CN114182046B - 人类疱疹病毒的病原体核酸检测引物探针组合、试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物及核酸基因组检测领域，具体涉及利用等温核酸扩增技术对临床上一种常见的人类疱疹病毒(EB病毒)核酸检测的引物组合和探针，特别涉及EB病毒的等温核酸检测引物探针组合，试剂盒及其应用。本发明提供的引物组合与探针，特异性好，灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及微生物及核酸基因组检测领域，特别涉及人类疱疹病毒的病原体核酸检测引物探针组合、试剂盒及其应用。
背景技术
EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)是人类疱疹病毒家族中的双链DNA病毒，可引起多种常见的临床疾病，EBV感染是传染性单核细胞增多症的主要病因，在儿童中常见，也与B淋巴瘤相关疾病和鼻咽癌密切相关。与其他人类疱疹病毒一样，EB病毒感染也可引起神经***感染、呼吸道疾病等。EB病毒还具有潜伏特性，感染人体后，往往会潜伏于人类B淋巴细胞，当人体免疫力低下的情况下，容易再激活引发相关疾病，特别是在发育未完全的新生儿中、患有HIV感染患者和接受器官移植的患者中，严重危害人类的生命和健康。
目前，在临床上对EB病毒感染的病原学鉴定主要包括免疫学检测和分子生物学检测。免疫学检测适合于流行病学调查，但存在有耗时长、窗口期不稳定等问题。虽然异嗜性凝集试验可以提示EBV感染，但在儿童中往往呈阴性，影响临床大夫对疾病判断。近几年，定量聚合酶链反应(Quantitative Polymerase chain reaction, qPCR)逐渐成为病原体核酸检测的“金标准”，对病原体的核酸定量检测，为临床提供早期诊断和可依据的预防治疗。然而，昂贵且精密的复杂设备在基层应用中难度较大，因此有必要开发一种简单、快速、方便、适用的核酸检测方法。
发明内容
有鉴于此，本发明提供了人类疱疹病毒（EB病毒）的病原体核酸检测引物探针组合、试剂盒及其应用。本发明提供的引物组合与探针，特异性好，灵敏度高。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了引物探针组合，包括第一引物探针组合和/或第二引物探针组合；
所述第一引物探针组合为含有外源性内参的等温核酸扩增体系组合，具有：
（I）. 上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和
（II）. 下游引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；和
（III）. 探针具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；或
（IV）. 如（I）、（II）和/或（III）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（I）、（II）和/或（III）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
（V）. 与（I）、（II）、（III）和/或（IV）所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列；和/或
所述第二引物探针组合为含有内源性内参的等温核酸扩增体系组合，具有：
（I）. 上游引物具有如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；和
（II）. 下游引物具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；和
（III）. 探针具有如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；或
（IV）. 如（I）、（II）和/或（III）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（I）、（II）和/或（III）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
（V）. 与（I）、（II）、（III）和/或（IV）所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述引物探针组合还包括靶基因探针，所述靶基因探针具有：
（I）. 如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；或
（II）. 如（I）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（I）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
（III）. 与（I）和/或（II）所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，所述第二引物探针组合为含有内源性内参的等温核酸扩增体系组合，还包括：
