CN107164511B - 一种快速检测副猪嗜血杆菌血清4型的方法 - Google Patents

Abstract

本发明通过提供一种副猪嗜血杆菌血清4型的特异性基因片段及具有特异性的引物组，及其用包含有上述引物组的试剂盒检测样品中是否存在副猪嗜血杆菌血清4型特异性基因片段进而确定样品是否为副猪嗜血杆菌血清4型。本发明检测试剂和检测方法具有敏感性高(对副猪嗜血杆菌血清4型基因组DNA的检测敏感度为1.0pg，对副猪嗜血杆菌血清4型菌液的检测敏感度为1.6×10²cfu/mL)、特异性强、方便快捷、不需要特殊仪器、适用范围广等优点，可解决副猪嗜血杆菌血清4型的现场快速检测和基层普及应用的难题。

Description

一种快速检测副猪嗜血杆菌血清4型的方法

技术领域

本发明涉及病原菌的快速检测方法技术领域，尤其是涉及一种快速检测副猪嗜血杆菌血清4型的方法。

背景技术

副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)是一种重要的猪呼吸道病原菌，目前已至少鉴定出15个血清型，不同血清型菌株之间存在高毒力、中等毒力和无毒力等显著差异，鉴定HPS血清型对该病的诊断和防治具有重要意义。HPS血清4型是高毒力菌株，又是我国目前流行最多、分布范围最广的血清型之一。目前该菌常规血清型鉴定方法为细菌分离培养和鉴定的基础上，通过琼脂扩散试验与HPS所有血清型的阳性血清进行反应来判定血清型，通常需要3-5天的时间，费时费力，而且约有30％的HPS分离菌株不能被准确鉴定出血清型，严重影响副猪嗜血杆菌病的快速诊断和检测。

环介导等温扩增技术(LAMP，国际专利公开号WO 00/28082)是2000年Notomi等开发出的一种核酸扩增新技术，即针对靶基因的6个区域设计4条特异性引物(如需要还可以添加环引物对)，利用一种链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在65℃左右恒温条件保温约60分钟，即可完成核酸扩增反应，扩增结果可通过凝胶电泳进行检测。用于LAMP技术扩增的2对引物是针对靶基因序列的6个区段，因而具有比PCR更高的特异性，同时也具备不需要热循环、扩增效率更高、不需要特殊仪器等优点。

副猪嗜血杆菌感染的流行病学研究主要利用血清学分型方法开展，即在HPS分离培养和鉴定的基础上，通过琼脂扩散试验与HPS所有血清型的阳性血清进行反应来判定血清型，通常需要3-5天的时间，费时费力，而且约有30％的HPS分离菌株不能被准确鉴定出血清型，严重影响副猪嗜血杆菌病的快速诊断和检测。

发明内容

本发明的技术目的是建立一种简便、快速、高灵敏度、高特异性、高准确度的HPS血清4型LAMP检测方法。

为快速准确地鉴定HPS血清4型，本发明参考GenBank发表的副猪嗜血杆菌SW124菌株的脂多糖合成蛋白(lipopolysaccharide biosynthesis protein，wciP4)基因序列(登录号KC795356.1)，运用引物设计软件Primer Explorer 4.0，在线进行LAMP引物设计。按照引物设计原则，针对其6个特定区域设计4条引物：两条外引物分别为上游外引物(F3)和下游外引物(B3)；两条内引物分别为上游内引物(FIP)和下游内引物(BIP)，FIP由F1的互补序列和正向序列F2构成，BIP由B1的互补序列和正向序列B2构成，靶基因片段即为上游外引物F3与下游外引物B3之间的基因序列。依据Primer Explorer 4.0设计的引物，可获得多个靶基因片段，然后运用BLAST进行序列比对，筛选出wciP4基因特异性高且高度保守的靶基因片段(如SEQ ID No.5所示)。创新性发现，此wciP4基因特异性片段经LAMP方法扩增，仅在恒温条件下(62℃)反应60分钟，即可将目的DNA从几个拷贝扩增到10⁹个拷贝，通过电泳检测扩增产物来判定结果。故而可作为一种运用LAMP技术快速检测HPS血清4型方法的分子标记使用。

