一种鳗鲡疱疹病毒的qPCR检测方法，所述鳗鲡疱疹病毒的qPCR检测方法的Ct值组内和组间变异系数均小于2%。
将上述试剂盒应用于鳗鲡组织和细胞样品中鳗鲡疱疹病毒的快速、定量检测。
本发明的有益效果：
（1）本发明提供的引物对是通过优选获得，针对的靶标基因为鳗鲡疱疹病毒ORF49。
（2）基于该引物对提供了一种定量检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒，该试剂盒灵敏性高，是普通PCR的100倍；特异性强，对几种常见的鳗鲡DNA病毒和阴性对照无扩增；重复性好，组内Ct值变异系数（C.V.）在0.05%~0.42%之间，组间Ct值C.V.在1.07%~1.13%之间，均小于2%。
（3）本发明提供的定量检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒可应用于检测疑似鳗鲡疱疹病毒感染样品，对疑似样品的阳性检出率明显高于普通PCR，为快速、准确的定量检测样品中鳗鲡疱疹病毒的数量提供了新的检测方法，可应用于鳗鲡疱疹病毒病的诊断和流行病学研究。
（4）本发明提供的定量检测鳗鲡疱疹病毒qPCR检测试剂盒使用的是SYBR Green染料法，区别于TaqMan探针法，具有成本低、应用广泛等特点。
附图说明
图1为鳗鲡疱疹病毒ORF49基因的扩增片段电泳图；其中：泳道M为DL1000 DNAmarker；泳道1为鳗鲡疱疹病毒，目的片段大小为693 bp，泳道2为阴性对照。
图2为本发明qPCR检测方法的标准曲线。
图3为本发明qPCR检测的熔解曲线，108~101拷贝质粒的熔解曲线均只有一个熔解峰，Tm值为88.34~88.95 ℃。
图4为本发明qPCR的灵敏性检测结果，其中1-9依次为1×108~1×100 拷贝/μL的重组质粒，10为阴性对照。
图5本发明常规PCR的灵敏性检测结果，其中泳道M为DL500 DNA marker；泳道1-9依次为1×108~1×100 拷贝/μL的重组质粒，泳道10为阴性对照。
图6为本发明qPCR的特异性检测结果，其中1为AngHV，2为重组质粒pET-32a-ORF49，3-5依次为CyHV-3、EIV、RGV，6为阴性对照。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详细说明。
所用病毒株、细胞系及备检材料
鳗鲡疱疹病毒(Anguillid herpesvirus, AngHV）、鳗鲡虹彩病毒（Eel iridovirus,EIV）、蛙虹彩病毒（Rana grylio virus, RGV）由福建省农科院生物技术研究所分离并保存。25份疑似感染鳗鲡疱疹病毒的鳗鲡组织样品由福建省农科院生物技术研究所于2008年至2019年间在福建省各鳗鲡养殖场采集并保存。
实施例1：定量检测鳗鲡疱疹病毒试剂盒的引物设计与筛选
参照Genbank中鳗鲡疱疹病毒ORF8、ORF49、ORF78和ORF95基因的序列（NC_013668.3），采用DNASTAR lasergene V7.1设计10对鳗鲡疱疹病毒的特异性引物，作为本发明中检测方法的备选引物，由上海生工生物有限公司合成。
将AngHV接种鳗鲡卵巢细胞系（Eel ovary cell line, EO），待细胞产生典型病变后，收集细胞，提取DNA，作为模板，用合成的引物进行qPCR扩增，根据扩增曲线和Ct值筛选出扩增效率好、特异性强的引物对，用于后续检测方法的建立。
表1 筛选出的用于定量检测鳗鲡疱疹病毒的引物
Figure DEST_PATH_IMAGE002
实施例2：定量检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒
1、制备阳性质粒标准品
根据GenBank中鳗鲡疱疹病毒ORF49基因的序列（NC_013668.3），设计合成特异性引物对49F (5´-GGATCCATGATTTGTTGGGCGG-3´)和49R (5´-GAATTCTCATACGCAGCTCCCAAG-3´)。以鳗鲡疱疹病毒 DNA作为模板，进行PCR扩增，反应体系为：Premix Taq 12.5 μL，上下游引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 9.5 μL，阴性对照中用等量的ddH2O代替模板；反应条件为：95 ℃5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30个循环；72 ℃，10 min。
扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，切胶回收并纯化目的片段，进行测序验证。将目的片段克隆至pET-32a载体，用质粒抽提试剂盒提取质粒DNA后进行酶切、测序鉴定，获得质粒pET-32a-ORF49；用超微量紫外分光光度计测定其浓度和纯度，用DNA/RNA CopyNumber Calculator（http://www.endmemo.com/bio/dnacopynum.php）计算每μL提取DNA样品中质粒的拷贝数，-80℃保存备用。测得质粒的浓度为122.46 ng/μL，计算出的质粒拷贝数为1.8×1010 copies/μL。
2、建立标准曲线
将质粒pET-32a-ORF49的DNA按10倍比稀释为108~101拷贝/μL 8个浓度梯度，作为模板，用引物对AngHV_qF/AngHV_qR，使用SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ ( Tli RNaseH Plus) 试剂盒进行qPCR扩增，每个浓度设置3个重复，阴性对照用灭菌ddH2O代替模板，制作标准曲线。反应体系和反应条件如下，反应体系为20 μL ：2×Mix 10 μL，上下游引物(10 μM/μL)各0.8 μL，Dye II 0.4 μL , DNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。扩增条件：95 ℃预变性30 s；95℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。
用质粒拷贝数与Ct值绘制标准曲线（图2），质粒拷贝数与Ct值的线性关系为y = -3.2859x + 37.427，相关系数R2为0.999，扩增效率为100.855%，表明该qPCR的Ct值与108~101 拷贝的ORF49基因有较好的线性关系。熔解曲线分析表明（图3），108~101拷贝质粒的熔解曲线均只有一个熔解峰，Tm值为88.34~88.95 ℃，表明反应产物均为ORF49的特异性扩增，无非特异性扩增或引物二聚体产生。