（I）. 上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和
（II）. 下游引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；和
（III）. 探针具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；或
（IV）. 如（I）、（II）和/或（III）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（I）、（II）和/或（III）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
（V）. 与（I）、（II）、（III）和/或（IV）所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列。
基于上述研究，本发明还提供了所述的引物组合在制备检测EB病毒的试剂或试剂盒中的应用。在本发明的一些具体实施方案中，所述人类疱疹病毒为EB病毒。在本发明的一些具体实施方案中，所述检测的扩增温度为39℃，扩增时间为30min。
此外，本发明还提供了人类疱疹病毒的检测试剂，包括所述的引物探针组合以及可接受的助剂。在本发明的一些具体实施方案中，所述人类疱疹病毒为EB病毒。
更重要的是，本发明还提供了人类疱疹病毒的检测试剂盒，包括所述的引物探针组合以及可接受的助剂或载体。在本发明的一些具体实施方案中，所述人类疱疹病毒为EB病毒。
重组酶介导的等温核酸扩增技术(Recombinase-aided amplification，RAA)是近几年新出现的具有我国自主知识产权的等温核酸扩增技术，在病原体核酸检测领域和单核苷酸多态性检测中被广泛应用，RAA技术在恒温条件下，体系内的重组酶与引物紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全匹配的序列时，在单链DNA结合蛋白的作用下，使模板双链打开，并在DNA聚合酶的作用下，启动模板合成，形成DNA双链，如此循环重复进而实现指数扩增，反应30min即可快速完成扩增，通过特异性荧光探针检测，最快几分钟即可判断结果。内部质控（internal control ，IC）包括外源性内参和内源性内参，是核酸检测反应的一个重要的体系监控，在核酸检测反应体系中引入IC，实时监测整个反应体系以此避免因操作失误、温度不当、反应体系混合物不正确、酶活性差或样品基质中存在抑制物质等原因导致的假阴性结果。外源性内参，是在反应体系或标本中添加一段内参模板。内源性内参采用来源于样本中的人类基因组，使用不同的引物对对靶基因和人运行基因分别进行扩增检测，更重要的是，可以对核酸提取到结果判读整个过程进行实时监控，不仅对扩增反应进行监控，还能够对样本采集质量和核酸提取质量进行解释。
本发明采用两种不同形式的IC引入RAA反应体系内，实现对EB病毒的实时核酸检测和监测。具体涉及利用等温核酸扩增技术对临床上一种常见的人类疱疹病毒（EB病毒）核酸检测的引物组合和探针。本发明提供的引物组合与探针，特异性好，灵敏度高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1（A）~图1（B）示含有外源性内参的等温核酸扩增检测EBV技术的外源性内参浓度分析图，靶基因为100拷贝/反应。其中，1 :1，2:2，3:4；4:10；
图2（A）~图2（B）示含有外源性内参的等温核酸扩增检测EBV技术的外源性内参浓度分析图，靶基因为5拷贝/反应；其中，1 :1，2:2，3:4；4:10；
图3（A）~图3（B）示含有外源性内参的等温核酸扩增检测EBV技术的外源性内参浓度分析图，靶基因为101拷贝/反应；其中，1 :1，2:2，3:4；4:10；
图4（A）~图4（B）示含有外源性内参的等温核酸扩增检测EBV技术的灵敏度分析图。其中，1：阴性，2：5，3：101，4：102，5:103,6:104;
图5（A）~图5（B）示含有外源性内参的等温核酸扩增检测EBV技术的特异性分析图;
图6（A）~图1（B）示含有内源性内参的等温核酸扩增检测EBV技术的灵敏度分析图，内源性内参浓度为2✕104拷贝/μL。其中，1:104，2:103，3：1024：101，5：2，6：阴性;
图7（A）~图7（B）示含有内源性内参的等温核酸扩增检测EBV技术的灵敏度分析图，内源性内参浓度为2✕102拷贝/μL；其中，1:104，2:103，3：1024：101，5：2，6：阴性;
图8（A）~图8（B）示含有内源性内参的等温核酸扩增检测EBV技术的灵敏度分析图，内源性内参浓度为2拷贝/μL；其中，1:104，2:103，3：1024：101，5：2，6：阴性;
图9（A）~图9（B）示含有内源性内参的等温核酸扩增检测EBV技术的特异性分析图;
注：所有图A均代表本发明的EBV靶基因扩增图（FAM荧光），所有图B代表图A相对应的内参DNA扩增图（HEX荧光）；X轴代表时间（min），Y轴代表荧光值（mv）。
具体实施方式
