CN110863067A - 检测鳗鲡疱疹病毒的引物对及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了检测鳗鲡疱疹病毒的引物对及试剂盒,属于病毒检测技术领域,所述引物对包括引物HAVSYBR_F和引物HAVSYBR_R;所述引物HAVSYBR_F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示;所述引物HAVSYBR_R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。采用SYBR Green qPCR方法,利用本发明所述引物对和试剂盒对鳗鲡疱疹病毒进行检测,无需电泳观察结果,也无需添加荧光探针,添加荧光染料即可;本发明所述试剂盒检测方法更快捷简便,成本更低。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域,尤其涉及检测鳗鲡疱疹病毒的引物对及试剂盒。
背景技术
鳗鲡疱疹病毒(herpesvirus anguillae,HVA)是一个普遍存在,具有高度传染性和高致病性的病毒性病原,能够导致鳗鲡“脱粘败血病”。自20世纪80年代以来,野生鳗鲡数量的减少或与之有关。HVA给多国鳗鲡养殖业造成巨大经济损失,目前该病毒已经在全球多个国家发现。随着鳗苗等活鳗的引进,我国主要鳗鲡养殖区普遍发生鳗鲡疱疹病毒感染。以我国“鳗鲡之都”福州为例,主要养殖场发病率约80%,个别养殖场发病率达100%,死亡率约90%,给养殖生产造成严重的危害。
对于鳗鲡疱疹病毒的检测,国外已研究建立了分子杂交检测的方法。但是分子杂交检测方法灵敏度较低,检测程序复杂。无临床症状的鳗鲡依然会携带HVA,具有高灵敏度的检测方法才可以检测鳗鲡携带的HVA。分子杂交的方法不利于携带HVA的鳗鲡的检测,也不满足快速检测通关要求。Rijsewijk等(Rijsewijk,Frans1.Development of apolymerase chain reaction for the detection of Anguillid herpesvirus DNA ineels based on the herpesvirus DNA polymerase gene[J].Journal of VirologicalMethods,2005,1-2:87-94.)建立的PCR检测方法,以HVA的DNA聚合酶基因为序列,分别通过引物对HVApolF/HVApolR,和HVAF/HVAR扩增产生394bp及620bp的目的条带。上述方法存在下述问题:(1)由于不同的普通PCR检测方法因其引物的特性不同,以及反应条件等因素的影响,灵敏度和特异性具有较大差距,上述研究报道的两种PCR检测方法是否满足口岸检疫部门所采用的检测方法应具备的准确性、灵敏性等要求尚待国内权威机构及专家的验证;(2)普通PCR方法检测程序依然较复杂,易于交叉污染,检测通量较低,不利于高通量的检测。2016年,Beurden等报道了利用TaqMan探针检测HVA的的real-time PCR方法(Beurden,Voorbergen-Laarman,Roozenburg,Development and validation of a real-time PCRassay for the detection of anguillid herpesvirus 1[J].Journal of FishDiseases.2016,39,95-104.),进一步简化了检测程序,避免了交叉污染,但是所述方法成本高,不利于规模化推广。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的在于提供检测鳗鲡疱疹病毒的引物对及试剂盒;采用SYBR Green qPCR方法,利用所述引物对和试剂盒对鳗鲡疱疹病毒进行检测,比普通PCR方法更快捷简便,比荧光探针PCR成本更低。
为了实现上述发明目的,本发明提供了以下技术方案:
本发明提供了检测鳗鲡疱疹病毒的引物对,包括引物HAVSYBR_F和引物HAVSYBR_R;所述引物HAVSYBR_F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示;所述引物HAVSYBR_R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明提供了一种检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒,包括所述的引物对。
优选的,所述试剂盒中的引物HAVSYBR_F和引物HAVSYBR_R的使用浓度独立为0.3~0.5μmol/L。
优选的,所述试剂盒中的引物HAVSYBR_F和引物HAVSYBR_R的使用浓度为0.4μmol/L。
优选的,所述试剂盒还包括SYBR Premix Ex Taq II、阳性对照DNA和水。
优选的,所述试剂盒的检测样本对象包括鳗鲡的组织、细胞或DNA。
本发明的有益效果:本发明提供了检测鳗鲡疱疹病毒的引物对和试剂盒;采用SYBR Green qPCR方法,利用所述引物对和试剂盒对鳗鲡疱疹病毒进行检测,无需电泳观察结果,也无需添加荧光探针,添加荧光染料即可;本发明提供的引物对和试剂盒比普通PCR方法更快捷简便,比荧光探针PCR成本更低。
附图说明
图1为SYBR qPCR扩增动力曲线图。
具体实施方式
本发明提供了检测鳗鲡疱疹病毒的引物对,包括引物HAVSYBR_F和引物HAVSYBR_R;所述引物HAVSYBR_F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示;所述引物HAVSYBR_R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明中所述引物对根据GenBank中HAV的DNA聚合酶基因保守序列设计,具体的序列和特征如表1所示。
