CN110872577A

CN110872577A - 修饰的免疫细胞及其应用

Info

Publication number: CN110872577A
Application number: CN202010062327.7A
Authority: CN
Inventors: 赵同标; 靳利远; 朱颖婕; 曹磊; 曹佳妮; 李晓燕
Original assignee: Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2020-01-20
Filing date: 2020-01-20
Publication date: 2020-03-10
Anticipated expiration: 2040-01-20
Also published as: WO2021147121A1; CN110872577B; JP2023510651A; JP7457899B2

Abstract

本发明属于细胞治疗领域，具体而言，本发明涉及通过基因修饰免疫细胞如T细胞、肿瘤浸润T细胞、NK细胞、NKT细胞和巨噬细胞，使其增强在实体肿瘤处的归巢和聚集以及实体瘤浸润，进而增强免疫细胞对于实体肿瘤的治疗效果。

Description

修饰的免疫细胞及其应用

技术领域

本发明属于免疫细胞治疗领域。具体而言，本发明涉及通过基因修饰的免疫细胞，使其增强在实体肿瘤内的归巢和聚集，进而增强免疫细胞例如CAR-T细胞对于实体肿瘤的治疗效果。

背景技术

近几年来，肿瘤免疫疗法发展迅速，尤其是过继性细胞疗法（ACT），即指从病人体内分离出T细胞、NK细胞等免疫细胞，通过体外修饰扩增培养，随后回输入患者体内进行肿瘤治疗的方法。2013年，肿瘤的免疫疗法被Science杂质评为“十大突破”之首。

CAR-T和TCR-T是过继性细胞疗法重要的组成部分，尤其CAR-T疗法，在血液肿瘤的治疗上取得了显著的成就，取得了较高的缓解率，典型的CAR结构由三部分组成，胞外识别肿瘤抗原的scFv、铰链和跨膜结构域、胞内共刺激信号和激活结构域。第一代的CAR并不包含胞内共刺激信号，CAR-T细胞的杀伤活性较低且生存时间较短。因此，第二代CAR开始加入共刺激信号如CD28和4-1BB，采用不同的共刺激信号的CAR-T细胞的特性也不尽相同，CD28增强了CAR-T细胞的杀伤活性而4-1BB则增强CAR-T细胞杀伤活性的同时延长了CAR-T细胞的生存时间。随后，出现了共同表达两个共刺激信号域的三代CAR，然而其抗肿瘤效果并不如二代CAR-T。因此，现在临床应用的主要为二代CAR-T细胞。

CAR-T疗法不仅在血液肿瘤的治疗上成果显著，而且商业化进展顺利，美国FDA于2017年正式批准了两种CAR-T药品上市。尽管CAR-T细胞疗法在血液肿瘤的治疗上大放异彩，而对于实体瘤却并没有较好的治疗效果，缓解率低且容易发生脱靶等毒副作用。CAR-T细胞不能有效的在实体瘤处聚集是影响其疗效的重要因素之一，虽然已有研究采用局部输注CAR-T细胞的方式以增强其在肿瘤细胞的数目进而增强其抗肿瘤活性，然而这种输注方式使用范围较小。因此，仍然需要新的方式诱导CAR-T细胞在实体肿瘤内的归巢聚集。科研人员对CAR-T细胞实体瘤治疗作了大量研究，采用多种方式对CAR-T细胞进行了改良，例如专利CN110157682A, 人工靶向修饰的CAR-T细胞及其制备方法与应用, 涉及代谢修饰的CAR-T细胞及其制备方法与应用，其通过在CAR-T细胞表面标记偶联有叠氮等的糖类、氨基酸等生物活性分子，使得生物活性分子在活体内可以有效地将CAR-T细胞靶向引导至肿瘤部位；而体内这种靶向与拉近使得CAR-T细胞上特异性CAR分子在肿瘤部位与肿瘤抗原结合，从而刺激CAR-T细胞特异性活化，达到更为高效的肿瘤杀伤能力。专利CN110144325A，一种靶向性T淋巴细胞及其制备方法和应用，提供了一种靶向性T淋巴细胞，包括靶向DR5的嵌合抗原受体CARDR5和/或靶向c Met的嵌合抗原受体CAR c Met，CAR DR5可以专一性的靶向DR5，CAR c Met可以专一性的靶向c Met，从而促进T细胞在患者体内的扩增，高效且特异性的杀伤肿瘤细胞，并且能够有效的抑制肿瘤细胞逃逸的发生，更好的维持细胞的活力和杀伤力。