在此基础上，本发明进一步提供一组环介导等温扩增引物，其可特异性环介导等温扩增所述的分子标记。根据一种优选的实施方式，所述引物组包括上游外引物F3和下游外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID No.1-2所示；以及上游内引物FIP和下游内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID No.3-4所示。

更进一步，本发明提供一种快速检测HPS血清4型的方法，以待测样品细胞基因组DNA为模板，利用上述的特异性引物组进行环介导等温扩增反应。所述待测样品细胞基因组DNA可以将待测样品经常规细菌培养后提取细菌基因组DNA。

所述的方法，还包括步骤：设置阴性对照模板和阳性对照模板，阴性对照模板为超纯水，阳性对照模板为HPS血清4型参考菌株HS79基因组DNA；利用凝胶电泳对环介导等温扩增产物进行检测，电泳结果出现特征性梯度状电泳条带判定为阳性，若无任何扩增产物则为阴性。

所述环介导等温扩增反应的反应体系包括：10×LAMP bufffer：2.5μL；10mmol/L的dNTPs：3.0μL；0.25mol/L的MgSO₄：0.2μL；5mol/L的Betaine：0.5μL；10μmol/L的FIP引物：2.0μL；10μmol/L的BIP引物：2.0μL；10μmol/L的F3引物：0.5μL；10μmol/L的B3引物：0.5μL；8U/μL的Bst DNA聚合酶：0.7μL；模板DNA：1.0μL；用灭菌超纯水补足体系至25μL；

其中10×LAMP bufffer组成：200mmol/L Tris-HCl，100mmol/L KCl，20mmol/LMgSO₄，100mmol/L(NH₄)₂SO₄，1.0％Tritonx-100。

所述环介导等温扩增反应的反应条件如下：95℃变性5min，取出样品冰浴，加入Bst DNA聚合酶，然后62℃反应60min，最后80℃反应10min终止反应。

所述方法中使用的试剂优选制作为快速检测HPS血清4型的试剂盒，包括所述特异性引物组。

优选的包括：

10×LAMP bufffer：2.5μL；10mmol/L的dNTPs：3.0μL；0.25mol/L的MgSO₄：0.2μL；5mol/L的Betaine：0.5μL；10μmol/L的FIP引物：2.0μL；10μmol/L的BIP引物：2.0μL；10μmol/L的F3引物：0.5μL；10μmol/L的B3引物：0.5μL；8U/μL的Bst DNA聚合酶：0.7μL；模板DNA：1.0μL；使用时用灭菌超纯水补足体系至25μL；

其中10×LAMP bufffer组成：200mmol/L Tris-HCl，100mmol/L KCl，20mmol/LMgSO₄，100mmol/L(NH₄)₂SO₄，1.0％Tritonx-100。

本发明通过提供一种HPS血清4型的特异性基因片段及具有特异性的引物组，及其用包含有上述引物组的试剂盒检测样品中是否存在HPS血清4型特异性基因片段进而确定样品是否为HPS血清4型。本发明检测试剂和检测方法具有敏感性高(对HPS血清4型基因组DNA的检测敏感度为1.0pg，对副猪嗜血杆菌血清4型菌液的检测敏感度为1.6×10²cfu/mL)、特异性强(仅检测HPS血清4型参考菌株和分离菌株为阳性，而对HPS其它血清型参考和分离菌株、以及其它种属的细菌检测均为阴性)、方便快捷(整个检测在3小时内完成，与现有的琼脂扩散试验检测血清型相比省时2-3天)、不需要特殊仪器(在恒温水浴锅中就可反应)、适用范围广(适用于兽医科研检测实验室、检验检疫部门、养殖企业等)等优点，可解决HPS血清4型的现场快速检测和基层普及应用的难题。

