CN113248619A - 一种双靶向嵌合抗原受体、编码基因及重组表达载体 - Google Patents

一种双靶向嵌合抗原受体、编码基因及重组表达载体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种双靶向嵌合抗原受体，包括依次串联连接的双抗原结合区、第一铰链区、嵌合抗原受体T细胞激活域和蛋白共表达自剪切域，所述双抗原结合区包括以串联方式连接的MSLN、MUC1单链抗体的重链VH和轻链VL、及连接MSLN、MUC1单链抗体的第二铰链区。本发明的双靶向CAR‑T细胞能杀伤表达双抗原的肿瘤细胞，使杀伤更为精准高效，同时降低或避免了“脱靶效应”的发生，降低了非特异杀伤的副作用，增强了抗肿瘤功效。

Description

一种双靶向嵌合抗原受体、编码基因及重组表达载体
技术领域
本发明涉及肿瘤免疫治疗技术领域，特别是涉及一种用于恶性肿瘤免疫治疗的双靶向嵌合抗原受体、编码基因、重组表达载体及其应用。
背景技术
胰腺癌是一种恶性程度高，诊断和治疗都很困难的消化道恶性肿瘤，约90％为起源于腺管上皮的导管腺癌。胰腺癌早期的确诊率低，治愈率极低，是预后最差的恶性肿瘤之一，5年生存率＜1％。导致死亡的主要原因是胰腺癌引起的转移性疾病，肿瘤的浸润和转移是一个连续的的过程，由黏附分子介导，通过蛋白酶使细胞外基质降解和血管生成。胰腺癌可发生于胰腺的头、体、尾部或累及整个胰腺，但以胰头部最多，约占胰腺癌的60％-70％，发生于胰体者次之，尾部最少见。肉眼下肿瘤呈圆形或卵圆形，边界弥漫浸润于临近胰腺组织难以分辨。胰腺癌的治疗是众所周知的难题，它召集人体的天然免疫***在肿瘤周围建造一个坚固的物理屏障，使杀死肿瘤细胞的免疫细胞不能穿透屏障。而且，胰腺癌肿瘤组织可以在相当匮乏的供血下生存，因此，传统化疗(血液循环给药)很难进入癌肿瘤内部。
嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR))疗法，是指通过基因修饰技术，将带有特异性抗原识别结构域及T细胞激活信号的遗传物质转入T细胞，使T细胞直接与肿瘤细胞表面的特异性抗原相结合而被激活。T细胞被激活后，一方面通过释放穿孔素、颗粒酶素B等直接杀死肿瘤细胞；另一方面通过释放细胞因子，募集人体内源性免疫细胞来杀死肿瘤细胞，以达到***的目的。同时，还可形成免疫记忆T细胞，从而获得特异性的抗肿瘤长效机制。
近年来，CAR-T细胞在B细胞恶性血液***肿瘤治疗中取得了惊人的突破。例如，在临床应用中，CAR-T细胞对CD19阳性的难治复发白血病细胞的靶向杀伤作用及高缓解率(80-90％)的临床疗效。这一事实不仅再次证实了免疫细胞治疗的临床价值，同时也激发了学者对于实体肿瘤相关抗原和CAR-T细胞技术的拓展热情。但CAR-T细胞在治疗B-淋巴细胞白血病等几种类型的血液肿瘤方面也存在一些局限性，比如目前一个嵌合抗原受体只能识别一种抗原靶标，但肿瘤细胞是个复杂的群体，含有相应抗原的肿瘤细胞被清除以后，不含相应抗原的肿瘤细胞会迅速增殖，一段时间后导致肿瘤复发。
间皮素(MSLN，MSLN)是由体腔中的间皮细胞所产生，一种细胞表面糖基化磷脂酰肌醇连接的糖蛋白，分子量为40kDa。几乎所有的胰腺癌组织都过量产生间皮素，而在正常组织中少量表达。
美国Fred Hutchinson癌症研究中心研究发现，间皮素可作为CAR-T细胞的设计靶点，识别并攻击胰腺癌细胞，该研究表明接受识别非癌蛋白的T细胞治疗的动物在它们检测到胰腺癌后平均生存54天，接受CAR(间皮素)-T细胞治疗的动物平均生存96天，即在胰腺癌晚期可延长78％的生存期。
粘蛋白，是一类主要由黏多糖组成的糖蛋白，常见于膝盖滑膜液。粘蛋白是高分子量、重糖基化的蛋白，对正常的上皮起润滑和保护作用，同时还介导信号传导和细胞黏附功能，免疫活化和抑制作用等。粘蛋白-1(MUC1)在正常的细胞表面并不存在，而在很多类型的实体瘤和白血病的癌细胞表面上大量存在。
研究认为，MUC1的异常表达与胰腺癌密切相关，在胰腺癌的发生、发展中发挥重要作用，可以作为胰腺癌早期诊断的分子标志之一，并有望成为药物治疗胰腺癌的特异靶点。
但目前，尚未出现以MUC1作为胰腺癌的靶点，用于嵌合抗原受体疗法在体内应用，更不存在将MSLN和MUC1相结合，以进一步提高胰腺癌的治疗效果的相关应用。
发明内容
为了解决目前单嵌合抗原受体治疗胰腺癌效果受限的问题，本发明的目的是提供一种用于胰腺癌免疫治疗的双靶向嵌合抗原受体、编码该双靶向嵌合抗原受体的基因、包含该双靶向嵌合抗原受体的重组表达载体及其应用。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种双靶向嵌合抗原受体，包括依次串联连接的双抗原结合区、第一铰链区、嵌合抗原受体T细胞激活域和蛋白共表达自剪切域，所述双抗原结合区包括以串联方式连接的MSLN、MUC1单链抗体的重链VH和轻链VL、及连接MSLN、MUC1单链抗体的第二铰链区。
其中，所述双靶向嵌合抗原受体还包括信号肽或肿瘤穿透肽iRGD。
其中，信号肽或肿瘤穿透肽iRGD，可以位于双靶向嵌合抗原受体的任意位置。
其中，所述信号肽或肿瘤穿透肽iRGD与双抗原结合区相连接，且位于远离第一铰链区的一端。
其中，所述双靶向嵌合抗原受体还包括趋化因子域。
其中，所述趋化因子域可以位于双靶向嵌合抗原受体的任意位置。
其中，所述趋化因子域与蛋白共表达自剪切域相连接，且位于远离嵌合抗原受体T细胞激活域的一端，所述趋化因子域的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示。
其中，所述双靶向嵌合抗原受体还包括肿瘤穿透肽iRGD，肿瘤穿透肽iRGD位于双靶向嵌合抗原受体的任意位置。
肿瘤穿透肽iRGD可以位于双抗原结合区的前端，用于替代信号肽使用，也可以位于蛋白共表达自剪切域的末端，用于替代趋化因子域使用；也可以位于双靶向嵌合抗原受体的其他位置，肿瘤穿透肽iRGD的加入，便于CAR-T细胞浸润肿瘤细胞。信号肽用于将表达的双靶向嵌合抗原受体定位于细胞膜，或者使得双靶向嵌合抗原受体激活的T细胞穿透肿瘤外膜到达肿瘤内部；肿瘤穿透肽iRGD是一个由9个氨基酸残基组成的特异性肽段，一般包含三个部分：血管靶向序列，Gend R基序和蛋白酶识别位点，肿瘤穿透肽iRGD具有血管靶向RGD的功能，可与多种肿瘤细胞及肿瘤血管内皮细胞高表达的整合素受体ανβ3、ανβ5特异性结合，肿瘤穿透肽的加入，使得CAR-T细胞便于浸润肿瘤细胞，提高抗肿瘤效果。双抗原结合区用于识别相应靶抗原；第一铰链区用于将双靶向嵌合抗原受体固定于细胞膜上；嵌合抗原受体T细胞激活域用于刺激T淋巴细胞体外激活和进入体内杀伤肿瘤细胞；蛋白共表达自剪切域，用于在生成整条mRNA后，经过翻译后的蛋白前体自剪切表达成两个独立的蛋白。趋化因子域，用于趋化T细胞浸润肿瘤组织，介导肿瘤免疫，同时抑制肿瘤内免疫抑制因子的释放，间接促进免疫细胞抗原提呈作用，并抑制血管形成，最终抑制肿瘤的生长。
双抗原结合区包括以串联方式连接的MSLN、MUC1单链抗体的重链VH和轻链VL、及连接MSLN、MUC1单链抗体的第二铰链区，此处的第二铰链区包括用于连接MSLN单链抗体的重链VH和轻链VL、MUC1单链抗体的重链VH和轻链VL的抗体内铰链区，及用于连接MSLN、MUC1单链抗体的抗体间铰链区，抗体内铰链区和抗体间铰链区的氨基酸序列不完全相同。
优选地，MUC1单链抗体置于MSLN单链抗体的前端。
其中，所述MSLN单链抗体的重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述MSLN单链抗体的轻链VL的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述MUC1单链抗体选自TnMUC1单链抗体,TnMUC1单链抗体的重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述TnMUC1单链抗体的轻链VL氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述第二铰链区的氨基酸序列为(G4S)n，其中n为大于等于1的正整数。
其中，所述MSLN单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.28或SEQ ID NO.29所示。
其中，抗体内铰链区的氨基酸序列为(G4S)3，抗体间铰链区的氨基酸序列为(G4S)5。
其中，所述肿瘤穿透肽iRGD的氨基酸序列如SEQ ID NO.31所示。
其中，所述的第一铰链区包括CD8Hinge嵌合受体铰链区和CD8 transmembrane嵌合受体跨膜区，所述CD8Hinge嵌合受体铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述CD8transmembrane嵌合受体跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