趋化因子***对于免疫细胞的迁移起着至关重要的作用。例如，T细胞向***的归巢、造血干细胞在骨髓中的驻留等过程都需要趋化因子***的参与。趋化因子不仅与免疫细胞的迁移有关，还参与肿瘤细胞的增殖、转移等过程。肿瘤细胞往往分泌大量的趋化因子促进其增殖和转移。关于趋化因子提高T细胞靶向性的研究相对较少，目前公开的文献有“Enhanced tumor trafficking of GD2 chimeric antigen receptor T cells byexpression of the chemokine receptor CCR2b,J Immunother,2010”，“T lymphocytescoexpressing CCR4 and a chimeric antigen receptor targeting CD30 haveimproved homing and antitumor activity in a Hodgkin tumor model，Blood,2009”，“CXCR1- or CXCR2-modified CAR-T cells co-opt IL-8 for maximal antitumorefficacy in solid tumors，Nat Commun，2019”，CAR-T细胞共表达CCR4或CCR2b或CXCR2有利于向表达CCL17/CCL22或CCL2或CXCL8的肿瘤细胞渗入，然而上述研究适用的实体瘤种类局限，缺乏对趋化因子家族和实体瘤关系的***性研究，同时趋化因子是否在肿瘤中过表达缺乏临床数据的支持。此外，鉴于细胞因子的多样性以及细胞信号传导途径的复杂性，不同的趋化因子在不同的肿瘤中所起的作用也可能并不相同，理论分析往往和实际研究结果差距较大。

发明内容

本发明提供了基因修饰的免疫细胞，旨在增强经修饰的免疫细胞在实体瘤处聚集的方法，是为了解决经修饰的免疫细胞如CAR-T细胞在实体瘤杀伤活性较低的缺陷。

本发明是通过如下技术方案来实现的：

第一方面，本发明提供了修饰的免疫细胞，所述免疫细胞包括嵌合抗原受体CAR和趋化因子受体CCR6；

进一步地，所述免疫细胞表达嵌合抗原受体CAR，并且过表达趋化因子受体CCR6；

其中，免疫细胞为T细胞，NK细胞，NKT细胞，巨噬细胞；优选T细胞；

可选地，所述趋化因子受体CCR6是过表达的；

可选地，将目的基因转入到免疫细胞进行表达得到嵌合抗原受体CAR和趋化因子受体CCR6；

可选地，将目的基因转入到免疫细胞的方式包括慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、普通质粒载体、附加体载体、纳米递送***、电转导、转座子和其它能够实现目的基因进入免疫细胞的递送***；优选地，所述病毒为慢病毒，例如FUW、CSII-EF-MCS或pCDH等本领域常规的慢病毒。

优选地，所述趋化因子***为CCL20-CCR6。

在本发明中，过表达趋化因子受体CCR6的CAR-T细胞的细胞因子分泌不受影响。

在本发明中，过表达趋化因子受体CCR6的CAR-T细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤能力不受影响。

在本发明中，过表达趋化因子受体CCR6的CAR-T细胞明显向分泌CCL20的肿瘤内迁移。

在本发明中，所述CAR包含前导序列，识别抗原的scFv，铰链区和跨膜结构域，胞内共刺激信号，胞内激活信号。

任选地，前导序列来源于GM-CSF，CD3,CD4,CD8。

任选地，铰链和跨膜区来源与CD28,CD3,CD4,CD8,IgG。

优选地，胞内共刺激信号来源于CD28,CD134,CD137(4-1BB),ICOS,NKG2D。

第二方面，本发明提供了所述免疫细胞在治疗相关疾病的药物中应用；

进一步地，所述药物为细胞治疗相关的药物；

所述相关疾病为肿瘤，优选实体肿瘤；

可选地，所述实体肿瘤过表达CCL20；

优选地，宫颈鳞癌和腺癌，结肠癌，食管癌，多形成性胶质细胞瘤，头颈鳞状细胞癌，肾透明细胞癌，肝细胞癌，肺腺癌，肺鳞癌，卵巢癌，胰腺癌，直肠癌，胃癌和子宫内膜癌；

更优选地，肺腺癌和肺鳞癌；

第三方面，本发明提供了一种表达***，其由表达CAR的载体和表达CCR6的载体组成；优选地，所述载体为慢病毒载体。

第四方面，本发明还提供了一种获得所述免疫细胞的方法，包括：

将CAR的编码基因和CCR6的编码基因分别***到采用EF-1α启动子的慢病毒表达质粒中，得到CAR重组质粒和CCR6重组质粒；

分别对所述重组质粒进行包装，得到第一慢病毒载体和第二慢病毒载体，

将两种慢病毒载体按顺序或者共转染免疫细胞，分离。

将CAR的编码基因和CCR6的编码基因通过2A序列或IRES序列串联，再将串联序列***到慢病毒表达质粒中，得到CAR-2A-CCR6和CCR6-2A-CAR或CAR-IRES-CCR6和CCR6-IRES-CAR。

分别对所述串联质粒进行包装，得到慢病毒载体，

将慢病毒载体染免疫细胞，分离。

第五方面，本发明还提供了嵌合抗原受体的构建和表达。

在一些实施方案中，将CAR的编码基因、CCR6的编码基因、CAR-2A-CCR6编码基因、CCR6-2A-CAR、CAR-IRES-CCR和CCR6-IRES-CAR编码基因的编码基因人工合成，并在序列的前端加入XbaI酶切位点，序列的末端加入FseI酶切位点。

