CN114720580A - 一种生物样品中西格列汀和二甲双胍的检测方法 - Google Patents

一种生物样品中西格列汀和二甲双胍的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种生物样品中西格列汀和二甲双胍的检测方法，采用LC‑MS/MS方法检测，色谱条件：色谱柱：ZORBAX SB‑C18 4.6*150mm,3.5μm色谱柱；质谱条件：API 4000(ESI源)质谱，正离子，离子喷射电压为5500V，温度550℃，雾化气压力为55psi，解簇电压压力为55psi，气帘气体压力为20psi，扫描方式为多重反应监测(MRM)。流动相：A‑0.1％甲酸水溶液(含5mM乙酸铵)、B‑乙腈；流速：1.00ml/min；柱温：40℃；进样量：3.00μl。本发明方法可专属、灵敏、快速地测定人血浆中西格列汀和二甲双胍浓度，主要适用于片剂中西格列汀和二甲双胍含量的测定。

Description

一种生物样品中西格列汀和二甲双胍的检测方法
技术领域
本发明属于药物色谱、质谱分析领域，涉及化学品的检测方法，具体涉及一种生物样品中西格列汀和二甲双胍的检测方法。
背景技术
西格列汀属于强效、高选择性的二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂，二甲双胍为双胍类口服降血糖药物，西格列汀二甲双胍片是两种作用机制互补的降血糖药物复方，配合饮食和运动治疗，用于经二甲双胍单药治疗血糖仍控制不佳或正在接受二者联合治疗的2型糖尿病患者。该药物原研厂家为默沙东，于2007年获得FDA批准，2012年在中国获批商品名为
Figure BDA0003481410100000011
Figure BDA0003481410100000012
目前，还没有关于同时检测这种西格列汀和二甲双胍这两种成分的方法，在此方面产生了技术空白。
发明内容
要解决的技术问题：本发明针对目前对于同时检测西格列汀和二甲双胍的检验方法方面的空白，提供一种检测西格列汀和二甲双胍的检验方法，该方法操作简单，分析快速，而且能应用于多种不同的生物基质。
技术方案：一种生物样品中西格列汀和二甲双胍的检测方法，包括以下步骤：
(1)标曲工作液配制：精密称取西格列汀10.09mg(质量校正系数99.1％)，置于15mL塑料管中，用二甲基亚砜溶解1mg/mL，作为西格列汀储备液；精密称取盐酸二甲双胍10.22mg(质量校正系数77.9％)，置于15mL塑料管中，用甲醇溶解1mg/mL，作为二甲双胍储备液；用50％甲醇水稀释西格列汀储备液和二甲双胍储备液，配制混合标曲工作液，其中二甲双胍工作液浓度范围为160～80000ng/mL，西格列汀工作液浓度范围为20.0～10000ng/mL；
(2)质控工作液配制：西格列汀10.35mg(质量校正系数99.1％)，置于15mL塑料管中，用二甲基亚砜溶解1mg/mL，作为西格列汀储备液；精密称取盐酸二甲双胍10.19mg(质量校正系数77.9％)，置于15mL塑料管中，用甲醇溶解1mg/mL，作为二甲双胍储备液；用50％甲醇水稀释西格列汀储备液和二甲双胍储备液，配制混合质控工作液，其中二甲双胍质控工作液浓度480、12800、64000ng/mL，西格列汀质控工作液浓度为60.0、1600、8000ng/mL；
(3)内标工作液配制：取一支西格列汀-d41mg，置于1.5mL塑料管中，用二甲基亚砜溶解1mg/mL，作为西格列汀-d4储备液；取一支盐酸二甲双胍-d61mg，置于1.5mL塑料管中，用甲醇溶解1mg/mL，作为二甲双胍-d6储备液；用乙腈稀释西格列汀-d4储备液和二甲双胍-d6储备液，配制混合内标工作液，其中二甲双胍-d6浓度为20.0ng/mL，西格列汀-d4浓度为20.0ng/mL；
(4)生物样品前处理：标曲质控前处理：取空白生物样品190μL至1.5mLEP管中，分别与10μL标准曲线工作液、质控工作液混匀后，然后各取混匀后样品100μL，加入500μL内标工作溶液(双空白样品加入500μL乙腈)，涡旋1min，15400±10g，4℃，离心10min，取上清液100μL进样分析；生物样品取100μL，加入500μL内标工作溶液，涡旋1min，15400±10g，4℃，离心10min，取上清液100μL进样分析；