本发明公开了人类疱疹病毒的病原体核酸检测引物探针组合、试剂盒及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了实现上述发明目的，发明人根据EB病毒基因组序列和人源性基因组（RNasP）序列，寻找同源性高的保守序列，设计适用于等温核酸扩增技术的特异性引物对和靶探针。经过比对提供两种目的基因的特异性DNA序列，两种目的基因的片段位置分别是GenBank登录号M80571.1公开的序列第177631–177771bp位（EBV）和GenBank登录号U77664.1公开的序列第554–708bp位（RNaseP）。
本发明提供了引物探针组合，包括第一引物探针组合和/或第二引物探针组合；
所述第一引物探针组合为含有外源性内参的等温核酸扩增体系组合，具有：
（I）. 上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和
（II）. 下游引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；和
（III）. 探针具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列；或
（IV）. 如（I）、（II）和/或（III）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（I）、（II）和/或（III）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
（V）. 与（I）、（II）、（III）和/或（IV）所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列；和/或
所述第二引物探针组合为含有内源性内参的等温核酸扩增体系组合，具有：
（I）. 上游引物具有如SEQ ID No.5所示的核苷酸序列；和
（II）. 下游引物具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列；和
（III）. 探针具有如SEQ ID No.7所示的核苷酸序列；或
（IV）. 如（I）、（II）和/或（III）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（I）、（II）和/或（III）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
（V）. 与（I）、（II）、（III）和/或（IV）所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，引物探针组合还包括靶基因探针，所述靶基因探针具有：
（I）. 如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；或
（II）. 如（I）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（I）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
（III）. 与（I）和/或（II）所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列。
在本发明的一些具体实施方案中，引物探针组合中所述第二引物探针组合为含有内源性内参的等温核酸扩增体系组合还包括：
（I）. 上游引物具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；和
（II）. 下游引物具有如SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；和
（III）. 探针具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列；或
（IV）. 如（I）、（II）和/或（III）所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且与（I）、（II）和/或（III）所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或
（V）. 与（I）、（II）、（III）和/或（IV）所示的核苷酸序列至少有80%同一性的核苷酸序列。
基于上述研究，本发明还提供了所述的引物组合在制备检测人类疱疹病毒的试剂或试剂盒中的应用。在本发明的一些具体实施方案中，引物探针组合，所述人类疱疹病毒为EB病毒。
本发明实施例中，本发明采用的等温核酸扩增体系具体配置如下：缓冲液、冻干粉、靶基因正向引物、靶基因反向引物、靶基因探针、内参正向引物、内参反向引物、内参探针、内参和靶基因模板、无核酶水、醋酸镁。
更重要的是，本发明还提供了人类疱疹病毒的检测试剂，包括所述的引物探针组合以及可接受的助剂。在本发明的一些具体实施方案中，所述人类疱疹病毒为EB病毒。
本发明还提供了人类疱疹病毒（EB病毒)的检测试剂盒，包括所述的引物探针组合以及可接受的助剂或载体。在本发明的一些具体实施方案中，所述人类疱疹病毒为EB病毒。