表1引物对的核苷酸序列和特征参数
本发明提供了一种检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒,包括上述述的引物对;在本发明中,所述试剂盒中的引物HAVSYBR_F和引物HAVSYBR_R的使用浓度独立优选为0.3~0.5μmol/L更优选为0.4μmol/L。
在本发明中,所述试剂盒优选的还包括SYBR Premix Ex Taq II、阳性对照DNA和水。本发明对所述SYBR Premix Ex Taq II没有特殊限定,采用本领域市售产品即可。在本发明中,所述阳性对照DNA为包括鳗鲡疱疹病毒序列的DNA,优选为包括鳗鲡疱疹病毒DNA的重组质粒;所述水优选为PCR专用水。在本发明中,所述试剂盒的检测样本对象包括鳗鲡的组织、细胞或DNA;具体的为鳗鲡的脾脏、肾脏或肝脏等组织的细胞提取的DNA。在本发明中,所述试剂盒还包括阴性对照品;所述阴性对照品优选为水。
在本发明中,所述试剂盒的使用方法优选的包括以下步骤:
1)从待检测的鳗鲡材料中提取DNA;
2)将所述提取获得的DNA、SYBR Premix Ex Taq II和水混合进行荧光染料qPCR;根据所述荧光染料qPCR的检测结果确定所述鳗鲡材料中是否存在鳗鲡疱疹病毒。
在本发明中,从待检测的鳗鲡材料中提取DNA。本发明对所述提取DNA的方法没有特殊限定,采用本领域常规的动物血液、细胞、组织基因组DNA提取试剂盒进行提取即可。
本发明将所述提取获得的DNA、SYBR Premix Ex Taq II和水混合进行荧光染料qPCR。在本发明中,所述荧光染料qPCR的扩增体系优选的如表2所示、
表2荧光染料qPCR扩增体系
在本发明中,所述荧光染料qPCR的扩增程序优选的如下:95℃预变性10min;95℃变性5s、60℃退火30s,40个扩增循环;在60℃时收集荧光信号。
在本发明中,优选的将所述样本DNA替换为阳性对照DNA;按照上述体系和程序进行扩增;结果作为阳性对照参考。
在本发明中,优选的将所述样本DNA替换为阴性对照品水;按照上述体系和程序进行扩增;结果作为阴性对照参考。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明,但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
根据GenBank中HAV的DNA聚合酶基因保守序列,采用Primer3 Plus软件,设计特异引物对,如下:
扩增程序:95℃预变性10min,40个扩增循环过程为95℃5s、60℃30s,在60℃时收集荧光信号。
扩增体系如下:
将纯化的***有鳗鲡病毒基因序列的标准品重组质粒进行系列稀释,得到质粒浓度为1.28×107~1.28copies/μL的倍比稀释标准品。
以系列稀释的质粒DNA为模板进行SYBR Green qPCR的结果如图1所示,表明所述方法可以检测到12.8拷贝的质粒标准品模板;可以得到良好的扩增曲线和单一峰形的溶解曲线,并可以将样品检测到12.8copies。
样本检测
D7和D8 HAV阳性样本来源为确认感染有HVA的鳗鲡肝组织;D9阴性对照来源为确认未感染HVA的鳗鲡肝组织;D10空白对照为无菌水。
软件检测结果如表3所示。
表3 SYBR Green qPCR检测结果
注:D7~D8.HAV阳性样本检测平行,D9为阴性对照,D10为空白对照。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 厦门海关技术中心
<120> 检测鳗鲡疱疹病毒的引物对及试剂盒
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ggtgaacaag gtggtgttgg 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
catctgacag atgcgatccg a 21
Claims (6)
1.检测鳗鲡疱疹病毒的引物对,其特征在于,包括引物HAVSYBR_F和引物HAVSYBR_R;所述引物HAVSYBR_F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示;所述引物HAVSYBR_R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.一种检测鳗鲡疱疹病毒的试剂盒,其特征在于,包括权利要求1所述的引物对。
3.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中的引物HAVSYBR_F和引物HAVSYBR_R的使用浓度独立为0.3~0.5μmol/L。
4.根据权利要求3所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒中的引物HAVSYBR_F和引物HAVSYBR_R的使用浓度为0.4μmol/L。
5.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括SYBR Premix Ex TaqII、阳性对照DNA和水。
6.根据权利要求2所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒的检测样本对象包括鳗鲡的组织、细胞或DNA。
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