CN112924613A - 一种定量分析抗结核药血浆浓度的lc-ms/ms方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种定量分析抗结核药血浆浓度的LC‑MS/MS方法，该方法通过S1标准工作液配制、S2样品制备、S3样品处理、S4样品检测及S5标准曲线制作和定量分析，可同时对异烟肼、利福平、吡嗪酰胺及乙胺丁醇进行检测，样品前处理过程简单易操作，所用试剂均为常规试剂，成本较低。以反相150mm×2.1mm的C18柱、控制流速为0.3mL/min、柱温为30℃，可以很好地解决异烟肼、利福平、吡嗪酰胺以及乙胺丁醇的极性差异大的问题，分离效果较好，且成本较低。本申请具有较高的灵敏度、准确度与精密度，检测线性范围宽，检测时间短，可作为一种可靠的宜推广的检测方法用于临床一线抗结核病药物的治疗浓度监测。
Description
技术领域
本发明属于药物分析技术领域，特别涉及一种定量分析抗结核药血浆浓度的LC-MS/MS方法。
背景技术
结核病是患者感染结核分枝杆菌后引起的传染性疾病，目前临床上的治疗方案是通过多种抗结核药物长期联合应用，其中利福平(Rifampicin，RFP)、异烟肼(Isoniazid，INH)、吡嗪酰胺(Pyrazinamide，PZA)和乙胺丁醇(Ethambutol，EMB)属于一线抗结核药物。由于结核病患者通常合并其他的病症，同时使用多种药物，加之病人个体的差异，造成抗结核药物在人体内的浓度有很大的差异。体内药物浓度过低，则达不到治疗效果；体内药物浓度过高又会引起毒副反应。因此，监测结核病患者体内抗结核药物浓度对于保证治疗效果、减少耐药性及毒副反应具有重要意义。
目前国内外针对抗结核药血浆浓度检测的方法主要有液相色谱法、液相-串联质谱法(LC-MS/MS)及超高效液相-串联质谱法(UPLC-MS/MS)，这些方法中，有的是仅检测一种抗结核药物，检测时间长，检测成分单一，在联合用药时不太适用。有些方法是同时检测多种抗结核药物，甚至有专利报道同时检测11种抗结核药物，但同时检测这些药物的方法，大多使用UPLC-MS/MS法，需要用到UPLC液相色谱仪及UPLC柱，检测成本较大，不适宜推广。
发明内容
本发明的目的在于克服目前存在的技术缺陷，提供一种定量分析抗结核药血浆浓度的LC-MS/MS(液相-串联质谱)方法。该方法可以同时对人血浆中四种一线抗结核药(包括利福平、异烟肼、吡嗪酰胺、乙胺丁醇)进行定量检测，检测快速，前处理过程简单易行，检测灵敏度高，定量精确，并且可以广泛适用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种定量分析抗结核药血浆浓度的LC-MS/MS方法，包括如下步骤：
S1标准工作液配制：
a、分别精密称取4种抗结核药物标准品，分别用溶剂溶解后并稀释至标准工作液；分别量取相同体积的所述4种抗结核药物的标准工作液并混合，配置得到混合标准液；取所述混合标准液，用甲醇-水溶液稀释至不同浓度的标准曲线系列工作液和不同浓度的质控系列工作液；
b、分别精密称取内标标准品，并用甲醇溶解稀释至内标工作液的浓度；分别量取所述内标工作液并混合，配制得到混合内标液；
S2样品制备：
a、标准曲线样品制备：以空白血浆作为空白基质，加入所述标准曲线系列工作液，涡旋混匀，配置不同浓度的标准曲线样品；
b、质控样品制备：以空白血浆作为空白基质，加入所述质控系列工作液，涡旋混匀，配制不同浓度的质控样品；
S3样品处理：往100μL目标样品中加入800μL所述混合内标液，震荡提取5min，15000r/min离心10min，吸取50μL上清液用450μL流动相混合液稀释，得到待测目标样品；
S4样品检测：取步骤S3的待测目标样品2μL进行高效液相色谱串联质谱检测；
S5标准曲线制作和定量分析：分别以4种所述抗结核药物标准品与各自内标的峰面积的比值为纵坐标(Y)，以4种所述抗结核药物标准品各自在血浆样本中的已知浓度为横坐标(X)，采用加权最小二乘法进行线性回归，分别得到4种所述抗结核药物标准品的标准曲线方程，再通过标准曲线定量所述待测目标样品。
步骤S1中，
所述4种抗结核药物标准品分别为利福平、异烟肼、吡嗪酰胺以及乙胺丁醇。
所述溶剂为甲醇或甲醇-水溶液。
所述异烟肼对应的内标是异烟肼-d4，所述利福平和所述吡嗪酰胺对应的内标是吡嗪酰胺-15N d3，所述乙胺丁醇对应的内标是乙胺丁醇-d4。
