CN113092655A - 高效液相色谱检测乌头汤中有效成分的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及高效液相色谱检测乌头汤中有效成分的方法。本发明提供了乌头汤中有效成分的检测方法，包括将乌头汤经冻干、提取获得待测液，以高效液相色谱法对待测液进行检测，流动相A为磷酸二氢铵溶液，其pH值为2.1；流动相B为乙腈；本发明的方法可以采用同一种方法对乌头汤中12中有效成分进行测定，与现有技术相比，该方法高效，省时省力，成本低廉，适用于科学研究及生产实践，通过实施例及实验例证明，该方法稳定可靠，各成分间分离度良好，且与阴性对照液对比分析，无假阳性及干扰峰存在。

Description

高效液相色谱检测乌头汤中有效成分的方法

技术领域

本发明涉及分析检测技术领域，尤其涉及高效液相色谱检测乌头汤中有效成分的方法。

背景技术

经典名方是中医药的精髓，如何将中医药现代化是我国提出并持续坚持的目标和方针。“乌头汤”出自张仲景《金匮要略》中风历节病脉证第五中，该方由川乌(制)、麻黄、甘草(炙)、白芍、黄芪等五味中药材组成，用于治疗类风湿性关节炎已有千年历史。现代医学研究表明，乌头汤成分复杂，具有多成分，多靶点的治疗特点。本领域认为，有效成分的组成及含量对疗效存在显著的影响，因此针对复方中多种有效成分的定性、定量分析成为现代中药开发与利用的重中之重。

高效液相色谱法(HPLC)是目前普遍应用于中药复方中有效化学成分研究的主要方法手段。通过高效液相色谱，对复杂的中药复方成分进行逐一分离，并通过标准物质对其所含有的成分进行定性和定量分析，从而对中药及其复方进行质量控制及安全监测。但是，现有HPLC(高效液相色谱)法无法采用同一种方法对乌头汤中各类有效成分进行统一的定量分析，而是根据不同类型的化合物，采取不同的条件和方法，该技术操作复杂，繁琐，为科研及从业人员带来不必要的麻烦和负担。另有通过UPLC-MS(高效液相色谱质谱)法对乌头汤进行检测，该方法虽然可以采用同一种方法对乌头汤中若干成分进行统一的定性定量分析，通用性较强，但检测成本较高，这主要由于UPLC-MS这种大型仪器造价较高，普及率低，因此不能满足大多数科研从业人员需求。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供高效液相色谱检测乌头汤中有效成分的方法。

本发明提供的高效液相色谱检测乌头汤中有效成分的方法，包括：乌头汤经冻干、提取获得待测液，以高效液相色谱法对待测液进行检测，色谱参数为：

C18色谱柱；

流动相A：磷酸二氢铵溶液，其pH值为2.1；

流动相B：乙腈；

梯度洗脱程序为：

本发明中，所述乌头汤的制备方法包括：分别称取麻黄、黄芪、炙甘草、白芍、制川乌(质量比为9:9:9:9:6)于煎药壶内，加入16倍质量的水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮2次，每次90min，合并煎煮液即为乌头汤。

本发明对色谱条件进行多方摸索，根据色谱峰分离情况以及检测的精密度、稳定性、重复性、准确性和线性最终确定优选色谱条件如下：

本发明中，所述C18色谱柱为Waters CSH C18，尺寸4.6×250mm，5μm。

本发明中，所述色谱的检测器为PDA检测器(二极管阵列检测器)，检测波长为210nm和/或235nm。

本发明中，所述流动相A的磷酸二氢铵溶液浓度为10mmol/L，以磷酸调节pH值为2.1。

本发明中，所述色谱条件还包括：流动相流速1ml/min；柱温为35℃；进样量5μL。

一些实施例中，所述提取包括：将乌头汤经冻干后的粉末与甲醇水溶液混合，超声提取20～40min后离心取上清液为待测液。

其中，所述甲醇水溶液的中甲醇的体积分数为95％；所述粉末与甲醇水溶液混合的质量体积比为0.2g/5mL；所述离心的条件为10000rpm，10min。

另一些实施例中，所述提取包括：

步骤1：将乌头汤经冻干后的粉末以盐酸水溶液和***混合，涡旋混匀离心后，，取水相；

步骤2：所述水相中加入氨试液和***，涡旋混匀离心后，取有机相进行干燥后，以甲醇定容获得待测液。

步骤1中，所述盐酸水溶液的浓度为1mol/L；所述盐酸水溶液与***的体积比为1:10；所述粉末与盐酸水溶液和***的比例为1g：1mL：10mL；所述涡旋混匀的时间为30s；所述离心转速为5000rpm/min，时间为5min；提取次数为1次；

步骤2中，所述氨试液与***的体积比为1:10；所述粉末与氨试液和***的比例为1g：1mL：10mL；所述涡旋混匀的时间为30s；所述离心转速为5000rpm/min，时间为5min；提取次数为2次；

所述甲醇定容为，每1g冻干后的粉末经提取获得的产物以1mL甲醇定容。本发明上所述的检测方法中，所述检测为根据获得色谱图的出峰时间对有效成分进行定性；根据获得的色谱图的峰面积对有效成分进行定量；

检测波长为210nm获得的色谱图中：

出峰时间为9.632±0.2min的为麻黄碱；

出峰时间为10.357±0.2min的为伪麻黄碱；

检测波长为235nm获得的色谱图中：

出峰时间为24.130±0.2min的为芍药苷；

出峰时间为26.774±0.2min的为毛蕊异黄酮葡萄糖苷；

出峰时间为29.268±0.2min的为甘草苷；

出峰时间为32.275±0.2min的为苯甲酰新乌头原碱；

出峰时间为36.846±0.2min的为苯甲酰乌头原碱；

出峰时间为40.136±0.2min的为苯甲酰次乌头原碱；

出峰时间为48.898±0.2min的为新乌头碱；

出峰时间为52.017±0.2min的为次乌头碱；

出峰时间为52.299±0.2min的为乌头碱；

出峰时间为58.122±0.2min的为甘草酸。

一些实施例中，

盐酸麻黄碱的线性方程为Y＝1.05e⁷X-3902.69；

盐酸伪麻黄碱的线性方程为Y＝1.09e⁷X-9361.95；

芍药苷的线性方程为Y＝6.93e⁶X-12581.7；

毛蕊异黄酮葡萄糖苷的线性方程为Y＝1.83e⁷X-9010.81；

甘草苷的线性方程为Y＝1.17e⁷X-6892.79；

苯甲酰新乌头原碱的线性方程为Y＝4.96e⁶X+3324.99；

苯甲酰乌头原碱的线性方程为Y＝3.72e⁶X+2423.79；

苯甲酰次乌头原碱的线性方程为Y＝2.73e⁶X-2380.28；

新乌头碱的线性方程为Y＝6.19e⁶X+2097.92；

次乌头碱的线性方程为Y＝6.61e⁶X+5151.44；

乌头碱的线性方程为Y＝5.87e⁶X+6749.13；

甘草酸的线性方程为Y＝2.93e⁶X+5015.44。

本发明提供了乌头汤中有效成分的检测方法，包括将乌头汤经冻干、提取获得待测液，以高效液相色谱法对待测液进行检测，流动相A为磷酸二氢铵溶液，其pH值为2.1；流动相B为乙腈；本发明的方法可以采用同一种方法对乌头汤中12中有效成分进行测定，与现有技术相比，该方法高效，省时省力，成本低廉，适用于科学研究及生产实践，通过实施例及实验例证明，该方法稳定可靠，各成分间分离度良好，且与阴性对照液对比分析，无假阳性及干扰峰存在。

此外该方法也同时将乌头中容易引起中毒反应的毒性成分双酯型乌头碱(新乌头碱、乌头碱、次乌头碱)一并纳入检测范围，在对乌头汤中9种有效物质进行定量分析的同时，也对3种毒性成分进行监测，确保用药安全。众所周知乌头属植物中的毒性成分为双酯型乌头碱，所用乌头类药材必先经过炮制减毒方可用药，因此本发明在对乌头汤中9种有效物质进行定量分析的同时，兼顾3种双酯型乌头碱的监测，既用于乌头汤及其制品的质量控制，又兼顾用药安全，可谓一举两得。

附图说明

图1示12种标准品HPLC色谱图，其中色谱峰1～12依次为：1.麻黄碱；2.伪麻黄碱；3.芍药苷；4.毛蕊异黄酮葡萄糖苷；5.甘草苷；6.苯甲酰新乌头原碱；7.苯甲酰乌头原碱；8.苯甲酰次乌头原碱；9.新乌头碱；10.次乌头碱；11.乌头碱；12.甘草酸；

图2示乌头汤阴性对照HPLC色谱图，其中，各供试品制备方法为2.4中的方法1；检测波长为210nm，各谱图中，Sta：标准品，NH：无黄芪，NM：无麻黄，NG：无甘草，NW：无川乌，NB：无白芍；色谱峰1～2依次为：1.麻黄碱；2.伪麻黄碱；

图3示乌头汤阴性对照HPLC色谱图，其中，各供试品制备方法为2.4中的方法1；检测波长为235nm，各谱图中，Sta：标准品，NH：无黄芪，NM：无麻黄，NG：无甘草，NW：无川乌，NB：无白芍；色谱峰依次为：3.芍药苷；4.毛蕊异黄酮葡萄糖苷；5.甘草苷；12.甘草酸；

图4示乌头汤阴性对照HPLC色谱图，其中，各供试品制备方法为2.4中的方法2；检测波长为235nm，各谱图中，Sta：标准品，NH：无黄芪，NM：无麻黄，NG：无甘草，NW：无川乌，NB：无白芍；色谱峰依次为：6.苯甲酰新乌头原碱；7.苯甲酰乌头原碱；8.苯甲酰次乌头原碱；9.新乌头碱；10.次乌头碱；11乌头碱；

图5示乌头汤HPLC色谱图；其中，A和B为方法1制得供试品，C为方法2制得供试品，谱图中，1麻黄碱；2伪麻黄碱；3芍药苷；4毛蕊异黄酮葡萄糖苷；5甘草苷；6苯甲酰新乌头原碱；7苯甲酰乌头原碱；8苯甲酰次乌头原碱；12甘草酸；

图6示色谱柱：waters Xbridge C18，流动相：0.1％磷酸水-乙腈条件下乌头汤的HPLC色谱图；

图7示waters Xselect C18，流动相：0.1％磷酸水，氨水调pH9-乙腈条件下乌头汤的HPLC色谱图；

图8示色谱柱：waters Xselect C18，流动相：磷酸水pH2.4-乙腈条件下乌头汤的HPLC色谱图；

图9示色谱柱：waters Xselect C18，流动相：2.5mmol/L磷酸二氢铵，磷酸调pH2.3-乙腈条件下乌头汤的HPLC色谱图；

图10示色谱柱：waters Xselect C18，流动相：5mmol/L磷酸二氢铵，磷酸调pH2.3-乙腈条件下乌头汤的HPLC色谱图。

具体实施方式

本发明提供了高效液相色谱检测乌头汤中有效成分的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1材料与仪器

1.1芍药苷(18032901)、甘草酸(18060805)、苯甲酰乌头原碱(18110710)、苯甲酰次乌头原碱(18032807)、苯甲酰新乌头原碱(18032406)、新乌头碱(17111010)、次乌头碱(17111310)、乌头碱(17110910)、毛蕊异黄酮葡萄糖苷(18031920)、甘草苷(18032801)购自于北京世纪奥科生物技术有限公司，盐酸麻黄碱(171241-201809)、盐酸伪麻黄碱(171237-201510)购自于中国食品药品检定研究院，乙腈、甲醇为色谱纯(美国赛默飞世尔科技有限公司)、娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈有限公司)，磷酸等其它试剂均为分析纯。

1.2岛津LC-20AT***(SPD-M20A PDA检测器、SIL-20A自动进样器，日本岛津科技有限公司)，电子天平(MS105DU，梅特勒-托利多仪器有限公司)，超声波清洗器(AS3120A，天津奥特赛恩斯仪器有限公司)，冷冻干燥仪(Epsilon 2-4 Lsplus，)，高速离心机(TGL16M，湖南凯达科学仪器有限公司)，PH计(PHSJ-3F，上海仪电科学仪器股份有限公司)

1.3药材：制川乌、黄芪、麻黄、白芍、炙甘草、经鉴定依次为毛茛科植物乌头Aconitum carmichaelii Debx的干燥母根，豆科黄芪属植物蒙古黄芪Astragalusmembranaceus(Fish.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao干燥的根，麻黄科植物草麻黄Ephedra sinica Stapff的干燥草质茎，毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall的干燥的根，豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch干燥的根的蜜制品。

2、受试溶液配制

2.1对照品溶液配制：精密称取盐酸麻黄碱11.4mg、盐酸伪麻黄碱8.02mg、芍药苷13.18mg、毛蕊异黄酮葡糖糖苷4.24mg、甘草苷12.52mg、苯甲酰新乌头原碱22.5mg、苯甲酰乌头原碱24.06mg、苯甲酰次乌头原碱21.96mg、新乌头碱10.08mg、乌头碱11.22mg、次乌头碱7.7mg、甘草酸15.1mg于25mL容量瓶内,甲醇定容至刻度，配制成浓度分别为0.456、0.3208、0.5272、0.1696、0.5008、0.9、0.9624、0.8784、0.4032、0.4488、0.308、0.604mg/mL的标准混合对照品溶液(记为Sta)备用。

2.2供试品制备：分别称取麻黄9g、黄芪9g、炙甘草9g、白芍9g、制川乌6g于煎药壶内，16倍量水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮2次，每次90min，合并煎煮液冷冻干燥，即得乌头汤冻干粉，即为供试品。

2.3阴性对照制备：分别取不含有上述各味药材的复方：

不含麻黄的阴性对照(记为NM)：称取黄芪9g、炙甘草9g、白芍9g、制川乌6g于煎药壶内，16倍量水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮2次，每次90min，合并煎煮液冷冻干燥，即得NM对照冻干粉。

不含黄芪的阴性对照(记为NH)：称取麻黄9g、炙甘草9g、白芍9g、制川乌6g于煎药壶内，16倍量水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮2次，每次90min，合并煎煮液冷冻干燥，即得NH对照冻干粉。

不含炙甘草的阴性对照(记为NG)：称取麻黄9g、黄芪9g、白芍9g、制川乌6g于煎药壶内，16倍量水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮2次，每次90min，合并煎煮液冷冻干燥，即得NG对照冻干粉。

不含白芍的阴性对照(记为NB)：称取麻黄9g、黄芪9g、炙甘草9g、制川乌6g于煎药壶内，16倍量水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮2次，每次90min，合并煎煮液冷冻干燥，即得NB对照冻干粉。

不含制川乌的阴性对照(记为NW)：称取麻黄9g、黄芪9g、炙甘草9g、白芍9g于煎药壶内，16倍量水浸泡30min，武火煮沸，文火煎煮2次，每次90min，合并煎煮液冷冻干燥，即得NW对照冻干粉。

2.4.供试溶液制备：

以如下方法1提取麻黄碱，伪麻黄碱，芍药苷，毛蕊异黄酮葡萄糖苷，甘草苷，甘草酸，方法2提取苯甲酰新乌头碱，苯甲酰次乌头碱，苯甲酰乌头碱，新乌头碱，乌头碱，次乌头碱，

方法1：取2.2中制备的乌头汤冻干粉或2.3中制备的对照品冻干粉0.2g，加95％的甲醇5ml，超声提取30min，于10000rpm/min，离心10min取上清，即得溶液1；

方法2：取2.2中制备的乌头汤冻干粉或2.3中制备的对照品冻干粉1g，加入1mol/L的盐酸1ml，10ml***涡旋混匀30s，离心，弃去***液，向残渣中加入1ml氨试液，10ml***，涡旋混匀30s后离心，提取2次，合并提取液，40℃氮气吹干，1ml甲醇定容，即得溶液2。

3方法与结果

3.1色谱条件

色谱柱：Waters XSelect CSH C18(4.6×250mm，5μm)，

流动相：10mM/L磷酸二氢铵，磷酸调pH：2.1(A)-乙腈(B)，采用梯度洗脱：

时间min	流动相A％	流动相B％
			0	95.5	4.5
8	95.5	4.5
			11	91	9
16	82	18
			30	80	20
35	77	23
			43	72	28
51	57	43
			59	5	95
65	5	95
			67	95.5	4.5
75	95.5	4.5

流速：1mL/min，柱温：35℃，检测波长：210nm、235nm，进样量：5μL。

3.2方法学考察

3.2.1线性关系考察

称取上述对照品标准溶液0.1mL、0.5mL、1mL、2mL、5mL、8mL、10mL于10mL容量瓶内，甲醇定容至刻度，配制成不同浓度的混合标准品溶液，进样量5μL，以各标准品峰面积为Y轴，浓度为X轴绘制标准曲线，结果见表1：

表1 12种化合物线性方程及线性范围

结果表明：采用本发明提供的方法，乌头汤中各有效成分在相应浓度范围内线性良好。

3.2.2精密度实验取对照品溶液，按上述3.1色谱条件连续进样6次。计算各成分峰面积的RSD，考察仪器精密度。结果显示盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、乌头碱、次乌头碱、甘草酸的RSD(％)分别为0.32、0.25、0.46、0.58、0.36、0.39、0.42、0.61、0.52、0.58、0.46、0.41，表明该仪器精密度良好峰。

3.2.3稳定性实验精密量取同一供试品的溶液(分别以方法1和方法2制备)，密闭置于室温条件下放置，分别于0，2，4，8，10，24h按3.1色谱条件进行测定，结果显示盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、乌头碱、次乌头碱、甘草酸的RSD(％)分别为2.56、3.23、2.21、1.68、2.06、2.87、3.26、1.78、2.32、3.01、2.75、2.48，表明供试品溶液放置24h基本稳定。

3.2.4重复性实验精密称取同一批供试品，按2.4项下的方法平行制备6份供试品溶液，并按3.1项下色谱条件进行检测，结果显示盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、乌头碱、次乌头碱、甘草酸的RSD(％)分别为1.96、1.69、1.56、1.78、2.06、2.36、3.04、2.41、1.89、2.96、1.78、2.76，表明该方法重复性良好。

3.2.5加样回收实验精密量取已知含量的供试品6份，各组分按1:1的比例分别精密加入一定量混合对照品，按2.4项下方法进行供试品制备，并按3.1项下色谱条件进行检测。加样回收的计算方式为(添加对照品后样品中各化合物的含量-已知冻干粉中各化合物的含量)/添加的各组分对照品的含量×100％＝加样回收率。结果显示盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱、芍药苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、甘草苷、苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰次乌头原碱、新乌头碱、乌头碱、次乌头碱、甘草酸的平均回收率(％)分别为97.8、98.5、100.3、99.6、97.6、95.4、96.5、96.8、99.8、98.7、99.2、101.2，表明各成分回收率良好。

3.2.7对对照品溶液和阴性对照溶液进行检测，结果如图1～4。

3.2.6样品含量测定按照2.2项下方法制备三批供试品按照2.4中的方法制备成溶液，并按3.1项下方法进行检测，计算每批样品中各成分的含量。结果见表2，色谱图如图5。

表2样品含量测定结果mg/g

由色谱图可见，采用本发明提供的色谱条件进行检测，各组分分离度良好，获得良好的检测效果。

对比例

采用实施例1中的材料、仪器和受试溶液，进行验证。

色谱条件如下，洗脱梯度与实施例1中3.1相同。

Ⅰ：色谱柱：waters Xbridge C18，流动相：A为0.1％磷酸水，B为乙腈，10,11号峰，即次乌头碱和乌头碱未分开(图6)。

II：色谱柱：waters Xselect C18，流动相：A为0.1％磷酸水，氨水调pH9，B为乙腈，1～2号峰拖尾，即麻黄碱和伪麻黄碱分离度较差(图7)。

Ⅲ：色谱柱：waters Xselect C18，流动相：A为磷酸水pH2.4，B为乙腈，1～2号峰即麻黄碱和伪麻黄碱分离效果差(图8)。

IV：色谱柱：waters Xselect C18，流动相：A为2.5mmol/L磷酸二氢铵，磷酸调pH2.3，B为乙腈，1～2号峰(麻黄碱和伪麻黄碱)和10～11号峰(次乌头碱和乌头碱)分离差(图9)。

Ⅴ：色谱柱：waters Xselect C18，流动相：A为5mmol/L磷酸二氢铵，磷酸调pH2.3，B为乙腈，虽然一定程度上色谱峰分离有所改善，但与供试品及阴性对照品中其它峰存在干扰(图10)。

因此，以上方法条件，均存在一些缺陷，不能实现对样品的良好检测。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.乌头汤中有效成分的检测方法，其特征在于，乌头汤经冻干、提取获得待测液，以高效液相色谱法对待测液进行检测，色谱参数为：

C18色谱柱；

流动相A：磷酸二氢铵溶液，其pH值为2.1；

流动相B：乙腈；

梯度洗脱程序为：

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述C18色谱柱为Waters CSH C18，尺寸4.6×250mm，5μm。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱的检测器为PDA检测器，检测波长为210nm和/或235nm。

4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相A的磷酸二氢铵溶液浓度为10mmol/L，以磷酸调节pH值为2.1。

5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱条件还包括：流动相流速1ml/min；柱温为35℃；进样量5μL。

6.根据权利要求1～5任一项所述的检测方法，其特征在于，所述提取包括：将乌头汤经冻干后的粉末与甲醇水溶液混合，超声提取20～40min后离心取上清液为待测液。

7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述甲醇水溶液的中甲醇的体积分数为95％；所述粉末与甲醇水溶液混合的质量体积比为0.2g/5mL；所述离心的条件为10000rpm，10min。

8.根据权利要求1～5任一项所述的检测方法，其特征在于，所述提取包括：

步骤1：将乌头汤经冻干后的粉末以盐酸水溶液和***混合，涡旋混匀离心后，，取水相；

步骤2：所述水相中加入氨试液和***，涡旋混匀离心后，取有机相进行干燥后，以甲醇定容获得待测液。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，

步骤1中，所述盐酸水溶液的浓度为1mol/L；所述盐酸水溶液与***的体积比为1:10；所述粉末与盐酸水溶液和***的比例为1g：1mL：10mL；所述涡旋混匀的时间为30s；所述离心转速为5000rpm/min，时间为5min；，提取次数为1次；

步骤2中，所述氨试液与***的体积比为1:10；所述粉末与氨试液和***的比例为1g：1mL：10mL；所述涡旋混匀的时间为30s；所述离心转速为5000rpm/min，时间为5min，提取次数为2次；

所述甲醇定容为，每1g冻干后的粉末经提取获得的产物以1mL甲醇定容。

10.根据权利要求1～9任一项所述的检测方法，其特征在于，所述检测为根据获得色谱图的出峰时间对有效成分进行定性；根据获得的色谱图的峰面积对有效成分进行定量；

检测波长为210nm获得的色谱图中：

出峰时间为9.632±0.2min的为麻黄碱；

出峰时间为10.357±0.2min的为伪麻黄碱；

检测波长为235nm获得的色谱图中：

出峰时间为24.130±0.2min的为芍药苷；

出峰时间为26.774±0.2min的为毛蕊异黄酮葡萄糖苷；

出峰时间为29.268±0.2min的为甘草苷；

出峰时间为32.275±0.2min的为苯甲酰新乌头原碱；

出峰时间为36.846±0.2min的为苯甲酰乌头原碱；

出峰时间为40.136±0.2min的为苯甲酰次乌头原碱；

出峰时间为48.898±0.2min的为新乌头碱；

出峰时间为52.017±0.2min的为次乌头碱；

出峰时间为52.299±0.2min的为乌头碱；

出峰时间为58.122±0.2min的为甘草酸。

Images