其中，所述嵌合抗原受体T细胞激活域包括CD28激活域、CD137激活域和CD3ζ激活域。
其中，所述嵌合抗原受体T细胞激活域包括CD28激活域、OX40激活域和CD3ζ激活域。
其中，CD28激活域的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，CD137激活域的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，CD3ζ激活域的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；OX40激活域的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
其中，所述蛋白共表达自剪切域选自T2A、E2A、F2A、P2A或IRES。
T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；E2A的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；F2A的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；P2A的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；编码IRES的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
本发明的第二方面，提供一种编码上述的双靶向嵌合抗原受体的基因。
本发明的第三方面，提供包含上述的双靶向嵌合抗原受体的重组表达载体，还包括表达载体。
其中，所述的表达载体为慢病毒表达载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体或类腺病毒载体。
本发明的第四方面，提供一种双靶向嵌合抗原受体T细胞，在基因组内导入上述的重组表达载体或经上述的双靶向嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞。
本发明的第五方面，提供一种试剂盒，包括上述的双靶向嵌合抗原受体T细胞。
本发明的第六方面，提供上述的双靶向嵌合抗原受体T细胞在制备恶性肿瘤治疗药物中的应用。
其中，所述恶性肿瘤为胰腺癌、肺癌或乳腺癌。
与现有技术相比，本发明实现的有益效果：本发明的双靶向CAR-T细胞能杀伤表达双抗原的肿瘤细胞，使杀伤更为精准高效，同时降低或避免了“脱靶效应”的发生，降低了非特异杀伤的副作用，增强了抗肿瘤功效。双靶向CAR-TnMUC1-MSLN-T细胞具有重要的序贯耐受作用，能有效地解决阴性复发的问题；双靶向的CAR-T细胞能提高药物精准度，降低治疗副作用，为患者带来更好的治疗效果。
附图说明
以下结合附图和具体实施方式来进一步详细说明本发明：
图1为双靶点CAR-T预测的空间结构图，其中A为CAR-TnMUC1-MSLN-T预测图，B为CAR-MSLN-TnMUC1-T预测图；
图2为各种嵌合抗原受体的元件顺序示意图；其中A为包括Luc单链抗体的嵌合抗原受体；B为包括TnMUC1单链抗体的嵌合抗原受体；C为包括MSLN单链抗体的嵌合抗原受体；D为同时包括TnMUC1单链抗体和MSLN单链抗体的嵌合抗原受体，且TnMUC1单链抗体靠近信号肽；E为同时包括TnMUC1单链抗体和MSLN单链抗体的嵌合抗原受体，且MSLN单链抗体靠近信号肽，其中Leader指代信号肽；
图3为不同CAR-T细胞的酶切琼脂糖凝胶电泳图；
图4为不同的双靶向CAR-T细胞对ASPC-1细胞的杀伤效果图；
图5为AsPC-1细胞经不同的双靶向CAR-T细胞处理后的流式检测AsPC-1细胞比例图；
图6为荷瘤小鼠经不同的CAR-T细胞处理后肿瘤体积变化情况。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
现在治疗胰腺癌的突出问题在于CAR-T细胞很难浸润到肿瘤组织内部。申请号201710418911.X公开了将PDL1和PSCA作为双靶点用于抗肿瘤治疗，但201710418911.X中仅公开了体外细胞数据而没有动物体内的相关数据，且PDL1仅为多种肿瘤的靶点而非胰腺癌的特异靶点，且目前尚无PDL1和PSCA双靶点用于抗肿瘤治疗的体内报道，本领域技术人员并不明确PDL1和PSCA双靶点在体内治疗胰腺癌的具体效果，双靶向CAR-T用于治疗胰腺癌处于不断摸索阶段。
本申请的发明人经过长期的摸索，意外地发现，将MSLN、MUC1相结合作为双靶向CAR-T来治疗胰腺癌相对于单独CAR-MSLN-T、CAR-MUC1-T，具有突出的治疗胰腺癌的效果。
TnMUC1是在MUC1氨基酸序列相关位点糖基化后的产物，糖基化后的抗原抗体亲和力增强。本申请采用TnMUC1与MSLN相结合作为双靶向CAR-T用于胰腺癌的治疗。
但MSLN与TnMUC1的结合顺序及结合方式，对治疗胰腺癌的效果影响明显。通过Phyre2和RaptorX的资源预测CAR结构中蛋白质结构，对不同的靶点进行多靶点的组合，预测靶点构效关系、分析和优化，发现CAR-TnMUC1-MSLN-T串联形式相对于CAR-MSLN-TnMUC1-T串联形式，效果更佳优异，而TnMUC1与MSLN并联形式对应的治疗效果甚至低于CAR-MSLN-T+CAR-TnMUC-T混合后的效果。预测CAR-TnMUC1-MSLN-T、CAR-MSLN-TnMUC1-T的空间结构如图1，其中A为CAR-TnMUC1-MSLN-T预测图，B为CAR-MSLN-TnMUC1-T预测图。A明显保持了传统的抗体结构，先靶点TnMUC1再连接MSLN靶点的scFv，其融合蛋白空间结构充分暴露在T细胞表面，更有利于与肿瘤的相应抗原结合；而纵观B，在先靶点MSLN再连接TnMUC1靶点的scFv，充分暴露在T细胞表面的只有与MSLN相结合的MSLN的scFv，并且连接在CAR结构的C末端TnMUC1靶点scFv破坏了传统的抗体结构，且结构紧密，不利于抗体抗原的结合。而MSLN与TnMUC1采取IRES等间隔序列变成并列的CAR结果，根据相关分析，其效果还不如单一靶点的CAR-T细胞混合后的治疗效果。
以下实施例中的材料来源说明如下：
1.慢病毒表达载体pLenti6.2/V5-GW/lacZ，慢病毒包装质粒PL1、PL2和PLPVSVG均购自Invitrogen；
2.4DNA ligase，限制性核酸内切酶BamH1和Xho1购自NEB；
3.感受态Stable 3细胞购自Invitrogen公司；
4.胶回收试剂盒，质粒小提试剂盒购自QIAGEN有限公司；
5.293T细胞购自ATCC细胞库；
6.FBS、DMEM、1640培养、PBS、Opti-MEM，Iipofectamine 2000购自ThermoFisher,Invitrogen；
7.ProFlex PCR仪购自ABI；
8.NanouDrop超微量板购自ThermoFisher；
9.Eppendorf 5418R台式冷冻离心机购自Eppendorf；Fresco微量离心机；超速离心机Optima购自贝克曼库尔特Optima；
10.电泳液，快转液，胶水平电泳槽、凝胶成像仪购自BioRad；Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra Cell小型电泳***购自Bio-Rad；
11.生物安全柜、CO2直热式细胞培养箱、双开门4度冰箱购自Thermo Fisher；
12.移液器、电动助吸器购自Eppendorf；
13.显微镜购自奥林巴斯；
14.注射器，0.45μm滤膜、各规格的培养皿，培养瓶，多孔培养板，各种规格离心管购自Corning；
15.Access RT-PCR System试剂盒(A1250)购自Promega公司；
16.AMV/Tfl与Tfl DNA Polymase分别购自Promega公司。
实施例1构建重组表达载体
一、质粒提取
1、LB液体培养基的配制方法：电子天平称取5g液体培养基干粉于500mL锥形瓶，加100mL纯水，锡箱纸封口后，于高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，冷却至40℃～50℃时，以1000:1加入0.2％氨苄青霉素，小心混匀后，储存条件为4度。
2、LB固体培养基的配制方法：电子天平称取5g固体培养基干粉于500mL锥形瓶，加IOOmL超纯水，锡箱纸封口后，于高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，冷却至40℃～50℃时，以1000:1加入0.2％氨苄青霉素，小心混匀后，倒板，凝固后，贴封口膜储存于4℃。
3、从-80℃冰箱分别取出甘油菌，甘油菌含有pLenti6.2/V5-GW/lacZ，慢病毒包装质粒pLP1,pLP2,和pLPVSVG质粒,分别取5μL接种于5mL LB液体培养基(AMP抗性)中，各取8管,分别做好标记,于恒温摇床振荡培养12～16h，条件为37℃,220rmp。