所述混合内标液中，所述异烟肼-d4的浓度为33.33ng/mL，所述吡嗪酰胺-15N d3的浓度为333.33ng/mL，所述乙胺丁醇-d4的浓度为200.00ng/mL。
步骤S2中，
所述标准曲线样品中，所述异烟肼的浓度分别为48.03ng/mL、96.06ng/mL、192.13ng/mL、384.26ng/mL、1152.78ng/mL、3458.33ng/mL、10375.00ng/mL以及31125.00ng/mL；所述利福平的浓度分别为49.15ng/mL、98.30ng/mL、196.60ng/mL、393.21ng/mL、1179.63ng/mL、3538.89ng/mL、10616.67ng/mL以及31850.00ng/mL；所述吡嗪酰胺的浓度分别为62.19ng/mL、124.38ng/mL、248.77ng/mL、497.53ng/mL、1492.59ng/mL、4477.78ng/mL、13433.33ng/mL以及40300.00ng/mL；所述乙胺丁醇的浓度分别为17.67ng/mL、35.34ng/mL、70.68ng/mL、141.36ng/mL、424.07ng/mL、1272.22ng/mL、3816.67ng/mL以及11450.00ng/mL。
所述质控样品中，所述异烟肼的浓度分别为100ng/mL、1000ng/mL及25000ng/mL；所述利福平的浓度分别为101.76ng/mL、1017.6ng/mL及25440ng/mL；所述吡嗪酰胺的浓度分别为128.96ng/mL、1289.6ng/mL及32240ng/mL；所述乙胺丁醇的浓度分别为36.76ng/mL、367.6ng/mL及9190ng/mL。
步骤S3中，
所述流动相混合液为0.2％甲酸水溶液与甲醇按体积比2：8混合的混合液。
所述目标样品为待测血浆样品、标准样品和质控样品中的一种。
步骤S4中，
所述高效液相色谱的色谱条件如下：流动相A为0.2％甲酸水溶液，流动相B为甲醇，流动相A与流动相B的体积比例为25：75，色谱柱为150mm×2.1mm、5μm的反相C18柱，流动相的流速为0.3mL/min，柱温为30℃。
所述质谱的检测条件如下：采用电喷雾离子源(ESI)和正离子多反应监测模式(MRM)，源喷射电压：5500V，源温度：450℃；所述异烟肼及其内标的母离子/子离子对质荷比(m/z)分别为：138.2/121.2和142.1/125.3，去簇电压均为45V，碰撞能量均为20eV；所述利福平的母离子/子离子对质荷比(m/z)分别为：823.4/791.5，去簇电压为50V，碰撞能量为26eV，内标同吡嗪酰胺；所述吡嗪酰胺及其内标的母离子/子离子对质荷比(m/z)分别为：124.3/79.3和128.2/82.2，去簇电压均为45V，碰撞能量均为23eV；所述乙胺丁醇及其内标的母离子/子离子对质荷比(m/z)分别为：205.3/116.2和209.3/120.3，去簇电压均为45V，碰撞能量均为20eV。
步骤S5中，
所述加权最小二乘法的权重因子为l/x2。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明可以同时对四种主要的一线抗结核病药物(包括异烟肼、利福平、吡嗪酰胺以及乙胺丁醇)进行检测，样品前处理过程简单易操作，所用试剂均为常规试剂，成本较低。以反相150mm×2.1mm的C18柱、控制流速为0.3mL/min、柱温为30℃，可以很好地解决异烟肼、利福平、吡嗪酰胺以及乙胺丁醇的极性差异大的问题，分离效果较好，且成本较低。本申请具有较高的灵敏度、准确度与精密度，检测线性范围宽，检测时间短，可作为一种可靠的宜推广的检测方法用于临床一线抗结核病药物的治疗浓度监测。
附图说明
图1为本申请实施例的异烟肼、利福平、吡嗪酰胺及乙胺丁醇的标准曲线图；
图2为本申请实施例的异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇以及其对应内标物的空白血浆色谱图；
图3为本申请实施例在空白血浆中加入内标物对照品的色谱图；
图4为本申请实施例在空白血浆中加入异烟肼、利福平、吡嗪酰胺及乙胺丁醇对照品的色谱图；
图5为本申请实施例在空白血浆中加入异烟肼、利福平、吡嗪酰胺及乙胺丁醇抗结核药和内标对照品的色谱图；
图6为本申请实施例的结核病患者用抗结核药后的血浆样本色谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
本发明一实施例提供一种定量分析抗结核药血浆浓度的LC-MS/MS方法，包括如下步骤：