(5)LC-MS/MS方法检测
通过LC-MS/MS方法检测，基于待测物与内标的峰面积比，通过归一化法得到标准曲线，从而定量得到生物样品中西格列汀和二甲双胍的浓度。
优选的，所述LC-MS/MS方法的色谱及质谱条件如下：
色谱条件：
色谱柱：ZORBAX SB-C184.6*150mm,3.5μm，Agilent；
流动相：0.1％甲酸水溶液(含5mM乙酸铵)、B-乙腈；
流速：1.00ml/min；
柱温：40℃；
进样量：3.00μl；
等度程序：流动相比例：A:B＝30:70
质谱条件：
电喷雾正离子模式；
喷雾电压：5500V；
气帘气(CUR)：20psi；
碰撞激发裂解(CAD)：10；
雾化气(GS1)：55psi
辅助气(GS2)：55psi
扫描方式：多重反应监测(MRM)。
优选的，所述步骤(4)中生物样品选自受试者的血浆样品。
优选的，所述多重反应监测参数为：
Figure BDA0003481410100000031
有益效果：
本发明提供了一种同时测定西格列汀和二甲双胍的生物样品分析方法，通过高效、快速、灵敏的液相-质谱联用***(LC-MS)方法对西格列汀和二甲双胍进行联合分析。此方法采取了简单的有机溶剂蛋白沉淀法对生物样本进行前处理，基于待测物与内标的峰面积比，通过归一化法得到标准曲线，从而定量得到生物样品中西格列汀和二甲双胍的浓度。本方法为测定西格列汀和二甲双胍在人体内的药代动力学中西格列汀和二甲双胍的检测提供了简便的分析方法。本检测方法操作简单，分析快速，而且能应用于多种不同的生物基质。
附图说明：
图1为二甲双胍及内标的色谱图，其中图1(A)为二甲双胍色谱图，图1(B)为内标色谱图。
图2为西格列汀及内标的色谱图，其中图2(A)为西格列汀色谱图，图2(B)为内标色谱图。
图3为二甲双胍基于待测物与内标的峰面积比，通过归一化法得到的标准曲线。
图4为西格列汀基于待测物与内标的峰面积比，通过归一化法得到的标准曲线。
图5为受试者血浆样本中检测出西格列汀和内标的色谱图，其中图5(A)为西格列汀色谱图，图5(B)为内标色谱图。
图6为受试者血浆样本中检测出二甲双胍和内标的色谱图，其中图6(A)为二甲双胍色谱图，图6(B)为内标色谱图。
具体实施方式
仪器与试剂：仪器与试剂：高效液相色谱仪：SHIMADZU HPLC；色谱柱：ZORBAX SB-C18 4.6*150mm,3.5μm，Agilent；西格列汀标准品(MACKCIN)；盐酸二甲双胍标准品(中国食品药品检定研究院)；西格列汀-d4(TLC Pharmaceutical Standards)和盐酸二甲双胍-d6标准品(Toronto Fisher Scientific)；甲酸、乙酸铵及乙腈均购于Thermo FisherScientific。
实施例1
一种生物样品中西格列汀和二甲双胍的检测方法，包括以下步骤：
(1)色谱条件：
色谱柱：ZORBAX SB-C184.6*150mm,3.5μm，Agilent；
流动相：0.1％甲酸水溶液(含5mM乙酸铵)、B-乙腈；
流速：1.00ml/min；
柱温：40℃；
进样量：3.00μl；
等度程序：流动相比例：A:B＝30:70
质谱条件：
电喷雾正离子模式；
喷雾电压：5500V；
气帘气(CUR)：20psi；
碰撞激发裂解(CAD)：10；
雾化气(GS1)：55psi
辅助气(GS2)：55psi
扫描方式：多重反应监测(MRM)：
Figure BDA0003481410100000041
(2)标曲工作液配制：精密称取西格列汀10.09mg(质量校正系数99.1％)，置于15mL塑料管中，用二甲基亚砜溶解1mg/mL，作为西格列汀储备液；精密称取盐酸二甲双胍10.22mg(质量校正系数77.9％)，置于15mL塑料管中，用甲醇溶解1mg/mL，作为二甲双胍储备液；用50％甲醇水稀释西格列汀储备液和二甲双胍储备液，配制混合标曲工作液，其中二甲双胍工作液浓度范围为160～80000ng/mL，西格列汀工作液浓度范围为20.0～10000ng/mL；
