CN111896750A - 牛免疫球蛋白（IgG）双抗体夹心胶体金免疫层析试纸条、制备方法、试剂盒和检测方法 - Google Patents

牛免疫球蛋白（IgG）双抗体夹心胶体金免疫层析试纸条、制备方法、试剂盒和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种牛免疫球蛋白(IgG)双抗体夹心胶体金免疫层析试纸条、制备方法、试剂盒和检测方法。胶体金免疫层析试纸条，其特征是，包括底板、以及重叠设置在PVC底板上的吸水垫、层析膜、结合物释放垫和样品垫，结合物释放垫上包被有胶体金标记的牛免疫球蛋白抗体a复合物，层析膜上设有一条检测线和一条质控线，所述检测线包被有抗牛免疫球蛋白抗体b，所述质控线包被有羊抗鼠IgG。本发明同时提供了所述层析试纸条的制备方法，和包括该试剂条的试剂盒，以及该试剂盒进行检测的方法。本发明的技术方案基于双抗体夹心胶体金显色以及金标免疫分析仪定量的原理制成，可用来快速定量检测牛免疫球蛋白(IgG)含量。

Description

牛免疫球蛋白(IgG)双抗体夹心胶体金免疫层析试纸条、制备 方法、试剂盒和检测方法
技术领域
本发明涉及检测试剂条、试剂盒领域，尤其涉及一种牛免疫球蛋白(IgG) 双抗体夹心胶体金免疫层析试纸条，该试剂条的制备方法，和包括该试剂条的试剂盒，以及该试剂盒进行检测的方法。
背景技术
免疫球蛋白Ig是机体免疫***中的重要组成部分，普遍存在哺乳动物的血液、乳汁、初乳及淋巴液中，一般分为IgG、IgA、IgD、IgM、IgE等五大类。随着对牛免疫球蛋白的分离技术不断进步，人们对牛免疫球蛋白的生物学功能认识也不断深入，其富含优质蛋白、维生素和矿物质等营养元素，可以调节动物的免疫功能，增强机体抵抗力，因此在食品中的应用也越来越广泛，从牛乳中分离的牛免疫球蛋白(IgG)已经成为婴幼儿配方奶粉及各种乳制品、保健品的重要添加成分。由于IgG的含量直接决定了各种配方产品的质量和价格，因此对此类产品中的牛免疫球蛋白(IgG)含量的检测极为重要。
目前，用来检测牛免疫球蛋白(IgG)含量的方法主要分为仪器方法和免疫学方法两大类，仪器法主要包括紫外分光光度法，电泳法和高效液相色谱法，仪器法都具有检测准确率高，可重复的特点，但是仪器法耗时长，对设备和人员的要求高；免疫学检测方法主要包括酶联免疫分析法(ELISA)、免疫双向扩散法、荧光免疫分析法，想较于仪器方法，免疫学检测方法具有检测通量高，方便的特点，但是灵敏度不高、步骤复杂，胶体金免疫层析法由于其快速方便，检测结果直观的特点，已被广泛应用于药物和疾病检测领域，在对样品进行前处理后，只需10-15min，即可得到检测结果，结合检测仪，更是可以对样品的含量进行定量，在牛免疫球蛋白(IgG)检测领域，未见胶体金检测方法的报道。
发明内容
本发明是为了克服现有技术中的牛免疫球蛋白(IgG)检测领域的上述不足之处，且无法实现高通量处理的不足之处，提供一种牛免疫球蛋白(IgG)双抗体夹心胶体金免疫层析试纸条、制备方法、试剂盒和检测方法，可对样品中的牛免疫球蛋白实现快速定量检测，极大的缩短了检测时间，并可实现大批量样品的快速准确筛查。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的一种牛免疫球蛋白(IgG)双抗体夹心胶体金免疫层析试纸条，包括底板、以及重叠设置在底板上的吸水垫、层析膜、结合物释放垫和样品垫，结合物释放垫上包被有胶体金标记的牛免疫球蛋白抗体a复合物，层析膜上设有一条检测线和一条质控线，所述检测线包被有抗牛免疫球蛋白抗体b，所述质控线包被有羊抗鼠IgG。
作为优选，层析膜上的检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的抗牛免疫球蛋白抗体b，层析膜上的质控线包被有浓度为0.5-1mg/mL的羊抗鼠IgG。
作为优选，所述抗牛免疫球蛋白抗体a和抗牛免疫球蛋白抗体b同为抗牛免疫球蛋白单克隆抗体或抗牛免疫球蛋白多克隆抗体或抗牛免疫球蛋白重组抗体中的一种。
作为优选，所述抗牛免疫球蛋白抗体a和抗牛免疫球蛋白抗体b同为抗牛免疫球蛋白单克隆抗体。
