CN112852987A - 一种检测鳗鲡肤孢虫的pcr特异性引物及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种检测鳗鲡肤孢虫的PCR特异性引物及检测方法，该引物对的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示。提取待检测样本的DNA并以该DNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物对为引物进行PCR扩增，如果能得到836bp的扩增产物，则该样本含有鳗鲡肤胞虫。本发明使用鳗鲡肤孢虫18S rDNA作为分子靶标进行引物设计，可以成功的从感染了鳗鲡肤胞虫的鳗鲡与翘嘴鳜组织中扩出鳗鲡肤孢虫，具有较高的特异性与灵敏性，操作简单快捷，能够准确地对鳗鲡肤孢虫的早期阶段进行检测及鉴定，有效预测鳗鲡肤孢虫病。

Description

一种检测鳗鲡肤孢虫的PCR特异性引物及检测方法

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种检测鳗鲡与翘嘴鳜寄生鳗鲡肤孢虫的PCR引物及方法。

背景技术

肤孢虫(Dermocystidium)隶属于新单胞菌门(Neomonada)、中粘菌纲(Mesomycetozoea)、肤孢虫目(Dermocystida)，是一类寄生于鱼类鳃、鳍条、皮肤的单细胞寄生虫。肤孢虫在宿主靶器官形成大量孢囊，影响宿主生长发育，降低商品鱼价值，严重时可导致养殖鱼类的大量死亡肤孢虫在宿主靶器官形成大量孢囊，影响宿主生长发育，降低商品鱼价值，严重时可导致养殖鱼类的大量死亡。

鳗鲡是我国名贵的优质养殖种类，翘嘴鳜是我国重要的经济养殖品种，随着近年来养殖***的完善与养殖技术的升级，我国水产养殖规模逐渐扩大，但病害问题也逐年增多，其中鳗鲡肤孢虫病严重影响我国鳗鲡与翘嘴鳜的养殖效益。

鳗鲡肤孢虫(Dermocystidiumanguillae)爆发时的明显症状为在鳗鲡鳃部或者翘嘴鳜的鳃部以及皮肤鳍条出现大量细长白色孢囊。鳗鲡肤孢虫病的流行时间一般为每年的3-4月与9-11月，患病鱼体之间可相互感染，感染率较高。我国肤孢虫病的检测也是以肉眼可见的白色孢囊和显微镜下观察的孢囊内的球形孢子为依据，此方法虽易于操作，但只能检测已出现病变的宿主，对于较为早期的无症状或者症状不明显感染无法进行有效检测。而且鳗鲡肤孢虫孢子由孢囊包裹且孢子具有几丁质的细胞壁，药物难以对其发挥作用，至今仍没有有效的防控方法。

PCR检测技术是根据生物体特异性基因片段，对生物体进行检测鉴定的技术，具有特异性高、灵敏性强以及高效快捷等优点。由于目前我国大部分鳗鲡(如：美洲鳗鲡)苗种来源于国外进口，因此，有必要建立一种简单快速的早期检测方法，为鳗鲡肤孢虫病的潜伏、发生提供可靠的监测手段，进而为有效预测与防治鳗鲡肤孢虫提供科学依据。

发明内容

本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种检测鳗鲡与翘嘴鳜寄生鳗鲡肤孢虫的PCR引物及方法，解决现有的镜检只能检测已发病鱼类无法在感染早期进行检测的问题。

本发明的技术方案为：检测鳗鲡肤孢虫的PCR特异引物对，该引物对的上游引物序列为：5’-TTCGCTTCTCGAAAGCGGC-3’(SEQ ID No.1)，下游引物序列为：5’-TTACCCATACCTTCCGGTACAGGTG-3’(SEQ ID No.2)。

检测鳗鲡肤孢虫的PCR方法，提取待检测样本的DNA并以该DNA为模板，以SEQ IDNo.1和SEQ ID No.2所示的引物对为引物进行PCR扩增，如果能得到836bp的扩增产物，则该样本含有鳗鲡肤胞虫。

进一步地，上述PCR扩增中，反应体系为：DNA扩增模板1μl，上下游引物各0.5μl，2×Taq Plus PCR Master Mix 10μl，灭菌ddH₂O补足至20μl；反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min，12℃保存。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明使用鳗鲡肤孢虫18S rDNA作为分子靶标，使用其基因序列与鳗鲡以及翘嘴鳜18S rDNA序列比对的差异位点进行引物设计，具有较高的特异性与灵敏性，可以对鳗鲡肤孢虫的早期阶段进行检测，有效预测鳗鲡肤孢虫病。

