CN115754284A - 一种层析检测试纸条及其制备方法 - Google Patents
一种层析检测试纸条及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请涉及免疫检测技术领域,具体公开了一种层析检测试纸条及其制备方法。本申请提供的层析检测试纸条包括支撑底板;所述支撑底板上设置有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫;所述硝酸纤维素膜上设有检测T线和质控C线;检测T线上包被有待检测病原体对应的抗体1,质控C线上包被有用于识别唾液淀粉酶的物质;所述用于识别唾液淀粉酶的物质包括唾液淀粉酶抗体1;本申请还提供了上述层析检测试纸条的制备方法。本申请提供的层析检测试纸条能够判断待测样本的来源,进而保证检测结果的真实有效性。
Description
技术领域
本申请涉及免疫检测技术领域,具体涉及一种层析检测试纸条及其制备方法。
背景技术
流行性感冒和新型冠状病毒肺炎均属于传染性呼吸道疾病,具有传播速度快、传播范围广的特点。目前市场上研发出了一种家庭装自用检测试纸条,该检测试纸条只需要一条试纸即可实现传染性呼吸道疾病的病毒检测,因此具有检测速度快、检测准确率高等优点。
检测试纸条上通常存在两个***,一个是检测***,一个是质控***,目前检测试纸条的质控***大多数采用的是羊抗鼠IGG抗体、羊抗兔IGG抗体、羊抗鸡IGY抗体或者DNP抗体,通过将羊抗鼠IGG抗体、羊抗兔IGG抗体、羊抗鸡IGY抗体或者DNP抗体包被在硝酸纤维素膜上形成质控线;同时利用鼠IGG抗体、兔IGG抗体、鸡IGY抗体或者DNP-BSA抗体标记胶体金或者荧光微球,然后将标记有鼠IGG抗体、兔IGG抗体、鸡IGY抗体或者DNP-BSA的胶体金或者荧光微球固定在硝酸纤维素膜上,通过硝酸纤维素膜上的层析作用,使标记有鼠IGG抗体、兔IGG抗体、鸡IGY抗体或者DNP-BSA的胶体金或者荧光微球达到质控线,从而实现质控试纸条的有效性。
然而上述质控***并不需要样本的参与,也就是质控***对样本的识别无差别,因此无法判断用户的测试样本来源,故无法保证检测结果的真实有效性。
发明内容
为了克服相关技术中自用检测试纸条对样本来源无法判断的问题,本申请提供一种层析检测试纸条及其制备方法。
第一方面,本申请提供一种层析检测试纸条,采用如下的技术方案:
一种层析检测试纸条,所述层析检测试纸条包括支撑底板;所述支撑底板上设置有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫;所述硝酸纤维素膜上设有检测T线和质控C线;所述检测T线上包被有待检测病原体对应的抗体1,所述质控C线上包被有用于识别唾液淀粉酶的物质;所述用于识别唾液淀粉酶的物质包括唾液淀粉酶抗体1。
本申请提供的层析检测试纸条与相关技术相比,采用了用于识别唾液淀粉酶的物质作为层析检测试纸条的质控***,当检测样本是通过咽拭子取样获得,则待检测样本中含有的唾液淀粉酶就会被质控***捕获形成复合物,进而使质控C线在肉眼下或一定波长下发生显色。因此,本申请采用的用于识别唾液淀粉酶的物质作为层析检测试纸条的质控***可以判断待测样本的来源,进而可以保证层析检测试纸条检测结果的真实有效性。
唾液淀粉酶是唾液中最丰富的蛋白质,主要由腮腺、下颌下腺和舌下腺分泌,经过咽拭子采样的样品,就含有唾液淀粉酶,即可被本申请提供的层析检测试纸条的质控***捕获与识别。
本申请中,用于识别唾液淀粉酶的物质包括但不限于唾液淀粉酶抗体1、配体。
目前市场上的自用检测试纸条的使用,并不能得知待检测样本来源,当以反应液、尿液等作为待检测样本时,可能存在检测结果不准确的情况,尤其是呼吸道类疾病。经研究发现,对于呼吸道类疾病,通过利用咽拭子获取的检测样品才能够真实有效地反映被采集人的病毒感染状况,获得的检测结果才更真实可靠。
