CN111944850A

CN111944850A - 表达抗cd22嵌合抗原受体和pd-l1阻断蛋白的细胞的制备方法、表达载体及应用

Info

Publication number: CN111944850A
Application number: CN202010891848.3A
Authority: CN
Inventors: 赵琦; 刘婕
Original assignee: University of Macau
Current assignee: University of Macau
Priority date: 2020-08-28
Filing date: 2020-08-28
Publication date: 2020-11-17
Anticipated expiration: 2040-08-28
Also published as: CN111944850B

Abstract

本发明公开了表达抗CD22嵌合抗原受体和PD‑L1阻断蛋白的细胞的制备方法、表达载体及应用，涉及医药生物技术领域。表达载体***有编码抗CD22嵌合抗原受体的第一核酸和编码PD‑L1阻断蛋白的第二核酸。利用CD22靶标和PD‑L1靶标，通过靶向CD22的抗体或其片段，本发明的T细胞可高效、特异性地靶向表达抗原CD22的肿瘤细胞；PD‑L1阻断蛋白可以与内源表达的PD‑1竞争结合靶细胞上的PD‑L1，从而阻断PD‑1/PD‑L1信号通路，延长了本发明上述T细胞的作用时间，提高了肿瘤杀伤作用，由此缓解了实体瘤对CAR T细胞疗法的免疫耐受性的问题。

Description

表达抗CD22嵌合抗原受体和PD-L1阻断蛋白的细胞的制备方法、表达载体及应用

技术领域

本发明涉及医药生物技术领域，具体而言，涉及表达抗CD22嵌合抗原受体和PD-L1阻断蛋白的细胞的制备方法、表达载体及应用。

背景技术

在肿瘤治疗领域，嵌合抗原受体T细胞疗法越来越受到人们的关注。嵌合抗原受体T细胞(CAR T细胞)是被基因改造而具有嵌合抗原受体的T细胞，用于免疫治疗。

嵌合抗原受体(CAR)是一种人工构建的融合基因编码的跨膜分子，可将T细胞特异性靶向癌细胞表面的抗原，以消除靶癌细胞。CAR由胞外结构域(比如，抗体的单链抗体，scFv)、跨膜结构域和胞内结构域组成。胞外结构域的scFv负责特异性抗原的识别。胞内结构域负责信号的传导。当胞外结构域和抗原特异性结合之后，胞内结构域启动细胞活化所需的信号，从而促进T细胞的增殖、细胞因子的释放等。跨膜结构域将胞外结构域和胞内结构域连接。

第一代CAR将scFv与胞内信号传导域，比如CD3ζ连接，以诱导抗原特异性T细胞活化。随后的CAR并入单个(第二代)或多个(第三代)其他共刺激信号，比如CD28、4-1BB或OX40的结构域，以进一步增强和维持T细胞的效应子功能。

虽然CAR T细胞免疫疗法具有高靶向性、高杀伤活性等特点，但是由于免疫检查点分子，比如程序性死亡受体-1(PD-1)、细胞程序性死亡-配体1(PD-L1)等的存在，肿瘤分子可使CAR T细胞失活，从而逃避CAR T细胞的杀伤。

PD-1是一种重要的免疫抑制分子。PD-1主要表达于T细胞、活化的T细胞、单核细胞和自然杀伤性T细胞(Keir等)中。PD-1的结构包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内尾部。PD-1属于协同抑制受体，有2个配体，分别为PD-L1和细胞程序性死亡-配体2(PD-L2)。PD-L1在不同的恶性肿瘤，如肺癌、食管癌、卵巢癌、膀胱癌、恶性黑色素瘤和胶质瘤中表达。在体内，PD-1与PD-L1或PD-L2的结合，下调抗原刺激的淋巴细胞增殖以及细胞因子的产生，最终导致淋巴细胞“耗尽”而诱导免疫耐受。实体瘤中的肿瘤细胞可上调PD-L1的表达，继而提供下调活化T细胞的信号，最终关闭免疫反应并诱导免疫耐受性。

嵌合抗原受体(CAR)T细胞疗法在血液***恶性肿瘤中取得了巨大的成功，但在实体瘤中却没有取得成功，克服实体瘤对CAR T细胞疗法的免疫耐受性，已经成为亟待解决的问题。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种表达抗CD22嵌合抗原受体和PD-L1阻断蛋白的细胞的制备方法、表达载体及应用以解决上述技术问题。

本发明是这样实现的：

一种表达载体，表达载体***有编码抗CD22嵌合抗原受体的第一核酸和编码PD-L1阻断蛋白的第二核酸；

PD-L1阻断蛋白为缺乏PD-1跨膜区和胞内信号区的PD-L1，抗CD22嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，PD-L1阻断蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

CD22是B细胞的另一种特异性抗原，具有与CD19相似的组织分布。该糖蛋白在B细胞谱系细胞的表面上表达。CD22已被证实是淋巴瘤和B细胞白血病的有希望的靶标。有研究证明靶向CD22的CART实现优异的抗白血病功效。因此，CD22具有作为所有患者的CAR-T细胞疗法的靶标的潜力。对于接受了靶向CD19的CART治疗但不幸康复后复发的患者，它也可以提供第二选择。

发明人将编码抗CD22嵌合抗原受体的第一核酸和编码PD-L1阻断蛋白的第二核酸构建在同一个载体上，同时利用CD22靶标和PD-1靶标，通过靶向CD22的抗体或其片段，本发明的T细胞可高效、特异性地靶向表达抗原CD22的肿瘤细胞。

PD-L1阻断蛋白仅由PD-1的胞外结构域组成，PD-L1阻断蛋白可以与内源表达的PD-1竞争结合靶细胞上的PD-L1，从而阻断PD-1/PD-L1信号通路。因此，缓解了实体瘤对CART细胞疗法的免疫耐受性的问题。