附图说明

图1 PCR特异性试验凝胶电泳图，M：DNA分子质量标准；1：鳗鲡肤孢虫；2：美洲鳗鲡；3：翘嘴鳜；4：空白对照；

图2PCR灵敏性试验凝胶电泳图，M：DNA分子质量标准；1-9分别为1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8ng鳗鲡肤孢虫DNA+100ng美洲鳗鲡DNA+100ng翘嘴鳜DNA；10：空白对照。

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。

实验材料：鳗鲡肤孢虫、美洲鳗鲡、翘嘴鳜，样品全部由本实验室自行采集与保存。

主要试剂：通用型柱式基因组提取试剂盒购于康为世纪生物科技，2×Taq PlusPCR Master Mix、琼脂糖凝胶均购于北京睿博兴科生物科技有限公司，Marker DL1500购于北京全式金生物技术有限公司。引物由北京擎科生物技术有限公司合成。

实施例1

(1)引物设计与筛选：根据七条鳗鲡肤孢虫序列拼接而成的一条长度1856bp的鳗鲡肤孢虫总序列，与美洲鳗鲡Anguilla rostrata(FM946071.1)、翘嘴鳜Sinipercachuatsi(AY452490.1)的18S rRNA序列进行比对找出差异位点，在变异区域进行引物设计与筛选，最终得到一对特异性引物，引物对上游引物序列为：5’-TTCGCTTCTCGAAAGCGGC-3’(SEQ IDNo.1)，下游引物序列为：5’-TTACCCATACCTTCCGGTACAGGTG-3’(SEQ ID No.2)。

(2)PCR检测：提取待检测标本的DNA并以该DNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示的引物对为引物进行PCR扩增，如果能得到836bp的扩增产物，则该标本含有鳗鲡肤胞虫。PCR扩增中，反应体系为：DNA扩增模板1μl，上下游引物各0.5μl，2×Taq Plus PCRMaster Mix 10μl，灭菌ddH₂O补足至20μl；反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min，12℃保存。

实施例2特异性检测

利用本发明设计的引物对，扩增鳗鲡肤孢虫DNA、健康美洲鳗和翘嘴鳜DNA，扩增反应体系为：DNA扩增模板1μl，上下游引物各0.5μl，2×Taq Plus PCR Master Mix 10μl，灭菌ddH₂O补足至20μl；反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min，12℃保存。扩增结束后取5μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，观察条带。检测引物的特异性。结果如图1所示：只有以鳗鲡肤孢虫DNA为模板可以扩增出预期长度的单一目的条带，而美洲鳗鲡与翘嘴鳜DNA未扩增出条带。表明本发明的筛选的引物特异性良好。

实施例3灵敏性检测

将提取的鳗鲡肤孢虫DNA进行10倍倍比稀释，得到不同的浓度(1、10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7、10^-8ng/μl)，每个反应加入100ng健康美洲鳗鲡DNA和翘嘴鳜DNA，以稀释后的不同浓度鳗鲡肤孢虫DNA与宿主DNA的混合物作为模板，以灭菌的ddH₂O作为空白对照，用具有特异性的引物进行PCR扩增。扩增结束后取5μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，观察条带，检测该引物的灵敏性。结果如图2所示：在宿主DNA干扰下，鳗鲡肤孢虫模板浓度为10^-6ng/μl时仍能扩增出条带，表明建立的PCR检测方法对鳗鲡肤孢虫的最低检测限为10^-6ng/μl，灵敏性较高。

序列表

<110> 青岛农业大学

<120> 检测鳗鲡与翘嘴鳜寄生鳗鲡肤孢虫的PCR引物及方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttcgcttctc gaaagcggc 19

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttacccatac cttccggtac aggtg 25

Claims (3)

1.检测鳗鲡肤孢虫的PCR特异引物对，该引物对的上游引物序列如SEQ ID No.1所示，下游引物序列如SEQ ID No.2所示。

2.检测鳗鲡肤孢虫的PCR方法，其特征在于，提取待检测样本的DNA并以该DNA为模板，以SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的引物对为引物进行PCR扩增，如果能得到836bp的扩增产物，则该样本含有鳗鲡肤胞虫。

3.根据权利要求2所述的检测鳗鲡肤孢虫的PCR方法，其特征在于，PCR扩增中，反应体系为：DNA扩增模板1μl，上下游引物各0.5μl，2×Taq Plus PCR Master Mix 10μl，灭菌ddH₂O补足至20μl；反应条件为：94℃预变性4min，94℃变性30s，59℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环；72℃延伸5min，12℃保存。

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