CN111796035A - 一种定量分析人血浆维格列汀浓度的lc-ms/ms检测方法 - Google Patents

一种定量分析人血浆维格列汀浓度的lc-ms/ms检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种定量分析人血浆维格列汀浓度的LC‑MS/MS检测方法，属于药物分析技术领域，该方法包括以下步骤：(1)样品制备：以人空白血浆作为空白基质，加入维格列汀标准工作溶液，配制8个已知的不同浓度的维格列汀标准样品；以人血浆作为空白基质，加入维格列汀标准溶液，配制低、中、高三个已知浓度的维格列汀质控样品；(2)样品处理：包括待测人血浆样品、标准样品、质控样品；(3)样品检测：步骤(2)获得的样品，取2μl自动进样，进行高效液相色谱串联质谱检测；(4)标准曲线制作和定量分析。该方法使维格列汀血药浓度的测定快速准确，前处理操作简单易行，灵敏度高，精确定量并且可以广泛适用。

Description

一种定量分析人血浆维格列汀浓度的LC-MS/MS检测方法
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，涉及一种定量分析人血浆维格列汀浓度的LC-MS/MS检测方法，具体地说，涉及一种应用高效液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术进行人血浆中维格列汀浓度的检测方法。
背景技术
维格列汀(vildagliptin)是一种具有选择性、竞争性、可逆的二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidase-4，DPP-4)抑制剂，由瑞士诺华制药有限公司研制开发,化学名为1-[[(3-羟基-1-金刚烷基)氨基]乙酰基]-2-氰基-(S)-四氢吡咯烷。2007年获得欧盟委员会批准，用于治疗2型糖尿病，其作用机理是通过与DPP-4结合形成DPP-4复合物而抑制该酶的活性，在提高胰高血糖素样肽-1(GLP-1)浓度，促使胰岛B细胞产生胰岛素的同时，降低胰高血糖素浓度，从而降低血糖，且对体重无明显影响。目前在世界上有超过132个国家使用。
国内外血浆中维格列汀浓度的检测方法主要包括高效液相色谱法(HPLC)、毛细管电泳(CE)加紫外线(UV)或(PDA)光电二极管阵列检测器、气相色谱-质谱联用法(GC/MS)、液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)。这些方法中，基于紫外检测器和DAD检测器的HPLC法和CE等方法主要用于分析药物制剂中维格列汀含量的检测，灵敏度和选择性较低[16-22]。GC/MS法在进样前需要衍生化步骤，使得分析比较繁琐和耗时。这些分析方法的另一缺点是运行时间长，没有根据国际标准进行充分验证。
发明内容
本发明的目的在于提供一种定量分析人血浆维格列汀浓度的LC-MS/MS检测方法，建立一种基于高效液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS/MS)的分析方法，对人血浆中维格列汀进行定量检测。该方法使维格列汀血药浓度的测定快速准确，前处理操作简单易行，灵敏度高，精确定量并且可以广泛适用。
其具体技术方案为：
一种定量分析人血浆维格列汀浓度的LC-MS/MS检测方法，包括以下步骤：
(1)样品制备：
a.标准样品制备：精密称取维格列汀对照品10.68mg于10ml容量瓶中，用甲醇溶液4ml和3ml分别冲洗管壁和称量纸残余至容量瓶中，混匀溶解，再加入甲醇定容，颠倒混匀，配成浓度为1.068mg/ml的维格列汀标准储备液A。用甲醇：水溶液(50：50，V/V)稀释配制维格列汀的标曲工作溶液，浓度分别为：22.25ng/ml、44.5ng/ml、89.0ng/ml、178.0ng/ml、534.0ng/ml、1186.67ng/ml、3560.0ng/ml、10680.0ng/ml。