S1标准工作液配制：
a、电子天平称取异烟肼12.47mg于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，颠倒混匀，配制浓度经校正因子换算为1.245mg/mL的异烟肼标准工作液；同样方法，称取利福平12.89mg配制得浓度为1.274mg/mL的利福平标准工作液，称取乙胺丁醇对照品12.47mg配制得浓度为0.916mg/mL的乙胺丁醇标准工作液；称取吡嗪酰胺对照品20.56mg于5mL容量瓶中，用甲醇-水溶液(甲醇：水溶液(50:50，V/V))溶解并定容，颠倒混匀，配制浓度为4.03mg/mL的吡嗪酰胺标准工作液。分别量取相同体积的所述4种抗结核药物的标准工作液并混合，配置得到混合标准液；取所述混合标准液，用甲醇-水溶液稀释至不同浓度的标准曲线系列工作液：其中含异烟肼浓度分别为480.32ng/mL、960.65ng/mL、1921.30ng/mL、3842.59ng/mL、11527.78ng/mL、34583.3ng/mL、103750ng/mL、311250ng/mL；含利福平浓度分别为491.51ng/mL、983.02ng/mL、1966.05ng/mL、3932.10ng/mL、11796.30ng/mL、35388.88ng/mL、106166.67ng/mL、318500ng/mL；含吡嗪酰胺浓度分别为621.91ng/mL、1243.83ng/mL、2487.65ng/mL、4975.31ng/mL、14925.93ng/mL、44777.78ng/mL、134333.33ng/mL、403000ng/mL；含乙胺丁醇浓度分别为176.70ng/mL、353.40ng/mL、706.79ng/mL、1413.58ng/mL、4240.74ng/mL、12722.22ng/mL、38166.67ng/mL、114500ng/mL。
取所述混合标准液，用甲醇-水溶液稀释至不同浓度的质控系列工作液：其中，含异烟肼低、中、高浓度分别为1000ng/mL、10000ng/mL、250000ng/mL；含利福平低、中、高浓度分别为1017.6ng/mL、10176ng/mL、254400ng/mL；含吡嗪酰胺低、中、高浓度分别为1289.6ng/mL、12896ng/mL、322400ng/mL；含乙胺丁醇低、中、高浓度分别为367.6ng/mL、3676ng/mL、91900ng/mL。
b、分别精密称取内标标准品，并用甲醇溶解稀释至内标工作液的浓度；分别量取所述内标工作液并混合，配制得到混合内标液，具体操作如下：分别取1mL甲醇至各自装有1mg异烟肼-d4、1mg二盐酸乙胺丁醇-d4、1mg吡嗪酰胺-N15,d3标准品的玻璃瓶中，摇匀溶解，配成浓度为1mg/mL的异烟肼-d4、二盐酸乙胺丁醇-d4、吡嗪酰胺-N15,d3内标工作液；分别量取所述内标工作液并混合，配制得到混合内标液，混合内标液中含异烟肼-d4浓度为33.33ng/mL、含吡嗪酰胺-15N d3浓度为333.33ng/mL、含乙胺丁醇-d4浓度为200.0ng/mL。
S2样品制备：
a、标准样品制备：取所述标准曲线系列工作液10μL，加入空白血浆90μL，涡旋混匀，分别配制8个已知不同浓度的标准曲线样品；8个标准曲线样品中含异烟肼浓度分别为48.03ng/mL、96.06ng/mL、192.13ng/mL、384.26ng/mL、1152.78ng/mL、3458.33ng/mL、10375ng/mL、31125ng/mL，含利福平浓度分别为49.15ng/mL、98.30ng/mL、196.60ng/mL、393.21ng/mL、1179.63ng/mL、3538.89ng/mL、10616.67ng/mL、31850ng/mL，含吡嗪酰胺浓度分别为62.19ng/mL、124.38ng/mL、248.77ng/mL、497.53ng/mL、1492.59ng/mL、4477.78ng/mL、13433.33ng/mL、40300ng/mL，含乙胺丁醇浓度分别为17.67ng/mL、35.34ng/mL、70.68ng/mL、141.36ng/mL、424.07ng/mL、1272.22ng/mL、3816.67ng/mL、11450ng/mL。
