CN201903546U

CN201903546U - 检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸条

Info

Publication number: CN201903546U
Application number: CN2010205466819U
Authority: CN
Inventors: 王静; 景滢滢; 杨宇; 杨永莉; 孙肖红; 胡孔新
Original assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Current assignee: Chinese Academy of Inspection and Quarantine CAIQ
Priority date: 2010-09-28
Filing date: 2010-09-28
Publication date: 2011-07-20
Anticipated expiration: 2020-09-28

Abstract

本实用新型公开了一种检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸条，包括反应支撑物、紧密连接于反应支撑物上表面中部的硝酸纤维膜，硝酸纤维膜起始端的上表面与吸水垫部分重叠连接、硝酸纤维膜末端的下表面与金标抗体保护膜部分重叠连接，金标抗体保护膜的下表面部分重叠连接有样品垫，其中，金标抗体保护膜包括膜本体、及均匀涂布在其上的胶体金标记的SPA涂层，硝酸纤维膜上靠近其起始端处设置有羊抗兔IgG包被的质控条带、靠近其末端处设置有重组FopA蛋白包被的检测条带。本实用新型结合了胶体金标记和双抗原夹心免疫层析的技术原理，将样品结合垫采用分散剂和封闭剂进行预处理，具有操作简单，检测时间短，适合快速现场检测等优点。

Description

检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸条

技术领域

本实用新型涉及一种检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸条。

背景技术

目前，国内用的双抗原夹心胶体金法检测土拉菌时，常用土拉菌的脂多糖(LPS)作为检测血清中抗体的抗原。但脂多糖在大量的获取、对环境的污染及操作人员安全等方面存在缺陷，限制了这些方法的推广和应用。而FopA蛋白是一种具有土拉菌共有的特异性强和保守性好的外膜蛋白，并具有良好的抗原性，可用作检测土拉菌的检测抗原。

本实验利用制备的重组抗原，采用间接法的胶体金免疫层析试纸条来检测土拉菌抗体，并对该方法的特异性、敏感性进行评价。通过对在人血清中掺入土拉菌FopA抗体的模拟样品进行检验，评价该法用于检测土拉菌的可行性。

实用新型内容

本实用新型的目的在于提供一种快速定性和定量检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸条。

为实现上述目的，本实用新型检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸条，包括反应支撑物、紧密连接于反应支撑物上表面中部的硝酸纤维膜，硝酸纤维膜起始端的上表面与吸水垫部分重叠连接、硝酸纤维膜末端的下表面与金标抗体保护膜部分重叠连接，金标抗体保护膜的上表面部分重叠连接有样品垫，其中，金标抗体保护膜包括膜本体、及均匀涂布在其上的胶体金标记的SPA涂层，硝酸纤维膜上靠近其起始端处设置有羊抗兔IgG包被的质控条带、靠近其末端处设置有重组FopA蛋白包被的检测条带。

进一步，所述反应支持物为PVC板，吸水垫为滤油纸。

进一步，所述金标抗体保护膜为玻璃纤维膜、聚脂膜或滤纸纤维。

进一步，所述样品垫为玻璃纤维膜、聚脂膜或滤纸纤维。

进一步，所述试纸整体的外部包裹有外壳，该外壳上对应于所述样品垫处设置有样品孔，外壳上对应于所述质控条带、检测条带处设置有观察窗。

本实用新型检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸条，结合了胶体金标记和双抗原夹心免疫层析的技术原理，将样品结合垫采用分散剂和封闭剂进行预处理，确定了最佳反应条件，保证了检测方法的敏感性和特异性，具有操作简单，检测时间短，无需专业人员，适合快速现场检测等优点。并且，借助于相关设备，可做到定性和定量检测，从而大大提高了其推广和应用。

附图说明

图1为本实用新型检测试纸条的目测敏感性图；

图2为特异性检测试验图；

图3为本实用新型检测试纸条稳定性检测图；

图4为本实用新型检测试纸的拟合直线图；

图5A为本实用新型检测试纸的正面示意图；

图5B为本实用新型检测试纸的侧面结构示意图；

图6A为本实用新型检测试纸的阳性检测结果示意图；

图6B为本实用新型检测试纸的阴性检测结果示意图；

图6C为本实用新型检测试纸的无效检测结果示意图。

具体实施方式

如图1至图4，图5A、图5B、图6A、图6B、图6C所示，图1是本实用新型检测试纸条的目测敏感性图。1：阴性对照；2-7：土拉菌抗体浓度2400ng/mL、1200ng/mL、120ng/mL、60ng/mL、30ng/mL、15ng/mL。