本发明所采用的两种形式的内参。一种为外源性内参（重组DNA），由植物病毒片段和靶基因片段(本发明为EBV片段)组成，其中EBV靶基因探针(SEQ ID NO .3)互补区被植物病毒片段所替换，其他序列位置保留。在这种情况下，外源性内参DNA提前添加在等温核酸扩增反应体系中，EBV靶基因和外源性内参共同使用完全相同的引物序列，分别使用各自的探针进行荧光检测。另一种为内源性内参，内源性内参为人类基因组DNA片段，这种情况下，EBV靶基因和外源性内参分别使用各自的引物和探针进行扩增检测。
在本发明的一些具体实施方案中，所述扩增检测温度为39-42℃，优选39℃，扩增检测时间为15~30min，优选30min。
结果判读：体系混合后置于带有FAM（靶基因）和HEX（内参）通道的荧光检测仪中。在扩增时间范围内，设置荧光检测仪的曲线扩增斜率大于等于20且具有明显的扩增曲线，即可判断为阳性。
其中，FAM和HEX均为阳性，判断为阳性结果。
FAM为阳性，HEX为阴性，判断为阳性结果。
FAM为阴性，HEX为阳性，判断为阴性结果。
FAM和HEX均为阴性判断为无效结果。
本发明提供了利用等温核酸扩增技术对两种临床上常见的人类疱疹病毒的病原体核酸检测的引物组合和探针。本发明提供的引物组合与探针，特异性好，灵敏度高。
本发明提供的人类疱疹病毒的病原体核酸检测引物探针组合、试剂盒及其应用中，所用原料及试剂均可有市场购得。RAA扩增检测试剂盒（荧光法）购于江苏奇天有限公司。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
下载并比对全部EBV全基因组序列和RNaseP的基因组序列，选择保守性高的序列。根据RAA引物和探针设计原理，针对EBV BARF1基因和RPP38基因手工设计了引物和探针。引物和探针的长度范围分别为30-35bp和46-52bp。探针由携带5‘-FAM(靶基因探针)和5’-HEX(IC探针)的上游寡核苷酸组成，分别通过THF间隔区与相邻的下游寡核苷酸相连。下游寡核苷酸的3‘端带有C3’间隔区(聚合酶延伸阻断基团)，用Oligo7.0软件和NCBI的PrimerBLAST软件对引物和探针的特异性进行分析和评价，引物和探针的序列如SEQ ID No.1-SEQID No.7所示。所有的引物和探针均委托专业公司合成，引物采用PAGE纯化，探针采用HPLC纯化。三条探针采用双标记探针，靶基因探针使用FAM，IC探针使用HEX，淬灭集团均采用BHQ-1，两个荧光基团之间为四氢呋喃。
外源性内参序列为选择好的EBV靶基因序列，其靶基因探针位置被植物病毒序列片段代替。用所选EBV基因组序列中的玫瑰花环序列替换靶探针位置。委托专业公司合成构建和返回靶基因和两种内参目的片，用于后续发明中体系建立和优化。
EBV 靶基因序列 5’-3’：（如SEQ ID No.8所示）
ATGGCCAGGTTCATCGCTCAGCTCCTCCTGTTGGCCTCCTGTGTGGCCGCCGGCCAGGCTGTCACCGCTTTCTTGGGTGAGCGAGTCACCCTGACCTCCTACTGGAGGAGGGTGAGCCTCGGTCCAGAGATTGAGGTCAGCTGGTTTAAACTGGGCCCAGGAGAGGAGCAGGTGCTTATTGGGCGCATGCACCACGATGTCATCTTTATAGAGTGGCCTTTCAGGGGCTTCTTTGATATCCACAGAAGTGCCAACACCTTCTTTTTAGTAGTCACCGCTGCCAACATCTCCCATGACGGCAACTACCTGTGCCGCATGAAACTGGGCGAGACCGAGGTCACCAAGCAGGAACACCTGAGCGTGGTGAAGCCTCTAACGCTGTCTGTCCACTCCGAAAGGTCTCAGTTCCCAGACTTCTCTGTCCTTACTGTGACATGCACCGTGAATGCATTTCCCCATCCCCACGTCCAGTGGCTCATGCCCGAGGGCGTGGAGCCCGCACCAACTGCGGCAAATGGCGGTGTTATGAAGGAAAAGGATGGGAGCCTCTCTGTTGCTGTTGACCTGTCACTTCCCAAGCCCTGGCACCTGCCAGTGACCTGCGTTGGGAAAAATGACAAGGAGGAAGCCCACGGGGTTTATGTTTCTGGATACTTGTCGCAATAA
外源性内参序列 5’-3’:（如SEQ ID No.9所示）