附图说明

图1：LAMP检测HPS不同血清型菌株的特异性结果，其中M：DL2000DNA Marker；1-17孔所用模板对应的菌株与表3中的菌株序号一致，其中第5孔出现阳性条带，为HPS血清4型参考菌株HS79。

图2：LAMP检测其它种属细菌菌株的特异性结果，其中M：DL2000DNA Marker；1-20孔所用模板对应的菌株与表4中的菌株序号一致，第20孔为HPS血清4型参考菌株HS79作为阳性对照。

图3：LAMP检测HPS血清4型基因组DNA的敏感性结果，其中M：DL2000DNA Marker；模板DNA的量分别标注于泳道上面，检测结果显示本发明的检测限为1.0pg。

图4：LAMP检测HPS血清4型菌液的敏感性结果，其中M：DL2000DNA Marker；泳道上面的标注为菌液的稀释度，检测结果显示本发明的检测限为4个菌，敏感性为0.16cfu/μL(1.6×10²cfu/mL)。

图5：LAMP检测临床分离HPS菌株结果，其中M：DL2000；1-21孔所用模板对应的菌株与表5中的菌株序号一致，结果显示只有孔道1-14这14株HPS血清4型菌株出现典型的梯状条带，其它血清型菌株均为阴性。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1 LAMP引物的设计和合成

参考GenBank发表的副猪嗜血杆菌SW124菌株的脂多糖合成蛋白(lipopolysaccharide biosynthesis protein，wciP4)基因序列(登录号KC795356.1)，运用引物设计软件Primer Explorer 4.0，在线进行LAMP引物设计。按照引物设计原则，针对其6个特定区域设计4条引物：两条外引物分别为上游外引物(F3)和下游外引物(B3)；两条内引物分别为上游内引物(FIP)和下游内引物(BIP)，FIP由F1的互补序列和正向序列F2构成，BIP由B1的互补序列和正向序列B2构成，靶基因片段即为上游外引物F3与下游外引物B3之间的基因序列。依据Primer Explorer 4.0设计的引物，可获得多个靶基因片段，然后运用BLAST进行序列比对，筛选出wciP4基因特异性高且高度保守的靶基因片段(如SEQ IDNo.5所示)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物名称和序列见表1。

表1 LAMP所用引物名称及序列

实施例2用作模板的HPS细菌基因组DNA提取

取分离培养的HPS菌株，划线培养于添加终浓度100μg/mL NAD的胰酶大豆琼脂(TSA)平板上，于37℃温箱中培养过夜。自培养平板上挑取单菌落接种于5mL添加终浓度100μg/mL NAD的胰酶大豆肉汤(TSB)培养基中，于37℃摇床中振摇培养过夜。取过夜培养的菌液1ml，离心后弃上清液，菌沉淀重悬于50μL超纯水中，煮沸5min裂解细菌后，离心取上清液1.0μL用于LAMP反应模板。

实施例3 LAMP反应体系的建立

LAMP反应体系总量为25μL，反应组分见表2。

表2 LAMP反应体系的组分及添加量

LAMP反应在PCR仪中进行，首先95℃变性5min，取出样品冰浴，加入Bst DNA聚合酶，然后62℃反应60min，最后80℃反应10min终止反应。利用琼脂糖凝胶电泳对LAMP扩增产物进行检测，电泳结果出现特征性梯度状电泳条带判定为阳性，若无任何扩增产物则为阴性。

实施例4具体检测方法的建立

(1)细菌培养。取拟鉴定血清型的HPS分离菌株，接种于5mL添加终浓度100μg/mL烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)的胰酶大豆肉汤(TSB)培养基中，于37℃摇床中振摇培养过夜。

(2)细菌基因组DNA的提取。取过夜培养的菌液1ml，离心后弃上清液，菌沉淀重悬于50μL超纯水中，煮沸5min裂解细菌后，离心取上清液1.0μL作为LAMP反应模板。