b、质控样品制备：取所述质控系列工作液10μL，加入空白血浆90μL，涡旋混匀，配制低、中、高三个已知浓度的质控样品；质控样品中含异烟肼浓度分别为100ng/mL、1000ng/mL、25000ng/mL，含利福平浓度分别为101.76ng/mL、1017.6ng/mL、25440ng/mL，含吡嗪酰胺浓度分别为128.96ng/mL、1289.6ng/mL、32240ng/mL，含低、中、高浓度分别为36.76ng/mL、367.6ng/mL、9190ng/mL。
S3样品处理：
目标样品为待测血浆样品、标准样品和质控样品中的一种，均采用以下处理方法：
2mL EP管中加入目标样品100μL以及800μL所述混合内标液，振荡器上自动震荡5min，随后离心(15000r/min)10min，再吸取50μL上清液至另一干净EP管中，加入450μL0.2％甲酸水溶液与甲醇混合液(2：8)，振荡器上自动震荡2min，离心(15000r/min)5min后，转移上清至进样瓶,得到待测目标样品；
S4样品检测：取步骤S3的待测目标样品2μL进行高效液相色谱串联质谱检测；
a、液相条件：仪器为日本岛津公司的Nexera UHPLC/HPLC高效液相色谱仪；流动相A为0.2％甲酸水；流动相B为甲醇；等度洗脱模式，A：B＝25：75。流速0.3mL/min；进样体积2.0μL；进样器温度15℃；色谱柱为Hypurity C18(150mm×2.1mm，5μm，Thermo Hypersil)；柱温30℃；
b、质谱条件：仪器为美国AB SCIEX公司的Triple QuadTM6500质谱仪；电喷雾电离源(Turbo Spray)；MRM正离子扫描；源喷射电压：5500V；入口电压：10V；温度：450℃；碰撞气：9Psi；气帘气：35Psi；离子源气体1：50Psi；离子源气体2：55Psi；质荷比(m/z)及MRM参数如下表1所示。
表1样品检测的质谱条件
S5标准曲线制作和定量分析：分别以异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇标准品与各自内标的峰面积的比值为纵坐标(Y)，以异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇标准品各自在血浆样本中的已知浓度为横坐标(X)，采用加权最小二乘法(权重因子l/x2)进行线性回归，分别得到异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇标准品的标准曲线方程，再通过标准曲线定量所述待测目标样品。
S6方法学验证：
(1)选择性
本发明设置了以下实验方案证明本发明方法的选择性：(a)分别取6个不同个体来源的空白血浆，不加待测物标准溶液和内标，按步骤S3处理。(b)分别取6个不同个体来源的空白血浆加入内标工作溶液，不加待测物标准溶液，按步骤S3处理。(c)分别取6个不同个体来源的空白血浆，加入待测物标准溶液，不加内标，按步骤S3处理。(d)分别取不同个体来源的空白血浆，加入待测物标准溶液和内标溶液，按步骤S3处理。(e)取结核病患者用抗结核药后的血浆样品，按步骤S3处理。
按照步骤S4的检测方法，对上述样品进行检测，结果如图2-图6所示，空白血浆的色谱图中，4种待测物和内标的保留时间处，均未见明显专属峰(图2)。空白血浆加入内标对照品的色谱图中，内标异烟肼-d4、吡嗪酰胺-15N d3和乙胺丁醇-d4的保留时间分别为1.23、1.43、0.84min，可见专属峰(图3)。空白血浆加入待测物对照品的色谱图中，异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇的保留时间分别为1.23、2.50、1.43、0.84min，可见专属峰(图4)。空白血浆中加入内标和待测物对照品的色谱图中，内标和待测物的保留时间处，均有专属峰(图5)。在结核病患者用抗结核药后的血浆样品色谱图中，内标和待测物的保留时间处，均有专属峰(图6)。该结果表明空白血浆基质不含有对4种待测物和内标有干扰的内源性物质，此方法具有良好的选择性。
(2)线性和灵敏度
通过至少两天对3条校正曲线进行考察，得到的标准曲线表明异烟肼浓度在48.03-31125ng/mL之间、利福平浓度在49.15-31850ng/mL之间、吡嗪酰胺浓度在62.2-40300ng/mL之间、乙胺丁醇浓度在17.67-11450ng/mL之间，均呈现良好的线性关系，R2分别为0.9985、0.9949、0.9965、0.9989。标准曲线参数和变异系数见表2。代表性图见图1。