ATGGCCAGGTTCATCGCTCAGCTCCTCCTGTTGGCCTCCTGTGTGGCCGCCGGCCAGGCTGTCACCGCTTTCTTGGGTGAGCGAGTCACCCTGACCTCCTACTGGAGGAGGGTGAGCCTCGGTCCAGAGATTGAGGTCAGCTGGTTTAAACTGGGCCCAGGAGAGGAGCAGGTGCTTATTGGGCGCATGCACCACGATGTCATCTTTATAGAGTGGCCTTTCAGGGGCTTCTTTGATATCCACAGAAGTGCCAACACCTTCTTTTTAGTAGTCACCGCTGCCAACATCTCCCATGACGGCAACTACCTGTGCCGCATGAAACTGGGCGAGACCGAGGTCACCAAGCAGGTAAGGTGCTAGACTAAAATTGTTGGGACTTTGAATCTCTGAAGTAAAAGGAGGTCTCAGTTCCCAGACTTCTCTGTCCTTACTGTGACATGCACCGTGAATGCATTTCCCCATCCCCACGTCCAGTGGCTCATGCCCGAGGGCGTGGAGCCCGCACCAACTGCGGCAAATGGCGGTGTTATGAAGGAAAAGGATGGGAGCCTCTCTGTTGCTGTTGACCTGTCACTTCCCAAGCCCTGGCACCTGCCAGTGACCTGCGTTGGGAAAAATGACAAGGAGGAAGCCCACGGGGTTTATGTTTCTGGATACTTGTCGCAATAA
内源性内参序列 5’-3’:（如SEQ ID No.10所示）
TGGACTTCAGAAGATTGAAGATAAGAAGAAAAAGAACAAAACACCTTTTCTGAAAAAAGAAAGCAGAGAGAAATGCAGCATTGCTGTTGATATTAGTGATAATCTGAAGGAGAAGAAAACAGATGCTAAGCAGCAAGTGTCAGGGTGGACGCCTGCACACGTCAGGAAGCAGCTTGTCATTGGCGTTAACGAAGTTACCAGAGCCCTGGAAAGGAGGGAACTGCTGTTAGTTCTGGTGTGTAAATCAGTCAAGCCTGCCATGATCACCTCACACTTGATTCAGTTAAGCCTAAGCAGAAGTGTCCCTGCCTGTCAGGTCCCCCGGCTCAGTGAGAGAATCGCCCCCGTCATTGGCTTAAAATGTGTTCTAGCCTTGGCGTTCAAAAAGAACACCACTGACTTTGTGGACGAAGTAAGAGCCATCATCCCCAGAGTCCCCAGTTTAAGTGTACCATGGCTTCAAGACAGAATTGAAGATTCTGGGGAAAATTTAGAGACTGAACCTCTGGAAAGCCAAGACAGAGAGCTTTTGGACACTTCATTTGAAGATCTGTCAAAACCTAAGAGAAAGCTTGCTGACGGTCGGCAGGCTTCTGTAACATTACAACC
引物和探针采用实施例1中设计合成好的引物探针（SEQ ID No.1-SEQ ID No.4）。模板采用实施例1中构建合成好的EBV靶基因DNA和外源性内参DNA。
反应试剂采用江苏奇天的RAA荧光检测试剂盒，整个等温核酸扩增体系（50ul）配置如下：缓冲液25μL、靶基因正向引物（如SEQ ID No.1所示，420nM）、反向引物（如SEQ IDNo.2所示，420nM）、靶基因探针（如SEQ ID No.3所示，120nM）、外源性内参探针（如SEQ IDNo.4所示，120nM）、 外源性内参DNA、模板1μL、无核酸酶水体积可调。将混合好的反应体系加入到预先装有冻干粉的反应管（单链结合蛋白500ng/μL、DNA聚合酶90ng/μL、重组酶400ng/μL、核酸外切酶85ng/μL和UvsY蛋白70ng/μL），最后添加醋酸镁14mM。
结果判读：体系混合后将反应管置于带有FAM（靶基因）和HEX（内参）通道的荧光检测仪中。在扩增时间范围内，设置荧光检测仪的曲线扩增斜率大于等于20且具有明显的扩增曲线，即可判断为阳性。扩增效果主要通过荧光信号强度和起峰时间判断。
其中，FAM和HEX均为阳性，判断为阳性结果。
FAM为阳性，HEX为阴性，判断为阳性结果。
FAM为阴性，HEX为阳性，判断为阴性结果。
FAM和HEX均为阴性判断为无效结果，建议重新检测。
外源性内参浓度的确认
根据经验，在外源性内参DNA浓度分别为10拷贝/μL、4拷贝/μL、2拷贝/μL和1拷贝/μL时，检测低拷贝的EBV靶基因标准质粒（1、5、10拷贝/反应），保证外源性内参的扩增不会影响靶基因的正常扩增并确认合适的外源性内参DNA浓度。
结果显示，当EBV靶基因拷贝数为10拷贝时，4种不同浓度的外源性内参均被判断为阳性，而且并未影响到靶基因的正常扩增，靶基因的扩增效果无明显差异。如图3A-图3B所示。当EBV靶基因拷贝数为5拷贝时，4种不同浓度的外源性内参均被判断为阳性，而且并未影响到靶基因的正常扩增。其中，在外源性内参DNA浓度为1拷贝/μL存在情况下，靶基因(1拷贝)的扩增效果（荧光值和起峰时间）要优于另外3种外源性内参DNA浓度存在情况下靶基因的扩增效果。如图3A-图3B所示。当EBV靶基因拷贝数为1拷贝，4种不同浓度的外源性内参均被判断为阳性，而靶基因为阴性。如图3A-图3B所示。重复以上实施例，能得到相同的扩增结果，重复性好。因此本发明根据本实施例中所得到的，内参的扩增并未影响靶基因的扩增，且靶基因的扩增效果达到最优。最终选择的合适的外源性内参DNA浓度为1拷贝每微升。
按照本实施例中确定的体系和外源性内参DNA浓度对本发明中检测EBV的含有外源性内参的等温核酸扩增技术进行灵敏度和特异性分析。