(3)HPS菌株的LAMP检测。按照表2中的LAMP反应体系将除Bst DNA聚合酶外的其它组分加入0.2mL反应管中，放入PCR仪中，95℃变性5min，取出样品冰浴，加入Bst DNA聚合酶，然后62℃反应60min，最后80℃反应10min终止反应。同时设置阴性对照和阳性对照。

(4)LAMP扩增产物的电泳检测。利用琼脂糖凝胶电泳进行检测：取9μL LAMP扩增产物加1μL 10×上样缓冲液混匀，以DL2000DNA Marker作为相对分子量标准，用含核酸染色剂的1.5％琼脂糖凝胶在100V电压下电泳约30min，于凝胶成像***中拍照分析结果。电泳图片显示LAMP特征性梯度状条带，则结果为阳性；如无任何条带则结果为阴性。

实施例5特异性实验

取甘油保存的HPS不同血清型菌株，划线培养于添加终浓度100μg/mL NAD的胰酶大豆琼脂(TSA)平板上，于37℃温箱中培养过夜。自培养平板上挑取单菌落接种于5mL添加终浓度100μg/mL NAD的胰酶大豆肉汤(TSB)培养基中，于37℃摇床中振摇培养过夜。针对用于鉴定LAMP菌种间特异性试验所用的其它种属细菌菌株，同样取适量甘油保存的相应菌株，划线培养于TSA平板，于37℃温箱中培养过夜。自培养平板上挑取单菌落接种于5mL TSB培养基中，于37℃摇床中振摇培养过夜。利用Promega公司的细菌全基因组DNA提取试剂盒抽提细菌基因组DNA，操作步骤简述为：取2mL培养12～16h的菌液至1.5mL离心管；13,000rpm离心2min，弃净上清，留取菌体沉淀；加入600μL Nuclei Lysis Solution，轻轻吹打至沉淀重悬；80℃培养5min，使菌体裂解，然后使其冷却至室温；加入3μL RNase Solution，颠倒2～5次，混匀；水浴37℃培养30min，并冷却至室温；加入200μL ProteinPrecipitation Solution，高速涡旋振荡20s；将样品在冰上放置5min；13,000rpm离心10min；将含有DNA的上清液转移至一个干净的的装有600μL异丙醇的1.5mL离心管；轻轻颠倒混匀直至出现线状DNA；13,000rpm离心5min；轻轻倒出上清液，并用干净的吸水纸将管内残液吸干；加入600μL70％乙醇，轻轻颠倒几次；13,000rpm离心2min，小心吸出乙醇；将离心管在空气中晾10～15min，至乙醇完全蒸发；加入100μL DNA Rehydration Solution，65℃培养1h水化DNA，并定期敲打离心管，也可在4℃过夜水化DNA；将提取的DNA保存于-20℃。提取的模板DNA通过凝胶电泳和紫外分光光度计分析其质量和浓度。核酸浓度测定：用紫外分光光度计分别测定核酸在260nm和280nm处的紫外吸收值，以260nm和280nm处的紫外吸收值的比值计算纯度，高质量DNA的OD260/280的值在1.8左右。细菌基因组DNA完整性测定：取3μL提取的模板DNA溶液电泳，选用的电泳胶为1.0％的琼脂糖凝胶，在紫外投射仪下检测DNA的大小，根据其亮度和扩散管程度来判断DNA的完整性。

(1)LAMP检测HPS不同血清型菌株的特异性

分别以表3中的17株副猪嗜血杆菌不同血清型的参考菌株基因组DNA作为模板，利用LAMP反应体系和程序进行扩增，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定HPS血清型特异性。检测结果见表3和图1，HPS血清4型参考菌株HS79的孔内有明显的阶梯状条带，其它血清型孔内无条带出现，表明本发明的LAMP反应体系对HPS不同血清型菌株具有高特异性。

(2)LAMP检测其它种属细菌菌株的特异性

分别以表4中的19株其它种属细菌菌株基因组DNA作为模板，利用优化后的LAMP反应体系和程序进行扩增，通过琼脂糖凝胶电泳鉴定LAMP方法对其它种属细菌的特异性。检测结果见表4和图2，HPS血清4型参考菌株HS79的孔内有明显的阶梯状条带，其它种属细菌菌株孔内无条带出现，表明本发明的LAMP反应体系对其它种属细菌菌株具有高特异性。