4、质粒小提试剂盒QIAGEN Plasmid Kits购自QIAGEN公司，按其说明书进行质粒提取。具体操作如下：以下Pl、p2、p3、pw均属于上述试剂盒里面的试剂。
(1)取5mL过夜培养的菌液，加入离心管，12000rpm，离心10min，尽量吸除上清(多次离心将菌体沉淀收集到一个离心管中)；
(2)向菌体沉淀的离心管中加入250μL溶液Pl，悬浮混匀沉淀，如果有未彻底混匀的菌块，会影响裂解，导致提取量和纯度偏低；
(3)加入250μL溶液P2,温和的上下翻转6-8次，使菌体充***解。(温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。此时菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体过多，裂解不彻底，应减少菌体量)；
(4)向离心管中加入350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm，离心l0min，此时在离心管底部形成沉淀。(P3加入后应立即混合，避免产生局部沉淀。如果上清中还有微小白色沉淀，可再次离心后取上清)；
(5)将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱中(吸附柱放入收集管中),注意尽量不要吸出沉淀。12000pm，离心60s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放入收集管中；
(6)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW，12000rpm，离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中，重复一次；
(7)将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm，离心2min，将吸附柱中残余的漂洗液去除，并置于室温放置2min，以彻底晾干残余；
(8)将吸附柱置于一个干净的离心管中，向吸附膜中间滴加60μL Free H20,室温放置2min，12000rpm，离心2min，将质粒收集到离心管中，分别得到慢病毒表达质粒pLenti6.2/V5-GW/lacZ，慢病毒包装质粒pLP1,pLP2,和pLPVSVG质粒。Nanodrop检测产物浓度并写好标签，保存于-20℃备用。
二、酶切、连接、转化
1、载体酶切
慢病毒骨架载体用相应的内切酶进行酶切；pLenti6.2/V5-GW/lacZ用BamHl和Xhol酶切线性化后，胶回收大片段的质粒骨架。
慢病毒骨架载体酶切体系(30μL)
慢病毒骨架载体 4μL
内切酶BamHl 1μL
内切酶Xhol 1μL
10×CutSmart buffer 3μL
ddH2O 21μL
Total 30μL
2、琼脂糖凝胶电泳
慢病毒表达质粒pLenti6.2/V5-GW/lacZ酶切产物需要0.8％的琼脂糖凝胶：称取琼脂糖0.16g于100mL锥形瓶中，加入20mL 1X TAE中，微波炉加热溶解，待冷却至50℃～60℃时，加入2μL的EB核酸染料，摇勾，倒入到已插好梳子凝胶板中，凝固备用。待胶冷却凝固后，在质粒酶切产物中按照终体积加入6X Loading buffer，吹打混匀，依次加入上样孔中。放入电泳槽，90V，30min，用凝胶成像仪观察并将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)放入干净的离心管中，称取重量备用。
3、胶回收
用QIAGEN公司的QIAquick Gel Extraction Kit琼脂糖凝胶回收试剂盒说明书进行胶回收，具体操作步骤如下：
(1)切胶，不要切太大；
(2)加入3倍体积的QC(比如100mg胶加入300μL QC)；
(3)50℃孵育10mins左右，直到胶块完全溶解，期间每隔2mins左右，上下颠倒混匀一下。如果颜色变成橘黄色或者紫色，加入10μL 3M醋酸钠，调整缓冲体系；
(4)加入1倍体积异丙醇，混匀；
(5)转移到柱子上，13000rpm 1min，弃滤液；
(6)加入500μL QC 13000rpm 1min，弃滤液；
(7)加入750μL PE，静置2-5mins，13000rpm 1min.空转2mins，除尽残余液体；
(8)柱子放入新的1.5mL离心管中；
(9)加入50μL EB buffer，静置4min，13000rpm 1min,可以重复洗脱；
(10)用Nanodrop检测浓度：载体酶切后回收浓度是13ng/μL，存放于-20度备用。
4、RT-PCR扩增
合成A-E对应的基因序列(5μg),以此为模板，进行PCR扩增，PCR扩增中涉及的第一引物序列如SEQ ID NO.7所示，第二引物序列如SEQ ID NO.8所示，其中Leader的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示，Luc单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.30所示。
A：Leader-Luc-CD8-CD28-CD137-CD3ζ-T2A-CCL19；
B：Leader- TnMUC1VH-(G4S)3-TnMUC1VLscFv-CD8-CD28-CD137-CD3ζ-T2ACCL19；
C:Leader-MSLNVH-(G4S)3-MSLNVLscFv-CD8-CD28-CD137-CD3ζ-T2A-CCL19；
D：Leader-TnMUC1VH-(G4S)3-TnMUC1VLscFv-(G4S)5-MSLNVH-(G4S)3-MSLNVLscFv-CD8-CD28-CD137-CD3ζ-T2A-CCL19；
E：Leader-MSLNVH-(G4S)3-MSLNVLscFv-(G4S)5-TnMUC1VH-(G4S)3-TnMUC1VLscFv-CD8-CD28-CD137-CD3ζ-T2A-CCL19。
反应程序：98℃，30s；98℃，10s；55℃，30s；72℃，2min；35cycles；72℃，5min；4℃，4h
反应体系：50μL
DNA(模板) 1μL
第一引物 1μL
第二引物 1μL
AMV/Tfl 5×Reaction Buffe 10μL
Tfl DNA Polymase,5μ/μl 0.5μL
dNTP(原液) 1μL
ddH2O 34.5μL
Total 50μL
dNTP中包含等比例的dATP、dCTP、dGTP和dTTP。
将PCR扩增好的外源片段分别跑胶、挖胶回收并纯化。
5、连接
连接体系(10μL)
Figure BDA0002381808700000091
Figure BDA0002381808700000101
高通量分子克隆试剂为上海帝鹤思医疗科技有限公司生产Cat No：A-MC-0001或购自宝日医生物技术(北京)有限公司。
在50℃下连接1-2h，产物于-20℃下冻存备用。
6.连接产物钙转至大肠杆菌感受态(Stable3)中：
连接产物钙转转化具体步骤：
1)从-80℃冰箱中取出Stable 3感受态(每管50μL)，置于冰上解冻，待感受态溶化后，取4.5μL连接产物加入到感受态中，小心轻柔混合均匀，置于冰上20-30min；
2)42℃水浴锅热激1min，迅速置于冰上2min(勿动)；
3)每管加入200μL LB复苏液，放入37℃恒温摇床复苏50-60min；
4)取复苏的菌液涂平板，置于37℃恒温培养箱中过夜培养(16-18h)；
7、从培养皿中挑取单克隆进行菌落PCR扩增，PCR扩增所涉及的引物为上述的第一引物和第二引物。
菌落PCR体系：20μL
DNA(模板) 4μL
第一引物(10μM) 0.5μL
第二引物(10μM) 0.5μL
2×Taq Mix 10μL
ddH<sub>2</sub>O 5μL
Total 20μL
反应程序：
94℃，2min；94℃，30s；58℃，30s；72℃，1min；30cycles；72℃，1min；12℃，
2min；
8、跑胶检测，找阳性克隆，取5μL送测序：对测序结果进行序列比对；序列比对无误，质粒扩繁后保存。
实施例2重组表达载体的包装
采用四质粒包装***进行慢病毒包装。四质粒分别为含有CAR结构的慢病毒表达质粒pLenti6.2 TnMUC1-MSLN CAR等，慢病毒包装质粒pLP1,pLP2和pVSVG；细胞为293T细胞。
具体实施步骤如下：
1)转染前24h内进行铺板:一般选择传代次数在3代以内的细胞，根据细胞生长密度和状态调整细胞密度，10cm皿中生长状态良好，生长密度达到80％的293T细胞吸弃废液；
2)向其中缓慢贴壁加入3mLPBS以洗涤细胞；
3)吸弃废液后，缓慢贴壁加入1mL胰酶，于恒温培养箱中消化2min；
4)向消化好的细胞中加入3mL的DMEM完全培养基(10％FBS)以终止消化，并转入15mL离心管中800rpm离心3min；
5)弃去上清，向细胞沉淀中加5mL DMEM完全培养基(10％FBS)重悬细胞，缓慢吹打混匀；