图2为特异性检测试验。测试条1-6：1ug/mL的马秋波GP2抗体、天花M1R抗体、黄热YF-E-D3抗体、禽流感NP抗体、登革病毒Deng-E-D3抗体和普氏立克次体120N抗体

图3为本实用新型检测试纸条的目测敏感性图稳定性检测；测试条1：阴性对照，2～4：土拉菌抗体浓度120ng/mL、60ng/mL、30ng/mL

图5A、图5B中，1：吸水垫；2：硝酸纤维膜，T：包被重组FopA蛋白检测条带；C：包被羊抗兔IgG的质控条带；3：含有胶体金标记SPA的玻璃纤维膜；4：样品垫；5：反应支持物。

图6A、图6B、图6C是本实用新型的检测结果示意图；T、C两条线阳性；C一条线阴性；无效。

本实用新型检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸条，定性检测土拉弗朗西斯菌抗体灵敏度达到30ng/ml。在模拟样品检测中，检测正常人血清中添加不同浓度土拉弗朗西斯菌抗体的灵敏度达到到30ng/ml。另外，本实用新型的胶体金免疫层析试纸条在37℃放置一周后检测发现试纸条的检测敏感性没有下降，显示了良好的稳定性，相当于4℃存放12个月的效果；与马秋波GP2抗体、天花M1R抗体、黄热YF-E-D3抗体、禽流感NP抗体、登革病毒Deng-E-D3抗体和普氏立克次体120N抗体等相似毒素没有交叉反应特异性良好。

结合金标分析仪建立了胶体金免疫层法定量检测土拉弗朗西斯菌抗体的工作拟合曲线，在线性范围内，即R²0.9905；线性范围30～960ng/ml，可以进行定量检测。经检测发现，该方法回收率高(41.0％～118.6％)、重复性良好。本研究建立的胶体金定量检测方法可以在15min内完成一定范围内的定量检测，检测时间缩短了3～4个小时。并且经过整个检测***的优化克服了检测血清样品时出现假阳性的现象。

本实用新型检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸条，其中包括将待测标本与样品稀释液混匀，再将样品混合液加入试纸样品孔处，样品中的液体依靠虹吸作用上行，10-15分钟判读结果；所述检测试纸条包括：

(1)反应支持物；

(2)吸水垫；

(3)硝酸纤维膜，该膜包被有重组FopA蛋白和质控抗体的检测条带和质控条带；

(4)金标抗体保护膜，其中含有胶体金标记的SPA；

(5)样品垫；

其中反应支持物选用PVC板；吸水垫选用滤油纸；硝酸纤维膜上靠近其起始端处设置有羊抗兔IgG包被的质控条带、靠近其末端处设置有重组FopA蛋白包被的检测条带。金标抗体保护膜的材料选自聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维，其上含有胶体金标记的SPA；样品垫材料选自聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维。

本实用新型方法所涉及试纸中的所述吸水垫选用滤纸，所述反应支持物选用PVC板，所述金标抗体保护膜的材料选自聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维，其上均匀涂布有胶体金标记的抗体。

本实用新型方法所涉及试纸中的所述金标抗体保护膜由将胶体金标记的SPA均匀涂布在聚脂膜、玻璃纤维膜或滤纸纤维膜上来制成。

本实用新型检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸条的结构为：反应支持物5位于底层，硝酸纤维膜2位于反应支持物5上的中部，硝酸纤维膜2的T处是重组FopA蛋白包被的检测条带，C处是羊抗兔IgG包被的质控条带；金标抗体保护膜3位于硝酸纤维膜2上部的一侧并与之部分重叠，该膜含有胶体金标记的重组土拉弗朗西斯菌抗体；吸水垫1位于硝酸纤维膜2上部的相对于金标抗体保护膜3而言的另一侧、并与硝酸纤维膜2部分重叠；样品垫4位于硝酸纤维膜2上与吸水垫1相反的一侧并与金标抗体保护膜3部分重叠。