本试纸条基于双抗体夹心原理实现检测，固定于结合物释放垫上的胶体金标记的牛免疫球蛋白抗体复合物和检测线的抗牛免疫球蛋白抗体分别识别牛免疫球蛋白的不同的抗原决定簇，当待测样品中含有牛免疫球蛋白时，首先在结合物释放垫形成牛免疫球蛋白-胶体金-牛免疫球蛋白抗体a复合物，从而与检测线上的抗牛免疫球蛋白抗体b结合，在检测线显色，而质控线会一直显色以保证试纸条有效。当待测样品中不含有牛免疫球蛋白时，只有质控线会显色。
本申请同时提供一种胶体金标记的牛免疫球蛋白抗体a复合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
取10mL烧制完成的胶体金溶液，用0.1MK2CO3溶液调节pH至7.5，磁力搅拌下逐滴加入1mL浓度为110μg/mL的牛免疫球蛋白抗体溶液，混匀，静置 1h；
静置完成后的溶液中逐滴加入1.3mL含10％BSA和1％PEG的硼酸缓冲液，混匀，静置1h，13500r/min离心30min，弃上清，用硼酸缓冲液复溶后重复离心一次，最后沉淀用1％BSA，5％蔗糖定容至1mL，即胶体金标记的牛免疫球蛋白抗体a复合物的浓缩液。
作为优选，所述胶体金为氯金酸在柠檬酸钠还原下烧制获得的20-60nm的胶体金颗粒。
作为优选，所述胶体金颗粒为20-50nm。
本发明还提供一种牛免疫球蛋白(IgG)双抗体夹心胶体金免疫层析试纸条的制备方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1，制备样品垫：所述样品垫采用玻璃纤维膜，使用含1％BSA、2％蔗糖、0.1％PEG、0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液处理玻璃纤维膜1h后，烘干制成样品垫；
步骤2，制备结合物释放垫：所述结合物释放垫采用玻璃纤维膜，使用含1％BSA、2％蔗糖、0.1％PEG、0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液预处理玻璃纤维膜1 h后烘干备用；采用上述胶体金标记的牛免疫球蛋白抗体a复合物的制备方法所制备的胶体金标记的牛免疫球蛋白抗体a复合物的浓缩液5-10倍稀释后以3 μL/cm均匀喷涂在预处理的玻璃纤维膜上，得到包被胶体金标记的牛免疫球蛋白抗体a复合物的结合物释放垫，37℃干燥24h后，密封备用；
结合物释放垫上包被有胶体金标记的牛免疫球蛋白单克隆抗体a，浓度为 0.5-1mg/mL，通过喷金划膜仪喷涂干燥后得到；
步骤3，制备层析膜：所述层析膜采用硝酸纤维膜，在层析膜上设置一条检测线和一条质控线，所述检测线包被有1mg/mL的抗牛免疫球蛋白单克隆抗体 b，所述质控线包被有0.5mg/mL的羊抗鼠二抗IgG；
步骤4，组装试纸条：样品垫、结合物释放垫、层析膜依次压覆在PVC底板上，并且在边缘重叠2～3mm；吸水垫(1)压覆在层析膜(2)的另一端且边缘重叠2～3mm，得到组装的定量检测牛免疫球蛋白(IgG)双抗体夹心胶体金免疫层析试纸条。
本发明另外还提供一种定量检测牛免疫球蛋白(IgG)双抗体夹心胶体金免疫层析试剂盒，所述试剂盒包括上述的胶体金免疫层析试纸条和金标免疫分析仪组成。
本发明同时提供一种基于定量检测牛免疫球蛋白(IgG)双抗体夹心胶体金免疫层析试剂盒的检测方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将胶体金免疫层析试纸平放；吸取一系列含牛免疫球蛋白浓度梯度的样品，每个浓度梯度的样品取4滴分别滴加到样品垫上；
(2)所述样品经过层析作用与结合物释放垫上的胶体金标记的牛免疫球蛋白抗体a复合物特异性结合；
(3)待样品中的牛免疫球蛋白与胶体金标记的牛免疫球蛋白抗体复合物进一步经过检测线和质控线；
(4)静置10-15min；
(5)通过金标免疫分析仪对检测线和质控线的显色强度进行测量，来对样品中的牛免疫球蛋白含量进行精确定量。