表3 LAMP检测HPS不同血清型菌株的特异性

注：检测结果中“-”为阴性；“+”为阳性。

表4 LAMP检测其它种属细菌菌株的特异性

注：检测结果中“-”为阴性；“+”为阳性。

实施例6敏感性实验

(1)LAMP检测HPS血清4型基因组DNA的敏感性

取甘油保存的HPS血清4型参考菌株HS79，划线培养于添加终浓度100μg/mL NAD的胰酶大豆琼脂(TSA)平板上，于37℃温箱中培养过夜。自培养平板上挑取单菌落接种于5mL添加终浓度100μg/mL NAD的胰酶大豆肉汤(TSB)培养基中，于37℃摇床中振摇培养过夜。利用Promega公司的细菌全基因组DNA提取试剂盒抽提细菌基因组DNA，操作步骤简述为：取2mL培养12～16h的菌液至1.5mL离心管；13,000rpm离心2min，弃净上清，留取菌体沉淀；加入600μL Nuclei Lysis Solution，轻轻吹打至沉淀重悬；80℃培养5min，使菌体裂解，然后使其冷却至室温；加入3μL RNase Solution，颠倒2～5次，混匀；水浴37℃培养30min，并冷却至室温；加入200μL Protein Precipitation Solution，高速涡旋振荡20s；将样品在冰上放置5min；13,000rpm离心10min；将含有DNA的上清液转移至一个干净的的装有600μL异丙醇的1.5mL离心管；轻轻颠倒混匀直至出现线状DNA；13,000rpm离心5min；轻轻倒出上清液，并用干净的吸水纸将管内残液吸干；加入600μL 70％乙醇，轻轻颠倒几次；13,000rpm离心2min，小心吸出乙醇；将离心管在空气中晾10～15min，至乙醇完全蒸发；加入100μL DNARehydration Solution，65℃培养1h水化DNA，并定期敲打离心管，也可在4℃过夜水化DNA；将提取的DNA保存于-20℃。提取的模板DNA通过凝胶电泳和紫外分光光度计分析其质量和浓度。核酸浓度测定：用紫外分光光度计分别测定核酸在260nm和280nm处的紫外吸收值，以260nm和280nm处的紫外吸收值的比值计算纯度，高质量DNA的OD260/280的值在1.8左右。细菌基因组DNA完整性测定：取3μL提取的模板DNA溶液电泳，选用的电泳胶为1.0％的琼脂糖凝胶，在紫外投射仪下检测DNA的大小，根据其亮度和扩散管程度来判断DNA的完整性。

以浓度为100ng/μL的HPS血清4型参考菌株HS79基因组DNA为初始模板，分别以超纯水进行系列稀释，每个梯度各取1μL加入反应管中，反应体系中细菌基因组DNA的量分别为100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、5pg、2.5pg、1.0pg、0.1pg、0.05pg、0.01pg、0.001pg，以超纯水作为阴性对照，扩增后通过琼脂糖凝胶电泳鉴定敏感性结果。结果如图3所示，从第7泳道至第14泳道均出现LAMP反应典型的阶梯状电泳条带，而且随着模板DNA浓度的增加，条带亮度逐渐增强。结果表明，本发明建立的LAMP方法最低限度能检测到1.0pg的HPS血清4型参考菌株HS79基因组DNA，且随着模板DNA浓度的增加，LAMP扩增产物量也随之增多。