使用实时例中1的EBV靶基因模板（104、103、102、101、5、100拷贝/反应)进行灵敏度分析。在外源性内参DNA浓度为1拷贝/μL时，内参的扩增不影响靶基因的正常扩增，且靶基因的灵敏度为5拷贝/反应。重复以上结果，重复性好。结果如图4A-图4B所示。
使用本发明中收集的其他病毒的临床样本阳性核酸，包括EBV、人类疱疹病毒1型、2型、5型、6型、人类乙型肝炎病毒、人类丙型肝炎病毒和西尼罗病毒以及人类基因组。结果显示，与其他种类病原体均无无交叉反应，表明方法特异性好。如图5A-图5B所示。
实施例3 含有内源性内参的等温核酸扩增检测EBV技术体系的建立、灵敏度分析、特异性分析
与实施例2不同的是，引物和探针采用实施例1中设计合成好的引物探针（SEQ IDNo.1-SEQ ID No.3和SEQ ID No.5-SEQ ID No.7）。模板采用实施例1中构建合成好的EBV靶基因DNA和内源性内参DNA。
反应试剂采用江苏奇天的RAA荧光检测试剂盒，整个等温核酸扩增体系（50ul）配置如下：缓冲液25μL、靶基因正向引物（如SEQ ID No.1所示，420nM）、反向引物（如SEQ IDNo.2所示，420nM）、靶基因探针（如SEQ ID No.3所示，120nM）、内源性内参正向引物（如SEQID No.4所示，120nM）、内源性内参反向引物（如SEQ ID No.4所示，120nM）、内源性内参探针（如SEQ ID No.4所示，50nM）、无核酸酶水和模板的体积可调。将混合好的反应体系加入到预先装有冻干粉的反应管（单链结合蛋白500ng/μL、DNA聚合酶90ng/μL、重组酶400ng/μL、核酸外切酶85ng/μL和UvsY蛋白70ng/μL），最后添加醋酸镁14mM。
结果判读：体系混合后将反应管置于带有FAM（靶基因）和HEX（内参）通道的荧光检测仪中。在扩增时间范围内，设置荧光检测仪的曲线扩增斜率大于等于20且具有明显的扩增曲线，即可判断为阳性。扩增效果主要通过荧光信号强度和起峰时间判断。
其中，FAM和HEX均为阳性，判断为阳性结果。
FAM为阳性，HEX为阴性，判断为阳性结果。
FAM为阴性，HEX为阳性，判断为阴性结果。
FAM和HEX均为阴性判断为无效结果，建议重新检测。
按照本实施例中确定的体系，对本发明中检测EBV的含有外源性内参的等温核酸扩增技术进行灵敏度和特异性分析。
根据经验，使用实时例中1的EBV靶基因模板（104、103、102、101、2拷贝/反应)，在3种不同的内源性内参存在情况下进行进行灵敏度分析。结果显示，在内源性内参浓度为2✕104拷贝/μL，8次重复检测结果，其灵敏度均可以达到2拷贝每反应。结果如图6A-图6B所示；在内源性内参浓度为2✕102拷贝/μL，8次重复检测结果，其灵敏度均可以达到2拷贝每反应。结果如图7A-图7B所示；在内源性内参浓度为2拷贝/μL，8次重复检测结果，其灵敏度均可以达到2拷贝每反应。结果如图8A-图8B所示。
使用本发明中收集的其他病毒的临床样本阳性核酸，包括EBV、人类疱疹病毒1型、2型、5型、6型、人类乙型肝炎病毒、人类丙型肝炎病毒和西尼罗病毒。结果显示，与其他种类病原体均无无交叉反应，表明方法特异性好。如图9A-图9B所示。
实施例4 临床样本的评价
收集125份怀疑有EBV感染患者的临床样本，采用Qiagen mini DNA Kit试剂盒提取DNA，对两种EBV IC-RAA方法进行临床样本的评估。
1. 使用EBV的商业化聚合酶链反应定量试剂盒对样本进行DNA检测。
2. 反应程序均为：93°C，2min；93°C，45s，55°C，1min，10个循环；93°C，30s，55°C，45s，30个循环。
3. 反应组分：42μLPCR反应液，3μLTaq酶，5μLDNA。
4. 结果判读：当CT≤30,阳性；CT＞30，阴性。
5. 按照实施例2中确立好的含有外源性内参的等温核酸扩增检测EBV技术体系和实施例3中确立好的含有内源性内参的等温核酸扩增检测EBV技术体系对上述收集到的标本进行检测。
6. 结果判读方式参考实施例2和实施例3。
检测结果如下表所示：
使用本发明中的实施例2中确立好的含有外源性内参的等温核酸扩增检测EBV技术体系和实施例3中确立好的含有内源性内参的等温核酸扩增检测EBV技术体系分别对收集的临床样本进行评估，与商业化的定量PCR试剂盒进行统计学比较，展现出了良好的一致性，且重复性好。
两种方法的临床样本评估种发现两种不同形式的内参均检测为阳性结果，并未影响到靶基因EBV扩增，适合于对RAA反应体系的扩增监测。在含有内源性内参的RAA技术中，通过临床样本的评估间接证明样本核酸DAN提取效果良好。本发明中两种不同形式的内参均可以成功应用于RAA技术中，且效果良好，重复性好。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 冯志山
<120> 人类疱疹病毒的病原体核酸检测引物探针组合、试剂盒及其应用
<130> MP21019590
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctacctgtgc cgcatgaaac tgggcgagac cga 33
<210> 2
<211> 30
<212> DNA