本方法中异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇的定量下限(LLOQ)分别是48.03ng/mL、49.15ng/mL、62.2ng/mL、17.67ng/mL。定量限信噪比＞5。实测值和理论值的差异以及精密度数据见表3。
表2标准曲线参数汇总
表3定量下限实测值和理论值的差异以及精密度
(3)精密度和准确度
本发明设定了以下实验方案证明方法的精密度和准确度：制备并测定LLOQ、低、中、高四个浓度水平的质控血浆样本各6个，按步骤S3的方法处理并按步骤S4的条件测定，同时随行校正标准曲线计算各样本浓度。至少两天共验证3个批次。其中批内精密度为各浓度水平的6个样本的测定值相对标准差(RSD％)。准确度则按公式Cm/Cn x 100％计算得到，其中Cm是每个浓度水平6个样本测定值的平均值，Cn是质控浓度理论值。批间精密度和准确度则通过各浓度水平3个批次共18个样本的测定值进行计算。精密度和准确度检测结果见表4-1至4-4。
表4-1异烟肼批间、批内精密度和准确度
表4-2利福平批间、批内精密度和准确度
表4-3吡嗪酰胺批间、批内精密度和准确度
表4-4乙胺丁醇批间、批内精密度和准确度
(4)回收率
本发明设定了以下实验方案考察方法的回收率。第一种处理：制备低、中、高三个浓度水平的质控血浆样本各6份，按步骤S3的方法处理并按步骤S4的条件测定，分别得到血浆样本中待测物的峰面积(A1)和内标的峰面积(A2)。
第二种处理：取空白血浆100μL，加入0.8mL含混合内标的甲醇溶液，震荡5min，离心(15000r/min)10min后，取0.8mL上清液至另一干净EP管中，再相应加入低、中、高三个浓度水平的待测物工作液各10μL，震荡2min，15000r/min离心5min后，取上清液50μL至另一干净EP管中，再加入450μL 0.2％甲酸水溶液与甲醇混合液(2：8)，震荡2min，离心(15000r/min)5min后，转移上清至进样瓶，在上述步骤S4的测定条件下，分别得到待测物的峰面积(A1′)和内标的峰面积(A2′)。
提取回收率评价方式：以每一浓度第一种处理方法的平均峰面积与第二种处理方法的平均峰面积进行比较，计算公式分别为A1/A1′×100％和A2/A2′×100％。回收率检测结果见表5-1至5-4。
表5-1异烟肼提取回收率
表5-2利福平提取回收率
表5-3吡嗪酰胺提取回收率
表5-4乙胺丁醇提取回收率
(5)稳定性
本发明设定了以下实验方案考察本方法的稳定性：分别制备高低两个浓度水平的质控血浆样本，于室温(23.2℃)下放置4小时后，-80℃低温冰箱和室温之间反复冻融3次后，-80℃低温冰箱冷冻保存21天后，按步骤S3的方法处理并按步骤S4的条件测定，由随行校正标准曲线计算各样本浓度，检测结果见表6。
表6稳定性检测结果
本发明实施例通过对血浆中异烟肼、利福平、吡嗪酰胺和乙胺丁醇进行检测，证明本发明方法有较高的灵敏度、准确度和精密度，样品稳定性好，样本处理方法回收率高。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种定量分析抗结核药血浆浓度的LC-MS/MS方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1标准工作液配制：
a、分别精密称取4种抗结核药物标准品，分别用溶剂溶解后并稀释至标准工作液；分别量取相同体积的所述4种抗结核药物的标准工作液并混合，配置得到混合标准液；取所述混合标准液，用甲醇-水溶液稀释至不同浓度的标准曲线系列工作液和不同浓度的质控系列工作液；
b、分别精密称取内标标准品，并用甲醇溶解稀释至内标工作液的浓度；分别量取所述内标工作液并混合，配制得到混合内标液；
S2样品制备：
a、标准曲线样品制备：以空白血浆作为空白基质，加入所述标准曲线系列工作液，涡旋混匀，配置不同浓度的标准曲线样品；
b、质控样品制备：以空白血浆作为空白基质，加入所述质控系列工作液，涡旋混匀，配制不同浓度的质控样品；
S3样品处理：往100μL目标样品中加入800μL所述混合内标液，震荡提取5min，15000r/min离心10min，吸取50μL上清液用450μL流动相混合液稀释，得到待测目标样品；
S4样品检测：取步骤S3的待测目标样品2μL进行高效液相色谱串联质谱检测；
S5标准曲线制作和定量分析：分别以4种所述抗结核药物标准品与各自内标的峰面积的比值为纵坐标，以4种所述抗结核药物标准品各自在血浆样本中的已知浓度为横坐标，采用加权最小二乘法进行线性回归，分别得到4种所述抗结核药物标准品的标准曲线方程，再通过标准曲线定量所述待测目标样品。