以人空白血浆作为空白基质，加入维格列汀标准工作溶液，配制8个已知的不同浓度的维格列汀标准样品。
b.质控样品制备：精密称取维格列汀对照品10.70mg于10ml容量瓶中，用甲醇溶液4ml和3ml分别冲洗管壁和称量纸残余至容量瓶中，混匀溶解，再加入甲醇定容，颠倒混匀，配成浓度为1.070mg/ml的维格列汀标准储备液B。用甲醇：水溶液(50：50，V/V)稀释配制维格列汀的质控工作溶液，浓度分别为：44.583ng/ml、535.0ng/ml、8560.0ng/ml。
以人血浆作为空白基质，加入维格列汀标准溶液，配制低、中、高三个已知浓度的维格列汀质控样品；
(2)样品处理：包括待测人血浆样品、标准样品、质控样品，处理方法均如下：
取血浆样品100μl至2ml EP管中，加入1.0ml含3.15ng/ml内标的沉淀剂乙腈，振荡器上自动震荡5min，离心(15000r/min)10min后，吸取50μl上清液至另一干净2ml EP管中，再加入300μl 5mM甲酸铵水溶液与乙腈混合液(1：1)，振荡器上自动震荡2min，离心(15000r/min)5min后，转移上清至进样瓶。
(3)样品检测：步骤(2)获得的样品，取2μl自动进样，进行高效液相色谱串联质谱检测；
(4)标准曲线制作和定量分析：步骤(3)完成后，以维格列汀与内标峰面积的比值(Y)为纵坐标，以维格列汀在血浆样本中的浓度(X)为横坐标，采用加权最小二乘法(权重因子l/X2)进行线性回归，制作到维格列汀的标准曲线方程，再通过标准曲线定量质控样本和待测人血浆样本。
进一步，步骤(1)中，维格列汀标准样品系列浓度为1.113ng/ml、2.225ng/ml、4.45ng/ml、8.90ng/ml、26.70ng/ml、59.33ng/ml、178.0ng/ml、534.0ng/ml。
进一步，步骤(1)中，维格列汀质控样品低、中、高浓度分别为2.229ng/ml、26.75ng/ml、428.0ng/ml。
进一步，步骤(2)中，采用稳定的同位素标记物13C5-15N-维格列汀作为内标。其配制过程是：精密称取同位素13C5-15N-维格列汀对照品3.15mg于10ml容量瓶中，用甲醇溶液4ml和3ml分别冲洗管壁和称量纸残余至容量瓶中，混匀溶解，再加入甲醇定容，颠倒混匀，配成浓度为0.315mg/ml的13C5-15N-维格列汀标准储备液C。用甲醇：水溶液(50：50，V/V)稀释配制内标的工作溶液，最后使用的工作液(3.15ng/ml)则用乙腈稀释配制。
进一步，步骤(3)中分析测定血浆样品中维格列汀的浓度，采用梯度洗脱反相色谱法，流动相A为5mM甲酸铵水溶液，流动相B为乙腈，色谱柱为Hypurity C18柱(150mm×2.1mm，5μm，Thermo Hypersil)，流动相流速0.5ml/min，柱温在40℃。
再进一步，梯度洗脱程序为：0.0-0.5min，流动相B为70％，0.5-2.0min，流动相B由70％逐步升至90％，2.0-3.5min，流动相B为90％，3.5-4.0min，流动相B由90％逐步降至70％，4.0-6.0min，流动相B为70％。
进一步，步骤(3)中的质谱条件为：采用电喷雾离子源(ESI)和正离子多反应监测模式(MRM)，维格列汀及其内标的母离子/子离子对质荷比(m/z)分别为：304.3/154.2和310.3/160.3，去簇电压分别为50V和80V，碰撞能量分别为23eV和24eV，源喷射电压：5500V，源温度：500℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1.本发明使用稳定的同位素标记物13C5-15N-维格列汀作为内标，可有效校正血浆样本基质效应的影响，确保检测结果的准确性。
2.本发明采用母离子和子离子监测的MRM模式进行检测，通过对特征母离子和子离子的监测，有效降低血浆样本中复杂组分的干扰，提高方法的特异性和灵敏度。