本申请提供的层析检测试纸条在使用时,当待测样本是通过咽拭子采样获取的,则待测样本中会含有唾液淀粉酶,唾液淀粉酶会与结合垫中胶体金标记的唾液淀粉酶抗体2形成免疫复合物,沿着硝酸纤维素膜向前移动至质控C线,从而与硝酸纤维素膜的质控C线上预先包被的唾液淀粉酶抗体1反应形成复合物,在质控C线上形成一条反应线。故而说明当层析检测试纸条的质控C线发生反应,即证明检测样本是通过咽拭子取样获得的,则表明该层析检测试纸条检测T线的检测结果真实可靠;若质控C线不反应,即证明该检测样本并非咽拭子取样获得,该层析检测试纸条检测T线的检测结果的真实可靠较低。
优选地,所述唾液淀粉酶抗体1需要用包被稀释液进行稀释,所述包被稀释液为PBS和蔗糖的混合物。
本申请选用PBS和蔗糖的混合物作为包被稀释液,既能够将唾液淀粉酶抗体固定在硝酸纤维素膜上,还能保证唾液淀粉酶抗体的稳定性,使得质控C线具备优异的显色效果。PBS能够为唾液淀粉酶抗体提供支撑,使其固定在硝酸纤维素膜上,蔗糖可以增加唾液淀粉酶抗体的稳定性。
本申请具体的实施方案中,包被稀释液为10mM PBS和2.5%蔗糖的混合物。
进一步的,所述唾液淀粉酶抗体1的稀释浓度为1-3mg/mL。
本申请中,当唾液淀粉酶抗体1的稀释浓度过低时,唾液淀粉酶抗体1对待测样品中唾液淀粉酶的捕获效率低,从而导致质控C线的检测精密度降低。因此本申请将唾液淀粉酶抗体1的稀释浓度控制在上述范围内,既能够降低成本,又能使质控C线获得优异的检测精密度。
在一些实施方案中,所述唾液淀粉酶抗体1的稀释浓度为可以为1-1.5mg/mL、1-2mg/mL、1-2.5mg/mL、1.5-2mg/mL、1.5-2.5mg/mL、1.5-3mg/mL、2-2.5mg/mL、2-3mg/mL或2.5-3mg/mL。
在一个具体的实施方案中,所述唾液淀粉酶抗体1的稀释浓度为还可以为1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL或3mg/mL。
优选地,所述唾液淀粉酶抗体1的稀释浓度为1.5-2.5mg/mL。
优选地,所述结合垫上固定有标记示踪物标记的待检测病原体对应的抗体2和标记示踪物标记的唾液淀粉酶抗体2。
当待检测样本中含有待检测病原体或唾液淀粉酶时,上述待检测病原体或唾液淀粉酶会与结合垫上固定有标记示踪物标记的待检测病原体对应的抗体2或标记示踪物标记的唾液淀粉酶抗体2形成复合物,沿着硝酸纤维素膜向前移动,依次抵达检测T线与质控C线。当复合物抵达检测T线时,待检测病原体与结合垫上固定的标记示踪物标记的待检测病原体对应的抗体2形成的复合物会与检测T线上的待检测病原体对应的抗体1发生结合,并聚集在检测T线上,使得检测T线上形成抗原抗体复合物,并在肉眼下或一定波长下发生显色;当复合物当抵达质控C线时,所述唾液淀粉酶与结合金垫上固定的标记示踪物标记的唾液淀粉酶抗体2形成的复合物会与质控C线上的唾液淀粉酶抗体1发生结合,并聚集在质控C线上,使质控C线在肉眼下或一定波长下发生显色。
优选地,所述标记示踪物选自胶体金、彩色微球和荧光微球。
胶体金是一种胶体状态的带有负电的疏水胶溶液,胶体金在弱碱环境下带负电,能够与蛋白质分子的正电荷基团发生静电吸附进而形成牢固的结合,该结合过程并不影响蛋白质的生理活性,因此能够顺利进行后续的特异性结合。彩色微球是一种带有特殊功能基团的微球,具有稳定的结构形态,可作为标记示踪物应用在免疫层析技术中。荧光微球是一种特殊的功能微球,具有稳定的结构形态与高效的发光效率,可作为标记示踪物应用在免疫层析技术中。
优选地,所述待检测病原体为上呼吸道病毒;所述上呼吸道病毒包括新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒。