2.根据权利要求1所述的定量分析抗结核药血浆浓度的LC-MS/MS方法，其特征在于，步骤S1中，所述4种抗结核药物标准品分别为利福平、异烟肼、吡嗪酰胺以及乙胺丁醇。
3.根据权利要求2所述的定量分析抗结核药血浆浓度的LC-MS/MS方法，其特征在于，所述溶剂为甲醇或甲醇-水溶液；所述异烟肼对应的内标是异烟肼-d4，所述利福平和所述吡嗪酰胺对应的内标是吡嗪酰胺-15Nd3，所述乙胺丁醇对应的内标是乙胺丁醇-d4。
4.根据权利要求3所述的定量分析抗结核药血浆浓度的LC-MS/MS方法，其特征在于，所述混合内标液中，所述异烟肼-d4的浓度为33.33ng/mL，所述吡嗪酰胺-15Nd3的浓度为333.33ng/mL，所述乙胺丁醇-d4的浓度为200.00ng/mL。
5.根据权利要求4所述的定量分析抗结核药血浆浓度的LC-MS/MS方法，其特征在于，步骤S2中，所述标准曲线样品中，所述异烟肼的浓度分别为48.03ng/mL、96.06ng/mL、192.13ng/mL、384.26ng/mL、1152.78ng/mL、3458.33ng/mL、10375.00ng/mL以及31125.00ng/mL；所述利福平的浓度分别为49.15ng/mL、98.30ng/mL、196.60ng/mL、393.21ng/mL、1179.63ng/mL、3538.89ng/mL、10616.67ng/mL以及31850.00ng/mL；所述吡嗪酰胺的浓度分别为62.19ng/mL、124.38ng/mL、248.77ng/mL、497.53ng/mL、1492.59ng/mL、4477.78ng/mL、13433.33ng/mL以及40300.00ng/mL；所述乙胺丁醇的浓度分别为17.67ng/mL、35.34ng/mL、70.68ng/mL、141.36ng/mL、424.07ng/mL、1272.22ng/mL、3816.67ng/mL以及11450.00ng/mL。
6.根据权利要求5所述的定量分析抗结核药血浆浓度的LC-MS/MS方法，其特征在于，步骤S2中，所述质控样品中，所述异烟肼的浓度分别为100ng/mL、1000ng/mL及25000ng/mL；所述利福平的浓度分别为101.76ng/mL、1017.6ng/mL及25440ng/mL；所述吡嗪酰胺的浓度分别为128.96ng/mL、1289.6ng/mL及32240ng/mL；所述乙胺丁醇的浓度分别为36.76ng/mL、367.6ng/mL及9190ng/mL。
7.根据权利要求6所述的定量分析抗结核药血浆浓度的LC-MS/MS方法，其特征在于，步骤S3中，所述流动相混合液为0.2％甲酸水溶液与甲醇按体积比2：8混合的混合液；所述目标样品为待测血浆样品、标准样品和质控样品中的一种。
8.根据权利要求7所述的定量分析抗结核药血浆浓度的LC-MS/MS方法，其特征在于，步骤S4中，所述高效液相色谱的色谱条件如下：流动相A为0.2％甲酸水溶液，流动相B为甲醇，流动相A与流动相B的体积比例为25：75，色谱柱为150mm×2.1mm、5μm的反相C18柱，流动相的流速为0.3mL/min，柱温为30℃。
9.根据权利要求8所述的定量分析抗结核药血浆浓度的LC-MS/MS方法，其特征在于，步骤S4中，所述质谱的检测条件如下：采用电喷雾离子源和正离子多反应监测模式，源喷射电压：5500V，源温度：450℃；所述异烟肼及其内标的母离子/子离子对质荷比分别为：138.2/121.2和142.1/125.3，去簇电压均为45V，碰撞能量均为20eV；所述利福平的母离子/子离子对质荷比分别为：823.4/791.5，去簇电压为50V，碰撞能量为26eV，内标同吡嗪酰胺；所述吡嗪酰胺及其内标的母离子/子离子对质荷比分别为：124.3/79.3和128.2/82.2，去簇电压均为45V，碰撞能量均为23eV；所述乙胺丁醇及其内标的母离子/子离子对质荷比分别为：205.3/116.2和209.3/120.3，去簇电压均为45V，碰撞能量均为20eV。
10.根据权利要求9所述的定量分析抗结核药血浆浓度的LC-MS/MS方法，其特征在于，步骤S5中，所述加权最小二乘法的权重因子为l/x2。
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| CN (1) | CN112924613A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115389677A (zh) * | 2022-09-13 | 2022-11-25 | 北京豪思生物科技股份有限公司 | 定量检测抗结核药物浓度的试剂、应用及试剂盒 |