3.本发明单个样本检测时间短，整个检测时间为6min，较高效液相色谱法明显缩短。同时使用自动进样***，可实现进样自动化和高通量检测。
4.本发明灵敏度高，使用100μl血浆，2μl自动进样的最低定量限为1.113ng/ml。
5.本发明精密度和准确度高，不同浓度质控样品的准确度在-0.23％到8.18％之间，精密度在1.62％到8.46％之间。
6.本发明样本处理提取回收率高，总体回收率为86.35％，不同浓度之间回收率的变异系数为2.85％。
7.本发明样本前处理为蛋白沉淀法，过程简单，样本用量少，100μL血浆即可，所用试剂亦为常规化学试剂。因此本发明分析成本低且便于操作。
附图说明
图1为代表性标准曲线图；
图2为空白血浆色谱图，其中，A为维格列汀，B为内标；
图3为空白血浆中加入内标物对照品色谱图，其中，A为维格列汀，B为内标；
图4为空白血浆中加入维格列汀对照品色谱，其中，A为维格列汀，B为内标；
图5为空白血浆中加入内标和维格列汀对照品色谱图，其中，A为维格列汀，B为内标；
图6为待测人血浆样本色谱图，其中，A为维格列汀，B为内标。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
1.样品制备：
a.标准样品制备：精密称取维格列汀对照品10.68mg于10ml容量瓶中，用甲醇溶液4ml和3ml分别冲洗管壁和称量纸残余至容量瓶中，混匀溶解，再加入甲醇定容，颠倒混匀，配成浓度为1.068mg/ml的维格列汀标准储备液A。用甲醇：水溶液(50：50，V/V)稀释配制维格列汀的标曲工作溶液，浓度分别为：22.25ng/ml、44.5ng/ml、89.0ng/ml、178.0ng/ml、534.0ng/ml、1186.67ng/ml、3560.0ng/ml、10680.0ng/ml。
取人血浆95μl作为空白基质，加入维格列汀标准溶液5μl，配制8个已知的不同浓度的维格列汀标准样品，浓度分别为1.113ng/ml、2.225ng/ml、4.45ng/ml、8.90ng/ml、26.70ng/ml、59.33ng/ml、178.0ng/ml、534.0ng/ml。
b.质控样品制备：精密称取维格列汀对照品10.70mg于10ml容量瓶中，用甲醇溶液4ml和3ml分别冲洗管壁和称量纸残余至容量瓶中，混匀溶解，再加入甲醇定容，颠倒混匀，配成浓度为1.070mg/ml的维格列汀标准储备液B。用甲醇：水溶液(50：50，V/V)稀释配制维格列汀的质控工作溶液，浓度分别为：44.583ng/ml、535.0ng/ml、8560.0ng/ml。
取人血浆95μl作为空白基质，加入维格列汀标准溶液5μl，配制低、中、高三个已知浓度的维格列汀质控样品，浓度分别为2.229ng/ml、26.75ng/ml、428.0ng/ml。
c.内标液制备：精密称取同位素13C5-15N-维格列汀对照品3.15mg于10ml容量瓶中，用甲醇溶液4ml和3ml分别冲洗管壁和称量纸残余至容量瓶中，混匀溶解，再加入甲醇定容，颠倒混匀，配成浓度为0.315mg/ml的13C5-15N-维格列汀标准储备液C。用甲醇：水溶液(50：50，V/V)稀释配制内标的工作溶液，最后使用的工作液(3.15ng/ml)则用乙腈稀释配制。
2.样品处理：
待测人血浆样品、标准样品、质控样品，均采用以下处理方法：
取血浆样品100μl至2ml EP管中，加入1.0ml含3.15ng/ml内标的沉淀剂乙腈，振荡器上自动震荡5min，离心(15000r/min)10min后，吸取50μl上清液至另一干净2ml EP管中，再加入300μl 5mM甲酸铵水溶液与乙腈混合液(1：1)，振荡器上自动震荡2min，离心(15000r/min)5min后，转移上清至进样瓶。
3.样品检测：步骤(2)获得的样品，取2μl自动进样，进行高效液相色谱串联质谱检测；
a.液相条件：
仪器：Nexera UHPLC/HPLC高效液相色谱仪，日本岛津公司；
流动相A：5mM甲酸铵；
流动相B：乙腈；
洗脱模式：梯度；如表1所示。