6)取5个10cm皿，并加5mL DMEM完全培养基(10％FBS)；
7)向每个10cm皿中加入1mL细胞悬液，小心混匀，使细胞需完全贴壁且贴壁均匀；
8)待生长密度达80％，细胞状态良好，即可进行病毒包装；
9)根据转染细胞数量，按如下比例配置每个6cm皿所需的三质粒混合液各CAR重组表达质粒
pLenti6.2 TnMUC1-MSLN CAR 6μg
慢病毒包装质粒
pLP1 6μg
pLP2 6μg
pVSVG 6μg
按照各质粒浓度确定需要加入的剂量。本次需加入的剂量如下：
向质粒混合液中加入1mL Opti-MEM，室温静置5min；
10)另需配置Lipofectamine 2000(4℃保存)混合液，想1mL opti-MEM转染培养液加入60μL Lipofectamine 2000，室温静置5min；
11)将以上⑼和(10)混于一管中，室温静止20min；
12)将已铺好的293T细胞取出，吸弃废液，并小心贴壁加入5mLDMEM培养基，防止细胞漂浮；
13)将(11)中的混合液小心滴入(12)中的细胞中，防止细胞漂浮，混匀后，继续培养4h；
14)将(13)的细胞换新鲜培养液10ml后继续培养48h；
15)收集48h后培养上清，收集3次病毒上清，通过0.45μm滤膜过滤备用；
实施例3重组表达载体的浓缩
l)5X PEG8000NaCl配制：称取NaC1 8766g；PEG8000 50g溶解在200mLMilli-Q纯水中；121℃，湿热灭菌30min，保存在4℃；
2)每30mL过滤后的病毒初始液，加入5X PEG8000NaCl母液7.5mL；
3)每20～30min混合一次，共进行3-5次；
4)4℃放置过夜；
5)4℃，4000g，离心20min；
6)吸弃上清，静置管子1～2min，吸走残余液体；
7)每30mL过滤后的病毒初始液，加入300μLPBS溶解慢病毒沉淀；
8)收集后的病毒悬液分装成50μL每份，保存在成品管中。用碎干冰速冻后储存在-80℃备用(避免浓缩病毒液反复冻融)；
9)也可超速离心机浓缩(注意清洗平台离心管及管盖)，病毒溶于1xPBS或无血清培养基(一个10cm皿病毒溶40-50ul)，检测病毒浓缩液有无污染。
实施例4重组表达载体的滴度测定
1)取生长状态良好的293T细胞，消化后计数，按2x 105细胞/孔将细胞均匀铺至24孔细胞培养板，培养6～10h至细胞贴壁；
2)向24孔板中细胞培养上清中加入不同浓度的浓缩病毒液，轻轻拍打24孔板边缘，使病毒液与培养液混合均匀，于培养箱中感染48h；
3)感染48h后，消化并收集细胞，流式细胞术检测阳性细胞百分比，并根据以下公式计算病毒滴度，单位为TU/mL:T＝(铺板时细胞数*阳性细胞百分比*1000)/加入的病毒液体积(μL)，测得病毒的滴度在108量级。
实施例5 CAR-T细胞的构建
1.PBMC分离
1)用含有肝素的真空采血管收集约6mL人外周新鲜血液；
2)稀释:室温下加入等体积的PBS，轻轻吹打混匀；
3)加样:取50mL离心管，吸取6mL Ficoll(淋巴细胞分离液)于离心管中，(Ficoll与稀释前血液的体积比为1:1)，管倾斜45，将稀释后的血液在癋icoll液面上方约1cm处沿管壁缓慢加至Ficoll上面；
4)离心：18-20癈，2000rpm，30min，离心后从管底至液面分四层，依次为红细胞和粒细胞层、分层液层、单个核细胞层、血浆层；
5)回收:将移液管直接***单个核细胞层(或者先吸去上层的血浆)，轻轻吸出单个核细胞层，放入新的离心管中；
6)洗涤：加入至少于PBMC(外周血单个核细胞)体3倍的PBS，18-20癈，2000rpm，10min，两次；
7)利用Stemcell technologies的T细胞纯化磁珠进一步纯化PBMC细胞而得到较纯的T细胞；
8)细胞计数:弃上清，加lmLRPMI-1640培养基(含10％胎牛血清)，吹打混匀，制备成PBMC细胞悬液。采用血细胞计数板计数:取一滴PBMC悬液与一滴2％台盼蓝染液混匀后加于血细胞计数板中，在显微镜下计数4大格内细胞总数。细胞数/mL＝4个大方格细胞总数/4*104*2(稀释倍数)
2.T细胞的激活与CAR基因转导
1)调整细胞密度至1*106细胞/mL，加入细胞因子及抗体复合物(终浓度50U/mL的IL-2、用Anti-CD3、Anti-CD28抗体磁珠活化,连续培48h；
2)按照MOI＝20,计算所需要的病毒量。计算公式如下：所需病毒量(mL)＝(MO*细胞数量)/病毒滴度；
3)从-80℃冰箱取出病毒后，迅速在37℃水浴锅中融化。在六孔板中加入上述计算所得的病毒量，添加终浓度为8μg/m L的polybrene，充分混匀后，使用封口膜封住孔板，将孔板置于离心机中，800g离心60min；
4)取出孔板，将孔板置于37℃、5％CO2的培养箱中，继续培养24h；
5)250g离心l0min，去掉含有病毒的培养基上清，用新鲜培养基重悬细胞沉淀，将细胞转移至新的3.5-10cm板中，继续培养3-6天备用。
实施例6 CAR—T细胞的性能验证
将A-E对应的嵌合抗原受体分别导入T细胞，制备获得CAR-Luc -T细胞、CAR-TnMUC1-T细胞、CAR-MSLN -T细胞、CAR-MSLN- TnMUC1- T细胞、CAR-TnMUC1-MSLN- T细胞。
一、细胞总RNA的提取
1、分别取上述细胞离心去其上清，用PBS洗两次后，每孔加TRIZOL试剂1ml，摇匀，无菌罩内消化3-5min。
2、将各细胞裂解液吸到DEPC处理过的1.5ml EP管中，加新开的氯仿0.2ml，轻摇15s。
3、室温静置2-3min后，12000rpm，15min，4℃，离心。然后取上清无色水相(约0.6ml)到EP管(DEPC处理过)，加0.5ml新开的异丙醇，室温下静置10min。
4、12000rpm，10min，4℃，离心。观察总RNA在管底的白色沉淀，弃去上清，75％乙醇1.0ml洗涤(用DEPC水新配制)后，7500rpm，5min，4℃离心。
5、去上清，点离，用小Tip吸干液体。气干沉淀5-10min，DEPC处理水20-30μl加入，用枪打匀，55-60℃水浴10min溶解总RNA，测OD值。
二、从总RNA中分离mRNA(Oligotex mRNA Mini Kit,Cat.no.:70022,QIAGEN)
1、取上述提取的总RNA若干(少于0.25mg)到一个新的无RNase的EP管中，用无RNase的水定容到250μl。
2、加入Buffer OBB 250μl,Oligotex Suspension 15μl。用Tip打匀或用手弹匀。
3、70℃水浴，3min(裂解RNA的二级结构)。
4、20-30℃条件下，静置10min(让Oligotex与mRNA结合)。
5、高速离心2min，小心吸走上清(该上清要保留)，留下约50μl的上清在原管里。
6、用Buffer OW2 400μl重悬含Oligotex/mRNA复合物的沉淀，然后将这些加到套有1.5ml EP管的SPIN柱子上，高速离心1min。
7、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加Buffer OW2 400μl到柱子，高速离心1min，丢掉滤过液。
8、将SPIN柱子移到一个新的EP管上，加20-100μl热的(70℃)Buffer OEB到柱子上，用Tip来回吸打3-4次，高速离心1min。
9、为保证最大的mRNA产量，可再次重复第8步。用NanoDrop检测其纯度和浓度。
三、RT-PCR
引物的配制：
1.将所合成的目的基因和β-actin上下游引物(1OD)，其中β-actin上游引物序列如SEQ ID NO.19所示，β-actin下游引物序列如SEQ ID NO.20所示，用0.1％DEPC水溶解。
2.根据各个引物分子量的不同，计算加0.1％DEPC水的量。
3.前面合成目的基因和β-actin上下游引物分别加入适量的0.1％DEPC水，使其终浓度均为20pmol/μl，其中Muc1上游引物序列如SEQ ID NO.21所示，Muc1下游引物序列如SEQ ID NO.22所示，MSLN上游引物序列如SEQ ID NO.23所示，MSLN下游引物序列如SEQ IDNO.24所示，CCL19上游引物序列如SEQ ID NO.25所示，CCL19下游引物序列如SEQ ID NO.26所示。
4.于-20℃冰箱中冻存，备用。
RT－PCR反应体系(25ul)：
无酶水14.4μl
AMV Buff 5μl
dNTP 0.5μl
目的基因上游引物0.75μl
目的基因下游引物0.75μl
β-actin上游引物0.75μl
β-actin下游引物0.75μl
MgSO4 0.8μl
Tfl DNA Poly 0.5μl
RNA 0.8μl
将上述各成分混匀并覆盖石蜡油20μl，标注号码后放入基因扩增仪内。
(七)RT-PCR产物电泳分析
RT-PCR扩增的条件与参数：48℃，45min，94℃，2min；94℃30s，58℃60s，68℃2min共循环相应次数；循环完毕后68℃延伸7min。扩增产物进行电泳或-20度冻存。