(3)质控工作液配制：西格列汀10.35mg(质量校正系数99.1％)，置于15mL塑料管中，用二甲基亚砜溶解1mg/mL，作为西格列汀储备液；精密称取盐酸二甲双胍10.19mg(质量校正系数77.9％)，置于15mL塑料管中，用甲醇溶解1mg/mL，作为二甲双胍储备液；用50％甲醇水稀释西格列汀储备液和二甲双胍储备液，配制混合质控工作液，其中二甲双胍质控工作液浓度480、12800、64000ng/mL，西格列汀质控工作液浓度为60.0、1600、8000ng/mL；(4)内标工作液配制：取一支西格列汀-d41mg，置于1.5mL塑料管中，用二甲基亚砜溶解1mg/mL，作为西格列汀-d4储备液；取一支盐酸二甲双胍-d61mg，置于1.5mL塑料管中，用甲醇溶解1mg/mL，作为二甲双胍-d6储备液；用乙腈稀释西格列汀-d4储备液和二甲双胍-d6储备液，配制混合内标工作液，其中二甲双胍-d6浓度为20.0ng/mL，西格列汀-d4浓度为20.0ng/mL；
(5)生物样品前处理：标曲质控前处理：取空白生物样品190μL至1.5mLEP管中，分别与10μL标准曲线工作液、质控工作液混匀后，然后各取混匀后样品100μL，加入500μL内标工作溶液(双空白样品加入500μL乙腈)，涡旋1min，15400±10g，4℃，离心10min，取上清液100μL进样分析；受试者的血浆样品取100μL，加入500μL内标工作溶液，涡旋1min，15400±10g，4℃，离心10min，取上清液100μL进样分析；
(6)LC-MS/MS方法检测
通过上述LC-MS/MS方法检测，基于待测物与内标的峰面积比，通过归一化法得到标准曲线，从而定量得到生物样品中西格列汀和二甲双胍的浓度。
(7)色谱图获得
经过上述步骤进样分析得到西格列汀及内标的色谱图，如图1所示。其中图1(A)为西格列汀色谱图，图1(B)为内标色谱图。二甲双胍及内标的色谱图，如图2所示。其中图2(A)为西格列汀色谱图，图2(B)为内标色谱图。
(8)标准曲线
西格列汀基于待测物与内标的峰面积比，通过归一化法得到标准曲线，如图3所示，标准方程为：y＝0.00721x+0.000295(r＝0.9997)。二甲双胍基于待测物与内标的峰面积比，通过归一化法得到标准曲线，如图4所示，标准方程为：y＝0.00232x+0.00168(r＝0.9995)。
(9)定量结果
通过标准曲线定量得到人血浆生物样品中西格列汀和二甲双胍的浓度如表1所示：
表1
时间点(h) 西格列汀浓度(ng/mL) 二甲双胍浓度(ng/mL)
0 0.00 0.00
0.5 11.0 1270
1 44.8 3770
1.5 90.4 3480
2 158 2770
2.33 218 2660
2.67 208 2560
3 201 2420
3.5 233 2380
4 215 2120
5 237 1980
6 209 1770
8 182 1310
10 163 1090
12 132 761
15 92.0 471
24 37.5 93.1
36 16.1 23.0
48 8.84 16.6
虽然在实施例中已经通过一般性说明、具体实施方式及试验对本发明作出了详尽的描述，但在不偏离本发明核心的基础上，仍可以作出的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.一种生物样品中西格列汀和二甲双胍的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)标曲工作液配制：精密称取西格列汀10.09mg，置于15mL塑料管中，用二甲基亚砜溶解1mg/mL，作为西格列汀储备液；精密称取盐酸二甲双胍10.22mg，置于15mL塑料管中，用甲醇溶解1mg/mL，作为二甲双胍储备液；用50％甲醇水稀释西格列汀储备液和二甲双胍储备液，配制混合标曲工作液，其中二甲双胍工作液浓度范围为160～80000ng/mL，西格列汀工作液浓度范围为20.0～10000ng/mL；