表1
时间min 0.0 0.5 2.0 3.5 4.0 6.0
B％ 70％ 70％ 90％ 90％ 70％ 70％
流速：500μL/min；
进样体积：2.0μl；
进样器温度：15℃；
色谱柱：Hypurity C18(150mm×2.1mm，5μm，Thermo Hypersil)；
柱温箱：40℃；
b.质谱条件：
仪器：Triple QuadTM6500质谱仪，美国AB SCIEX公司；
离子源：电喷雾电离源(Turbo Spray)；
检测方式：正离子；
扫描方式：MRM；
源喷射电压：5500V；
入口电压：10V；
温度：500℃；
碰撞气：9Psi；
气帘气：35Psi；
离子源气体1：55Psi；
离子源气体2：55Psi；
质荷比(m/z)及MRM参数：如表2所示。
表2
Figure BDA0002554223990000071
4.标准曲线制作和定量分析：以维格列汀与内标峰面积的比值(Y)为纵坐标，以维格列汀在血浆样本中的浓度(X)为横坐标，采用加权最小二乘法(权重因子l/X2)进行线性回归，制作到维格列汀的标准曲线方程，再通过标准曲线定量质控样本和待测人血浆样本。
方法学验证
(1)选择性
为了证明本发明方法的选择性，本发明设定了以下实验方案：(a)分别取不同个体来源的空白血浆按步骤(2)处理。(b)分别取不同个体来源的空白血浆加入内标工作溶液，按步骤(2)处理。(c)分别取不同个体来源的空白血浆，加入维格列汀溶液，按步骤(2)处理。(d)分别取不同个体来源的空白血浆，加入维格列汀和内标溶液，按步骤(2)处理。(e)取受试者用药1小时后的血浆样品，按步骤(2)处理。
按照上述步骤(3)的测定方法，对上述实验样品进行测定，结果如图2-图6所示，在空白血浆的色谱图中，在待测物和内标的保留时间处，未见峰(图2)，在空白人正常血浆中加入内标物对照品的色谱图中，在内标物的保留时间处2.29min，有专属峰(图3)，在空白人正常血浆中加入维格列汀对照品的色谱图中，在维格列汀的保留时间处2.26min，有专属峰(图4)，在空白人正常血浆中加入内标和维格列汀对照品的色谱图中，在内标和维格列汀的保留时间处，有专属峰(图5)，在受试者血浆中加入内标对照品的色谱图中，在内标和维格列汀的保留时间处，有专属峰(图6)，该结果表明空白血浆基质不含有对维格列汀和内标有干扰的内源性物质，此方法具有良好的选择性。
(2)线性和灵敏度
在上述步骤(3)的测定条件下，通过连续两天内对3条校正曲线进行考察，制作的标准曲线表明维格列汀浓度在1.113ng/ml到534.0ng/ml之间，呈现良好的线性关系，R2为0.9946。标准曲线参数和变异系数见表3。代表性图如图1所示。
本方法的定量下限(LLOQ)是1.113ng/ml。定量下限的实测值和理论值的差异以及精密度数据见表4。定量限信噪比＞5。
表3标准曲线参数汇总
批次序号 斜率 截距 R<sup>2</sup> 拟合方程
1 0.0383 -0.00771 0.9970 Y＝0.0383+-0.00771
2 0.0354 -8.78E-05 0.9940 Y＝0.0354+-0.00008
3 0.0355 -0.00135 0.9928 Y＝0.0355+-0.00135
平均值 0.0364 -0.00305 0.9946
SD 0.0016 0.0041 0.0022
％CV 4.52 -133.98 0.22
表4定量下限的实测值和理论值的差异以及精密度
Figure BDA0002554223990000091
(3)精密度和准确度
为了证明本发明方法的精密度和准确度，本发明设定了以下实验方案：配制LLOQ、低、中、高四个浓度水平的质控血浆样本，每一浓度水平的样本制备并测定6个样本，按步骤(2)的方法进行处理，在上述步骤(3)的测定条件下，由随行校正标准曲线计算各样本浓度，按此方法至少两天共进行3个批次的验证。然后计算批间、批内的精密度和准确度。批内精密度由各浓度水平的6个样本的测定值相对标准差(RSD％)表示。准确度按以下公式计算得到：准确度(％)＝Cm/Cn x 100％，其中Cm是每个浓度点上6个样本测定值的平均值，Cn是每个浓度点的理论值。批间精密度由各浓度水平的3个批次共18个样本的测定值相对标准差(RSD％)表示。准确度按上述公式计算，其中Cm是每个浓度点上18个样本测定值的平均值。精密度和准确度检测结果见表5。