转染本发明提供的表达载体可以得到相应的T细胞，该T细胞可以实现抗CD22嵌合抗原受体和PD-L1阻断蛋白的共表达。在肿瘤细胞上表达的PD-L1与本发明上述的T细胞表面上表达的PD-L1阻断蛋白结合后，限制了肿瘤细胞上表达的PD-L1与上述T细胞表面上PD-1的结合。由此，减少或甚至阻断了PD-1/PD-L1信号通路。最终，延长了本发明上述T细胞的作用时间，提高了肿瘤杀伤作用。

本发明提供了编码抗CD22嵌合抗原受体的第一核酸，在其他实施方式中，并不限于CD22靶点，也可以根据靶向需求选择CD19、CD20，CD30，CD123，BCMA，Her2，GPC3，Mesothelin等其他靶点。

在其他实施方式中，对CD22特异的结合结构域(即编码抗CD22嵌合抗原受体的第一核酸)还可以是与单链可变片段(scFv)具有至少90％同一性的多肽序列。对CD22特异的结合结构域可以与CD22结合。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述第一核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，第二核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述表达载体为慢病毒表达载体；

优选地，慢病毒表达载体为pLVX-IRES-Zsgreen慢病毒表达载体。在其他实施方式中，慢病毒表达载体也可以根据需要进行自适应选择。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述在表达载体上与第二核酸连接有跨膜结构域；

优选地，跨膜结构域选自T细胞受体亚基，CD4，CD8或CD28的跨膜结构域。

设置跨膜结构域的目的在于：在细胞的表面表达能力以及相互作用以指导免疫细胞对预定靶标细胞的细胞反应。

在其他实施方式中，跨膜结构域可以来源于天然或合成的来源。跨膜结构域可以来源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。例如，跨膜多肽可以是T细胞受体的亚基如α、β或δ。合成的跨膜结构域可以包含主要是疏水的残基如亮氨酸和缬氨酸。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述表达载体上还包括：胞外结构域和胞内结构域。

胞外结构域包括铰链；胞内结构域包括共刺激信号分子和胞内信号转导结构域；

优选地，铰链来自CD8α。

铰链用于将跨膜结构域连接到胞外的对CD22特异的结合结构域。在其他实施方式中铰链也可以选自FcRIIIα受体。

共刺激信号分子选自人4-1BB的共刺激信号分子、CD27、PD1、ICOS、OX40或B7-H3；胞内信号转导结构域为人CD3ζ信号转导结构域。

胞内信号转导结构域负责在胞外的对CD22特异的结合结构域与靶标结合后的胞内信号转导，引起免疫细胞活化和免疫应答。在其他实施例中，胞内信号转导结构域还可以选自CD3γ，CD5或CD3ε。

共刺激信号分子是指T细胞上特异性结合共刺激配体从而介导细胞的共刺激应答的关联性结合伴侣。在其他实施例中，共刺激信号分子还可以是CD27、PD1、ICOS、OX40或B7-H3。

本发明提供的表达载体由编码抗CD22嵌合抗原受体的第一核酸(CD22 SCFV)、CD8的跨膜结构域(CD8 TM)、41-BB、CD3ζ、第二核酸以及CD28基因依次串联而成。

一种表达抗CD22嵌合抗原受体和PD-L1阻断蛋白的细胞的制备方法，制备方法包括：将上述表达载体转染宿主细胞；优选地，宿主细胞为T细胞。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述T细胞为人外周血单核细胞。

一种药物组合物，其包括上述表达载体或由上述细胞制备方法制得的细胞，以及药学上可接受的赋形剂。

药物组合物还包括可溶性的单克隆抗体；优选地，单克隆抗体为抗人PD-L1抗体。

发明人研究发现，将抗人PD-L1抗体与本发明提供的细胞制备方法制得的CAR T细胞共培养可以拯救细胞因子IL2和TNFα的表达，促进T细胞杀伤肿瘤细胞。

应当指出的是，实际上可促进T细胞杀伤肿瘤细胞的单克隆抗体并不限于抗人PD-L1抗体，在其他实施例中，可以根据需要进行自适应调整。

表达载体或由上述方法制得的细胞可以应用于制备***的药物。

在本发明应用较佳的实施方式中，上述肿瘤为PD-L1阳性或CD22阳性的肿瘤；

优选地，肿瘤为如下肿瘤中的任意一种：淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤。

在其他实施例中，也可以应用于其他实体肿瘤和血液***恶性肿瘤的治疗。

本发明具有以下有益效果：

本发明构建了一种表达载体，该表达载体可以实现抗CD22嵌合抗原受体和PD-L1阻断蛋白的共表达，利用CD22靶标和PD-1靶标，通过靶向CD22的抗体或其片段，本发明的T细胞可高效、特异性地靶向表达抗原CD22的肿瘤细胞；PD-L1阻断蛋白可以与内源表达的PD-1竞争结合靶细胞上的PD-L1，从而阻断PD-1/PD-L1信号通路，延长了本发明上述T细胞的作用时间，提高了肿瘤杀伤作用，由此缓解了实体瘤对CAR T细胞疗法的免疫耐受性的问题。本发明提供的表达抗CD22嵌合抗原受体和PD-L1阻断蛋白的细胞的制备方法制得的细胞可以广泛用于实体肿瘤治疗药物的制备。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1显示了构建本发明的CAR PDR T细胞使用的载体的设计方案图；

图2A-图2C分别显示了由载体CD22ABPDR 4 ZS、CD22ABPDR 8 ZS和CD22ABPDR 28ZS转染的293 T细胞分别表达CAR、PDR和ZsGreen1的结果；