(2)LAMP检测HPS血清4型菌液的敏感性

取甘油保存的HPS血清4型参考菌株HS79，划线培养于添加终浓度100μg/mL NAD的TSA平板上，于37℃温箱中培养过夜。自培养平板上挑取单菌落接种于5mL添加终浓度100μg/mL NAD的TSB培养基中，于37℃摇床中振摇培养过夜。经分光光度计测得菌液浓度OD600为0.6，将菌液用超纯水倍比稀释至10^-11，从10^-6、10^-7和10^-8管中各取出100μL分别涂在TSA平板上，过夜培养后计算细菌的菌落数。同时从每个稀释度管中取出1μL作为模板DNA进行LAMP扩增，扩增后通过琼脂糖凝胶电泳鉴定敏感性结果。结果如图4所示，从第9泳道至第13泳道均有典型的梯状条带，最低限度至少能检测到10^-5。平板计数结果显示在10^-7培养基中是80cfu/mL、10^-6培养基中是400cfu/mL，倍比计算得到10^-5约4000cfu/mL，模板取量为1μL，所以该LAMP反应检测的最低含菌量为4个菌，即灵敏性为0.16cfu/μL(1.6×10²cfu/mL)。

实施例7 LAMP检测临床分离HPS菌株

取表5中的21株HPS临床分离株(已利用琼脂扩散试验鉴定血清型)，分别过夜培养后取菌液1ml，离心后弃上清液，菌沉淀重悬于50μL超纯水中，煮沸5min裂解细菌后，离心取上清液1.0μL用于LAMP反应用模板DNA。以优化后的LAMP反应体系及程序进行扩增，核酸电泳观察LAMP扩增结果。LAMP检测结果如图5所示，在所有HPS分离菌株中，只有14株血清4型菌株出现典型的梯状条带，其它血清型菌株均为阴性反应，提示本发明建立的LAMP检测方法可用于临床HPS分离株血清4型的检测和鉴定。

表5 LAMP检测临床分离HPS不同血清型菌株的结果

注：检测结果中“-”为阴性；“+”为阳性。

序列表

<110> 北京市农林科学院

<120> 一种快速检测副猪嗜血杆菌血清4型的方法

<130> P1710133

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

agagtttctt tttcgagaa 19

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ataaatcttc aggatgagaa 20

<210> 3

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cagctctaga aaccaaataa ctacacttct taattcccct ttttatggat tc 52

<210> 4

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gtggaaagat tgtatcatgt acataaaaag acctttgata ctagattgaa tagcaaga 58

<210> 5

<211> 224

<212> DNA

<213> wciP4基因片段

<400> 5

agagtttctt tttcgagaaa atataaaaat tcttaattcc cctttttatg gattcttttt 60

atatcgaacg tgtagttatt tggtttctag agctgttgtg gaaagattgt atcatgtaca 120

taaaaagttt tgttatttag cagatgattg ggggaatctt gctattcaat ctagtatcaa 180

aggttttaca tattgtaaga ttttttctca tcctgaagat ttat 224

Claims (4)

1.一组用于环介导等温扩增技术快速检测副猪嗜血杆菌血清4型的引物组，包括上游外引物F3和下游外引物B3，其核苷酸序列如SEQ ID No.1-2所示；以及上游内引物FIP和下游内引物BIP，其核苷酸序列如SEQ ID No.3-4所示。

2.权利要求1所述引物组在制备环介导等温扩增技术快速检测副猪嗜血杆菌血清4型试剂盒中的应用。

3.一种快速检测副猪嗜血杆菌血清4型的试剂盒，其包括权利要求1所述的引物组。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，其还包括：

10× LAMP bufffer：2.5μL；10mmol/L的dNTPs：3.0μL；0.25mol/L的MgSO₄：0.2μL；5mol/L的Betaine：0.5μL；10μmol/L的FIP引物：2.0μL；10μmol/L的BIP引物：2.0μL；10μmol/L的F3引物：0.5μL；10μmol/L的B3引物：0.5μL；8U/μL的Bst DNA聚合酶：0.7μL；模板DNA：1.0μL；使用时用灭菌超纯水补足体系至25μL；

其中10× LAMP bufffer组成：200mmol/L Tris-HCl，100mmol/L KCl，20mmol/L MgSO₄，100mmol/L(NH₄)₂SO₄，1.0％Tritonx-100。

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