| CN115480008A (zh) * | 2022-09-13 | 2022-12-16 | 北京豪思生物科技股份有限公司 | 高效液相串联质谱同时检测多种抗结核药物成分的方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102727497A (zh) * | 2011-12-31 | 2012-10-17 | 沈阳药科大学 | 利福平抗结核药物复方制剂的制备方法 |
| CN108333272A (zh) * | 2018-03-02 | 2018-07-27 | 重庆华邦胜凯制药有限公司 | Lc-msms法分离测定对氨基水杨酸及其相关杂质的方法 |
| CN110146620A (zh) * | 2019-06-11 | 2019-08-20 | 福建医科大学孟超肝胆医院(福州市传染病医院) | 一种uplc-ms/ms法同时检测血浆中五种抗结核药物的方法 |
| CN110441424A (zh) * | 2019-08-08 | 2019-11-12 | 江苏四环生物制药有限公司 | 一种液相色谱法分析测定吡嗪酰胺中有关物质的方法 |
| CN111766311A (zh) * | 2020-05-29 | 2020-10-13 | 南京品生医学检验实验室有限公司 | 一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗结核病药物的方法 |
-
2021
- 2021-01-31 CN CN202110132224.8A patent/CN112924613A/zh active Pending
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102727497A (zh) * | 2011-12-31 | 2012-10-17 | 沈阳药科大学 | 利福平抗结核药物复方制剂的制备方法 |
| CN108333272A (zh) * | 2018-03-02 | 2018-07-27 | 重庆华邦胜凯制药有限公司 | Lc-msms法分离测定对氨基水杨酸及其相关杂质的方法 |
| CN110146620A (zh) * | 2019-06-11 | 2019-08-20 | 福建医科大学孟超肝胆医院(福州市传染病医院) | 一种uplc-ms/ms法同时检测血浆中五种抗结核药物的方法 |
| CN110441424A (zh) * | 2019-08-08 | 2019-11-12 | 江苏四环生物制药有限公司 | 一种液相色谱法分析测定吡嗪酰胺中有关物质的方法 |
| CN111766311A (zh) * | 2020-05-29 | 2020-10-13 | 南京品生医学检验实验室有限公司 | 一种超高效液相色谱串联质谱技术检测血清中抗结核病药物的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 朱慧等: "LC-MS/MS方法同时检测人血浆中异烟肼、乙胺丁醇和吡嗪酰胺的浓度", 《药物分析杂志》 * |
| 赵冠人等: "HPLC-MS/MS方法同时检测人血浆中异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺和左氧氟沙星的浓度", 《中国药物应用与监测》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115389677A (zh) * | 2022-09-13 | 2022-11-25 | 北京豪思生物科技股份有限公司 | 定量检测抗结核药物浓度的试剂、应用及试剂盒 |
| CN115480008A (zh) * | 2022-09-13 | 2022-12-16 | 北京豪思生物科技股份有限公司 | 高效液相串联质谱同时检测多种抗结核药物成分的方法 |
| CN115389677B (zh) * | 2022-09-13 | 2023-06-30 | 北京豪思生物科技股份有限公司 | 定量检测抗结核药物浓度的试剂、应用及试剂盒 |
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