图2D分别显示了由载体CD22ABPDR 4 ZS、CD22ABPDR 8 ZS和CD22ABPDR 28 ZS转染的293 T细胞表达的PDR蛋白质印迹实验的结果；

图3显示了构建本发明的CAR PDR T细胞使用的载体的另一设计方案图；

图4A显示了由载体ZS、PDR、CD22AB和CD22ABPDR转染的人外周血淋巴细胞中相关蛋白表达的Q-PCR鉴定的结果；

图4B为PD-1逐步表达的结果图；

图5显示了本发明中使用的肿瘤细胞系K562-PD-L1、Raji-PD-L1、Daudi-PD-L1和BV173-PD-L1稳定高表达PD-L1；

图6A显示了圈选CD3 T细胞之后，由载体ZS、PDR、CD22AB和CD22ABPDR转染的人外周血淋巴细胞中CD4和CD8的比例；

图6B显示了由载体ZS、PDR、CD22AB和CD22ABPDR转染的人外周血淋巴细胞中表达的活化标记CD27的FACS检测结果；

图6C显示了由载体ZS、PDR、CD22AB和CD22ABPDR转染的人外周血淋巴细胞中表达的活化标记CD28的FACS检测结果；

图6D显示了由载体ZS、PDR、CD22AB和CD22ABPDR转染的人外周血淋巴细胞中表达的活化标记CD69的FACS检测结果；

图7A显示了将由载体ZS、PDR、CD22AB和CD22ABPDR转染的人外周血淋巴细胞与肿瘤细胞系BV173-PD-L1共培养24小时之后，CD45RA和CD62L表达的FACS检测；

图7B显示了将由载体ZS、PDR、CD22AB和CD22ABPDR转染的人外周血淋巴细胞与肿瘤细胞系BV173-PD-L1共培养24小时之后，CD45RA+CD62L-细胞类型的不同比例；

图8显示了由载体ZS、PDR、CD22AB和CD22ABPDR转染的人外周血淋巴细胞对肿瘤细胞系K562、Raji、Daudi和BV173的裂解作用；

图9A显示了针对肿瘤细胞系BV173 PD-L1，抗PD-1抗体(anti-PD-1)对由载体CD22ABPDR转染的人外周血淋巴细胞的IL2和TNFα的表达的作用；

图9B显示了针对肿瘤细胞系BV173 PD-L1，抗PD-L1抗体(anti-PD-L1)对由载体CD22ABPDR转染的人外周血淋巴细胞的IL2和TNFα的表达的作用。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

本发明为了克服CAR T细胞疗法的免疫检查点抑制，针对CD22抗原，设计了一种T细胞，其共表达抗CD22嵌合抗原受体和PD-L1阻断蛋白，PD-L1阻断蛋白即PD-1的显性阴性受体。该T细胞简称为CAR PDR T细胞。此外，还研究了抗PD-L1抗体与本申请的CAR PDR T细胞联合使用的肿瘤杀伤作用。

实施例1

本实施例构建了一系列抗CD22载体以共表达CAR和PD-L1阻断蛋白。本发明中使用的抗CD22 CAR构建体是第二代CAR，它们都包含CD8α前导序列，抗CD22特异性scFv，CD8α铰链和TM(跨膜结构域)。细胞内结构域包含4-1BB共刺激结构域和CD3ζ信号结构域，被称为CD22AB。

为了鉴定免疫检查点分子在CAR T细胞中的效率，我们构建了具有不同跨膜区域(CD4，CD8和CD28)的共表达CAR和PD-1细胞外域的载体。每个载体分别被命名为22ABPDR 4、22ABPDR 8和22ABPDR28。***的基因和质粒的构建参照图1所示。

载体包括编码由抗CD22的抗体(Anti-CD22)的单链抗体、CD8跨膜结构域(TM)、41-BB和CD3ζ组成的嵌合抗原受体的第一核酸，以及由PD-1细胞外结构域和三种不同的TM组成的PD-1显性阴性受体(PDR)的核酸。通过本领域常规技术手段构建载体。

CD22AB scFv通过引物表1中的CD22AB F和CD22AB R扩增，CAR信号转导区通过signal F和signal R扩增，然后通过Overlap PCR将CD22AB scFv和信号转导区连成一个完整CAR基因。

通过PCR扩增PD-L1阻断蛋白基因和CD4/CD8/CD28的跨膜区，并用PCR扩增的方式引入P2A至CD4/CD8/CD28的跨膜区的5’端。然后再通过Overlap PCR连接跨膜区和CAR基因，在通过两端的酶切位点***慢病毒载体pLVX-EF1α-IRES-ZsGreen1中。

PCR体系为50ul，包括0.5U Q5 DNA聚合酶，2mM MgCl₂,0.2mM dNTP混合物，20ng质粒模板，0.25μM正向引物和0.25μM反向引物。PCR反应程序为：98℃预变性30s，变性10s，58℃退火20s，72℃延伸30，共30个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物在1％的琼脂糖中电泳，并用Omega胶回收试剂盒回收PCR片段。

表1引物序列表。

CAR F和CAR R扩增CD22AB CAR序列，PD-1 EM F和PD-1 EM R扩增PD-L1阻断蛋白，P2A F用于***P2A至5‘端的PD-1胞外序列。

P2A的核苷酸序列为：

Ggcgccaccaacttctccctgctgaagcaggccggcgacgtggaggagaaccccggcccc。P2A的氨基酸序列为：GATNFSLLKQAGDVEENPGP。

CD4/8/28 TM M R用于将不同的跨膜序列构建至PD-1胞外序列3’端，载体不含ZsGreen报告基因，CD4 TM B R，CD8 TM NR和CD28 TM B R用于将不同的跨膜序列构建至PD-L1阻断蛋白序列3‘端，载体含ZsGreen报告基因。跨膜区序列分别为：

