CN111983229A - 胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体试剂条及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体试剂条，所述试剂条包括底板，以及粘贴于底板上的样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸；所述样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次首尾相互重叠一段预设长度；所述硝酸纤维素膜上通过划线包被幽门螺杆菌天然抗原；所述胶体金垫通过将标记胶体金的幽门螺杆菌重组蛋白抗原溶液加样到玻璃纤维素膜上，干燥后获得。本发明的胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体试剂条可以实现用胶体金免疫层析法定量检测幽门螺杆菌抗体。对应的，本发明还提供了使用本发明的胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体试剂条定量检测幽门螺杆菌抗体的方法。
Description
技术领域
本发明涉及幽门螺杆菌抗体的检测技术，具体是胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体试剂条，以及用该试剂条定量检测幽门螺杆菌抗体的检测方法。
背景技术
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.p)，由Barry J.Marshall和J.RobinWarren二人首次发现，此二人因此获得2005年的诺贝尔生理学或医学奖。幽门螺杆菌是一种单极、多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的细菌，长2.5～4.0μm，宽0.5～1.0μm。在胃粘膜上皮细胞表面常呈典型的螺旋状或弧形。
幽门螺杆菌感染是慢性活动性胃炎、消化性胃溃疡以及胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤的主要致病因素，并且与胃癌的发生具有密切相关性。1994年世界卫生组织/国际癌症研究机构(WHO/IARC)将幽门螺杆菌定为I类致癌原。在亚洲地区，中国大陆、越南、印度等少年幽门螺杆菌的感染率分别60％、40％、70％，慢性胃炎患者的胃粘膜活检标本中幽门螺杆菌检出率可达80％～90％，而消化性胃溃疡患者更高，可达95％以上，甚至接近100％。胃癌由于局部上皮细胞已发生异化，因此其检出率高低报道不一。幽门螺杆菌的胃部感染已是个世界性医学问题，对其进行准确诊断有利于控制H.p传播与流行及根除H.p感染治疗的监测。
目前对幽门螺杆菌感染的诊断已发展出了许多方法，包括有细菌学、病理学、血清学、同位素示踪、分子生物学等。但总的讲来，从标本采集角度看，可以分为侵入性和非侵入性两大类。侵入性方法主要指必需通过胃镜取活检标本检查的方法，是目前消化病学科的常规方法。它包括细菌的分离培养和直接涂片、快速尿素酶试验，药敏试验。非侵入性方法主要指不通过胃镜取活检标本诊断幽门螺杆菌标本感染的方法。这类方法包括抗体检测、抗原检测、尿素13C/14C呼气试验等。抗体检测目前已有的方法包括酶联免疫法、免疫印迹法、胶体金法和胶乳增强免疫比浊法等。
血清学检测是一项常用的非侵入性检测方法，尤其适用于幽门螺杆菌感染率较高的地区。幽门螺杆菌引起慢性炎症，***的免疫反应会持续存在，产生IgG抗体。常用的血清学试验包括ELISA法、化学发光、蛋白印迹、胶体金免疫层析等方法，其中胶体金免疫层析法检测速度最快，只需要10分钟即可出结果，特别适合现场快速检测，但目前尚无定量的幽门螺杆菌抗体胶体金免疫层析法检测试剂面市。
发明内容
为了克服现有技术中存在的不足，本发明提供了胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体试剂条。本发明的胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体试剂条可以实现用胶体金免疫层析法定量检测幽门螺杆菌抗体。对应的，本发明还提供了使用本发明的胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体试剂条定量检测幽门螺杆菌抗体的方法。
对于试剂条，本发明技术方案为：
胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体试剂条，所述试剂条包括底板，以及粘贴于底板上的样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸；所述样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次首尾相互重叠一段预设长度；所述硝酸纤维素膜上通过划线包被幽门螺杆菌天然抗原；所述胶体金垫通过将标记胶体金的幽门螺杆菌重组蛋白抗原溶液加样到玻璃纤维素膜上，干燥后获得。
作为本发明的一种优化方案，前述的胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体试剂条中，所述胶体金垫通过以下方法步骤制备：步骤a.用0.1～0.3mol/L K2CO3溶液将胶体金溶液的pH调到7.0～9.0；步骤b.将步骤a中的胶体金溶液置于磁力搅拌器上搅拌，按每100mL胶体金溶液加入0.5～2mg幽门螺杆菌重组蛋白抗原的用量将幽门螺杆菌重组蛋白抗原滴加到胶体金溶液中，继续搅拌2～3h；步骤c.将步骤b中搅拌后的胶体金溶液加入到终浓度为1％BSA和1～2％的酪蛋白混合液中进行封闭标记60min；步骤d.将步骤c中封闭标记后的胶体金溶液在12000～15000r/m条件下离心，弃上层清液，沉淀物用0.01mol/L PBS溶液重悬，将沉淀物重悬为原沉淀物体积的1/10，得重悬液；步骤e.将步骤d制得的重悬液在2000～3000r/min条件下离心30min，取上层清液加入到葡聚糖凝胶层析柱纯化，得到纯度达90％以上的标记胶体金的幽门螺杆菌重组蛋白溶液；步骤f.将步骤e制得的标记胶体金的幽门螺杆菌重组蛋白抗原溶液加样到玻璃纤维素膜上，在温度20℃～25℃的条件下干燥4～6h，制成胶体金垫，备用。
作为本发明的一种优化方案，前述的胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体试剂条中，在所述硝酸纤维素膜上通过划线包被幽门螺杆菌天然抗原的方法步骤如下：步骤i.用0.01mol/L的PBS将幽门螺杆菌天然抗原稀释成0.2～0.5mg/mL；步骤ii.用点膜仪将经步骤i稀释后的幽门螺杆菌天然抗原在硝酸纤维素膜上按1μl/cm进行划线包被；步骤iii.幽门螺杆菌天然抗原包被完成后，将硝酸纤维素膜在干燥间室温干燥，备用。
作为本发明的一种优化方案，前述的胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体试剂条中，所述硝酸纤维素膜上还通过划线包被鼠抗幽门螺杆菌单克隆抗体，用于质控。进一步，在所述硝酸纤维素膜上，通过划线包被鼠抗幽门螺杆菌单克隆抗体的方法步骤如下：步骤①.用0.01mol/L的PBS将鼠抗幽门螺杆菌单克隆抗体稀释成0.2～0.5mg/mL；步骤②.用点膜仪将经步骤i稀释后的鼠抗幽门螺杆菌单克隆抗体在硝酸纤维素膜上按1μl/cm进行划线包被；步骤③.鼠抗幽门螺杆菌单克隆抗体包被完成后，将硝酸纤维素膜在干燥间室温干燥，备用。
作为本发明的一种优化方案，前述的胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体试剂条中，所述试剂条的组装在干燥间内完成，具体步骤如下：步骤I.在底板中央贴上包被好的幽门螺杆菌天然抗原硝酸纤维素膜；步骤II.在硝酸纤维素膜上缘粘贴吸水滤纸；步骤III.在硝酸纤维素膜下缘粘贴胶体金垫；步骤IV.在胶体金垫下缘粘贴样品垫，完成后用裁切机将贴好的试纸板切成试纸条，并密封于铝箔袋中。
优选的，所述底板可以由PVC制成。
与现有技术相比，本发明的胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体试剂条是采用幽门螺杆菌重组蛋白抗原和天然抗原组合双抗原夹心法制备出的幽门螺杆菌抗体胶体金定量检测试剂条，用该试剂条检测临床样本时，胶体金检测仪读取T/C值代入标准曲线，即可获得临床样本中幽门螺杆菌抗体的含量(AU/mL)，实现对幽门螺杆菌抗体(IgG抗体)的快速定量检测。
对于检测方法，本发明的技术方案为：
胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体的检测方法，该方法采用前述本发明的胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体试剂条对幽门螺杆菌抗体进行定性检测和定量检测；
