CN111983060B - 野六谷药材的质量控制方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种野六谷药材的质量控制方法，主要包括薏苡素含量测定，采用甲醇超声提取野六谷药材，以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，检测波长为232nm。实验表明，该方法具有较强的专属性和良好的重现性，结果缩短了目标峰的出峰时间，提高了效率。据此，发明人进一步研究了野六谷药材的薄层鉴别和显微鉴别，为制订科学的野六谷药材质量标准提供了科学依据。综上，本发明可用于鉴别野六谷药材真伪和评价野六谷药材质量优劣，控制野六谷药材的质量，确保人民群众用药安全有效。

Description

野六谷药材的质量控制方法
技术领域
本发明属于中草药药材质量控制技术领域，尤其涉及一种野六谷药材的质量控制方法。
背景技术
野六谷为禾本科植物薏苡(Coix Lacryma-jobi L.)的干燥根。薏苡，瑶族民间称为野六谷，也称为老鸦珠。野六谷，以根作为药用部位，始载于《本经》，俗名打碗子根，且在中国各少数民族如壮族、瑶族、傣族等，均有记载，曾收载于我国部分省市的地方药材标准，如《云南省中药材标准(2005年版)(第三册·傣族药)》和《上海市中药材标准》等。此外，《中国植物志》、《中药大辞典》、《全国中草药汇编》、《中华本草》、《广西本草选编》等大型辞书中对其药用价值、原植物、地理分布、产销情况亦有简要记述。野六谷在广西瑶族集居地，如金秀、恭城、巴马和凤山等地均有分布。本品多生于湿润的屋旁、山谷，野生或栽培。野六谷为广西瑶族民间习惯常用的药材，在瑶族民间中使用广泛，野六谷在瑶族地区部分药市有销售，如《广西恭城瑶族端午药市药用植物资源》中就有记载。《中国瑶药学》记载，本品具有健脾利肺，清热利湿，祛风除湿，驱虫的功效，主要用于***或结石、黄疽型肝炎、肝硬化腹水、水肿、尿浊、白带、经闭、疝气、虫积腹痛、小儿肺炎、高热喘咳、风湿性关节炎、肾炎腰痛、夜盲症、血尿等。
野六谷在广西瑶族民间主要以根入药用。本品全年均可采挖。产地加工大多除去芦头及泥沙，晒干。文献报道，野六谷主要含酚类、薏苡多糖类、脂类(薏苡素)等成分，分别具有一定的药理作用，其中薏苡素为野六谷的主要有效成分，具有抗癌、镇痛、消炎等功效。瑶医认为，野六谷具有清热利湿、健脾和杀虫等功效，用于治疗热淋、血淋、石淋、黄疸、水肿、白带过多、脚气、风湿痹痛和蛔虫病等症。研究资料表明，从野六谷根中分离得到的Benzoxanzinoid类化合物——薏苡素，具有抗炎镇痛作用，可以抑制刀豆蛋白A，刺激及免疫蛋白E(反应素)致敏的小鼠肥大细胞的组胺释放。此外，有研究表明，薏苡素对癌细胞有抑制作用，且对中枢神经***有镇静、镇痛的作用；能有效缓解疼痛及炎症反应，有抗血栓等作用；对肌肉具有收缩作用，对中枢神经***具有镇静、抑制、镇痛及降温与解热作用。
野六谷在民间的临床疗效作用已得到认可，但作为广西瑶族民间常用药材，野六谷尚未建立质量控制方法，难以控制药材品质，不利于野六谷药材的生产、流通、使用、检验及监管。因此，需要建立野六谷的质量控制方法，以控制野六谷药材的质量。目前，未见关于野六谷药材的显微鉴别、薄层鉴别相关研究的报道。野六谷薏苡素含量测定方法虽已有文献报道，但文献方法采用的流动相为乙腈-水或乙腈0.1％磷酸溶液，且均采用等度洗脱，结果目标峰的出峰时间较长。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种野六谷药材的质量控制方法，以便于鉴别野六谷药材真伪、评价野六谷药材质量优劣，保证用药安全。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
野六谷药材的质量控制方法，主要包括薏苡素含量测定，含量测定采用甲醇超声提取野六谷药材，以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，检测波长为232nm。
含量测定按以下操作进行：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；按下表梯度洗脱程序中规定进行梯度洗脱；
表1梯度洗脱程序
Figure BDA0002615594940000021
其中，柱温25℃；分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
对照品溶液与供试品溶液分别按以下操作进行制备：
对照品溶液：精密称薏苡素对照品，加甲醇制成每1ml含薏苡素55μg的溶液，即得；
供试品溶液：取野六谷药材粉末1g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
上述野六谷药材的质量控制方法，还包括薄层鉴别，薄层鉴别采用硅胶GF254薄层板，以石油醚-二氯甲烷-甲醇-冰醋酸溶液作为展开剂。
展开剂为体积比6：4：1：0.1的石油醚-二氯甲烷-甲醇-冰醋酸溶液。
薄层鉴别按以下操作进行：吸取供试品溶液、对照药材溶液各4～8μl，对照品溶液4μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以展开剂进行展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视。
供试品溶液、对照药材溶液和对照品溶液分别按以下操作进行制备：
供试品溶液或对照药材溶液：取野六谷药材粉末或野六谷对照药材粉末1g，加甲醇25ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，即得；
对照品溶液：取薏苡素对照品，加甲醇制成每1ml含薏苡素1mg的溶液。
上述野六谷药材的质量控制方法，还包括药材显微鉴别，显微鉴别中，
根横切面的表皮细胞1列，方圆形；皮层宽，下皮层细胞4～6列，细胞类圆形或多角形，其间有1～2列纤维环状分布，纤维壁薄，木化，在下皮层和中柱间有18～20余个花瓣状裂隙环绕，裂隙之间有1～3列薄壁细胞分隔；内皮层明显，向内的细胞壁明显增厚；韧皮部薄，细胞类圆形或不规则形；木质部稍宽，导管1列沿切向排列成环，直径45～115μm；髓部约占茎的四分之一，细胞类圆形，壁较厚；薄壁细胞中有的含有淀粉粒；
药材粉末呈灰黄色；纤维成束或分离，先端圆钝或折断，纤维壁厚薄不一，有的纤维密布圆形或人字形纹孔；纤维直径15～38μm；淀粉粒单粒或复粒，圆形、半圆形或类圆形，脐点点状、裂缝状或人字状，直径6～16μm；导管为网纹导管和具缘纹孔导管，直径20～68μm；木薄壁细胞长方形，有较多的点状纹孔，长90～170μm，宽16～38μm。
针对目前野六谷药材缺乏相关质量标准的问题，在现有技术手段的基础上，经过科学***的研究，发明人建立了一种野六谷药材的质量控制方法，主要包括薏苡素含量测定，采用甲醇超声提取野六谷药材，以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，检测波长为232nm。实验表明，该方法具有较强的专属性和良好的重现性，结果缩短了目标峰的出峰时间，提高了效率。据此，发明人进一步研究了野六谷药材的薄层鉴别和显微鉴别，为制订科学的野六谷药材质量标准提供了科学依据。综上，本发明可用于鉴别野六谷药材真伪和评价野六谷药材质量优劣，控制野六谷药材的质量，确保人民群众用药安全有效。
附图说明
图1是野六谷横切面的构造图，图中：1.表皮，2.纤维，3.皮层，4.裂隙，5.内皮层，6.韧皮部，7.木质部，8.导管，9.髓部。
图2是野六谷粉末的构造图，图中：1导管，2淀粉粒，3纤维，4木薄壁细胞。
图3是10种不同产地野六谷的薄层鉴别图，图中：1-10分别是1#～10#不同产地的野六谷药材，其中8#是野六谷对照药材；11.薏苡素对照品；特征斑点a、b、c为暗斑点。
图4是HPLC色谱图，图中：A.对照品，B.供试品，C.阴性对照，*—薏苡素峰。
具体实施方式
以下各例所用野六谷药材来自10个不同产地，经专家鉴定为禾本科植物薏苡CoixLacryma-jobi L.的根。药材来源详细信息见表2。
表2不同产地野六谷编号
Figure BDA0002615594940000041
实施例1显微鉴别(图1、图2)
对自10个不同产地的野六谷药材的显微结构进行了鉴别，结果如图1：
野六谷的根横切面表皮细胞1列，方圆形。皮层宽，下皮层细胞4～6列，细胞类圆形或多角形，其间有1～2列纤维环状分布，纤维壁薄，木化，在下皮层和中柱间有18～20余个花瓣状裂隙环绕，裂隙之间有1～3列薄壁细胞分隔。内皮层明显，向内的细胞壁明显增厚。韧皮部薄，细胞类圆形或不规则形。木质部稍宽，导管1列沿切向排列成环，直径45～115μm。髓部约占茎的四分之一，细胞类圆形，壁较厚。本品薄壁细胞中有的含有淀粉粒。
对所有野六谷药材粉末进行了显微观察，结果如图2：
药材粉末呈灰黄色。纤维成束或分离，先端圆钝或折断，纤维壁厚薄不一，有的纤维密布圆形或人字形纹孔；纤维直径15～38μm。淀粉粒单粒或复粒，圆形、半圆形或类圆形，脐点点状、裂缝状或人字状，直径6～16μm。导管为网纹导管和具缘纹孔导管，直径20～68μm。木薄壁细胞长方形，有较多的点状纹孔，长90～170μm，宽16～38μm。
综上，野六谷药材的显微鉴别要点：根的横切面皮层宽，其间有1～2列纤维环状分布，在下皮层和中柱间有18～20余个花瓣状裂隙环绕，裂隙之间有1～3列薄壁细胞分隔；木质部导管1列沿切向排列成环；根横切面和粉末薄壁细胞中有的含有淀粉粒；粉末可见网纹导管和具缘纹孔导管。
实施例2薄层色谱分析
以野六谷药材粉末制成的溶液为供试品，取药材粉未1g，加甲醇25ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取野六谷对照药材1g，同法制成对照药材溶液；再取薏苡素对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2015年版通则0502)试验，吸取供试品溶液、对照药材溶液各4～8μl，对照品溶液4μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚-二氯甲烷-甲醇-冰醋酸(6：4：1：0.1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视。
测定10批药材样品，结果如图3所示，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，也说明TLC方法重复性较好。
实施例3含量测定
一、仪器与材料
LC-20AT高效液相色谱仪(岛津公司，带自动进样器及DAD检测器)；KQ-3200DB型数控超声波清洗器(昆明市超声仪器有限公司)；XS205十万分之一电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Master-S15超纯水器(上海和泰公司)等。薏苡素对照品(南昌贝塔生物科技有限公司，批号20607-201809，纯度为99.8％，供含量测定用)；流动相所用甲醇、乙腈为色谱纯(德国merck公司)、水为超纯水，其余试剂均为分析纯。
二、方法
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，色谱柱为菲罗门Gemini NX-C18(4.6mm×250mm，5μm)；以乙腈为流动相A，以0.1％磷酸溶液为流动相B，按表1梯度洗脱程序中规定进行梯度洗脱；柱温25℃，检测波长为232nm。理论板数按薏苡素峰计算应不低于2000。精密称薏苡素对照品适量，加甲醇制成每1ml含薏苡素55μg的溶液，即得对照品溶液。取野六谷药材粉末(过四号筛)约1g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率300W，频率40KHZ)45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
结果：如图4所示，供试品溶液和对照品溶液色谱图相应的位置上，有保留时间相同的色谱峰，而阴性对照液色谱图则无此色谱峰。
1>线性关系考察
取薏苡素对照品适量，加甲醇制成0.184mg/ml的溶液。分别精密吸取以上对照品溶液0.1、1、2、4、6、10ml置10ml量瓶中，各加甲醇定容至10ml，摇匀。分别精密吸取上述供试品溶液各10μl，注入HPLC，以薏苡素峰面积为纵坐标，进样量(μg)为横坐标，绘制标准曲线。得到薏苡素的回归方程：Y＝3627016.9X-38601.8，r＝0.9997，薏苡素对照品进样量在0.0184～1.840ug范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2>精密度试验
取同一供试品溶液，按上述色谱条件连续进样测定6次。结果：6次测定薏苡素峰面积的RSD＝0.30％。表明仪器精密度良好。
3>重复性试验
取同一样品粉末6份，每份1g，精密称定，制备供试品溶液，按上述色谱条件测定。结果：6份供试品溶液中薏苡素含量的RSD为0.74％。表明本方法重现性良好。
4>稳定性试验
取同一供试品溶液，按上述色谱条件，分别于0、2、4、6、12、24h进样测定。结果：6次测得的薏苡素含量RSD为0.01％。表明供试品溶液中的薏苡素在24h之内稳定性良好。
5>加样回收率试验
取己知含量同一样品粉末6份，各0.5g，精密称定，精密加入薏苡素对照品溶液(16.00μg/ml)20ml，制备供试品溶液，按上述色谱条件测定薏苡素含量，计算平均回收率及RSD。结果：测定薏苡素含量平均回收率为97.87％，RSD＝0.02％。
三、样品测定
参照《中国药典》2015版一部通则0512高效液相色谱法，按照上述方法对12批次药材样品进行测定，结果见表3。
表3样品含量测定结果(n＝2)
Figure BDA0002615594940000071
结果表明：10批样品薏苡素含量为0.0060％～0.1489％，平均含量为0.046％。根据10批样品的测定结果，考虑到药材来源差异情况，拟定本品标准按干燥品计算含薏苡素(C8H7NO3)不得少于0.010％。

Claims (2)

1.一种野六谷药材的质量控制方法，主要包括薏苡素含量测定，其特征在于：所述野六谷为禾本科植物薏苡Coix Lacryma-jobi L.的干燥根；所述含量测定采用甲醇超声提取野六谷药材，以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸溶液为流动相B，进行梯度洗脱，检测波长为232nm；含量测定按以下操作进行：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；按下表梯度洗脱程序中规定进行梯度洗脱；
其中，柱温25℃；分别精密吸取高效液相对照品溶液与高效液相供试品溶液各10µl，注入液相色谱仪，测定，即得；所述高效液相供试品溶液按以下制备：取野六谷药材粉末1g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入甲醇20ml，密塞，称定重量，超声处理45分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；所述高效液相对照品溶液按以下操作进行制备：精密称薏苡素对照品，加甲醇制成每1ml含薏苡素55μg的溶液，即得；
还包括薄层鉴别，薄层鉴别采用硅胶GF254薄层板，以石油醚-二氯甲烷-甲醇-冰醋酸溶液作为展开剂；所述展开剂为体积比6：4：1：0.1的石油醚-二氯甲烷-甲醇-冰醋酸溶液；
所述薄层鉴别按以下操作进行：吸取薄层鉴别供试品溶液、薄层鉴别对照药材溶液各4~8μl，薄层鉴别对照品溶液4μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以展开剂进行展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视；
所述薄层鉴别供试品溶液、薄层鉴别对照药材溶液和薄层鉴别对照品溶液分别按以下操作进行制备：薄层鉴别供试品溶液或薄层鉴别对照药材溶液：取野六谷药材粉末或野六谷对照药材粉末1g，加甲醇25ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，即得；薄层鉴别对照品溶液：取薏苡素对照品，加甲醇制成每1ml含薏苡素1mg的溶液。
2.根据权利要求1所述的野六谷药材的质量控制方法，其特征在于还包括药材显微鉴别，显微鉴别中，根横切面的表皮细胞1列，方圆形；皮层宽，下皮层细胞4~6列，细胞类圆形或多角形，其间有1~2列纤维环状分布，纤维壁薄，木化，在下皮层和中柱间有18~20余个花瓣状裂隙环绕，裂隙之间有1~3列薄壁细胞分隔；内皮层明显，向内的细胞壁明显增厚；韧皮部薄，细胞类圆形或不规则形；木质部稍宽，导管1列沿切向排列成环，直径45~115μm；髓部约占茎的四分之一，细胞类圆形，壁较厚；薄壁细胞中有的含有淀粉粒；药材粉末呈灰黄色；纤维成束或分离，先端圆钝或折断，纤维壁厚薄不一，有的纤维密布圆形或人字形纹孔；纤维直径15~38μm；淀粉粒单粒或复粒，圆形、半圆形或类圆形，脐点点状、裂缝状或人字状，直径6~16μm；导管为网纹导管和具缘纹孔导管，直径20~68μm；木薄壁细胞长方形，有较多的点状纹孔，长90~170μm，宽16~38μm。
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