CD4 TM的核苷酸序列为：

gccctgattgtgctggggggcgtcgccggcctcctgcttttcattgggctaggcatcttcttc，CD4TM的氨基酸序列：ALIVLGGVAGLLLFIGLGIFF；

CD8 TM的核苷酸序列为：

atctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgc

CD8 TM的氨基酸序列：IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC；

CD28 TM的核苷酸序列为：

ttttgggtgctggtggtggttggtggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtg

CD28 TM的氨基酸序列为：

FWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWV。

图1中5’LTR表示5’长末端重复序列；LS表示前导序列；Anti-22表示抗CD22抗体-22AB的单链抗体的编码序列；CD8 TM表示CD8跨膜结构域的编码序列；41-BB和CD3ζ分别表示共刺激信号分子41-BB和胞内信号转导结构域CD3ζ的编码序列；2A表示Thoseaasigna病毒2A肽的编码序列；PD-1 EM+CD4 TM、PD-1 EM+CD8 TM和PD-1 EM+CD28 TM分别表示PD-1的胞外结构域与CD4、CD8和CD28跨膜结构域的组合的编码序列；IRES表示内部核糖体进入位点的编码序列；ZsGreen1表示一种荧光蛋白的编码序列。

分别构建了三种质粒载体，质粒CD22ABPDR 4 ZS，其中PD-1的胞外结构域与CD4跨膜结构域组合；质粒CD22ABPDR 8 ZS，其中PD-1的胞外结构域与CD8跨膜结构域组合；以及质粒CD22ABPDR 28 ZS，其中PD-1的胞外结构域与CD28跨膜结构域组合。

将上述三种质粒载体CD22ABPDR 4 ZS、CD22ABPDR 8 ZS和CD22ABPDR 28 ZS分别转染至293T细胞。

接下来，对转染的293 T细胞进行培养，收获后，进行FACS检测。

FACS检测包括如下步骤：

使用FITC抗人CD22抗体对肿瘤细胞系上的CD22表达进行染色。用CD22-Fc蛋白和二抗藻红蛋白(PE)缀合的抗人IgG，使用流式细胞术来测量转导的T细胞中的CAR表达。用小鼠抗人PD-1和APC缀合的山羊抗小鼠IgG检测转导的T细胞中的PDR表达。对于T细胞分型，用APC缀合的抗人CD3、PE缀合的抗人CD4、PE/CY7缀合的抗人CD8，对CAR T细胞或模拟T细胞进行染色。对于T细胞活化，用APC缀合的抗人CD8和PE缀合的CD27、PE缀合的CD28、PE缀合的CD69染色，对CAR T细胞或对照T细胞。对于T细胞亚型，用APC缀合的抗人CD3、PE缀合的抗人CD45、PE/CY7缀合的CD62L染色，对CAR T细胞或模拟T细胞染色。对于T细胞的细胞毒性功能，用APC缀合的抗人CD8和PE缀合的抗人颗粒酶B，对CAR T或模拟T细胞染色。所有的染色均在每1×10⁶个细胞的100μl的FACS缓冲液中进行(PBS+3％FBS)在4℃下避光，对于第一抗体进行一小时并且对于第二抗体进行30分钟。用混合的磁珠检测细胞因子，这些珠子被不同荧光强度的PE缀合的抗人IL2、IL4、IL6、IL10、TNF和IFNγ抗体包被。在装入流式细胞仪之前，除商品化的磁珠外，所有样品均用70μl的细胞过滤器过滤。使用BD Accuri^TM C6或Beckman CytoFLEX S进行流式细胞分析。

使用荧光活化细胞分选术(FACS)分别检测由上述三种载体CD22ABPDR 4 ZS、CD22ABPDR 8 ZS和CD22ABPDR 28 ZS转染的293 T细胞分别表达CAR、PDR和ZsGreen1的情况。

图2A-图2C分别显示了培养的转染后的293 T细胞的FACS检测的结果，图2A中显示了分别由载体CD22ABPDR 4 ZS、CD22ABPDR 8 ZS和CD22ABPDR 28 ZS转染的293 T细胞表达CAR的情况。由载体CD22ABPDR 4 ZS转染的293 T细胞表达的CAR(称为CD22AB CAR)的FACS计数表示数值为90.6；由载体CD22ABPDR 8 ZS转染的293 T细胞表达的CAR(称为CD22ABCAR)的FACS计数表示数值为72.5；由载体CD22ABPDR 28 ZS转染的293 T细胞表达的CAR(称为CD22AB CAR)的FACS计数表示数值为87.5。

图2B中显示了分别由载体22ABPDR 4 ZS、22ABPDR 8 ZS和22ABPDR 28 ZS转染的293 T细胞表达PDR的情况。由载体CD22ABPDR 4 ZS转染的293 T细胞表达的PDR的FACS计数表示数值为89.6；由载体CD22ABPDR 8 ZS转染的293 T细胞表达的PDR的FACS计数表示数值为58.5；由载体CD22ABPDR 28 ZS转染的293 T细胞表达的PDR的FACS计数表示数值为96.9。

图2C中显示了分别由载体CD22ABPDR 4 ZS、CD22ABPDR 8 ZS和CD22ABPDR 28 ZS转染的293 T细胞表达ZsGreen1的情况。由载体CD22ABPDR 4 ZS转染的293 T细胞表达的ZsGreen1的FACS计数表示数值为88.0；由载体CD22ABPDR 8 ZS转染的293 T细胞表达的ZsGreen1的FACS计数表示数值为90.2；由载体CD22ABPDR 28 ZS转染的293 T细胞表达的ZsGreen1的FACS计数表示数值为84.9。