本申请定量检测牛免疫球蛋白(IgG)双抗体夹心胶体金免疫层析试剂盒采用胶体金免疫层析试纸条结合金标免疫分析仪，可对样品中的牛免疫球蛋白实现快速定量检测，极大的缩短了检测时间，并可实现大批量样品的快速准确筛查。检测灵敏度为100ppb，与目前的常用的高效液相色谱法以及ELISA检测试剂盒方法相比，本发明提供的试剂盒可在10-15min内得到结果，具有快速、方便、灵敏等特点，适用于大批量样品筛查。
附图说明
图1为本发明基于胶体金免疫层析试纸条检测牛免疫球蛋白含量示意图。
图2为本发明胶体金免疫层析试纸条结果判定图。
图3为本发明胶体金免疫层析试纸条检测不同浓度牛免疫球蛋白结果图。
图4为牛奶样品不同稀释倍数下胶体金免疫层析试纸检测结果图。
图5为本发明的实际样本的检测的测定结果图表。
图中标注：1、吸水垫；2、层析膜；3、质控线；4、检测线；5、结合物释放垫；6、样品垫；7、PVC底板。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步描述。
实施例一
如图1所示，本实施例提供的一种牛免疫球蛋白(IgG)双抗体夹心胶体金免疫层析试纸条，包括底板、以及重叠设置在PVC底板上的吸水垫1、层析膜2、结合物释放垫5和样品垫6，结合物释放垫上包被有胶体金标记的牛免疫球蛋白抗体a复合物，层析膜上设有一条检测线(TestLine，T线)和一条质控线(Control Line，C线)，所述检测线包被有抗牛免疫球蛋白抗体b，所述质控线包被有羊抗鼠IgG。
层析膜上的检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的抗牛免疫球蛋白抗体b。层析膜上的质控线包被有浓度为0.5-1mg/mL的羊抗鼠IgG。
所述抗牛免疫球蛋白抗体a和抗牛免疫球蛋白抗体b同为抗牛免疫球蛋白单克隆抗体或抗牛免疫球蛋白多克隆抗体或抗牛免疫球蛋白重组抗体中的一种。本实施例中所述抗牛免疫球蛋白抗体a和抗牛免疫球蛋白抗体b同为抗牛免疫球蛋白单克隆抗体。
本试纸条基于双抗体夹心原理实现检测，固定于结合物释放垫上的胶体金标记的牛免疫球蛋白抗体复合物和检测线的抗牛免疫球蛋白抗体分别识别牛免疫球蛋白的不同的抗原决定簇，当待测样品中含有牛免疫球蛋白时，首先在结合物释放垫形成牛免疫球蛋白-胶体金-牛免疫球蛋白抗体a复合物，从而与检测线上的抗牛免疫球蛋白抗体b结合。
图2为本申请的快速检测试纸条结果判定图在检测线显色，而质控线会一直显色以保证试纸条有效。当待测样品中不含有牛免疫球蛋白时，只有质控线会显色。
具体实施例中，所述阳性样品选自光明纯牛奶，所述阴性样品选自光明优倍。
具体实例中，所述阴性样品中牛免疫球蛋白样品标准品的添加浓度为100， 200，500，1000，2000，5000，10000μg/L，检测结果如图3所示。
实施例二
本申请同时提供一种胶体金标记的牛免疫球蛋白抗体a复合物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
取10mL烧制完成的胶体金溶液，用0.1MK2CO3溶液调节pH至7.5，磁力搅拌下逐滴加入1mL浓度为110μg/mL的牛免疫球蛋白抗体溶液，混匀，静置 1h；
静置完成后的溶液中逐滴加入1.3mL含10％BSA和1％PEG的硼酸缓冲液，混匀，静置1h，13500r/min离心30min，弃上清，用硼酸缓冲液复溶后重复离心一次，最后沉淀用1％BSA，5％蔗糖定容至1mL，即胶体金标记的牛免疫球蛋白抗体a复合物的浓缩液。所述胶体金为氯金酸在柠檬酸钠还原下烧制获得的 20-50nm的胶体金颗粒。所述胶体金颗粒为20-50nm。
实施例三
本实施例提供一种牛免疫球蛋白(IgG)双抗体夹心胶体金免疫层析试纸条的制备方法，所述方法包括以下步骤：
步骤1，制备样品垫：所述样品垫采用玻璃纤维膜，使用含1％BSA、2％蔗糖、0.1％PEG、0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液处理玻璃纤维膜1h后，烘干制成样品垫；