定性检测过程如下：将幽门螺杆菌抗体检测条水平放置，准确滴加1滴血清或血浆样本在试纸条的样品垫上，室温反应10分钟后，质控线出现红色条带，检测线出现红色条带，检测结果为幽门螺杆菌IgG抗体阳性；质控线出现红色条带，检测线不出现红色条带，检测结果为幽门螺杆菌IgG抗体阴性；质控线不出现红色条带或质控线、检测线均不出现红色条带，试剂条检测失效；
定量检测过程如下：将幽门螺杆菌抗体试剂条水平放置，准确滴加1滴血清或血浆样本在试纸条的样品垫上，室温反应10分钟后，将幽门螺杆菌抗体试剂条放入胶体金定量读数仪中，读取T线与C线的峰面积比值即T/C值，代入幽门螺杆菌抗体检测标准曲线，获得样本中幽门螺杆菌抗体的含量(AU/mL)。
作为本发明的一种优化方案，前述的胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体的检测方法中，所述幽门螺杆菌抗体检测标准曲线的制作方法包括以下过程：用幽门螺杆菌抗体阴性血清按梯度稀释1AU/mL幽门螺杆菌抗体检测标准品，分别取50μL加到试剂条的样品垫中，室温反应10min，将试剂条放入胶体金定量读数仪中，读取T线与C线的峰面积比值即T/C值，以T/C值为横坐标、幽门螺杆菌抗体检测标准品AU值为纵坐标，制作标准曲线；所述1AU/mL幽门螺杆菌抗体检测标准品的制备方法如下：收集到20份幽门螺杆菌抗体阳性血清混合，经饱和硫酸铵盐析结合Protein G柱亲和层析纯化，得到终浓度为0.5mg/mL纯化幽门螺杆菌抗体，定为1AU/mL。
与现有技术相比，本发明的上述方法取得的显著进步是：利用胶体金免疫层析法实现了对幽门螺旋杆菌的定量检测。
附图说明
图1是本发明胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体试剂条的结构示意图；
附图中标记：1-底板，2-样品垫，3-胶体金垫，4-吸水滤纸，5-硝酸纤维素膜，501-检测线，502-质控线。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不作为限制本发明的依据。
参见图1，本发明的胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体试剂条包括PVC材质的底板1，以及粘贴于PVC材质的底板1上的样品垫2、胶体金垫3、硝酸纤维素膜5和吸水滤纸4；所述样品垫2、胶体金垫3、硝酸纤维素膜5和吸水滤纸4依次首尾相互重叠一段预设长度。
其中，所述硝酸纤维素膜5上通过划线包被幽门螺杆菌天然抗原，形成检测线501；所述胶体金垫3通过将标记胶体金的幽门螺杆菌重组蛋白抗原溶液加样到玻璃纤维素膜上，干燥后获得。
实施本发明时，硝酸纤维素膜5上可以通过划线包被鼠抗幽门螺杆菌单克隆抗体，形成质控线502，用于质控。
实施例：
本实施例的胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体试剂条按照如下步骤制得。
一、制备包被有幽门螺杆菌重组蛋白抗原的胶体金垫：用0.2mol/L K2CO3将胶体金溶液pH调到8。然后将溶液置于磁力搅拌器上缓慢搅拌，按每100mL胶体金溶液加入1.25mg幽门螺杆菌重组蛋白抗原将蛋白缓慢滴加到胶体金溶液中，继续搅拌2.5h，再滴加入到终浓度为1％BSA和1.5％的酪蛋白进行封闭标记60min，封闭标记结束后以13500r/m离心，弃上层清液，沉淀物用0.01mol/L PBS溶液重悬，将沉淀重悬为原体积的1/10，再经2500r/min离心30min，取上层清液加至葡聚糖凝胶层析柱纯化，得到纯度达90％以上的标记胶体金的幽门螺杆菌重组蛋白溶液。然后将标记胶体金的幽门螺杆菌重组蛋白抗原溶液加样于玻璃纤维素膜上，在温度22℃干燥5h，制成胶体金垫3，干燥备用。
二、幽门螺杆菌天然抗原包被硝酸纤维素膜：用0.01mol/L PBS将幽门螺杆菌天然抗原稀释成0.3mg/mL，然后用BIODOT点膜仪将幽门螺杆菌天然抗原在硝酸纤维素膜5上按1μl/cm进行划线包被，形成检测线501；同时在硝酸纤维素膜5上按1μl/cm包被鼠抗幽门螺杆菌单克隆抗体，用于产品的质控线502，包被完成后将硝酸纤维素膜5在干燥间室温干燥8h，备用。
三、试剂的组装：在干燥间内准备好PVC材质的底板1、样品垫2、胶体金垫3、硝酸纤维素膜5和吸水滤纸4，底板1中央贴上包被好的幽门螺杆菌天然抗原硝酸纤维素膜5，硝酸纤维素膜5上缘粘贴吸水滤纸4，硝酸纤维素膜5下缘粘贴包被幽门螺杆菌重组蛋白抗原胶体金垫3，胶体金垫3下缘粘贴样品垫2，完成后用裁切机将贴好的试纸板切成4mm宽的试纸条。再将试纸条密封于铝箔袋中，完成试剂的组装，获得产品。
以下结合检测方法以及一些必要的试验对本发明作进一步的说明。