3、灵敏性试验
以梯度稀释的质粒pET-32a-ORF49为模板，利用设计的引物对AngHV_qF/AngHV_qR分别进行qPCR和普通PCR扩增，分析两种方法所能检测的最低鳗鲡疱疹病毒拷贝数。
用108~100拷贝的10倍比稀释的质粒pET-32a-ORF49，分别进行qPCR和普通PCR扩增。结果显示，普通PCR的最低检出拷贝数为103（图4），而qPCR的最低检出拷贝数可达101（图5）；qPCR法比普通PCR的灵敏度高100倍。
4、特异性检测
将AngHV、CyHV-3、RGV和EIV分别接种细胞，待多数细胞发生典型细胞病变后，收集细胞，用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取DNA，作为模板，用建立的qPCR方法进行扩增，评价检测方法的特异性。结果表明，AngHV和质粒pET-32a-ORF49均有扩增曲线产生，而CyHV-3、EIV、RGV和阴性对照均无扩增信号（图6）。
5、重复性检测
取104、105、106 拷贝/μL 3个浓度的质粒pET-32a-ORF49，作为模板进行qPCR扩增，每个浓度设3个重复，根据Ct值的变异系数分析该方法的组内重复性；试验重复3次，分析组间重复性。
表2 鳗鲡疱疹病毒 qPCR的检测重复性
Figure DEST_PATH_IMAGE004
由表2可以看出，组内变异系数均小于1%，分别为0.42%、0.05%、0.19%；组间变异系数均小于2%，分别为1.13%、1.07%、1.13%，表明该方法重复性好，可保证检测结果的稳定性和可靠性。
实施例3：鳗鲡疱疹病毒定量检测试剂盒的应用
取实验室2008年至2019年间采集并保存的25份疑似感染鳗鲡疱疹病毒的鳗鲡组织样品，提取DNA，作为模板，用本发明提供的鳗鲡疱疹病毒定量检测试剂盒进行检测；同时用引物对AngHV_qF/AngHV_qR对样品进行普通PCR扩增（扩增体系25μL ：Premix Taq 12.5 μL，上下游引物(10 μM/μL)各1 μL， DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。扩增条件：95 ℃预变性5min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃延伸5 min），比较二者的鳗鲡疱疹病毒检出率。
表3 鳗鲡疱疹病毒定量检测试剂盒和普通PCR法检测疑似鳗鲡“脱黏败血综合征”样品
Figure DEST_PATH_IMAGE006
由表3可以看出，分别用本发明提供的鳗鲡疱疹病毒定量检测试剂盒和普通PCR方法对实验室2008年至2019年收集的25份疑似鳗鲡“脱黏败血综合征”病料进行检测，普通PCR法共检出19份阳性样品，阳性检出率为76%；而鳗鲡疱疹病毒定量检测试剂盒检出24份阳性样品，阳性检出率为96%，鳗鲡疱疹病毒定量检测试剂盒的阳性检出率明显高于普通PCR法。
本发明提供的定量检测鳗鲡疱疹病毒的引物对和试剂盒灵敏度高、特异性强、重复性好，应用效果好，可用于鳗鲡疱疹病毒的快速和定量检测，对鳗鲡“脱黏败血综合征”的防控也具有重要意义。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省农业科学院生物技术研究所
<120> 一种定量检测鳗鲡疱疹病毒的引物对和试剂盒
<130> 4
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccgtggtggt gcctcttatc taca 24
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tcctccgcgg cgtccacag 19
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggatccatga tttgttgggc gg 22
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gaattctcat acgcagctcc caag 24

Claims (5)

1.一种定量检测鳗鲡疱疹病毒的特异性引物对，其特征在于，所述引物序列为：
AngHV qF: 5´-CCGTGGTGGTGCCTCTTATCTACA-3´；
AngHV qR: 5´-TCCTCCGCGGCGTCCACAG-3´。
2.一种定量检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述引物对、含有鳗鲡疱疹病毒ORF49基因序列的阳性质粒标准品和阴性对照品，所使用的荧光染料为SYBR Green。
3.根据权利要求2所述的定量检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒，其特征在于，所述阳性质粒标准品浓度为1×109 拷贝/μL，阴性对照品为灭菌ddH2O。
4.根据权利要求2所述的定量检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒，其特征在于，所述定量检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒是采用qPCR法进行检测，包括以下步骤：
（1）建立qPCR反应标准曲线：阳性质粒标准品按10倍比稀释为108~101拷贝/μL 8个浓度梯度，作为模板，以鳗鲡疱疹病毒qPCR检测的特异性引物对AngHV qF/qR进行qPCR扩增，以模板拷贝数的对数为横坐标，对应的Ct值为纵坐标，制作标准曲线，所得标准曲线的线性回归方程为：y = -3.2859x + 37.427；
（2）将样品DNA稀释至标准曲线范围内，以鳗鲡疱疹病毒qPCR检测的特异性引物对为引物，进行qPCR反应，得到样品Ct值，根据标准曲线计算样品中病毒拷贝数；
（3）结果判定：Ct值＜35，且出现典型扩增曲线，则判断为阳性；阴性对照无典型扩增曲线，若阴性对照有扩增，则此次实验结果无效。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述qPCR的反应体系和条件如下，反应体系：2×Mix 10 μL，10 μM/μL上下游引物各0.8 μL，Dye II 0.4 μL , DNA模板1 μL，ddH2O7 μL；扩增条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40个循环。
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