步骤2，制备结合物释放垫：所述结合物释放垫采用玻璃纤维膜，使用含 1％BSA、2％蔗糖、0.1％PEG、0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液预处理玻璃纤维膜1 h后烘干备用；采用实施例二中提供的胶体金标记的牛免疫球蛋白抗体a复合物的制备方法所制备的胶体金标记的牛免疫球蛋白抗体a复合物的浓缩液5-10倍稀释后以3μL/cm均匀喷涂在预处理的玻璃纤维膜上，得到包被胶体金标记的牛免疫球蛋白抗体a复合物的结合物释放垫，37℃干燥24h后，密封备用；
结合物释放垫上包被有胶体金标记的牛免疫球蛋白单克隆抗体a，浓度为 0.5-1mg/mL，通过喷金划膜仪喷涂干燥后得到；
步骤3，制备层析膜：所述层析膜采用硝酸纤维膜，在层析膜上设置一条检测线和一条质控线，所述检测线包被有1mg/mL的抗牛免疫球蛋白单克隆抗体 b，所述质控线包被有0.5mg/mL的羊抗鼠二抗IgG；
步骤4，组装试纸条：样品垫、结合物释放垫、层析膜依次压覆在PVC底板上，并且在边缘重叠2～3mm；吸水垫(1)压覆在层析膜(2)的另一端且边缘重叠2～3mm，得到组装的定量检测牛免疫球蛋白(IgG)双抗体夹心胶体金免疫层析试纸条。
实施例四
本发明实施例提供一种定量检测牛免疫球蛋白(IgG)双抗体夹心胶体金免疫层析试剂盒，所述试剂盒包括上述的胶体金免疫层析试纸条和金标免疫分析仪组成。
本实施例的试剂盒基于双抗体夹心胶体金显色以及金标免疫分析仪定量的原理制成，可用来快速定量检测牛免疫球蛋白(IgG)含量，检测灵敏度为100ppb，与目前的常用的高效液相色谱法以及ELISA检测试剂盒方法相比，本发明提供的试剂盒可在10-15min内得到结果，具有快速、方便、灵敏等特点，适用于大批量样品筛查。
实施例五
本发明同时提供一种基于定量检测牛免疫球蛋白(IgG)双抗体夹心胶体金免疫层析试剂盒的检测方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将胶体金免疫层析试纸平放；吸取一系列含牛免疫球蛋白浓度梯度的样品，每个浓度梯度的样品取4滴分别滴加到样品垫上；
(2)所述样品经过层析作用与结合物释放垫上的胶体金标记的牛免疫球蛋白抗体a复合物特异性结合；
(3)待样品中的牛免疫球蛋白与胶体金标记的牛免疫球蛋白抗体复合物进一步经过检测线和质控线；
(4)静置10-15min；
(5)通过金标免疫分析仪对检测线和质控线的显色强度进行测量，来对样品中的牛免疫球蛋白含量进行精确定量。
本实施例中列举的一个具体使用实例中，所述阳性样品选自光明纯牛奶，所述阴性样品选自光明优倍。所述阴性样品中牛免疫球蛋白样品标准品的添加浓度为100，200，500，1000，2000，5000，10000μg/L，检测结果如图3所示。
图4为牛奶样品不同稀释倍数下胶体金免疫层析试纸检测结果图。样品基质效应：量取2mL于4℃保存的液态奶样品，待恢复至室温时，将样品分别用超纯水1:10，1:100，1:1000稀释，用本发明的胶体金免疫层析试纸条进行测试，选出可以检测出阳性反应的最低稀释倍数，作为实际样品检测时的稀释倍数。
结果判定如图2所示，加入待测样品10～15min后，若T线不显色，C线显色，表示牛奶样本中不含有免疫球蛋白，结果为阴性；若T线和C线均显色，表示牛奶样本中含有免疫球蛋白，结果为阳性，此时可结合金标免疫分析仪对试纸条显色强度进行读数，与标准曲线对比，准确地对样品中牛免疫球蛋白含量进行定量；若未出现C线，则说明试剂或试纸失效。
本实例提供了用于说明本发明胶体金免疫层析试剂盒精确定量检测牛初乳样品中牛免疫球蛋白(IgG)含量的方法。
操作步骤同实施例五，待9份牛初乳样品冷却至室温后，用超纯水按一定比例稀释后，分别用胶体金试纸条和高效液相色谱法检测。检测结果见图5。其中“+”表示检测结果出现两条红色条带，“-”表示检测结果只有C线一条红色条带。

Claims (10)

1.一种牛免疫球蛋白(IgG)双抗体夹心胶体金免疫层析试纸条，其特征是，包括底板、以及重叠设置在底板上的吸水垫、层析膜、结合物释放垫和样品垫，结合物释放垫上包被有胶体金标记的牛免疫球蛋白抗体a复合物，层析膜上设有一条检测线和一条质控线，所述检测线包被有抗牛免疫球蛋白抗体b，所述质控线包被有羊抗鼠IgG。