使用本发明的试剂卡快速定量检测幽门螺杆菌抗体的方法如下：将试剂条水平放置，准确滴加1滴血清或血浆样本在试纸条的样品垫2上，室温反应10分钟后，依照下列方法进行定量检测。
定量检测过程如下：将幽门螺杆菌抗体试剂条水平放置，准确滴加1滴血清或血浆样本在试纸条的样品垫2上，室温反应10分钟后，将幽门螺杆菌抗体试剂条放入胶体金定量读数仪中，读取T线与C线的峰面积比值即T/C值，代入幽门螺杆菌抗体检测标准曲线，获得样本中幽门螺杆菌抗体的含量(AU/mL)。
幽门螺杆菌抗体检测标准曲线的建立方法如下：用幽门螺杆菌抗体阴性血清按梯度稀释1AU/mL幽门螺杆菌抗体检测标准品，分别取50μL加到试剂条的样品垫2中，室温反应10min，将试剂条放入胶体金定量读数仪中，读取T线与C线的峰面积比值即T/C值，以T/C值为横坐标、幽门螺杆菌抗体检测标准品AU值为纵坐标，制作标准曲线。该试剂检测临床样本时，胶体金定量读数仪读取T/C值代入标准曲线，获得样本中幽门螺杆菌抗体的含量(AU/mL)。
上述幽门螺杆菌抗体检测标准品的制备方法如下：收集到20份幽门螺杆菌抗体阳性血清混合，经饱和硫酸铵盐析结合Protein G柱亲和层析纯化，得到终浓度为0.5mg/mL纯化幽门螺杆菌抗体，定为1AU/mL。
幽门螺杆菌抗体检测试试剂条特异性试验：以幽门螺杆菌IgG阳性血清、乙型肝炎病毒IgG阳性血清、巨细胞病毒IgG阳性血清、单纯疱疹病毒IgG阳性血清、腺病毒IgG阳性血清、呼吸道合胞病毒病毒IgG阳性血清和幽门螺杆菌IgG阴性血清采用幽门螺杆菌抗体免疫胶体金检测试纸条检测，只有幽门螺杆菌标准IgG阳性血清检测结果为阳性，其它均为阴性，说明该试剂条特异性良好。
幽门螺杆菌抗体免疫胶体金检测试纸条重复性试验：随机抽取20份幽门螺杆菌IgG阳性血清、阴性血清分别于不同的时间进行重复检测，变异系数均<5％，证明该试剂条具有良好的稳定性和重复性。
临床标本检测对比试验：
试纸条与芬兰BIOHIT公司试剂盒幽门螺杆菌IgG抗体ELISA检测试剂盒的比较：
对200份标本用两种试剂盒检测比较阴性与阳结果，如表1所示：
表1与芬兰BIOHIT公司试剂盒的比较结果
对200份标本用两种试剂盒检测共有195例相符(97.5％)，只有5例不符(2.5％)，这也表明本发明的试剂灵敏度和特异性高。
以上是以本发明的一个具体实施例进行说明的，在本发明技术方案的范围内对上述实施例中相关参数取值调整后所形成的其它具体实施例同样能够实现本发明的目的，在此不一一罗列。
本发明的试剂条还可以用于定性检测幽门螺杆菌抗体，具体方法如下：
将试剂条水平放置，准确滴加1滴血清或血浆样本在试纸条的样品垫2上，室温反应10分钟后，进行定性结果判断。
阳性：质控线502出现红色条带，检测线501出现红色条带，为幽门螺杆菌IgG抗体阳性；阴性：质控线502出现红色条带，检测线501不出现红色条带，为幽门螺杆菌IgG抗体阴性；失效：质控线502不出现红色条带，判断为试剂条失效(滴加样本时，同时滴加质控品)。
上述对本申请中涉及的发明的一般性描述和对其具体实施例的描述不应理解为是对该发明技术方案构成的限制。本领域所属技术人员根据本申请的公开，可以在不违背所涉及的发明构成要素的前提下，对上述一般性描述或/和实施例中的公开技术特征进行增加、减少或组合，形成属于本申请保护范围之内的其它的技术方案。
Claims (9)
1.胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体试剂条，其特征在于：
所述试剂条包括底板，以及粘贴于底板上的样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸；所述样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次首尾相互重叠一段预设长度；
所述硝酸纤维素膜上通过划线包被幽门螺杆菌天然抗原；所述胶体金垫通过将标记胶体金的幽门螺杆菌重组蛋白抗原溶液加样到玻璃纤维素膜上，干燥后获得。
2.根据权利要求1所述的胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体试剂条，其特征在于，所述胶体金垫通过以下方法步骤制备：
步骤a.用0.1～0.3mol/L K2CO3溶液将胶体金溶液的pH调到7.0～9.0；
步骤b.将步骤a中的胶体金溶液置于磁力搅拌器上搅拌，按每100mL胶体金溶液加入0.5～2mg幽门螺杆菌重组蛋白抗原的用量将幽门螺杆菌重组蛋白抗原滴加到胶体金溶液中，继续搅拌2～3h；