在一些实施方案中，使用XbaI和FseI酶切慢病毒表达质粒和目的合成基因。

在一些实施方案中，使用T4连接酶酶切后的慢病毒表达质粒和目的合成基因。

在一些实施方案中，T细胞的培养体系添加100 UI/mL的IL-2或10 ng/mL的IL7/IL15组合或含有其它有利于T细胞培养的因子。

在一些实施方案中，所述CAR包含前导序列，识别抗原的scFv，铰链和跨膜结构域，胞内共刺激信号，胞内激活信号。

任选地，

所述CAR的前导序列的核苷酸序列来自序列SEQ ID NO：1。

所述CAR的靶向肿瘤相关抗原EGFR的scFv核苷酸序列来自序列SEQ ID NO:2。

所述CAR的铰链和跨膜结构域的核苷酸序列来自序列SEQ ID NO:3。

所述CAR的胞内共刺激信号CD28的核苷酸序列来自序列SEQ ID NO:4。

所述CAR的胞内激活信号CD3ζ的核苷酸序列来自序列SEQ ID NO:5。

所述CAR的前导序列的氨基酸序列来自序列SEQ ID NO：6。

所述CAR的靶向EGFR的scFv氨基酸序列来自序列SEQ ID NO:7。

所述CAR的铰链和跨膜结构域的氨基酸序列来自序列SEQ ID NO:8。

所述CAR的胞内共刺激信号CD28的氨基酸序列来自序列SEQ ID NO:9。

所述CAR的胞内激活信号CD3ζ的氨基酸序列来自序列SEQ ID NO:10。

可选地，胞内的共刺激信号来源于CD28,CD134,CD137,ICOS。

优选地，所述趋化因子受体CCR6的核苷酸序列来自序列SEQ ID NO:11；氨基酸序列来自序列SEQ ID NO:12。

在其他实施方案中，所述肿瘤相关抗原还可选自AFP、 BMCA、CEA、CA-125、CA19-9、CA72-4、CD116、CD117、CD171、CD123、 CD16、CD19、CD20、CD22、CD30、CD61、CD64、CD70、CD71、CD78、CD96、 CLL1、CD133、CD138、Her2、GD2、gp36、GPC3、GnTV、EGFRvIII、 EpCAM、PSA、PSMA、PAP、NY-ESO-1、LAGA-1a、cMET、P53、Prostein、 PCTA-1、MAGE、ROR1、FAP、NKG2D、EMA、ETA、GFAP、MSA、MART-1、NSE、TAG-72、IL13Rα2、NKR-2、ROR1、VEGFR2、VEGFR、CLD18、EphA2、alpha-folateR、CAIX、MG7、LMP1、PD-L1、MUC1、间皮素、导管上皮粘蛋白、鞘糖脂、肿瘤基质抗原、内皮因子、钙网膜蛋白、酪氨酸酶、胎盘碱性磷酸酶、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子1、异常ras蛋白、TPSA、FPSA、EB病毒抗原、EBNA、人HPV抗原E6和E7、端粒酶、HBV、gp100、MAGEA3、MAGEA4、纤维连接蛋白的额外结构域A（EDA）和额外结构域B(EDB)、ELF2M、嗜中性粒细胞蛋白弹性酶、胰岛素生长因子（IGF1）-1、IGF-II和IGFI受体。

与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

本发明***的比较了趋化因子CCL20和实体肿瘤的关系，并采用肺癌临床病例和人肺癌细胞系进行了验证。

本发明修饰的CAR-T细胞显著的促进了CAR-T细胞在实体肿瘤的聚集，解决了CAR-T细胞不能有效的接触实体肿瘤的劣势，并且促进了CAR-T细胞对实体肿瘤的浸润，进一步增强CAR-T细胞的抗肿瘤活性，使得CAR-T细胞治疗技术能够应用于治疗实体瘤，克服了现有技术中CAR-T对实体瘤治疗效果较差的技术缺陷。

本发明修饰的CCR6+CAR-T细胞可以适用于多种实体肿瘤，具有更广泛的适用性，双质粒***更加方便的将CCR6和靶向不同抗原的CAR组合，更好的扩展CCR6+CAR-T的适用范围。

本发明修饰的CCR6+CAR-T细胞适用的实体肿瘤包括多种恶行程度和危害性较高的肿瘤，包括肺癌、肝癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肾癌、胰腺癌、乳腺癌、***癌等主要脏器肿瘤。

本发明修饰的CCR6+CAR-T细胞不仅可以消灭肿瘤的原发灶，利用趋化因子***还可以更好的追踪杀伤CCL20高表达的肿瘤转移灶。

本发明修饰的CCR6+CAR-T细胞的细胞因子分泌能力以及对肿瘤细胞的特异性杀伤能力不受影响；但是增强了向分泌CCL20实体瘤的归巢和聚集的能力，延长患者生存时间。