取RT-PCR扩增后的产物各6μL与1μL上样缓冲液混合后上样于2％琼脂糖凝胶，同时以0.8μL Ladder点样，以0.5×TBE为缓冲液电泳。
75mv电泳至溴酚蓝位于琼脂糖凝胶的2/3后，紫外灯下观察，扫描、拍照并进行图像分析，结果如图3，其中control 1、control 2为空白对照组。
由图3可知，CAR-TnMUC1 scFv、CAR-MSLN scFv、CAR-MSLN- TnMUC1 scFv、CAR-TnMUC1-MSLN scFv在CAR-T细胞中均相应地表达，表明各CAR-T细胞构建成功。
实施例7显微成像检测
1)接种AsPC-1细胞并培养6小时；
2)将CAR-MSLN-TnMUC1 T细胞、CAR- TnMUC1-MSLN T细胞与AsPC-1细胞分别按照30:1的比例共培育20小时；
3)利用显微镜成像***检测拍照，结果如图4所示。
如图4可知，CAR- TnMUC1-MSLN-T细胞相对于CAR-MSLN-TnMUC1-T细胞，处理后的AsPC-1细胞明显状态较差。
实施例8流式细胞检测
1.用HBSS将CFSE母液2000倍稀释，配制成CFSE染色工作液。
2.将培养好的AsPC-1靶细胞消化后收集，用PBS洗涤2次。(400g离心5分钟)
3.将待测细胞用CFSE染色工作液重悬，至细胞浓度大约107/ml。
4.在37℃培养箱中避光孵育15-20分钟。
5.加10倍体积的含血清培养基，400g离心5分钟。
6.离心后去上清，收集细胞，用HBSS或无血清培养基洗涤细胞1-2次，最后加入培养基重悬细胞。
7.在37℃培养箱中孵育20-30分钟。
8.400g离心5分钟收集上述AsPC-1细胞，
9.用500μl HBSS重悬细胞，加入10μl PI染色液，混匀。
10.在2-8℃避光孵育5-15分钟。
11.在400g离心5分钟收集细胞。
12.用500μl HBSS或PBS重悬细胞。
13.取500μl细胞悬液，用流式细胞仪检测。
14.根据流式结果计算死亡细胞百分率。被杀伤死亡的靶细胞被PI染上会出现在CFSE+PI+区域，未杀伤的在CFSE+PI-区域，得出被杀伤的靶细胞的比例。用这个比例再计算毒性，结果如图5。
如图5可知，体外供孵育细胞杀伤实验流式细胞检测表明，CAR-TnMUC1-MSLN-T细胞杀伤作用明显强于CAR-MSLN-TnMUC1-T细胞。
实施例9 CAR-T细胞的小鼠体内靶杀伤效果检测
AsPC-1细胞株，购自ATCC。NSG小鼠：6周龄，雌雄不限，体重在15±2g的小鼠30只(Jackson Laboratories)，随机分成6组，分别是阴性CAR-Luc-T对照组(control)，CAR-TnMUC1- T组(TnMUC1 CAR-T)，CAR-MSLN- T组(Mesothelin CAR-T)，CAR-TnMUC1-T+ CAR-MSLN-T组(Mesothelin+ TnMUC1 CAR-T)，CAR-TnMUC1-MSLN- T组(TnMUC1-mesothelinCAR-T)和CAR-MSLN-TnMUC1- T组(mesothelin-TnMUC1CAR-T)，在SPF动物房中，喂养，在无菌条件下，腋下注射100μlPBS，包含50％的Matrigel(基质膜)的1x106AsPC-1细胞，当肿瘤长至200mm3后将CAR-TnMUC1-T组，CAR-MSLN-T组，CAR-TnMUC1-T+CAR-MSLN-T组，CAR-TnMUC1-MSLN- T组和CAR-MSLN-TnMUC1- T组分别尾静脉注射2*106的CAR-TnMUC1- T、CAR-MSLN-T、CAR-TnMUC1- T+ CAR-MSLN-T、CAR-TnMUC1-MSLN- T、CAR-MSLN-TnMUC1- T细胞，每天或隔天测量肿瘤的长(a)、宽(b)，以V＝1/2ab2计算肿瘤的体积，实验结果如图6。
由图6可知，随着静脉注射CAR- T细胞时间的延长，control组中肿瘤的体积随之快速增加，至注射40天时(总喂养时间为60天)，肿瘤体积已超过600mm3；TnMUC1 CAR-T组、Mesothelin CAR-T组、Mesothelin+ TnMUC1 CAR-T组随着静脉注射时间延长，肿瘤体积增长随之变缓，至注射40天时(总喂养时间为60天)，肿瘤体积接近400mm3；而TnMUC1-mesothelin CAR-T、mesothelin-TnMUC1 CAR-T组在注射的前20天(总喂养时间为40天)，肿瘤的体积不断降低至接近50mm3，继续注射CAR-T细胞，肿瘤的体积有一定程度的增加，但注射至40天时(总喂养时间为60天)，肿瘤体积仍然不超过200mm3，TnMUC1-mesothelin CAR-T组在注射至40天时的肿瘤体积接近100mm3。
比较TnMUC1-mesothelin CAR-T、mesothelin-TnMUC1 CAR-T组，mesothelin-TnMUC1CAR-T组的肿瘤体积要略高于TnMUC1-mesothelin CAR-T组。
故，小鼠体内肿瘤模型实验表明CAR-TnMUC1-MSLN-T细胞的抑制肿瘤AsPC-1作用明显强于CAR-MSLN-TnMUC1-T细胞，CAR-TnMUC1-MSLN-T细胞在一定程度上能够解决阴性复发的问题，其他组别的抑制效果不显著。
实验结果显示CAR-TnMuc1-MSLNT细胞具有小鼠体内最高的抗AsPC-1肿瘤的活性。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
序列表
<110> 上海帝鹤思医疗科技有限公司
<120> 一种双靶向嵌合抗原受体、编码基因及重组表达载体
<160> 31
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 126
<212> PRT
<213> 人工序列(未知)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Thr Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Thr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Met Ser Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Met Met Thr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ile Leu
115 120 125
<210> 2
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工序列(未知)
<400> 2
Gln Pro Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser Gly Ile Asn Val Gly Pro
20 25 30
Tyr Arg Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr
35 40 45
Leu Leu Asn Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val
50 55 60
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Val
65 70 75 80
Leu Leu Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys
85 90 95
Met Ile Trp His Ser Ser Ala Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu
100 105 110
Thr Val Leu
115
<210> 3
<211> 61
<212> PRT
<213> 人工序列(未知)
<400> 3
Met Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
1 5 10 15
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro
20 25 30
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr
35 40 45
Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly
50 55 60
<210> 4
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(未知)
<400> 4
Met Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala
1 5 10 15
Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro
20 25 30
Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly
35 40
<210> 5
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(未知)
<400> 5
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(未知)
<400> 6
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 7
<211> 60
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 7
ccatagaaga caccgactct agaggccacc atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt 60
<210> 8
<211> 44
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 8
cgcgggccct ctagactcga tcaagacaca gggctccttc tggt 44
<210> 9
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(未知)
<400> 9
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 10
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(未知)
<400> 10
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 11
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列(未知)
<400> 11
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp
50 55 60
Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg
65 70 75 80
Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr
85 90 95
Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 12
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列(未知)
<400> 12
Arg Arg Asp Gln Arg Leu Pro Pro Asp Ala His Lys Pro Pro Gly Gly
1 5 10 15
Gly Ser Phe Arg Thr Pro Ile Gln Glu Glu Gln Ala Asp Ala His Ser
20 25 30
Thr Leu Ala Lys Ile
35
<210> 13
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(未知)
<400> 13
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 14
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(未知)
<400> 14
Gln Cys Thr Asn Tyr Ala Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser
1 5 10 15
Asn Pro Gly Pro
20
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(未知)
<400> 15
Asn Phe Asp Leu Leu Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly
1 5 10 15
Pro
<210> 16
<211> 19
<212> PRT
<213> 人工序列(未知)
<400> 16
Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn
1 5 10 15
Pro Gly Pro
<210> 17
<211> 576
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 17
gcccctctcc ctcccccccc cctaacgtta ctggccgaag ccgcttggaa taaggccggt 60
gtgcgtttgt ctatatgtta ttttccacca tattgccgtc ttttggcaat gtgagggccc 120
ggaaacctgg ccctgtcttc ttgacgagca ttcctagggg tctttcccct ctcgccaaag 180
gaatgcaagg tctgttgaat gtcgtgaagg aagcagttcc tctggaagct tcttgaagac 240
aaacaacgtc tgtagcgacc ctttgcaggc agcggaaccc cccacctggc aacaggtgcc 300
tctgcggcca aaagccacgt gtataagata cacctgcaaa ggcggcacaa ccccagtgcc 360
acgttgtgag ttggatagtt gtggaaagag tcaaatggct ctcctcaagc gtattcaaca 420
aggggctgaa ggatgcccag aaggtacccc attgtatggg atctgatctg gggcctcggt 480
gcacatgctt tacatgtgtt tagtcgaggt taaaaaaacg tctaggcccc ccgaaccacg 540
gggacgtggt tttcctttga aaaacacgat gataat 576
<210> 18
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(未知)
<400> 18
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 19
ctccatcctg gcctcgctgt 20
<210> 20
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 20
gctgtcacct tcaccgttcc 20
<210> 21
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 21
gggatggtga cctcagcgcc aga 23
<210> 22
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 22
gggtccgtgt gctggagggg ctgt 24
<210> 23
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 23
gggcaagtac agctacaaca gtca 24
<210> 24
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 24
gggcaacacc gtcaattggg tt 22
<210> 25
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 25
tgaagacctt cttttcatct tagc 24
<210> 26
<211> 25
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(未知)
<400> 26
gggtgaagac cttcttttca tctta 25
<210> 27
<211> 196
<212> PRT
<213> 人工序列(未知)
<400> 27
Met Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr Ser Pro
1 5 10 15
Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys Leu Ser
20 25 30
Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe His Tyr
35 40 45
Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe Thr Thr
50 55 60
Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp Val Glu
65 70 75 80
Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys Arg Arg
85 90 95
Ser Ser Leu Ala Leu Leu Leu Ala Leu Ser Leu Leu Val Leu Trp Thr
100 105 110
Ser Pro Ala Pro Thr Leu Ser Gly Thr Asn Asp Ala Glu Asp Cys Cys
115 120 125
Leu Ser Val Thr Gln Lys Pro Ile Pro Gly Tyr Ile Val Arg Asn Phe
130 135 140
His Tyr Leu Leu Ile Lys Asp Gly Cys Arg Val Pro Ala Val Val Phe
145 150 155 160
Thr Thr Leu Arg Gly Arg Gln Leu Cys Ala Pro Pro Asp Gln Pro Trp
165 170 175
Val Glu Arg Ile Ile Gln Arg Leu Gln Arg Thr Ser Ala Lys Met Lys
180 185 190
Arg Arg Ser Ser
195
<210> 28
<211> 258
<212> PRT
<213> 人工序列(未知)
<400> 28
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Thr Pro Ser Gln
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Ile Ser Gly Asp Ser Val Ser Ser Asn
20 25 30
Ser Ala Thr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Ser Pro Ser Arg Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Leu Gly Arg Thr Tyr Tyr Arg Ser Lys Trp Tyr Asn Asp Tyr Ala
50 55 60
Val Ser Val Lys Ser Arg Met Ser Ile Asn Pro Asp Thr Ser Lys Asn
65 70 75 80
Gln Phe Ser Leu Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Val
85 90 95
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Met Met Thr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Ile Leu Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln
130 135 140
Pro Val Leu Thr Gln Ser Ser Ser Leu Ser Ala Ser Pro Gly Ala Ser
145 150 155 160
Ala Ser Leu Thr Cys Thr Leu Arg Ser Gly Ile Asn Val Gly Pro Tyr
165 170 175
Arg Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Ser Pro Pro Gln Tyr Leu
180 185 190
Leu Asn Tyr Lys Ser Asp Ser Asp Lys Gln Gln Gly Ser Gly Val Pro
195 200 205
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Lys Asp Ala Ser Ala Asn Ala Gly Val Leu
210 215 220
Leu Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Met
225 230 235 240
Ile Trp His Ser Ser Ala Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr
245 250 255
Val Leu
<210> 29
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列(未知)
<400> 29
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser Gln
20 25 30
Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Glu Lys Pro Gly Ala Ser
35 40 45
Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr
50 55 60
Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly
65 70 75 80
Leu Ile Thr Pro Tyr Asn Gly Ala Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Arg
85 90 95
Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met
100 105 110
Asp Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala
115 120 125
Arg Gly Gly Tyr Asp Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
130 135 140
Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Ser Gly Gly Gly Ser Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met
165 170 175
Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser
180 185 190
Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro
195 200 205
Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Gly
210 215 220
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser
225 230 235 240
Ser Val Glu Ala Glu Asp Asp Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser
245 250 255
Lys His Pro Leu Thr Tyr Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ala
260 265 270
Ser
<210> 30
<211> 516
<212> PRT
<213> 人工序列(未知)
<400> 30
Ala Thr Gly Gly Thr Cys Thr Thr Cys Ala Cys Ala Cys Thr Cys Gly
1 5 10 15
Ala Ala Gly Ala Thr Thr Thr Cys Gly Thr Thr Gly Gly Gly Gly Ala
20 25 30
Cys Thr Gly Gly Cys Gly Ala Cys Ala Gly Ala Cys Ala Gly Cys Cys
35 40 45
Gly Gly Cys Thr Ala Cys Ala Ala Cys Cys Thr Gly Gly Ala Cys Cys
50 55 60
Ala Ala Gly Thr Cys Cys Thr Thr Gly Ala Ala Cys Ala Gly Gly Gly
65 70 75 80
Ala Gly Gly Thr Gly Thr Gly Thr Cys Cys Ala Gly Thr Thr Thr Gly
85 90 95
Thr Thr Thr Cys Ala Gly Ala Ala Thr Cys Thr Cys Gly Gly Gly Gly