经蛋白质印迹实验(图2D)，我们可以看到CD22ABPDR 28可以在293T细胞中高度表达，由于293T为人细胞，由此推论CD22ABPDR 28可以适用于后面的人PBMC细胞。因此，CD28TM可以有效的促进本发明提供的组合表达。我们使用缩写为CD22ABPDR 28的该载体来完成其余的实验。

蛋白印迹的步骤：

将1ug上述质粒转染至6孔板中的293T细胞中,48小时后，用PBS洗涤两次细胞层，加入100ul RIPA每孔，冰上孵育30min后转移裂解液至1.5ml离心管中，12000rpm离心15min。转移上清至新的1.5ml EP管中，-20℃保存备用。

蛋白的测定采用BCA测定法，吸取5ul蛋白液用PBS稀释至25ul，加入200ulBCA工作液，37℃孵育30min后，在OD562下测定吸光值，然后根据吸光值的大小通过标准曲线计算蛋白浓度。

然后吸取35ug总蛋白，加入一定体积的SDS loadingbuffer，95℃加热5min后将样品12000rpm离心5min后将所有样品上样至SDSpage孔中，80V电泳30min，然后在120V电泳45min分离蛋白样品，然后将胶上的样品转移至PVDF膜上，条件为半干转20v 30min。电转完后将膜至于5％脱脂奶粉中室温封闭1h。用鼠抗人PD-1抗体(1:500)和鼠抗人β-Actin(1:5000)抗体4℃孵育过夜，PBST洗涤三次后，在用HRP-抗鼠Fc(1:5000)室温孵育1h。PBST洗涤三次后用Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate显色后用BioRadChemiDoc MP Imaging System拍照。

实施例2

本实施例分别构建了共表达CAR和PDR与CD28的T细胞。***的基因和质粒的构建参照图3所示。通过本领域常规技术手段，构建了四种质粒载体ZS、PDR、CD22AB和CD22ABPDR。其中，载体ZS为含有编码IRES和ZsGreen1的核酸的对照载体；载体PDR为含有编码PD-1 EM和CD28 TM的核酸的对照载体；载体CD22AB为含有编码Anti-CD22、CD8 TM、41-BB、CD3ζ、IRES和ZsGreen1的核酸的对照载体；而载体CD22ABPDR与实施例1中的载体CD22ABPDR 28 ZS相同。

将上述四种质粒载体转染至人外周血淋巴细胞中，构建CAR T细胞。

将转染的人外周血淋巴细胞培养，收获后，进行FACS检测和Q-PCR鉴定。

PBMC细胞的制备方法如下：将Buffy Coat中残余血30-50ml转入新的50ml离心管中，用PBS稀释至200ml，混匀后，转移28ml稀释血样至离心管中，轻轻加入21ml Ficoll，设置离心机转速为增速3降速0,400g离心30min。将白细胞层转移至新的50ml离心管中，加入10倍PBS洗涤两次，离心转速为100g 10min。然后用含有10％DMSO的FBS重悬PBMCs，计数后稀释至细胞浓度为2×107/ml分别冻存于液氮罐中备用。

CAR T细胞构建如下步骤所示：PBMCs复苏后培养至含IL2的RIPM+10％FBS+P.S.+Glutamine的培养基中，以1:1的比例加入Dynabeads。24h后将病毒按照MOI＝5～10加入含有5ug/mlpolybrene的PBMCs中，细胞浓度控制在终浓度为2×106左右，于32℃570g离心1h，48h重复感染一次，72h后换液至无polybrene的含IL2的RIPM+10％FBS+P.S.+Glutamine的培养基中，一周后去除磁珠，隔一天换液一半培养基直至达到需要的用量。

PBMC的分离：本发明使用的PBMC来自健康捐献者。按照制造商的说明，使用Ficoll-Paque PLUS从中间白层中分离出PBMC。再经过红细胞的裂解和NK细胞的去除而得到纯化的PBMC。

Q-PCR鉴定的结果显示在图4A中，可见，PDR在质粒CD22ABPDR和质粒PDR转染的人PBMC细胞中高表达。

在进一步检测PD-1表达变化之后，参照图4B所示，我们可以看到PD-1表达在激活后逐天被下调。在第12天，检测不到PD-1的表达，这意味着当PBMC在12天后体外培养时PD-1不表达。

实施例3

本实施例针对构建的CAR T细胞的效果进行验证。

(1)构建表达PD-L1的细胞系。

为了鉴定在CAR T细胞上表达的PDR的功能，肿瘤细胞需要表达PD-L1。因为Raji、K562、Daudi和BV173的肿瘤细胞系没有内源性PD-L1的表达，发明人使用慢病毒在Raji、K562、Daudi和BV173的肿瘤细胞系的基础上分别构建了表达PD-L1的肿瘤细胞系Raji-PD-L1、K562-PD-L1、Daudi-PD-L1和BV173-PD-L1。经流式细胞仪分析，确定所有构建的细胞系均可稳定高表达PD-L1(参照图5所示)。

(2)关键活化标志物的表达检测。

使用流式细胞仪分析由实施例2中四种质粒载体ZS、PDR、971和971PDR转染的人PMBC上表达的CD4和CD8比例以及其他活化细胞标记。

由图6A可见，分别由质粒载体971和971 PDR转染的人PMBC上表达的CD4和CD8的比例相似。从图6B可见，尽管在由质粒载体971转染的人PMBC中显示较高的CD8⁺ T细胞，但是活化细胞标记CD27的表达没有差异。然而，图6C和图6D显示由质粒971转染的人PMBC相比由其他三种质粒转染的人PMBC具有更低的CD28表达和更高的CD69表达。