附图说明

图1 生物信息学分析TCGA数据库中肿瘤组织和癌旁正常组织中CCL20的mRNA表达水平，CCL20在多种实体瘤的肿瘤组织中高表达。

图2 ELISA检测肺癌病人肿瘤组织和癌旁正常组织的CCL20的分泌水平，CCL20在大部分肺癌病人的肿瘤组织中呈现高表达状态。

图3 ELISA检测人肺癌细胞系CCL20的分泌水平，正常人肺上皮细胞BEAS-2B几乎不分泌CCL20，H23、A549和CCL20过表达细胞系A549/CCL20分泌高水平的CCL20。

图4 CCL20对应的趋化因子受体CCR6在肺癌病人的T细胞中（静息状态和激活状态）表达水平较低，尤其在杀伤细胞CD8 T细胞中。

图5 CCR6和EGFRCAR慢病毒颗粒感染T细胞，并通过流式细胞术分析其感染效率，CCR6+EGFRCAR共同感染的T细胞比例为23%。

图6 过表达CCR6并不影响CAR-T细胞IL-2及IFN-γ等细胞因子分泌。

图7 过表达CCR6并不影响CAR-T细胞对体外共培养的靶肿瘤细胞的特异性杀伤效果。

图8 过表达CCR6的Jurkat T细胞显著的向含有CCL20的肿瘤细胞培养基迁移。

图9 过表达CCR6+CAR的Jurkat T细胞显著的在肿瘤细胞（黄色圆圈）处聚集。

图10 相同的输注剂量下，与传统的CAR-T细胞相比，CCR6+CAR T细胞拥有更好的抗肿瘤效果，荷瘤小鼠的肿瘤大小显著变小。

图11 CCR6+CAR T输注治疗的小鼠肿瘤中，检测出更多的肿瘤浸润T细胞，表明CCR6促使CAR-T细胞更多的在肿瘤细胞处聚集并进入到肿瘤内部。

图12 与传统的CAR-T输注治疗相比，CCR6+CAR T输注治疗显著延长了荷瘤小鼠的生存时间。

具体实施方式

本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

生物信息学筛选实体肿瘤中高表达的趋化因子。

肿瘤基因组图谱计划（The Cancer Genome Altas, TCGA）由美国NCI发起，旨在通过高通量测序技术加深人类对癌症分子机制的理解。TCGA是全球著名的癌症数据库，包含33种癌症类型，11000多个临床样本。通过GEPIA网站分析工具筛选TCGA中趋化因子CCL20在各种肿瘤中的表达水平，如图1所示，CCL20在宫颈鳞癌和腺癌，结肠癌，食管癌，多形成性胶质细胞瘤，头颈鳞状细胞癌，肾透明细胞癌，肝细胞癌，肺腺癌，肺鳞癌，卵巢癌，胰腺癌，直肠癌，胃癌，子宫内膜癌，子宫肉瘤中呈现过表达水平。

收集肺癌病人的肿瘤组织和癌旁组织，使用预冷的PBS冲洗肿瘤组织后称重，将肿瘤组织剪碎，按照肺癌组织：PBS=0.1 g:10 mL的比例冰上充分研磨，5000 g 4℃离心10min后取上清分装备用，按照ELISA试剂盒说明书进行后续操作检测CCL20的分泌水平，如图2所示CCL20在大多数病人的肿瘤组织中呈现过表达的状态。随后，进一步检测人肺癌细胞系的CCL20分泌水平。以4×10⁵的密度接种肿瘤细胞于培养皿中，24h后收集培养基上清，按照说明书检测CCL20的分泌水平，如图3所示，CCL20在肺癌细胞系A549, H23和CCL20过表达细胞系A549/CCL20中的分泌水平较高。

同时，通过流式细胞术检测CCL20的对应受体CCR6在T细胞中的表达情况，淋巴细胞分离液分离富集肺癌病人外周血PBMC，收集静息和CD3/CD28 beads激活的T细胞，随后加入CD4，CD8和CCR6流式抗体4℃避光染色20min，PBS清洗1次后转移至流式细胞管中，BD公司的Aria流式细胞仪检测。如图4所示，CCR6在CD4 T细胞和CD8 T细胞中均表达较低，尤其在CD8 T细胞中。因此，我们尝试通过在T细胞中过表达CCR6以验证是否可以增强T细胞在实体瘤的归巢和聚集，进而提高杀伤效果。

实施例2

表达***的构建。

表达***由表达CAR的载体和表达CCR6的载体组成；CAR依次包含前导序列，识别抗原的scFv，铰链和跨膜结构域，胞内共刺激信号，胞内激活信号CD3ζ；载体为慢病毒载体FUW(参见Chimeric antigen receptor T (CAR-T) cells expanded with IL-7/IL-15mediate superior antitumor effects, Protein&Cell，June 2019)。