2.根据权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征是，层析膜上的检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的抗牛免疫球蛋白抗体b，层析膜上的质控线包被有浓度为0.5-1mg/mL的羊抗鼠IgG。
3.根据权利要求1所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征是，所述抗牛免疫球蛋白抗体a和抗牛免疫球蛋白抗体b同为抗牛免疫球蛋白单克隆抗体或抗牛免疫球蛋白多克隆抗体或抗牛免疫球蛋白重组抗体中的一种。
4.根据权利要求3所述的胶体金免疫层析试纸条，其特征是，所述抗牛免疫球蛋白抗体a和抗牛免疫球蛋白抗体b同为抗牛免疫球蛋白单克隆抗体。
5.一种胶体金标记的牛免疫球蛋白抗体a复合物的制备方法，其特征是，所述方法包括以下步骤：
取10mL烧制完成的胶体金溶液，用0.1M K2CO3溶液调节pH至7.5，磁力搅拌下逐滴加入1mL浓度为110μg/mL的牛免疫球蛋白抗体溶液，混匀，静置1h；
静置完成后的溶液中逐滴加入1.3mL含10％BSA和1％PEG的硼酸缓冲液，混匀，静置1h，13500r/min离心30min，弃上清，用硼酸缓冲液复溶后重复离心一次，最后沉淀用1％BSA，5％蔗糖定容至1mL，即胶体金标记的牛免疫球蛋白抗体a复合物的浓缩液。
6.根据权利要求5所述的胶体金标记的牛免疫球蛋白抗体a复合物的制备方法，其特征是，所述胶体金为氯金酸在柠檬酸钠还原下烧制获得的20-60nm的胶体金颗粒。
7.根据权利要求6所述的胶体金标记的牛免疫球蛋白抗体a复合物的制备方法，其特征是，所述胶体金颗粒为20-50nm。
8.一种牛免疫球蛋白(IgG)双抗体夹心胶体金免疫层析试纸条的制备方法，其特征是，所述方法包括以下步骤：
步骤1，制备样品垫：所述样品垫采用玻璃纤维膜，使用含1％BSA、2％蔗糖、0.1％PEG、0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液处理玻璃纤维膜1h后，烘干制成样品垫；
步骤2，制备结合物释放垫：所述结合物释放垫采用玻璃纤维膜，使用含1％BSA、2％蔗糖、0.1％PEG、0.05％吐温-20的磷酸盐缓冲液预处理玻璃纤维膜1h后烘干备用；采用权利要求7或8或9任意一项方法所制备的胶体金标记的牛免疫球蛋白抗体a复合物的浓缩液5-10倍稀释后以3μL/cm均匀喷涂在预处理的玻璃纤维膜上，得到包被胶体金标记的牛免疫球蛋白抗体a复合物的结合物释放垫，37℃干燥24h后，密封备用；
结合物释放垫上包被有胶体金标记的牛免疫球蛋白单克隆抗体a，浓度为0.5-1mg/mL，通过喷金划膜仪喷涂干燥后得到；
步骤3，制备层析膜：所述层析膜采用硝酸纤维膜，在层析膜上设置一条检测线和一条质控线，所述检测线包被有1mg/mL的抗牛免疫球蛋白单克隆抗体b，所述质控线包被有0.5mg/mL的羊抗鼠二抗IgG；
步骤4，组装试纸条：样品垫、结合物释放垫、层析膜依次压覆在PVC底板上，并且在边缘重叠2～3mm；吸水垫压覆在层析膜的另一端且边缘重叠2～3mm，得到组装的定量检测牛免疫球蛋白双抗体夹心胶体金免疫层析试纸条。
9.一种定量检测牛免疫球蛋白双抗体夹心胶体金免疫层析试剂盒，其特征是，所述试剂盒包括权利要求1或2或3或4或5任一一项所述的胶体金免疫层析试纸条和金标免疫分析仪组成。
10.一种检测方法，其特征是，所述方法包括以下步骤：
将胶体金免疫层析试纸平放；吸取一系列含牛免疫球蛋白浓度梯度的样品，每个浓度梯度的样品取4滴分别滴加到样品垫上；
所述样品经过层析作用与结合物释放垫上的胶体金标记的牛免疫球蛋白抗体a复合物特异性结合；
待样品中的牛免疫球蛋白与胶体金标记的牛免疫球蛋白抗体复合物进一步经过检测线和质控线；
静置10-15min；
通过金标免疫分析仪对检测线和质控线的显色强度进行测量，来对样品中的牛免疫球蛋白含量进行精确定量。
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