从这些结果可见，将质粒971转染至人PBMC中可以减少CD28的表达，但是提高了CD69的表达，而质粒PDR可恢复CD28的表达并下调CD69的表达。综上，PDR质粒的引入基本不影响人PBMC的活化功能。

(3)PDR对于CD22 CART细胞的分化功能的影响。

由载体971PDR转染的人外周血淋巴细胞中表达的PDR可有效地靶向表达PD-L1的肿瘤细胞，PDR可与内源表达的PD-1竞争结合靶细胞上的PD-L1上，从而增强CAR T细胞的活化。靶向肿瘤细胞的CAR T细胞可促进T细胞分化成不同亚型的T细胞。

将由四种质粒载体ZS、PDR、CD22AB和CD22ABPDR转染的人PMBC与实施例3构建的肿瘤细胞系BV173-PD-L1共培养。24小时后，收集细胞并用抗体染色，圈选CD8+T细胞之后，分析效应细胞CD62L-CD45RA+，发现由质粒载体CD22AB转染的人PMBC的效应T细胞的比例明显高于由质粒载体CD22ABPDR转染的人PMBC的效应T细胞的比例(见图7B)。图7A中CD62L+CD45RA+表达双阳性为NaiveT细胞，CD45RA+CD62L-为效应细胞，表示细胞分化成效应细胞的能力，进一步表明PDR能有效靶向表达PD-L1的肿瘤细胞，促使T细胞分化。

这意味着在质粒CD22ABPDR转染的人PBMC细胞上表达的PDR可有效地靶向肿瘤细胞上表达的PD-L1。质粒CD22ABPDR转染的人PBMC细胞上表达的PDR可靶向表达PD-L1的肿瘤细胞上的PD-L1，有助于由质粒CD22ABPDR转染的人PBMC细胞靶向肿瘤细胞而增加由质粒CD22ABPDR转染的人PBMC细胞的抗肿瘤功效，也加速由质粒CD22ABPDR转染的人PBMC细胞分化成终端效应细胞。该结果表明，表达CAR T细胞的PDR可以作为表达PD-L1的肿瘤细胞的第二个靶标。因此，可以通过同时靶向CAR和PD-1的CD22ABPDR CAR T细胞来增强T细胞活化。CAR T细胞靶向肿瘤细胞一方面可以提高CD22ABPDR的抗肿瘤功效，另一方面可以加速CD22ABPDR CAR T细胞分化为末端效应细胞。

(4)PDR与CAR的共表达增强CAR T细胞的肿瘤杀伤作用。

CAR T细胞可通过不限于MHC复合物的方法直接靶向表达抗原的肿瘤细胞。

进一步检测了由载体ZS、PDR、CD22AB和CD22ABPDR转染的人外周血淋巴细胞的肿瘤杀伤作用。

将T细胞在RPMI培养基+10％胎牛血清+100单位/毫升+1％双抗的人白介素-2中培养，肿瘤细胞在RPMI培养基+10％胎牛血清中培养。通过使用钙黄绿素-AM分析各自热外周血淋巴细胞的肿瘤杀伤作用。从图8可见，针对高度或中等表达CD22抗原的Raji、Daudi和BV173的肿瘤细胞系，由载体CD22ABPDR转染的人外周血淋巴细胞相对于由载体CD22AB转染的人外周血淋巴细胞具有增强的抗肿瘤效率，K562不表达CD22。这证实了将PD-l PDR共表达在CAR T细胞中，增强了CAR T细胞的肿瘤杀伤作用。

细胞毒性测定方法：

用钙黄绿素-AM(Invitrogen，C3100MP)分析CAR T细胞对肿瘤细胞的裂解作用。在37℃下将靶细胞在钙黄绿素-AM的10μm工作溶液中孵育30分钟，密度为1×106个细胞/ml。然后将细胞用完全培养基洗涤三次，以除去残留的钙黄绿素-AM，然后以1×105个细胞/ml的密度重悬。

接着，将靶细胞与效应CAR T或模拟T细胞共培养。将每孔100μl转移至96孔板作为靶。将CAR T细胞和靶细胞一式三份地添加到96孔板中，稀释度从20/1至2.5/1，每孔总体积为200μl。设置自发靶肿瘤对照孔和最大释放靶对照孔，并向每个孔中添加100μl培养基至200μl的总体积。然后，设置一组阴性对照，添加200μl培养基作为阴性对照。然后将板置于37℃，5％CO₂的潮湿气氛培养箱中。

在37℃的5％CO₂中孵育3小时后，将2μl triton X-100加入阳性孔中。在37℃的5％CO₂中继续孵育1小时，然后将板以1500rpm离心5分钟。接着，将100μl细胞裂解上清液转移至白色不透明的96孔板中。使用PerkinElmer Multimode Reader在495/515下测量荧光。使用以下公式计算肿瘤细胞裂解的百分比：

测试样品：杀伤肿瘤释放的荧光素数值；自发样品：肿瘤细胞自然释放的荧光素；样品最大值：肿瘤细胞中所有的荧光素；培养基最大值：培养基中的本底。

(5)抗PD-1抗体和抗PD-L1抗体对共表达PDR和CAR的T细胞的肿瘤杀伤作用的影响。

细胞因子分泌的测定方法包括：

使用BD Cytometric Bead Array(CBA)人Th1/Th2细胞因子试剂盒II检测细胞因子的释放。在完全RPMI-1640中，将1×10⁶个效应T细胞与1×10⁵个靶细胞共培养。24小时后，收集培养基，并测量细胞因子。