将CAR的编码基因、CCR6的编码基因进行人工合成，并在序列的前端加入XbaI酶切位点，序列的末端加入FseI酶切位点，连入克隆质粒中；使用XbaI和FseI酶切慢病毒表达质粒和含有目的基因的克隆质粒,随后进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收线性化的慢病毒表达质粒和目的基因片段；使用T4连接酶连接切胶回收的慢病毒表达质粒和目的基因，并转化至DH5α菌株中，涂于氨苄抗性的LB固体平板中培养过夜；挑取菌板上的单克隆菌落，接种于氨苄抗性的LB液体培养基中过夜培养12-14小时，随后小量提取质粒并进行酶切验证，分别得到正确连接的CAR重组质粒和CCR6重组质粒。

将CAR重组质粒和CCR6重组质粒进行无内毒素的大量提取，并分别和psPAX2和pMD2.G病毒包装质粒按照10：9：6的比例通过磷酸钙转染至病毒包装细胞293T中，48 h后收集含有病毒颗粒的培养基上清，0.45μm的滤器过滤培养基上清并转移至超速离心管中，通过低温超速离心（20000 rpm，2 h，4℃）浓缩病毒颗粒得到第一慢病毒载体和第二慢病毒载体，随后将两种慢病毒载体共转染免疫细胞。

所述CAR的前导序列的核苷酸序列来自序列SEQ ID NO：1。

所述CAR的胞内激活信号CD3ζ的核苷酸序列来自序列SEQ ID NO:5。

所述CAR的前导序列的氨基酸序列来自序列SEQ ID NO：6。

所述CAR的靶向EGFR的scFv氨基酸序列来自序列SEQ ID NO:7。

所述CCR6的核苷酸序列来自序列SEQ ID NO:11，氨基酸序列选自序列SEQ ID NO:12。

实施例3

健康人外周血T细胞的分离培养及感染。

采取健康人的外周血，通过密度梯度离心的方法分离得到单个核细胞，随后使用美天旎公司的T细胞富集试剂盒进行T细胞的富集，接种于Lonza的X-VIVO 15培养基中并添加100 UI/mL IL-2，随后按说明书加入赛默飞公司的CD3/CD28 Dynabeads进行T细胞的激活扩增。

待T细胞激活36 h后，以肺腺癌的靶标EGFR和CCL20-CCR6***为例，以感染复数为10的比例加入靶向EGFR的CAR和趋化因子受体CCR6的慢病毒颗粒进行感染。1周后，流式细胞仪检测T细胞的感染效率，如图5所示，T细胞成功的感染了CAR和CCR6，并且CAR和CCR6双阳的T细胞比例达到了23%。

实施例4

过表达CCR6不影响CAR-T细胞的因子分泌和细胞杀伤能力

将不同组的2×10⁵T细胞和2×10⁵肿瘤细胞共孵育24 h，随后离心收集上清后，按照赛默飞公司的IL-2和IFN-gama ELISA试剂盒说明书进行后续操作。如图6所示，过表达CCR6并不影响CAR-T细胞的细胞因子分泌能力。随后，我们采用基于荧光素酶的细胞杀伤测定。首先，分别使用GFP-luc病毒颗粒感染靶向肿瘤细胞，得到H1975/luc，H23/luc，A549/luc和A549-CCL20/luc。然后，将不同组的T细胞和肿瘤细胞按照效靶比10：1进行共孵育24 h，随后加入荧光素底物测定荧光素值以计算细胞的杀伤。不加T细胞的肿瘤细胞孔为参照，相比与参照孔，降低的荧光值比例即为杀伤效率，公式为：杀伤百分比=（参照孔荧光值-目的孔荧光值）÷参照孔×100%。如图7所示，CCR6的过表达并不影响CAR-T细胞的杀伤功能。

实施例5

过表达CCR6促使Jurkat T细胞向分泌CCL20的肿瘤细胞迁移

为了验证趋化因子***引导CAR-T细胞向肿瘤聚集的可行性，我们首先在Jurkat T细胞系中过表达CCR6和EGFRCAR，随后接种各组细胞于transwell小室中，如图8所示，过表达CCR6的Jurkat细胞明显迁移向含有CCL20的肿瘤培养基上清。随后，接种1×10⁶A549/CCL20细胞于小鼠背部皮下，10天后尾静脉输注感染CCR6和CAR病毒的Jurkat/luc细胞，随后与24h, 48 h和120 h检测皮下肿瘤处的荧光强度。如图9所示，相比于EGFR CAR Jurkat细胞，EGFR CAR+CCR6 Jurkat细胞明显的在皮下肿瘤处聚集。

实施例6

过表达CCR6的CAR T细胞更有效的杀伤了肿瘤细胞，并延长了荷瘤小鼠的生存时间。

为了进一步验证添加趋化因子受体CAR-T细胞的体内抗肿瘤活性，接种2×10⁵H23/luc细胞于小鼠背部皮下，7天后尾静脉输注梯度剂量（1×10⁷，3×10⁶，1×10⁶）的CAR T和CCR6+CAR T细胞，随后小动物成像仪检测荧光素强度来检测肿瘤细胞的大小。结果表明，相同输注剂量的条件下，CCR6+CAR T治疗组与传统CAR-T组相比具有更好的治疗效果（图10），并且CCR6促进了CAR-T细胞浸润入肿瘤内部（图11），发挥更好的抗肿瘤效果，并显著延长了荷瘤小鼠的生存时间（图12）。