100 105 110
Thr Gly Thr Cys Cys Gly Thr Ala Ala Cys Thr Cys Cys Gly Ala Thr
115 120 125
Cys Cys Ala Ala Ala Gly Gly Ala Thr Thr Gly Thr Cys Cys Thr Gly
130 135 140
Ala Gly Cys Gly Gly Thr Gly Ala Ala Ala Ala Thr Gly Gly Gly Cys
145 150 155 160
Thr Gly Ala Ala Gly Ala Thr Cys Gly Ala Cys Ala Thr Cys Cys Ala
165 170 175
Thr Gly Thr Cys Ala Thr Cys Ala Thr Cys Cys Cys Gly Thr Ala Thr
180 185 190
Gly Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Gly Ala Gly Cys Gly Gly Cys Gly
195 200 205
Ala Cys Cys Ala Ala Ala Thr Gly Gly Gly Cys Cys Ala Gly Ala Thr
210 215 220
Cys Gly Ala Ala Ala Ala Ala Ala Thr Thr Thr Thr Thr Ala Ala Gly
225 230 235 240
Gly Thr Gly Gly Thr Gly Thr Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr Gly Gly
245 250 255
Ala Thr Gly Ala Thr Cys Ala Thr Cys Ala Cys Thr Thr Thr Ala Ala
260 265 270
Gly Gly Thr Gly Ala Thr Cys Cys Thr Gly Cys Ala Cys Thr Ala Thr
275 280 285
Gly Gly Cys Ala Cys Ala Cys Thr Gly Gly Thr Ala Ala Thr Cys Gly
290 295 300
Ala Cys Gly Gly Gly Gly Thr Thr Ala Cys Gly Cys Cys Gly Ala Ala
305 310 315 320
Cys Ala Thr Gly Ala Thr Cys Gly Ala Cys Thr Ala Thr Thr Thr Cys
325 330 335
Gly Gly Ala Cys Gly Gly Cys Cys Gly Thr Ala Thr Gly Ala Ala Gly
340 345 350
Gly Cys Ala Thr Cys Gly Cys Cys Gly Thr Gly Thr Thr Cys Gly Ala
355 360 365
Cys Gly Gly Cys Ala Ala Ala Ala Ala Gly Ala Thr Cys Ala Cys Thr
370 375 380
Gly Thr Ala Ala Cys Ala Gly Gly Gly Ala Cys Cys Cys Thr Gly Thr
385 390 395 400
Gly Gly Ala Ala Cys Gly Gly Cys Ala Ala Cys Ala Ala Ala Ala Thr
405 410 415
Thr Ala Thr Cys Gly Ala Cys Gly Ala Gly Cys Gly Cys Cys Thr Gly
420 425 430
Ala Thr Cys Ala Ala Cys Cys Cys Cys Gly Ala Cys Gly Gly Cys Thr
435 440 445
Cys Cys Cys Thr Gly Cys Thr Gly Thr Thr Cys Cys Gly Ala Gly Thr
450 455 460
Ala Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala Ala Cys Gly Gly Ala Gly Thr Gly
465 470 475 480
Ala Cys Cys Gly Gly Cys Thr Gly Gly Cys Gly Gly Cys Thr Gly Thr
485 490 495
Gly Cys Gly Ala Ala Cys Gly Cys Ala Thr Thr Cys Thr Gly Gly Cys
500 505 510
Gly Thr Ala Ala
515
<210> 31
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(未知)
<400> 31
Cys Arg Gly Asp Lys Gly Pro Asp Cys
1 5

Claims (10)

1.一种双靶向嵌合抗原受体，其特征在于，包括依次串联连接的双抗原结合区、第一铰链区、嵌合抗原受体T细胞激活域和蛋白共表达自剪切域，所述双抗原结合区包括以串联方式连接的MSLN、MUC1单链抗体的重链VH和轻链VL、及连接MSLN、MUC1单链抗体的第二铰链区。
2.如权利要求1所述的双靶向嵌合抗原受体，其特征在于，所述双靶向嵌合抗原受体还包括信号肽或肿瘤穿透肽iRGD。
3.如权利要求1或2所述的双靶向嵌合抗原受体，其特征在于，所述双靶向嵌合抗原受体还包括趋化因子域，所述趋化因子域的氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示。
4.如权利要求1所述的双靶向嵌合抗原受体，其特征在于，所述MSLN单链抗体的重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述MSLN单链抗体的轻链VL的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述MUC1单链抗体选自TnMUC1单链抗体，所述TnMUC1单链抗体的重链VH的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述TnMUC1单链抗体的轻链VL氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述第二铰链区的氨基酸序列为(G4S)n，其中n为大于等于1的正整数；所述的第一铰链区包括CD8Hinge嵌合受体铰链区和CD8 transmembrane嵌合受体跨膜区，所述CD8Hinge嵌合受体铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述CD8 transmembrane嵌合受体跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述嵌合抗原受体T细胞激活域包括CD28激活域、CD137激活域和CD3ζ激活域，所述CD28激活域的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示，CD137激活域的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，CD3ζ激活域的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
5.如权利要求1所述的双靶向嵌合抗原受体，其特征在于，所述蛋白共表达自剪切域选自T2A、E2A、F2A、P2A或IRES，所述T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；E2A的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；F2A的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示；P2A的氨基酸序列如SEQ IDNO.16所示；编码IRES的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示。
6.编码如权利要求1-5任一项所述的双靶向嵌合抗原受体的基因。
7.包含如权利要求1-5任一项所述的双靶向嵌合抗原受体的重组表达载体，其特征在于，还包括表达载体。
8.一种双靶向嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，基因组内导入权利要求7所述的重组表达载体或经权利要求1-5任一项所述的双靶向嵌合抗原受体修饰的T淋巴细胞。
9.一种试剂盒，包括权利要求8所述的双靶向嵌合抗原受体T细胞。
10.如权利要求8所述的双靶向嵌合抗原受体T细胞在制备恶性肿瘤治疗药物中的应用。
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