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gggcgcatgc accacgatgt catctttata gagtggcctt tcaggggctt ctttgatatc 240
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actaaaattg ttgggacttt gaatctctga agtaaaagga ggtctcagtt cccagacttc 420
tctgtcctta ctgtgacatg caccgtgaat gcatttcccc atccccacgt ccagtggctc 480
atgcccgagg gcgtggagcc cgcaccaact gcggcaaatg gcggtgttat gaaggaaaag 540
gatgggagcc tctctgttgc tgttgacctg tcacttccca agccctggca cctgccagtg 600
acctgcgttg ggaaaaatga caaggaggaa gcccacgggg tttatgtttc tggatacttg 660
tcgcaataa 669
<210> 10
<211> 609
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tggacttcag aagattgaag ataagaagaa aaagaacaaa acaccttttc tgaaaaaaga 60
aagcagagag aaatgcagca ttgctgttga tattagtgat aatctgaagg agaagaaaac 120
agatgctaag cagcaagtgt cagggtggac gcctgcacac gtcaggaagc agcttgtcat 180
tggcgttaac gaagttacca gagccctgga aaggagggaa ctgctgttag ttctggtgtg 240
taaatcagtc aagcctgcca tgatcacctc acacttgatt cagttaagcc taagcagaag 300
tgtccctgcc tgtcaggtcc cccggctcag tgagagaatc gcccccgtca ttggcttaaa 360
atgtgttcta gccttggcgt tcaaaaagaa caccactgac tttgtggacg aagtaagagc 420
catcatcccc agagtcccca gtttaagtgt accatggctt caagacagaa ttgaagattc 480
tggggaaaat ttagagactg aacctctgga aagccaagac agagagcttt tggacacttc 540
atttgaagat ctgtcaaaac ctaagagaaa gcttgctgac ggtcggcagg cttctgtaac 600
attacaacc 609
Claims (5)
1.引物探针组合，其特征在于，包括第一引物探针组合；
所述第一引物探针组合为含有外源性内参的等温核酸扩增体系组合：
（I）. 上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；和
（II）. 下游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；和
（III）. 探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；
所述第一引物探针组合还包括靶基因探针，所述靶基因探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示。
2.如权利要求1所述的引物探针组合在制备检测EB病毒的试剂或试剂盒中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述检测的扩增温度为39℃，扩增时间为30min。
4. EB病毒的检测试剂，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物探针组合。
5. EB病毒的检测试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1所述的引物探针组合。
Priority Applications (1)
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| CN202110949243.XA CN114182046B (zh) | 2021-08-18 | 2021-08-18 | 人类疱疹病毒的病原体核酸检测引物探针组合、试剂盒及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|
| CN114182046A CN114182046A (zh) | 2022-03-15 |
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