以上列举的仅是本发明的最佳具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国科学院动物研究所

<120> 修饰的免疫细胞及其应用

<130> 1

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 66

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60

atccca 66

<210> 2

<211> 1362

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gatattctgc tgacccagag cccggtgatt ctgagcgtga gcccgggcga acgcgtgagc 60

tttagctgcc gcgcgagcca gagcattggc accaacattc attggtatca gcagcgcacc 120

aacggcagcc cgcgcctgct gattaaatat gcgagcgaaa gcattagcgg cattccgagc 180

cgctttagcg gcagcggcag cggcaccgat tttaccctga gcattaacag cgtggaaagc 240

gaagatattg cggattatta ttgccagcag aacaacaact ggccgaccac ctttggcgcg 300

ggcaccaaac tggaactgaa acgcaccgtg gcggcgccga gcgtgtttat ttttccgccg 360

agcgatgaac agctgaaaag cggcaccgcg agcgtggtgt gcctgctgaa caacttttat 420

ccgcgcgaag cgaaagtgca gtggaaagtg gataacgcgc tgcagagcgg caacagccag 480

gaaagcgtga ccgaacagga tagcaaagat agcacctata gcctgagcag caccctgacc 540

ctgagcaaag cggattatga aaaacataaa gtgtatgcgt gcgaagtgac ccatcagggc 600

ctgagcagcc cggtgaccaa aagctttaac cgcggcgcgg gctccacctc tggatccggc 660

aagcccggat ctggcgaggg atccaccaag ggccaggtgc agctgaaaca gagcggcccg 720

ggcctggtgc agccgagcca gagcctgagc attacctgca ccgtgagcgg ctttagcctg 780

accaactatg gcgtgcattg ggtgcgccag agcccgggca aaggcctgga atggctgggc 840

gtgatttgga gcggcggcaa caccgattat aacaccccgt ttaccagccg cctgagcatt 900

aacaaagata acagcaaaag ccaggtgttt tttaaaatga acagcctgca gagcaacgat 960

accgcgattt attattgcgc gcgcgcgctg acctattatg attatgaatt tgcgtattgg 1020

ggccagggca ccctggtgac cgtgagcgcg gcgagcacca aaggcccgag cgtgtttccg 1080

ctggcgccga gcagcaaaag caccagcggc ggcaccgcgg cgctgggctg cctggtgaaa 1140

gattattttc cggaaccggt gaccgtgagc tggaacagcg gcgcgctgac cagcggcgtg 1200

catacctttc cggcggtgct gcagagcagc ggcctgtata gcctgagcag cgtggtgacc 1260

gtgccgagca gcagcctggg cacccagacc tatatttgca acgtgaacca taaaccgagc 1320

aacaccaaag tggataaacg cgtggaaccg aaaagcgcgg cc 1362

<210> 3

<211> 204

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcaattgaag ttatgtatcc tcctccttac ctagacaatg agaagagcaa tggaaccatt 60

atccatgtga aagggaaaca cctttgtcca agtcccctat ttcccggacc ttctaagccc 120

ttttgggtgc tggtggtggt tgggggagtc ctggcttgct atagcttgct agtaacagtg 180

gcctttatta ttttctgggt gagg 204

<210> 4

<211> 120

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agtaagagga gcaggctcct gcacagtgac tacatgaaca tgactccccg ccgccccggg 60

cccacccgca agcattacca gccctatgcc ccaccacgcg acttcgcagc ctatcgctcc 120

<210> 5

<211> 339

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgctaa 339

<210> 6

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro

20

<210> 7

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu

1 5 10 15

Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile Lys

35 40 45

Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser Glu

65 70 75 80

Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Ala Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly

210 215 220

Glu Gly Ser Thr Lys Gly Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly

225 230 235 240

Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly

245 250 255

Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly

260 265 270

Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp

275 280 285

Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser

290 295 300

Lys Ser Gln Val Phe Phe Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr

305 310 315 320

Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe

325 330 335

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr

340 345 350

Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser

355 360 365

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu

370 375 380

Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His

385 390 395 400

Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

405 410 415

Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys

420 425 430

Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu

435 440 445

Pro Lys Ser Ala Ala

450

<210> 8

<211> 68

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Ala Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser

1 5 10 15

Asn Gly Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro

20 25 30

Leu Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly

35 40 45

Gly Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile

50 55 60

Phe Trp Val Arg

65

<210> 9

<211> 40

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro

1 5 10 15

Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro

20 25 30

Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser

35 40

<210> 10

<211> 112

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly

1 5 10 15

Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr

20 25 30

Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys

35 40 45

Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys

50 55 60

Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg

65 70 75 80

Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala

85 90 95

Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

100 105 110

<210> 11

<211> 1125

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

atgagcgggg aatcaatgaa tttcagcgat gttttcgact ccagtgaaga ttattttgtg 60

tcagtcaata cttcatatta ctcagttgat tctgagatgt tactgtgctc cttgcaggag 120

gtcaggcagt tctccaggct atttgtaccg attgcctact ccttgatctg tgtctttggc 180

ctcctgggga atattctggt ggtgatcacc tttgcttttt ataagaaggc caggtctatg 240

acagacgtct atctcttgaa catggccatt gcagacatcc tctttgttct tactctccca 300

ttctgggcag tgagtcatgc caccggtgcg tgggttttca gcaatgccac gtgcaagttg 360

ctaaaaggca tctatgccat caactttaac tgcgggatgc tgctcctgac ttgcattagc 420

atggaccggt acatcgccat tgtacaggcg actaagtcat tccggctccg atccagaaca 480

ctaccgcgca gcaaaatcat ctgccttgtt gtgtgggggc tgtcagtcat catctccagc 540

tcaacttttg tcttcaacca aaaatacaac acccaaggca gcgatgtctg tgaacccaag 600

taccagactg tctcggagcc catcaggtgg aagctgctga tgttggggct tgagctactc 660

tttggtttct ttatcccttt gatgttcatg atattttgtt acacgttcat tgtcaaaacc 720

ttggtgcaag ctcagaattc taaaaggcac aaagccatcc gtgtaatcat agctgtggtg 780

cttgtgtttc tggcttgtca gattcctcat aacatggtcc tgcttgtgac ggctgcaaat 840

ttgggtaaaa tgaaccgatc ctgccagagc gaaaagctaa ttggctatac gaaaactgtc 900

acagaagtcc tggctttcct gcactgctgc ctgaaccctg tgctctacgc ttttattggg 960

cagaagttca gaaactactt tctgaagatc ttgaaggacc tgtggtgtgt gagaaggaag 1020

tacaagtcct caggcttctc ctgtgccggg aggtactcag aaaacatttc tcggcagacc 1080

agtgagaccg cagataacga caatgcgtcg tccttcacta tgtga 1125

<210> 12

<211> 374

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Met Ser Gly Glu Ser Met Asn Phe Ser Asp Val Phe Asp Ser Ser Glu

1 5 10 15

Asp Tyr Phe Val Ser Val Asn Thr Ser Tyr Tyr Ser Val Asp Ser Glu

20 25 30

Met Leu Leu Cys Ser Leu Gln Glu Val Arg Gln Phe Ser Arg Leu Phe

35 40 45

Val Pro Ile Ala Tyr Ser Leu Ile Cys Val Phe Gly Leu Leu Gly Asn

50 55 60

Ile Leu Val Val Ile Thr Phe Ala Phe Tyr Lys Lys Ala Arg Ser Met

65 70 75 80

Thr Asp Val Tyr Leu Leu Asn Met Ala Ile Ala Asp Ile Leu Phe Val

85 90 95

Leu Thr Leu Pro Phe Trp Ala Val Ser His Ala Thr Gly Ala Trp Val

100 105 110

Phe Ser Asn Ala Thr Cys Lys Leu Leu Lys Gly Ile Tyr Ala Ile Asn

115 120 125

Phe Asn Cys Gly Met Leu Leu Leu Thr Cys Ile Ser Met Asp Arg Tyr

130 135 140

Ile Ala Ile Val Gln Ala Thr Lys Ser Phe Arg Leu Arg Ser Arg Thr

145 150 155 160

Leu Pro Arg Ser Lys Ile Ile Cys Leu Val Val Trp Gly Leu Ser Val

165 170 175

Ile Ile Ser Ser Ser Thr Phe Val Phe Asn Gln Lys Tyr Asn Thr Gln

180 185 190

Gly Ser Asp Val Cys Glu Pro Lys Tyr Gln Thr Val Ser Glu Pro Ile

195 200 205

Arg Trp Lys Leu Leu Met Leu Gly Leu Glu Leu Leu Phe Gly Phe Phe

210 215 220

Ile Pro Leu Met Phe Met Ile Phe Cys Tyr Thr Phe Ile Val Lys Thr

225 230 235 240

Leu Val Gln Ala Gln Asn Ser Lys Arg His Lys Ala Ile Arg Val Ile

245 250 255

Ile Ala Val Val Leu Val Phe Leu Ala Cys Gln Ile Pro His Asn Met

260 265 270

Val Leu Leu Val Thr Ala Ala Asn Leu Gly Lys Met Asn Arg Ser Cys

275 280 285

Gln Ser Glu Lys Leu Ile Gly Tyr Thr Lys Thr Val Thr Glu Val Leu

290 295 300

Ala Phe Leu His Cys Cys Leu Asn Pro Val Leu Tyr Ala Phe Ile Gly

305 310 315 320

Gln Lys Phe Arg Asn Tyr Phe Leu Lys Ile Leu Lys Asp Leu Trp Cys

325 330 335

Val Arg Arg Lys Tyr Lys Ser Ser Gly Phe Ser Cys Ala Gly Arg Tyr

340 345 350

Ser Glu Asn Ile Ser Arg Gln Thr Ser Glu Thr Ala Asp Asn Asp Asn

355 360 365

Ala Ser Ser Phe Thr Met

370

Claims

1.修饰的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞表达嵌合抗原受体，并且过表达趋化因子受体CCR6。