上述试纸中，吸水垫1一侧为起始端，金标抗体保护膜3一侧为末端，检测条带位于接近末端，质控条带接近于起始端。

上述试纸中，重组FopA蛋白的浓度为1-5mg/ml，质控羊抗兔IgG的浓度为0.1-5mg/ml。

上述试纸中，羊抗兔IgG抗体浓度优选为0.5-2.5mg/ml。

上述试纸中，SPA标记1ml胶体金的量为5-6ug。

本实用新型检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸条的制备方法，该方法包括：

(1)用隔流喷金划线机以一定喷膜速度喷涂抗土拉弗朗西斯菌抗体抗体和质控抗体两个条带的硝酸纤维膜；

(2)制备一种含有胶体金标记的SPA的金标抗体保护膜，将胶体金标记的SPA均匀涂布在玻璃纤维膜上，并烘干或冷冻干燥后，制成金标抗体保护膜。

本实用新型所述的制备方法，其中所述喷涂包被膜的步骤中，喷膜速度是10-100mm/s。

本实用新型所述的制备方法，其中所述重组FopA蛋白，其加入量为1-5mg/ml，该蛋白的稀释液可以为PB。

本实用新型所述的制备方法，其中质控羊抗兔IgG的浓度为0.1-5mg/ml。

本实用新型所述的制备方法，其中将胶体金标记的SPA均匀涂布在玻璃纤维膜上，其中pH为6.4-6.8。

本实用新型涉及所述试纸在检测土拉弗朗西斯菌抗体中的应用，其中包括将待测标本与样品稀释液混匀，再将样品混合液加入试纸样品孔处，样品中的液体依靠虹吸作用上行，10-15分钟判读结果。

本实用新型涉及上述方法制备的检测土拉弗朗西斯菌抗体的试纸。

本实用新型所述的方法和产品中使用层析测试条耗材，耗材例如是玻璃纤维的结合垫，硝酸纤维素膜(例如NC膜，SHF 1350225)，样品垫及吸水垫、滤纸，可购自Minipore公司。

本实用新型涉及的上述土拉弗朗西斯菌抗体的检测试纸，它还包含金标抗体保护膜。

本实用新型涉及的上述土拉弗朗西斯菌抗体的检测试纸，其中反应支持物选用PVC板。

本实用新型涉及的上述土拉弗朗西斯菌抗体的检测试纸，其中吸水垫选用滤纸。

本实用新型涉及的上述土拉弗朗西斯菌抗体的检测试纸，其中金标抗体保护膜选用聚脂膜、玻璃纤维或滤纸纤维。

一、胶体金免疫层析试纸条的制备

材料和方法

1、抗原及抗体

纯化的天然土拉弗朗西斯菌抗体，研究室制备的兔、鼠抗重组相思子A链多克隆抗体。

2、层析测试条耗材

结合垫(玻璃纤维)、硝酸纤维素膜(NC膜，SHF 1350225)、样品垫及吸水垫、滤纸购自Minipore公司。

3、实验仪器

金标分析仪(中国科学院上海光学精密机械研究所、中国检验检疫科学研究院联合研制)。

4、胶体金免疫层析试纸条的制备

4.1胶体金结合垫

将pH值6.4～6.8、浓度0.2mg/ml的SPA标记于柠檬酸钠法制备25nm的胶体金颗粒的胶体金颗粒，37℃干燥[7]。

4.2硝酸纤维素膜

检测带：重组FopA蛋白1mg/ml；质控带：羊抗兔IgG：1mg/ml，37℃干燥。

4.3组装

将样品垫、结合垫、吸水垫依次贴在带有豁合剂的底衬卡，切成0.4cm的条，干燥，装壳，室温贮存备用(参见上述文献)。

二、样品的定性和定量检测

1、模拟样品的处理

采用人的血清样品进行检测，用样品处理液进行100倍稀释后作为待检样品；另外，把稀释后的人血清中加入FopA抗体同时进行检测。

2、定性检测

将处理后的样品和样品处理液(作为阴性样品)100ul加到制备好的层析条样品垫端，静置15min，观察结果。检测带和质控带均出现红色判为阳性，仅质控带出现红色为阴性，检测带和质控带均不显色，则为试纸条失效。

3、定量检测

3.1判定值(CUT-OFF)的确定

按1.6.1将阴性样品检测20次，用金标免疫分析仪扫描读取信号T/C比值。20个样品T/C比值的平均值(AVERAGE)与3倍标准差(STDEVA)之和为CUT-OFF值。

3.2定量检测判定

将显色后的金标条放入金标免疫分析仪扫描，读取信号T/C比值，大于判定值为阳性。

三、灵敏度试验

1、定量检测

1、定量检测的灵敏度

检测不同浓度土拉弗朗西斯菌抗体，经过计算判定值(CUT-OFF)为0.002，浓度为15ng/ml的土拉菌FopA多抗的平均T/C比值均为0.001，低于0.002，为阴性；30～2400ng/ml的土拉菌FopA多抗的平均T/C比值分别为0.03，0.061，0.122，0.211，0.367，0.627，高于0.002的结果为阳性；当土拉菌FopA多抗浓度大于30ng/ml时，T/C比值平均值大于0.002，故检测灵敏度为30ng/ml。

表1土拉弗朗西斯菌抗体胶体金免疫层析试纸条各浓度检测结果

2、直观检测灵敏度的评价

按确定的最佳反应条件制备胶体金免疫层析试纸条，检测不同浓度的土拉弗朗西斯菌抗体。将土拉弗朗西斯菌抗体用样品处理液稀释成浓度依次为浓度依次为14.8μg/ml、7.4μg/ml、3.7μg/ml、1.85μg/ml、0.925μg/ml、0.4625μg/ml，同时进行检测。

结果如图1所示，直接目测的灵敏度30ng/mL显色更加清晰。

3、模拟样本检测

采用人的血清样品进行检测，用样品处理液进行100倍稀释后作为待检样品；另外，把稀释后的人血清中加入FopA抗体同时进行检测。人正常血清为阴性，添加土拉菌FopA抗体的样品检测灵敏度为30ng/mL。

四、标准曲线拟合

以土拉菌FopA多抗浓度为横坐标(X)，金标分析仪读值T/C比值(Y)为纵坐标作图，建立胶体金检测标准曲线。当土拉菌FopA抗体浓度为30～960ng/ml时，抗体的浓度与其金标分析仪读值T/C比值之间呈良好的线性关系(图2)，线性回归方程为Y＝0.0006X+0.0367，R2为0.9905。

五、特异性试验

按确定的最佳反应条件制备胶体金免疫层析试纸条，以样品稀释液同样分别处理制备好的胶体金免疫层析试纸条检测马秋波GP2抗体、天花M1R抗体、黄热YF-E-D3抗体、禽流感NP抗体、登革病毒Deng-E-D3抗体和普氏立克次体120N抗体，检测结果见2。检测结果均未出现阳性反应，证明与这些蛋白均无交叉反应，该检测方法特异性良好。

六、回收率试验

在线性检测范围内，检测已知浓度的土拉菌FopA抗体，根据金标分析仪读值T/C比值和标准曲线计算出检测浓度，检测浓度与理论浓度的比值百分率为回收率。由表2可见，检测理论浓度为50，100，200，500，800ng/ml的土拉菌FopA多抗时，其回收率在41.0％～118.6％之间。

表2土拉弗朗西斯菌抗体胶体金免疫层析试纸条检测***回收率

七、稳定性试验

参见图3，将新制备的胶体金免疫层析试纸条于37℃存放一周，分别用120ng/mL、60ng/mL、30ng/mL浓度的土拉菌FopA抗体进行检测，结果如图5.4所示。120ng/mL、60ng/mL、30ng/mL的土拉菌FopA抗体均为阳性反应，检测灵敏度为30ng/mL。用马秋波GP2抗体、天花M1R抗体、黄热YF-E-D3抗体、禽流感NP抗体、登革病毒Deng-E-D3抗体和普氏立克次体120N抗体进行检测均为阴性反应。该检测结果与新制备的检测试纸条相比，灵敏度没有明显下降，且特异性良好。

Claims

1.检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸条，其特征在于，该试纸条包括反应支撑物、紧密连接于反应支撑物上表面中部的硝酸纤维膜，硝酸纤维膜起始端的上表面与吸水垫部分重叠连接、硝酸纤维膜末端的下表面与金标抗体保护膜部分重叠连接，金标抗体保护膜的下表面部分重叠连接有样品垫，其中，金标抗体保护膜包括膜本体、及均匀涂布在其上的胶体金标记的SPA涂层，硝酸纤维膜上靠近其起始端处设置有羊抗兔IgG包被的质控条带、靠近其末端处设置有重组FopA蛋白包被的检测条带。

2.如权利要求1所述的检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸条，其特征在于，所述反应支持物为PVC板，吸水垫为滤油纸。

3.如权利要求1所述的检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸条，其特征在于，所述金标抗体保护膜为玻璃纤维膜、聚脂膜或滤纸纤维。

4.如权利要求1所述的检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸条，其特征在于，所述样品垫为玻璃纤维膜、聚脂膜或滤纸纤维。

5.如权利要求1所述的检测土拉弗朗西斯菌抗体的胶体金免疫检测试纸条，其特征在于，所述试纸整体的外部包裹有外壳，该外壳上对应于所述样品垫处设置有样品孔，外壳上对应于所述质控条带、检测条带处设置有观察窗。