步骤c.将步骤b中搅拌后的胶体金溶液加入到终浓度为1％BSA和1～2％的酪蛋白混合液中进行封闭标记60min；
步骤d.将步骤c中封闭标记后的胶体金溶液在12000～15000r/m条件下离心，弃上层清液，沉淀物用0.01mol/L PBS溶液重悬，将沉淀物重悬为原沉淀物体积的1/10，得重悬液；
步骤e.将步骤d制得的重悬液在2000～3000r/min条件下离心30min，取上层清液加入到葡聚糖凝胶层析柱纯化，得到纯度达90％以上的标记胶体金的幽门螺杆菌重组蛋白溶液；
步骤f.将步骤e制得的标记胶体金的幽门螺杆菌重组蛋白抗原溶液加样到玻璃纤维素膜上，在温度20℃～25℃的条件下干燥4～6h，制成胶体金垫，备用。
3.根据权利要求1所述的胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体试剂条，其特征在于，在所述硝酸纤维素膜上通过划线包被幽门螺杆菌天然抗原的方法步骤如下：
步骤i.用0.01mol/L的PBS将幽门螺杆菌天然抗原稀释成0.2～0.5mg/mL；
步骤ii.用点膜仪将经步骤i稀释后的幽门螺杆菌天然抗原在硝酸纤维素膜上按1μl/cm进行划线包被；
步骤iii.幽门螺杆菌天然抗原包被完成后，将硝酸纤维素膜在干燥间室温干燥，备用。
4.根据权利要求1所述的胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体试剂条，其特征在于，所述硝酸纤维素膜上还通过划线包被鼠抗幽门螺杆菌单克隆抗体，用于质控。
5.根据权利要求1所述的胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体试剂条，其特征在于，在所述硝酸纤维素膜上，通过划线包被鼠抗幽门螺杆菌单克隆抗体的方法步骤如下：
步骤①.用0.01mol/L的PBS将鼠抗幽门螺杆菌单克隆抗体稀释成0.2～0.5mg/mL；
步骤②.用点膜仪将经步骤i稀释后的鼠抗幽门螺杆菌单克隆抗体在硝酸纤维素膜上按1μl/cm进行划线包被；
步骤③.鼠抗幽门螺杆菌单克隆抗体包被完成后，将硝酸纤维素膜在干燥间室温干燥，备用。
6.根据权利要求1所述的胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体试剂条，其特征在于，所述试剂条的组装在干燥间内完成，具体步骤如下：
步骤I.在底板中央贴上包被好的幽门螺杆菌天然抗原硝酸纤维素膜；
步骤II.在硝酸纤维素膜上缘粘贴吸水滤纸；
步骤III.在硝酸纤维素膜下缘粘贴胶体金垫；
步骤IV.在胶体金垫下缘粘贴样品垫，完成后用裁切机将贴好的试纸板切成试纸条，并密封于铝箔袋中。
7.根据权利要求1-6任一权利要求所述的胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体试剂条，其特征在于，所述底板由PVC制成。
8.胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体的检测方法，其特征在于，该方法使用权利要求1-7任一权利要求的胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体试剂条对幽门螺杆菌抗体进行定量检测；
定量检测过程如下：将幽门螺杆菌抗体试剂条水平放置，准确滴加1滴血清或血浆样本在试纸条的样品垫上，室温反应10分钟后，将幽门螺杆菌抗体试剂条放入胶体金定量读数仪中，读取T线与C线的峰面积比值即T/C值，代入幽门螺杆菌抗体检测标准曲线，获得样本中幽门螺杆菌抗体的含量(AU/mL)。
9.根据权利要求8所述的胶体金定量检测幽门螺杆菌抗体的检测方法，其特征在于，所述幽门螺杆菌抗体检测标准曲线的制作方法包括以下过程：
用幽门螺杆菌抗体阴性血清按梯度稀释1AU/mL幽门螺杆菌抗体检测标准品，分别取50μL加到试剂条的样品垫中，室温反应10min，将试剂条放入胶体金定量读数仪中，读取T线与C线的峰面积比值即T/C值，以T/C值为横坐标、幽门螺杆菌抗体检测标准品AU值为纵坐标，制作标准曲线；
所述1AU/mL幽门螺杆菌抗体检测标准品的制备方法如下：收集到20份幽门螺杆菌抗体阳性血清混合，经饱和硫酸铵盐析结合Protein G柱亲和层析纯化，得到终浓度为0.5mg/mL纯化幽门螺杆菌抗体，定为1AU/mL。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20201124 |
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