2.根据权利要求1所述的修饰的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞未经修饰之前不表达或低表达趋化因子受体CCR6。

3.根据权利要求1-2任其一所述的修饰的免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞为T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞和其它肿瘤杀伤细胞。

4.根据权利要求3所述的免疫细胞，其特征在于，所述T细胞为嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）、T细胞受体T细胞（TCR-T）和肿瘤浸润T细胞（TIL）。

5.根据权利要求1-2任其一所述的免疫细胞，其特征在于，将目的基因转入到所述免疫细胞进行表达嵌合抗原受体和趋化因子受体CCR6。

6.根据权利要求5所述的免疫细胞，其特征在于，所述转入方式为：慢病毒、逆转录病毒、普通质粒载体、附加体载体、纳米递送***、电转导、转座子和其它递送***。

7.根据权利要求1或2或4或6所述的免疫细胞，其特征在于，与未修饰的免疫细胞相比较，所述免疫细胞具有至少a）-e）中的一项性能，

a）细胞因子分泌能力不受影响；

b）对肿瘤细胞的特异性杀伤能力不受影响；

c）增强向分泌CCL20实体瘤的归巢和聚集的能力；

d）增强在CCL20实体瘤的浸润；以及

e）延长患者生存时间的能力。

8.根据权利要求1或2或4或6所述的免疫细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含前导序列，识别肿瘤相关抗原的scFv，铰链区和跨膜结构域，胞内共刺激信号以及胞内激活信号CD3ζ。

9.根据权利要求8所述的免疫细胞，其特征在于，所述的肿瘤相关抗原包括AFP、 BMCA、CEA、CA-125、CA19-9、CA72-4、CD116、CD117、CD171、CD123、 CD16、CD19、CD20、CD22、CD30、CD61、CD64、CD70、CD71、CD78、CD96、 CLL1、CD133、CD138、Her2、GD2、gp36、GPC3、GnTV、EGFR、EGFRvIII、 EpCAM、PSA、PSMA、PAP、NY-ESO-1、LAGA-1a、cMET、P53、Prostein、 PCTA-1、MAGE、ROR1、FAP、NKG2D、EMA、ETA、GFAP、MSA、MART-1、NSE、TAG-72、IL13Rα2、NKR-2、ROR1、VEGFR2、VEGFR、CLD18、EphA2、alpha-folateR、CAIX、MG7、LMP1、PD-L1、MUC1、间皮素、导管上皮粘蛋白、鞘糖脂、肿瘤基质抗原、内皮因子、钙网膜蛋白、酪氨酸酶、胎盘碱性磷酸酶、甲状腺球蛋白、甲状腺转录因子1、异常ras蛋白、TPSA、FPSA、EB病毒抗原、EBNA、人HPV抗原E6和E7、端粒酶、HBV、gp100、MAGEA3、MAGEA4、纤维连接蛋白的额外结构域A（EDA）和额外结构域B(EDB)、ELF2M、嗜中性粒细胞蛋白弹性酶、胰岛素生长因子（IGF1）-1、IGF-II和IGFI受体。

10.根据权利要求9所述的免疫细胞，其特征在于，所述scFv选自单克隆抗体、嵌合单克隆抗体、人源化单克隆抗体、人抗体、纳米抗体以及合成抗体。

11.根据权利要求8所述的免疫细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含前导序列，识别EGFR的scFv，CD28或CD8铰链区和跨膜结构域，CD28或CD137 (4-1BB)共刺激结构域，以及胞内激活信号CD3ζ。

12.权利要求1-11任其一所述免疫细胞在制备***的药物中应用。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于，所述肿瘤选自实体肿瘤，所述实体肿瘤过表达CCL20。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述实体肿瘤选自宫颈鳞癌，***，结肠癌，食管癌，多形成性胶质细胞瘤，头颈鳞状细胞癌，肾透明细胞癌，肝细胞癌，肺腺癌，肺鳞癌，卵巢癌，胰腺癌，直肠癌，胃癌以及子宫内膜癌。

15.一种基因表达***，其特征在于，所述基因表达***包括由表达嵌合抗原受体的第一载体和表达CCR6的第二载体组成；或者包括共表达嵌合抗原受体和CCR6的载体。

16.一种修饰免疫细胞的方法，包括：

将权利要求15所述的基因表达***转染免疫细胞；

任选地，体外培养细胞进行扩增。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，所述免疫细胞为T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞和其它肿瘤杀伤细胞。