具体而言，将一瓶冻干的标准球与2ml分析缓冲液一起添加到15ml试管中，以将标准液重新配制为最高标准。将该混合物上下吸移几次。然后，将300μl最高标准溶液转移至含有300μl分析缓冲液的1:2稀释管中，并充分混合。然后，通过通过转移300μl，连续进行系列稀释，从1:2至1:4，依此类推直至1:256。设置一个阴性对照管，其中包括300μl的分析缓冲液。

在混合之前，将每个细胞因子捕获磁珠悬浮液剧烈起涡旋，然后将100μl捕获磁珠添加到单个试管中。再次剧烈起涡旋，以充分混合磁珠，并以200×g离心5分钟。然后，加入等体积的测定缓冲液，以重悬混合的磁珠，并将50μl的混合磁珠添加到10个新的试管中。然后，将50μl人细胞因子标准品稀释液或阴性对照添加到所有试管中，其中含有50μl混合磁珠和50μl的PE检测试剂。将这些管孵育并在室温下避光放置三小时。用洗涤缓冲液洗涤一遍后，将磁珠粒重悬于300μl洗涤缓冲液中以进行流式细胞术分析。

使用FlowJo分析数据。在圈选用不同荧光强度的PE缀合的抗人IL2、IL4、IL6、IL10、TNF和IFNγ抗体包被的磁珠之后，通过软件测量PE的平均荧光强度。以MFI为水平坐标，以细胞因子浓度为垂直坐标绘制标准曲线。

在完全RPMI-1640中，从与1×10⁵个靶向肿瘤细胞共培养的上清液中取样。磁珠的混合物需要进行预处理，以检测含有FBS的培养基中的细胞因子。转移并混合磁珠之后，将混合物以200×g离心5分钟。丢弃上清液，并将混合的磁珠重悬在等体积的血清增强缓冲液中。将该混合物在室温下孵育30分钟，避光，并以200×g离心5分钟。然后，加入等体积的测定缓冲液以重悬混合的磁珠。

将样品分为一式三份，并以1500rpm离心五分钟以弃去细胞碎片，并将50μl上清液转移至新试管中。然后，将50μl混合磁珠和50μl PE检测试剂添加到所有试管中，在室温下避光孵育3小时。用洗涤缓冲液洗涤一次之后，将磁珠重悬在300μl的洗涤缓冲液中，以进行流式细胞术分析。

使用FlowJo分析数据。在圈选出用不同荧光强度的PE缀合的抗人IL2、TNFα抗体包被的磁珠之后，通过软件计算PE的平均荧光强度。然后，使用标准曲线计算释放至上清液中的每种细胞因子的浓度。

将由载体CD22ABPDR转染的人外周血淋巴细胞和肿瘤细胞系BV173-PD-L1以10:1的比例共培养。

共培养的条件包括：CD22AB PDR或者CD22ABCAR T细胞与肿瘤细胞系BV173或BV173-PD-L1以10：1的比例在RPMI培养基+10％胎牛血清+1％双抗中共培养24h。细胞培养条件为：37℃5％CO₂培养箱。

其中一组共培养***中添加50nM的抗人PD-1抗体。24小时后，收集上清液，以分析细胞因子的变化。结果表明，与BV173-PD-L1共培养时，添加抗PD-1抗体不能挽救IL2和TNFα的表达(见，图9A)。

此外，在另一组共培养***中添加50nM的抗人PD-L1抗体。24小时后，收集上清液，以分析细胞因子的变化。结果表明，与BV173-PD-L1共培养时，添加抗PD-L1抗体可挽救IL2和TNFα的表达(见，图9B)。

这意味着由CAR T细胞上表达的PD-L1诱导了对细胞因子IL2和TNFα表达的抑制。因此，使用抗PD-L1抗体可进一步促进共表达PDR和CAR的T细胞的肿瘤杀伤作用。

综上，通过与具有或不具有PD-L1表达的肿瘤细胞系共培养来比较CAR和PDR+CART细胞之间的不同功能，发现在细胞毒性，细胞类型分化，细胞标志物表达和细胞因子方面存在许多差异。

结果表明，与CD22 CAR相比，CAR T细胞中共表达的PDR可以显着抑制IL2和TNFα的分泌。细胞因子抑制与有或无PD-L1表达的肿瘤细胞无关。当我们分析CAR T细胞上的PD-L1表达时，我们可以看到PD-L1可以在有或没有PDR表达的CAR T细胞上增量表达。

在进一步使用抗PD-1和抗PD-L1抗体阻断PD-L1与其受体的结合以查看是否对CART细胞的细胞因子分泌产生某些影响后，我们发现只有抗-PD-L1抗体可同时阻断PD-L1与PD-1和CD80的结合，这表明在CAR T细胞上表达的PD-L1可以抑制CAR T细胞的功能。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 澳门大学

<120> 表达抗CD22嵌合抗原受体和PD-L1阻断蛋白的细胞的制备方法、表达载体及

应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 489

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val

20 25 30

Lys Pro Ser Gln Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser

35 40 45

Val Ser Ser Asn Ser Ala Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser

50 55 60

Arg Gly Leu Glu Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr

65 70 75 80

Asn Asp Tyr Ala Val Ser Val Lys Ser Arg Ile Thr Ile Asn Pro Asp

85 90 95

Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu

100 105 110

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Val Thr Gly Asp Leu Glu

115 120 125

Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp

145 150 155 160

Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp

165 170 175

Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Trp Ser Tyr Leu

180 185 190

Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile Tyr

195 200 205

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Arg

210 215 220

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu

225 230 235 240

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Pro Gln Thr

245 250 255

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro

260 265 270

Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu

275 280 285

Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg

290 295 300

Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly

305 310 315 320

Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys

325 330 335

Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg

340 345 350

Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro

355 360 365

Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser

370 375 380

Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu

385 390 395 400

Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg

405 410 415

Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln

420 425 430

Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr

435 440 445

Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp

450 455 460

Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala

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Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485