本申请中,上呼吸道病毒包括但不限于新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒。
本申请提供的层析检测试纸条主要是针对于呼吸道类疾病的抗原检测,比如新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒。该类病毒的传播速度快、传播范围广,因此为了快速确定是否存在上述病原体,人们只需要自行利用层析检测试纸条进行检测;然而该层析检测试纸条的使用人群通常为非专业人群,使用环境为非医护环境,因此若不进行咽拭子采样,将会导致上呼吸道类疾病的检测结果不准确。
第二方面,本申请提供一种层析检测试纸条的制备方法,包括以下步骤:包被硝酸纤维素膜、制备结合垫;
包被硝酸纤维素膜:首先在硝酸纤维素膜表面划检测T线与质控C线,然后采用划膜设备在所述检测T线包被待检测病原体对应的抗体1,在所述质控C线包被唾液淀粉酶抗体1,经干燥即可获得包被后的硝酸纤维素膜。
进一步的,所述制备结合垫的具体步骤为:利用标记示踪物分别标记待检测病原体对应的抗体2与唾液淀粉酶抗体2,获得标记示踪物标记的待检测病原体对应的抗体2与标记示踪物标记的唾液淀粉酶抗体2;将所述标记示踪物标记的待检测病原体对应的抗体2与所述标记示踪物标记的唾液淀粉酶抗体2用金垫稀释液进行稀释,从而获得金垫工作液;然后将所述金垫工作液涂布在玻璃纤维素膜上,并置于干燥箱中干燥,即可获得结合垫。
优选的,所述金垫稀释液包括以下组分:20mM Tris8.0,0.5%牛血清白蛋白,0.5%吐温20,0.2%曲拉通100,3%蔗糖,0.1%proclin300。
一种胶体金作为标记示踪物的层析检测试纸条的制备方法,具体包括以下步骤:
(1)制备包被硝酸纤维素膜:首先在硝酸纤维素膜表面划检测T线与质控C线,然后采用划膜设备在检测T线包被待检测病原体对应的抗体1,在质控C线包被唾液淀粉酶抗体1,然后置于干燥箱中干燥,即可获得硝酸纤维素膜;
(2)制备结合垫:
(2-1)胶体金标记待检测病原体对应的抗体2:向胶体金溶液依次加入K2CO3溶液、待检测病原体对应的抗体2进行反应,反应完毕再加入BSA封闭剂,然后离心去上清,将沉淀用金垫稀释液重悬,即可得到胶体金标记的待检测病原体对应的抗体2;
(2-2)胶体金标记唾液淀粉酶抗体2:向胶体金溶液依次加入K2CO3溶液、唾液淀粉酶抗体2进行反应,反应完毕再加入BSA封闭剂,然后离心去上清,将沉淀用金垫稀释液重悬,即可得到胶体金标记的唾液淀粉酶抗体2;
(2-3)将所述胶体金标记的待检测病原体对应的抗体2与胶体金标记的唾液淀粉酶抗体2用金垫稀释液进行稀释,从而获得金垫工作液;然后将所述金垫工作液涂布在玻璃纤维素膜上,并置于干燥箱中干燥,即可获得结合垫;
(3)制备层析检测试纸条:在支撑底板上依次粘贴硝酸纤维素膜、结合垫、吸水垫、样品垫,然后切割成3.5mm宽的试纸条,即可获得层析检测试纸条。
综上所述,本申请具有以下有益效果:
1.本申请提供的层析检测试纸条的质控***采用的是用于识别唾液淀粉酶的物质,利用上述层析检测试纸条能够判断待测样本是否通过咽拭子取样获得,进而能够保证样本检测结果的真实有效性。
2.本申请选用PBS和蔗糖的混合物作为唾液淀粉酶的包被稀释液,并将唾液淀粉酶的稀释浓度控制在1-3mg/mL之间能够实现待测样本来源的判断;进一步的,将唾液淀粉酶的稀释浓度控制在1.5-2.5mg/mL之间时,对待测样本来源判断的准确性更高。
3.本申请提供的层析检测试纸条是对咽拭子采样获得的待测样本进行检测,因此适用于检测新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒等呼吸道类病原体,利用该层析检测试纸条对上述病原体进行检测,能够保证检测结果的真实有效性,检测的准确率高达100%。
附图说明
图1是实施例1获得的层析检测试纸条的检测结果(1-a:待测样本来源为咽拭子;1-b:待测样本来源为反应液;1-c:待测样本来源为尿液)。
图2是对比例3获得的层析检测试纸条的检测结果(2-a:待测样本来源为咽拭子;2-b:待测样本来源为反应液;2-c:待测样本来源为尿液)。
图3是对比例4获得的层析检测试纸条的检测结果(3-a:待测样本来源为咽拭子;3-b:待测样本来源为反应液;3-c:待测样本来源为尿液)。
具体实施方式
本申请提供一种层析检测试纸条,该层析检测试纸条包括支撑底板;所述支撑底板上设置有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫;所述硝酸纤维素膜上设有检测T线和质控C线;所述检测T线上包被有待检测病原体对应的抗体1,所述质控C线上包被有唾液淀粉酶抗体1;进一步的,所述结合垫上固定有标记示踪物标记的待检测病原体对应的抗体2和标记示踪物标记的唾液淀粉酶抗体2;所述标记示踪物为胶体金、彩色微球或荧光微球。
上述层析检测试纸条的制备方法包括以下步骤:
(1)包被硝酸纤维素膜:首先在硝酸纤维素膜表面划检测T线与质控C线,然后采用划膜设备在检测T线包被待检测病原体对应的抗体1,在质控C线包被唾液淀粉酶抗体1,然后将硝酸纤维素膜置于45℃的鼓风干燥箱中干燥24h,即可获得包被后的硝酸纤维素膜;
其中,所述待检测病原体对应的抗体与唾液淀粉酶抗体分别用包被稀释液稀释至浓度为1.5-2.5mg/mL;所述包被稀释液为10mM PBS和2.5%蔗糖的混合物。
(2)制备结合垫:
(2-1)胶体金标记待检测病原体对应的抗体2:取0.04%的胶体金溶液10mL,加入0.2M K2CO3缓冲液,调节至pH值为7-8,然后再按照20μg/mL的比例加入待检测病原体对应的抗体2进行反应,室温反应30min;反应完毕再按照20μL/mL的比例加入5%BSA封闭剂,25℃反应15min;反应完毕离心去上清,然后将沉淀用金垫稀释液重悬至1mL,即可得到胶体金标记的待检测病原体对应的抗体2;
(2-2)胶体金标记唾液淀粉酶抗体2:取0.04%的胶体金溶液10mL,加入0.2M K2CO3缓冲液,调节至pH值为7-8,然后再按照20μg/mL的比例加入唾液淀粉酶抗体2进行反应,室温反应30min;反应完毕再按照20μL/mL的比例加入5%BSA封闭剂,25℃反应15min;反应完毕离心去上清,然后将沉淀用金垫稀释液重悬至1mL,即可得到胶体金标记的唾液淀粉酶抗体2;
(2-3)将所述胶体金标记的待检测病原体对应的抗体2与胶体金标记的唾液淀粉酶抗体2用金垫稀释液进行稀释,获得金垫工作液;然后将该金垫工作液按照1mL/5cm×5cm的量涂布在玻璃纤维素膜上,并置于45℃的鼓风干燥箱中干燥24h,即可获得结合垫;其中,金垫工作液中胶体金标记的待检测病原体对应的抗体2的终浓度为12%,胶体金标记的唾液淀粉酶抗体2的终浓度为5%。
(3)制备层析检测试纸条:在支撑底板上依次粘贴硝酸纤维素膜、结合垫、吸水垫、样品垫,然后切割成10mm宽的试纸条,即可获得层析检测试纸条。
在本申请具体的实施例中,金垫稀释液包括以下组分:20mM Tris8.0,0.5%牛血清白蛋白,0.5%吐温20,0.2%曲拉通100,3%蔗糖,0.1%proclin300;硝酸纤维素膜为赛多利斯硝酸纤维素膜CN140;待检测病原体对应的抗体1为新冠N抗体-27,货号为N-27;待检测病原体对应的抗体2为新冠N抗体-28,货号为N-28;唾液淀粉酶抗体1为抗α-淀粉酶多抗,型号为A8273;唾液淀粉酶抗体2为唾液淀粉酶α1抗体(AMY1A),型号为MAB482Hu22;其余原料、试剂、溶剂等均可通过商购获得。
以下结合实施例、对比例、附图说明及性能检测试验对本申请作进一步详细说明。
实施例
实施例1
实施例1提供一种层析检测试纸条。
本实施例提供的层析检测试纸条包括支撑底板;所述支撑底板上依次设置有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫;所述硝酸纤维素膜上设有检测T线和质控C线;所述检测T线上包被有新冠N抗体-27,所述质控C线上包被有抗α-淀粉酶多抗;所述结合垫上固定有标记胶体金的新冠N抗体-28和胶体金标记的唾液淀粉酶α1抗体(AMY1A)。
上述层析检测试纸条的制备方法具体步骤如下:
(1)包被硝酸纤维素膜:首先在硝酸纤维素膜表面划检测T线与质控C线,检测T线与质控C线的之间的距离为4mm;然后采用划膜机在检测T线包被新冠N抗体-27,在质控C线包被抗α-淀粉酶多抗,划膜机的划线参数为1μL/cm、100mm/s;然后将硝酸纤维素膜置于45℃的鼓风干燥箱中干燥24h,即可获得包被后的硝酸纤维素膜;
其中,新冠N抗体-27与抗α-淀粉酶多抗分别用包被稀释液稀释至浓度为2mg/mL;包被稀释液为10mM PBS和2.5%蔗糖的混合物。
(2)制备结合垫:
(2-1)胶体金标记新冠N抗体-28:取0.04%的胶体金溶液10mL,加入0.2M K2CO3缓冲液,调节至pH值为7-8,然后再按照20μg/mL的比例加入新冠N抗体-28进行反应,室温反应30min;反应完毕再按照20μL/mL的比例加入5%BSA封闭剂,25℃反应15min;反应完毕离心去上清,然后将沉淀用金垫稀释液重悬至1mL,即可得到胶体金标记的新冠N抗体-28;(2-2)胶体金标记唾液淀粉酶α1抗体(AMY1A):取0.04%的胶体金溶液10mL,加入0.2M K2CO3缓冲液,调节至pH值为7-8,然后再按照20μg/mL的比例加入唾液淀粉酶α1抗体(AMY1A)进行反应,室温反应30min;反应完毕再按照20μL/mL的比例加入5%BSA封闭剂,25℃反应15min;反应完毕离心去上清,然后将沉淀用金垫稀释液重悬至1mL,即可得到胶体金标记的唾液淀粉酶α1抗体(AMY1A);
(2-3)将胶体金标记的新冠N抗体-28与胶体金标记的唾液淀粉酶α1抗体(AMY1A)用金垫稀释液进行稀释,获得金垫工作液;然后将该金垫工作液按照1mL/5cm×5cm的量涂布在玻璃纤维素膜上,并置于45℃的鼓风干燥箱中干燥24h,即可获得结合垫;其中,金垫工作液中胶体金标记的新冠N抗体-28的终浓度为12%,胶体金标记的唾液淀粉酶α1抗体(AMY1A)的终浓度为5%。
(3)制备层析检测试纸条:在支撑底板上依次粘贴硝酸纤维素膜、结合垫、吸水垫、样品垫,然后切割成3.5mm宽的试纸条,即可获得层析检测试纸条。
实施例2
实施例2提供一种层析检测试纸条。
上述实施例与实施例1的不同之处在于:步骤(1)包被硝酸纤维素膜中,新冠N抗体-27用包被稀释液稀释至浓度为2mg/mL,抗α-淀粉酶多抗用包被稀释液稀释至浓度为1mg/mL。
实施例3
实施例3提供一种层析检测试纸条。
上述实施例与实施例1的不同之处在于:步骤(1)包被硝酸纤维素膜中,新冠N抗体-27用包被稀释液稀释至浓度为2mg/mL,抗α-淀粉酶多抗用包被稀释液稀释至浓度为1.5mg/mL。
实施例4
实施例4提供一种层析检测试纸条。
上述实施例与实施例1的不同之处在于:步骤(1)包被硝酸纤维素膜中,新冠N抗体-27用包被稀释液稀释至浓度为2mg/mL,抗α-淀粉酶多抗用包被稀释液稀释至浓度为2.5mg/mL。
实施例5
实施例5提供一种层析检测试纸条。
上述实施例与实施例1的不同之处在于:步骤(1)包被硝酸纤维素膜中,新冠N抗体-27用包被稀释液稀释至浓度为2mg/mL,抗α-淀粉酶多抗用包被稀释液稀释至浓度为3mg/mL。
对比例
对比例1
对比例1提供一种层析检测试纸条。
上述对比例与实施例1的不同之处在于:步骤(1)包被硝酸纤维素膜中的包被稀释液为10mM PBS。
对比例2
对比例2提供一种层析检测试纸条。
上述对比例与实施例1的不同之处在于:步骤(1)包被硝酸纤维素膜中的包被稀释液为2.5%蔗糖。
对比例3
对比例3提供一种层析检测试纸条。
对比例3与实施例1的不同之处在于:质控C线上包被的抗α-淀粉酶多抗替换为羊抗兔IGG抗体,胶体金标记的唾液淀粉酶α1抗体(AMY1A)替换为胶体金标记的兔IGG抗体。
上述层析检测试纸条的制备方法具体步骤如下:
(1)包被硝酸纤维素膜:首先在硝酸纤维素膜表面划检测T线与质控C线,检测T线与质控C线的之间的距离为4mm;然后采用划膜机在检测T线包被新冠N抗体-27,在质控C线包被羊抗兔IGG抗体,划膜机的划线参数为1μL/cm、100mm/s;然后将硝酸纤维素膜置于45℃的鼓风干燥箱中干燥24h,即可获得包被后的硝酸纤维素膜;
其中,新冠N抗体-27与羊抗兔IGG抗体分别用包被稀释液稀释至浓度为2mg/mL;包被稀释液为10mM PBS和2.5%蔗糖的混合物。
(2)制备结合垫:
(2-1)胶体金标记新冠N抗体-28:取0.04%的胶体金溶液10mL,加入0.2M K2CO3缓冲液,调节至pH值为7-8,然后再按照20μg/mL的比例加入新冠N抗体-28进行反应,室温反应30min;反应完毕再按照20μL/mL的比例加入5%BSA封闭剂,25℃反应15min;反应完毕离心去上清,然后将沉淀用金垫稀释液重悬至1mL,即可得到胶体金标记的新冠N抗体-28;(2-2)胶体金标记的兔IGG抗体:取0.04%的胶体金溶液10mL,加入0.2M K2CO3缓冲液,调节至pH值为7-8,然后再按照20μg/mL的比例加入兔IGG抗体进行反应,室温反应30min;反应完毕再按照20μL/mL的比例加入5%BSA封闭剂,25℃反应15min;反应完毕离心去上清,然后将沉淀用金垫稀释液重悬至1mL,即可得到胶体金标记的兔IGG抗体;
(2-3)将胶体金标记的新冠N抗体-28与胶体金标记的兔IGG抗体用金垫稀释液进行稀释,获得金垫工作液;然后将该金垫工作液按照1mL/5cm×5cm的量涂布在玻璃纤维素膜上,并置于45℃的鼓风干燥箱中干燥24h,即可获得结合垫;其中,金垫工作液中胶体金标记的待检测病原体对应的抗体的终浓度为12%,胶体金标记的羊抗兔IGG抗体的终浓度为5%。
(3)制备层析检测试纸条:在支撑底板上依次粘贴硝酸纤维素膜、结合垫、吸水垫、样品垫,然后切割成3.5mm宽的试纸条,即可获得层析检测试纸条。
对比例4
对比例4提供一种层析检测试纸条。
对比例4与实施例1的不同之处在于:质控C线上包被的抗α-淀粉酶多抗替换为DNP抗体,胶体金标记的唾液淀粉酶α1抗体(AMY1A)替换为胶体金标记DNP-BSA。
上述层析检测试纸条的制备方法具体步骤如下:
(1)包被硝酸纤维素膜:首先在硝酸纤维素膜表面划检测T线与质控C线,检测T线与质控C线的之间的距离为4mm;然后采用划膜机在检测T线包被新冠N抗体-27,在质控C线包被DNP抗体,划膜机的划线参数为1μL/cm、100mm/s;然后将硝酸纤维素膜置于45℃的鼓风干燥箱中干燥24h,即可获得包被后的硝酸纤维素膜;
其中,新冠N抗体-27与DNP抗体分别用包被稀释液稀释至浓度为2mg/mL;包被稀释液为10mM PBS和2.5%蔗糖的混合物。
(2)制备结合垫:
(2-1)胶体金标记新冠N抗体-28:取0.04%的胶体金溶液10mL,加入0.2M K2CO3缓冲液,调节至pH值为7-8,然后再按照20μg/mL的比例加入新冠N抗体-28进行反应,室温反应30min;反应完毕再按照20μL/mL的比例加入5%BSA封闭剂,25℃反应15min;反应完毕离心去上清,然后将沉淀用金垫稀释液重悬至1mL,即可得到胶体金标记的新冠N抗体-28;(2-2)胶体金标记DNP-BSA:取0.04%的胶体金溶液10mL,加入0.2M K2CO3缓冲液,调节至pH值为7-8,然后再按照20μg/mL的比例加入DNP-BSA进行反应,室温反应30min;反应完毕再按照20μL/mL的比例加入5%BSA封闭剂,25℃反应15min;反应完毕离心去上清,然后将沉淀用金垫稀释液重悬至1mL,即可得到胶体金标记的DNP-BSA;
(2-3)将胶体金标记的新冠N抗体-28与胶体金标记的DNP-BSA用金垫稀释液进行稀释,获得金垫工作液;然后将该金垫工作液按照1mL/5cm×5cm的量涂布在玻璃纤维素膜上,并置于45℃的鼓风干燥箱中干燥24h,即可获得结合垫;其中,金垫工作液中胶体金标记的待检测病原体对应的抗体的终浓度为12%,胶体金标记的DNP-BSA的终浓度为5%。
(3)制备层析检测试纸条:在支撑底板上依次粘贴硝酸纤维素膜、结合垫、吸水垫、样品垫,然后切割成3.5mm宽的试纸条,即可获得层析检测试纸条。
性能检测试验
将实施例1-5、对比例1-4获得的层析检测试纸条装入试剂盒中,获得层析检测试剂盒,利用待测样本对上述层析检测试剂条进行性能检测验证。
1.待测样本来源:10名被采集人的咽拭子、反应液和尿液(已知上述样本的新型冠状病毒抗原检测结果均为阴性)。
2.检测方法:将待测样本放入含有样本提取液的离心管中,并使样本充分溶解至样本提取液中;然后将每种含有样本的提取液每100μL加入至一种层析检测试剂盒的加样孔中,每种样本共加入至九种层析检测试剂盒中(实施例1-5及对比例1-4的层析检测试剂盒),加入完毕15min后,观察检测T线与质控C线是否显色,并统计同一样本来源、同一层析检测试剂盒显色及不显色的样本个数。
表1实施例1-5、对比例1-4获得的层析检测试纸条的性能检测结果
由上表可以看出,本申请实施例1-5获得的层析检测试纸条能够准确识别咽拭子样本,并在质控C线上呈现一条红色的检测线,并且所有样本的检测T线均不显色;而当待检测样本为反应液或尿液时,实施例1-5获得的层析检测试纸条的质控C线上并不会显色。因此说明本申请提供的层析检测试纸条能够准确判断待检测样本是否来源于咽拭子,也就是说当层析检测试纸条的质控C线呈现红色时,表明待检测样本来源于咽拭子,其检测T线的检测结果真实有效;当层析检测试纸条的质控C线不显色时,表明待检测样的来源不正确,检测T线的检测结果真实有效性不能保证。
根据实施例1-5获得的层析检测试纸条的咽拭子样品结果分析可知,利用实施例2提供的抗α-淀粉酶多抗的稀释浓度为1mg/mL的层析检测试纸条检测10个样本中,有1个层析检测试纸条的质控C线未显色,说明抗α-淀粉酶多抗的稀释浓度太低会影响层析检测试纸条质控C线的灵敏度。因此,本申请进一步将唾液淀粉酶抗体的稀释浓度控制在1.5-2.5mg/mL之间,获得的层析检测试纸条的质控C线可以捕获并识别待测样本中的唾液淀粉酶,实现待测样本来源的判断,进而保证检测结果的真实有效性。
根据实施例1、对比例1-2的检测结果可知,对比例1-2提供的仅采用PBS或蔗糖作为包被稀释液时层析检测试纸条质控C线的准确性小于实施例1提供的采用PBS和蔗糖的混合液作为包被稀释液时层析检测试纸条质控C线的准确性,尤其是对比例2提供的只采用蔗糖作为包被稀释液时获得的层析检测试纸条质控C线的准确性仅为30%。说明本申请提供的层析检测试纸条中,选用PBS和蔗糖的混合液作为唾液淀粉酶抗体的包被稀释液,能够进一步提高待测样品来源检测的准确性。
根据实施例1、对比例3-4的检测结果可知,利用对比例3-4提供的层析检测试纸条分别检测咽拭子、反应液、尿液,获得的层析检测试纸的质控C线均呈现一条红色,说明对比例3-4提供的层析检测试纸条对待测样本的检测无差别,尤其是当待检测样本为尿液时,还出现了假阳的现象;而实施例1提供的层析检测试纸条的质控C线仅对咽拭子的待测样本显色。因此,说明本申请采用唾液淀粉酶作为层析检测试纸条的质控***,能够100%判断样本是否来源于咽拭子,且能保证待测样本质控C线的检测准确性为100%。
综上所述,本申请提供的层析检测试纸条的质控C线包被有用于识别唾液淀粉酶的物质,进而能够精确判断待测样本是否来源于咽拭子,且当唾液淀粉酶抗体的包被稀释液为PBS和蔗糖的混合物,并进一步将唾液淀粉酶抗体的稀释浓度控制在1.5-2.5mg/mL范围内时,既能降低层析检测试纸条的制造成本,又能使获得的层析检测试纸条100%判断样本的来源,从而保证待检测样本的真实有效性。
虽然,上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述,但在本发明基础上,可以对之作一些修改或改进,这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此,在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进,均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种层析检测试纸条,其特征在于,所述层析检测试纸条包括支撑底板;所述支撑底板上设置有样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫;所述硝酸纤维素膜上设有检测T线和质控C线;所述检测T线上包被有待检测病原体对应的抗体1,所述质控C线上包被有用于识别唾液淀粉酶的物质;所述用于识别唾液淀粉酶的物质包括唾液淀粉酶抗体1。
2.根据权利要求1所述的层析检测试纸条,其特征在于,所述唾液淀粉酶抗体1需要用包被稀释液进行稀释,所述包被稀释液为PBS和蔗糖的混合物。
3.根据权利要求2所述的层析检测试纸条,其特征在于,所述唾液淀粉酶抗体1的稀释浓度为1-3mg/mL。
4.根据权利要求1所述的层析检测试纸条,其特征在于,所述结合垫上固定有标记示踪物标记的待检测病原体对应的抗体2和标记示踪物标记的唾液淀粉酶抗体2。
5.根据权利要求4所述的层析检测试纸条,其特征在于,所述标记示踪物选自胶体金、彩色微球和荧光微球。
6.根据权利要求1所述的层析检测试纸条,其特征在于,所述待检测病原体为上呼吸道病毒;所述上呼吸道病毒包括新型冠状病毒、甲型流感病毒和乙型流感病毒。
7.如权利要求1-6中任一项所述的层析检测试纸条的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:包被硝酸纤维素膜、制备结合垫;
包被硝酸纤维素膜:首先在硝酸纤维素膜表面划检测T线与质控C线,然后采用划膜设备在所述检测T线包被待检测病原体对应的抗体1,在所述质控C线包被唾液淀粉酶抗体1,经干燥即可获得包被后的硝酸纤维素膜。
8.根据权利要求7所述的层析检测试纸条的制备方法,其特征在于,所述制备结合垫的具体步骤为:利用标记示踪物分别标记待检测病原体对应的抗体2与唾液淀粉酶抗体2,获得标记示踪物标记的待检测病原体对应的抗体2与标记示踪物标记的唾液淀粉酶抗体2;将所述标记示踪物标记的待检测病原体对应的抗体2与所述标记示踪物标记的唾液淀粉酶抗体2用金垫稀释液进行稀释,从而获得金垫工作液;然后将所述金垫工作液涂布在玻璃纤维素膜上,并置于干燥箱中干燥,即可获得结合垫。
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