(2)质控工作液配制：西格列汀10.35mg，置于15mL塑料管中，用二甲基亚砜溶解1mg/mL，作为西格列汀储备液；精密称取盐酸二甲双胍10.19mg，置于15mL塑料管中，用甲醇溶解1mg/mL，作为二甲双胍储备液；用50％甲醇水稀释西格列汀储备液和二甲双胍储备液，配制混合质控工作液，其中二甲双胍质控工作液浓度480、12800、64000ng/mL，西格列汀质控工作液浓度为60.0、1600、8000ng/mL；
(3)内标工作液配制：取一支西格列汀-d41mg，置于1.5mL塑料管中，用二甲基亚砜溶解1mg/mL，作为西格列汀-d4储备液；取一支盐酸二甲双胍-d61mg，置于1.5mL塑料管中，用甲醇溶解1mg/mL，作为二甲双胍-d6储备液；用乙腈稀释西格列汀-d4储备液和二甲双胍-d6储备液，配制混合内标工作液，其中二甲双胍-d6浓度为20.0ng/mL，西格列汀-d4浓度为20.0ng/mL；
(4)生物样品前处理：标曲质控前处理：取空白生物样品190μL至1.5mLEP管中，分别与10μL标准曲线工作液、质控工作液混匀后，然后各取混匀后样品100μL，加入500μL内标工作溶液，涡旋1min，15400±10g，4℃，离心10min，取上清液100μL进样分析；生物样品取100μL，加入500μL内标工作溶液，涡旋1min，15400±10g，4℃，离心10min，取上清液100μL进样分析；
(5)LC-MS/MS方法检测
通过LC-MS/MS方法检测，基于待测物与内标的峰面积比，通过归一化法得到标准曲线，从而定量得到生物样品中西格列汀和二甲双胍的浓度。
2.根据权利要求1所述的一种生物样品中西格列汀和二甲双胍的检测方法，其特征在于：所述LC-MS/MS方法的色谱及质谱条件如下：
色谱条件：
色谱柱：ZORBAX SB-C184.6*150mm，3.5μm；
流动相：0.1％甲酸水溶液，其中含5mM乙酸铵、B-乙腈；
流速：1.00ml/min；
柱温：40℃；
进样量：3.00μl；
等度程序：流动相比例：A:B＝30:70
质谱条件：
电喷雾正离子模式；
喷雾电压：5500V；
气帘气：20psi；
碰撞激发裂解：10；
雾化气：55psi
辅助气：55psi
扫描方式：多重反应监测。
3.根据权利要求1所述的一种生物样品中西格列汀和二甲双胍的检测方法，其特征在于：所述步骤(4)中生物样品选自受试者的血浆样品。
4.根据权利要求2所述的一种生物样品中西格列汀和二甲双胍的检测方法，其特征在于：所述多重反应监测参数为：
Figure FDA0003481410090000021
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Address after: 215300 unit 301-1, R & D building, small nucleic acid Research Institute, room 3, 168 Yuanfeng Road, Yushan Town, Kunshan City, Suzhou City, Jiangsu Province

Applicant after: Suzhou Xuhui biomedical Co.,Ltd.

Applicant after: SUZHOU XUHUI ANALYSIS Co.,Ltd.

Address before: 215300 unit 301-1, R & D building, small nucleic acid Research Institute, room 3, 168 Yuanfeng Road, Yushan Town, Kunshan City, Suzhou City, Jiangsu Province

Applicant before: Suzhou Xuhui biomedical Co.,Ltd.

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