表5批间、批内精密度和准确度
LLOQ LQC ng/ml MQC HQC ng/ml
批内均值 1.044 2.375 28.856 462.685
批内％CV 3.59 9.83 1.04 2.32
批内准确度％ 93.77 106.56 107.87 108.10
批间均值 1.110 2.319 28.530 462.992
批间％CV 8.46 7.48 1.62 2.10
批间准确度％ 99.77 104.02 106.65 108.18
(4)回收率
为了考察本发明方法的回收率，本发明设定了以下实验方案：配制低、中、高三个浓度水平的质控血浆样本，每个浓度平行制备6份。按步骤(2)的方法进行处理，在上述步骤(3)的测定条件下，分别得到血浆样本中维格列汀的峰面积(A1)和内标(A2)的峰面积。
取空白血浆100μl，不加维格列汀和内标工作溶液，加入1.0ml含3.15ng/ml内标的乙腈，振荡器上自动震荡5min，离心(15000r/min)10min后，吸取1.0ml上清液至另一干净2ml EP管中，再相应加入低、中、高三个浓度水平的维格列汀工作液各5μl，振荡器上自动震荡2min，4℃离心(15000r/min)1min后，吸取50μl上清液至另一干净2ml EP管中，再加入300μl 5mM甲酸铵水溶液与乙腈混合液(1：1)，振荡器上自动震荡2min，离心(15000r/min)5min后，转移上清至进样瓶，在上述步骤(3)的测定条件下，分别得到维格列汀的峰面积(A1′)和内标(A2′)的峰面积。
以每一浓度前一种处理方法的平均峰面积与后一种处理方法的平均峰面积进行比较来评价维格列汀和内标的提取回收率，计算公式分别为A1/A1′×100％和A2/A2′×100％。回收率检测结果见表6。
表6维格列汀提取回收率
Figure BDA0002554223990000111
(5)稳定性
为了考察本发明方法的稳定性，本发明设定了以下实验方案：配制低、高浓度水平的质控血浆样本，每个浓度6份平行，分别于室温(23.2℃)下放置1小时，反复冻融3次，-80℃低温冰箱冷冻保存90天后按上述检测方法中步骤(2)处理后按步骤(3)的测定条件测定，由随行校正标准曲线计算各样本浓度，当所得结果的RSD小于15％时，认为样品稳定。稳定性检测结果见表7。
表7稳定性检测结果
Figure BDA0002554223990000112
本发明实施例通过对空白血浆中维格列汀进行检测，证明本发明方法有较高的灵敏度、准确度和精密度及较高的回收率。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种定量分析人血浆维格列汀浓度的LC-MS/MS检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)样品制备：
a.标准样品制备：精密称取维格列汀对照品10.68mg于10ml容量瓶中，用甲醇溶液4ml和3ml分别冲洗管壁和称量纸残余至容量瓶中，混匀溶解，再加入甲醇定容，颠倒混匀，配成浓度为1.068mg/ml的维格列汀标准储备液A；用甲醇：水溶液＝50：50，V/V稀释配制维格列汀的标曲工作溶液，浓度分别为：22.25ng/ml、44.5ng/ml、89.0ng/ml、178.0ng/ml、534.0ng/ml、1186.67ng/ml、3560.0ng/ml、10680.0ng/ml；
以人空白血浆作为空白基质，加入维格列汀标准工作溶液，配制8个已知的不同浓度的维格列汀标准样品；
b.质控样品制备：精密称取维格列汀对照品10.70mg于10ml容量瓶中，用甲醇溶液4ml和3ml分别冲洗管壁和称量纸残余至容量瓶中，混匀溶解，再加入甲醇定容，颠倒混匀，配成浓度为1.070mg/ml的维格列汀标准储备液B；用甲醇：水溶液＝50：50，V/V稀释配制维格列汀的质控工作溶液，浓度分别为：44.583ng/ml、535.0ng/ml、8560.0ng/ml；
以人血浆作为空白基质，加入维格列汀标准溶液，配制低、中、高三个已知浓度的维格列汀质控样品；
(2)样品处理：包括待测人血浆样品、标准样品、质控样品，处理方法均如下：
取血浆样品100μl至2ml EP管中，加入1.0ml含3.15ng/ml内标的沉淀剂乙腈，振荡器上自动震荡5min，15000r/min下离心10min后，吸取50μl上清液至另一干净2ml EP管中，再加入300μl 5mM甲酸铵水溶液与乙腈混合液，所述甲酸铵水溶液与乙腈混合液的体积比为1：1，振荡器上自动震荡2min，15000r/min下离心5min后，转移上清至进样瓶；
(3)样品检测：步骤(2)获得的样品，取2μl自动进样，进行高效液相色谱串联质谱检测；
(4)标准曲线制作和定量分析：步骤(3)完成后，以维格列汀与内标峰面积的比值(Y)为纵坐标，以维格列汀在血浆样本中的浓度X为横坐标，采用加权最小二乘法权重因子l/X2进行线性回归，制作到维格列汀的标准曲线方程，再通过标准曲线定量质控样本和待测人血浆样本。
2.根据权利要求1所述的定量分析人血浆维格列汀浓度的LC-MS/MS检测方法，其特征在于，步骤(1)中，维格列汀标准样品系列浓度为1.113ng/ml、2.225ng/ml、4.45ng/ml、8.90ng/ml、26.70ng/ml、59.33ng/ml、178.0ng/ml、534.0ng/ml。
3.根据权利要求2所述的定量分析人血浆维格列汀浓度的LC-MS/MS检测方法，其特征在于，步骤(1)中，维格列汀质控样品低、中、高浓度分别为2.229ng/ml、26.75ng/ml、428.0ng/ml。
4.根据权利要求1所述的定量分析人血浆维格列汀浓度的LC-MS/MS检测方法，其特征在于，步骤(2)中，采用稳定的同位素标记物13C5-15N-维格列汀作为内标；其配制过程是：精密称取同位素13C5-15N-维格列汀对照品3.15mg于10ml容量瓶中，用甲醇溶液4ml和3ml分别冲洗管壁和称量纸残余至容量瓶中，混匀溶解，再加入甲醇定容，颠倒混匀，配成浓度为0.315mg/ml的13C5-15N-维格列汀标准储备液C；用甲醇：水溶液＝50：50，V/V稀释配制内标的工作溶液，最后使用的工作液则用乙腈稀释配制。
5.根据权利要求1所述的定量分析人血浆维格列汀浓度的LC-MS/MS检测方法，其特征在于，步骤(3)中分析测定血浆样品中维格列汀的浓度，采用梯度洗脱反相色谱法，流动相A为5mM甲酸铵水溶液，流动相B为乙腈，色谱柱为Hypurity C18柱150mm×2.1mm，5μm，ThermoHypersil，流动相流速0.5ml/min，柱温在40℃。
6.根据权利要求5所述的定量分析人血浆维格列汀浓度的LC-MS/MS检测方法，其特征在于，梯度洗脱程序为：0.0-0.5min，流动相B为70％，0.5-2.0min，流动相B由70％逐步升至90％，2.0-3.5min，流动相B为90％，3.5-4.0min，流动相B由90％逐步降至70％，4.0-6.0min，流动相B为70％。
7.根据权利要求1所述的定量分析人血浆维格列汀浓度的LC-MS/MS检测方法，其特征在于，步骤(3)中的质谱条件为：采用电喷雾离子源ESI和正离子多反应监测模式MRM，维格列汀及其内标的母离子/子离子对质荷比m/z分别为：304.3/154.2和310.3/160.3，去簇电压分别为50V和80V，碰撞能量分别为23eV和24eV，源喷射电压：5500V，源温度：500℃。
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