<210> 2

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu

1 5 10 15

Asn Pro Gly Pro Met Gln Ile Pro Gln Ala Pro Trp Pro Val Val Trp

20 25 30

Ala Val Leu Gln Leu Gly Trp Arg Pro Gly Trp Phe Leu Asp Ser Pro

35 40 45

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50 55 60

Thr Glu Gly Asp Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Phe Ser Asn Thr Ser

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Asp Lys Leu Ala Ala Phe Pro Glu Asp Arg Ser Gln Pro Gly Gln Asp

100 105 110

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Ser Val Val Arg Ala Arg Arg Asn Asp Ser Gly Thr Tyr Leu Cys Gly

130 135 140

Ala Ile Ser Leu Ala Pro Lys Ala Gln Ile Lys Glu Ser Leu Arg Ala

145 150 155 160

Glu Leu Arg Val Thr Glu Arg Arg Ala Glu Val Pro Thr Ala His Pro

165 170 175

Ser Pro Ser Pro Arg Pro Ala Gly Gln Phe Gln Phe Trp Val Leu Val

180 185 190

Val Val Gly Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala

195 200 205

Phe Ile Ile Phe Trp Val

210

<210> 3

<211> 1467

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

caggtgcagc tgcagcagtc tggccctggc ctcgtgaagc ctagccagac cctgagcctg 120

acctgtgcca tcagcggcga tagcgtgtcc agcaatagcg ccgcctggaa ctggatcaga 180

cagagcccta gcagaggcct ggaatggctg ggccggacct actaccggtc caagtggtac 240

aacgactacg ccgtgtccgt gaagtcccgg atcaccatca accccgacac cagcaagaac 300

cagttctccc tgcagctgaa cagcgtgacc cccgaggata ccgccgtgta ctactgcgcc 360

agagaagtga ccggcgacct ggaagatgcc ttcgacatct ggggccaggg cacaatggtc 420

accgtgtcta gcggtggcgg tggctcgggc ggtggtgggt cgggtggcgg cggatctgac 480

atccagatga cacagagccc cagctccctg agcgccagcg tgggagacag agtgaccatc 540

acctgtcggg ccagccagac catctggtcc tacctgaact ggtatcagca gcggcctggc 600

aaggccccca acctgctgat ctatgccgcc agctcactgc agagcggcgt gcccagcaga 660

ttttccggca gaggcagcgg caccgacttc accctgacaa tcagttccct gcaggccgag 720

gacttcgcca cctactactg ccagcagagc tacagcatcc cccagacctt cggccagggg 780

accaagctgg aaatcaaaac cacgacgcca gcgccgcgac caccaacacc ggcgcccacc 840

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gtgcacacga gggggctgga cttcgcctgt gatatctaca tctgggcgcc cttggccggg 960

acttgtgggg tccttctcct gtcactggtt atcacccttt actgcaaacg gggcagaaag 1020

aaactcctgt atatattcaa acaaccattt atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa 1080

gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa gaagaaggag gatgtgaact gagagtgaag 1140

ttcagcagga gcgcagacgc ccccgcgtac cagcagggcc agaaccagct ctataacgag 1200

ctcaatctag gacgaagaga ggagtacgat gttttggaca agagacgtgg ccgggaccct 1260

gagatggggg gaaagccgag aaggaagaac cctcaggaag gcctgtacaa tgaactgcag 1320

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<210> 4

<211> 642

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aggccagccg gccagttcca attttgggtg ctggtggtgg ttggtggagt cctggcttgc 600

tatagcttgc tagtaacagt ggcctttatt attttctggg tg 642

Claims

1.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体***有编码抗CD22嵌合抗原受体的第一核酸和编码PD-L1阻断蛋白的第二核酸；所述PD-L1阻断蛋白为缺乏PD-1跨膜区和胞内信号区的PD-L1，所述抗CD22嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述PD-L1阻断蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述第一核酸的核苷酸序列如SEQ IDNO.3所示，所述第二核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为慢病毒表达载体；

优选地，所述慢病毒表达载体为pLVX-IRES-Zsgreen慢病毒表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，在所述表达载体上，所述第一核酸和所述第二核酸均串联有跨膜结构域；

优选地，所述跨膜结构域选自T细胞受体亚基，CD4，CD8或CD28的跨膜结构域；

优选地，所述T细胞受体亚基为α亚基、β亚基或δ亚基。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体上还包括：胞外结构域和胞内结构域；

优选地，所述胞外结构域包括铰链；所述胞内结构域包括共刺激信号分子和胞内信号转导结构域；

优选地，所述铰链来自CD8α；

所述共刺激信号分子选自人4-1BB的共刺激信号分子、CD27、PD1、ICOS、OX40或B7-H3；所述胞内信号转导结构域为人CD3ζ信号转导结构域，CD3γ，CD5或CD3ε。

6.一种表达抗CD22嵌合抗原受体和PD-L1阻断蛋白的细胞的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：将权利要求1-5任一项所述的表达载体转染宿主细胞；优选地，所述宿主细胞为T细胞。

7.一种由权利要求6所述的制备方法制得的细胞。

8.一种药物组合物，其特征在于，其包括权利要求1-5任一项所述的表达载体或由权利要求6所述的制备方法制得的细胞，以及药学上可接受的赋形剂。

9.根据权利要求8所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括可溶性的单克隆抗体；

优选地，所述单克隆抗体为抗人PD-L1抗体。

10.一种如权利要求1-5任一项所述的表达载体或由权利要求6-7任一项所述的制备方法制得的细胞在制备***的药物中的应用，优选地，所述肿瘤为PD-L1阳性或CD22阳性的肿瘤；

优选地，所述肿瘤为如下肿瘤中的任意一种：淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤。