CN111763215A

CN111763215A - 一种具有含氮杂环结构的化合物及其制备方法和用途

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Publication number: CN111763215A
Application number: CN202010705735.XA
Authority: CN
Inventors: 刘冠锋; 杨茂; 李红波; 张俊; 刘龙飞; 拓方彬; 原晨光; 李英富
Original assignee: Chengdu Haibowei Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Chengdu Haibowei Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2020-07-21
Filing date: 2020-07-21
Publication date: 2020-10-13
Anticipated expiration: 2040-07-21
Also published as: CN111763215B

Abstract

本发明公开了一种具有含氮杂环结构的化合物及其制备方法和用途，该类化合物对表皮生长因子受体抑制剂EGFR具有明显的抑制作用，可作为EGFR抑制剂，用于制备治疗由EGFR介导的疾病的药物，所述由EGFR介导的疾病包括但不限于恶性肿瘤等，具有广阔的应用前景。

Description

一种具有含氮杂环结构的化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及药物化学技术领域，尤其涉及一种具有含氮杂环结构的化合物及其制备方法和用途。

背景技术

EGFR是表皮生长因子受体(HER)家族成员之一，EGFR信号通路对细胞的生长、增殖和分化等生理过程发挥重要的作用。研究表明在许多实体肿瘤中存在EGFR的高表达或异常表达。EGFR与肿瘤细胞的增殖、血管生成、肿瘤侵袭、转移及细胞凋亡的抑制有关。

研究表明，表皮生长因子受体EGFR能够激活细胞内下游信号通路，从而促进细胞***增殖，其主要在肺腺癌、亚裔、非吸烟及女性患者中，大约有15％的白种人和30～50％的亚洲人中有EGFR基因突变。EFGR活性突变(AMs)是非小细胞肺癌的常见驱动基因，其主要发生在EGFR基因的18/19/20/21外显子，导致EGFR即使在缺失配体的情况下也处于激活状态，使得下游信号通路持续处于超活化状态，引起细胞的恶性增殖(肿瘤)，因此，抑制不正常的EGFR信号通路，是***的策略之一。无吸烟史者的突变比例高达50～60％，常见的突变位点是外显子19和21，占90％，称为经典型突变，其余10％为外显子18和20的突变。EGFR外显子20***突变往往对EGFR-TKI耐药，预后较差。然而目前还没有获批的靶向药，标准治疗仍然是传统的细胞毒性化疗。

第一代EGFR抑制剂，如吉非替尼以及埃罗替尼，临床上约有70％的患者有明显药物应答反应，表现为肿瘤明显缩小，可见，EGFR是一个非常有效的作用靶点，但在10～16个月的治疗后，会产生耐药性，有近2/3的患者产生了二次获得性变异T790M。

通过分析产生耐药性的原因，在吉非替尼/埃罗替尼的基础上开发出了新一代的EGFR抑制剂，也称之为第二代EGFR-TKI。与第一代所不同的是，第二代化合物大多数采用了不可逆的共价键结合形式，比较成功典例如Afatinib、Dacomitinib，被FDA批准用于双突变的非小细胞肺癌治疗。虽然第二代药物能够克服耐药性问题，但是此类化合物存在较为严重的剂量依赖性副作用，如皮疹和腹泻，因此大大限制了其临床应用。

第三代EGFR抑制剂问世后，终于从根本解决了EGFR-T790M耐药突变问题。国际三代EGFR首次进入临床是2013年，截止今天，全球已有众多的三代EGFR小分子抑制剂进入了临床阶段。目前全球上市药物甲磺酸奥希替尼在2015到2019年的销售额分别为0.18亿美元、4.23亿美元、9.55亿美元、18.6亿美元和31.89亿美元年，远远高于前两代EGFR抑制剂，具有很大的市场前景。

奥希替尼尽管优秀，但在使用过程中，仍然不可避免的会产生C797S的耐药问题(即包含del19/T790M/C797S或L858R/T790M/C797S的顺式或反式三突变)，以及对20ins突变无能为力。对于20ins突变，TAK-788及波奇替尼具有较强的活性。(Poziotinib)是一种专门针对EGFR/HER2外显子20***突变的靶向药，被寄予厚望，先前的小规模的临床研究中治疗EGFR外显子20***突变的客观缓解率超过40％，但随着样本量扩大，客观缓解率却有下降趋势。因此，开发新的EGFR抑制剂具有重要意义。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种化合物，能够有效抑制表皮生长因子受体抑制剂EGFR。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：

提供一种化合物，具有式I所示结构或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体或其混合物形式、药学上可接受的水合物、溶剂化物或盐：

其中：

A选自C或N；

Y选自取代或非取代的含N单环基团、取代或非取代的含N螺环基团、取代或非取代的含N桥环基团、取代或非取代的含N并环基团，且N原子与羰基端相连；

B选自O或NR₄，R₄选自H、取代或非取代的烷基、取代或非取代的环烷基、取代或非取代杂烷基、取代或非取代的杂环烷基；

R₁每次出现时独立地选自氢、卤素、羟基、氰基、氨基、酯基、酰基、酰胺基、磺酰基、磷酰基、取代或非取代的烷基、取代或非取代的环烷基、取代或非取代杂烷基、取代或非取代的杂环烷基；

“R₁每次出现时独立地选自”，是指当限定R₁数量的n大于1时，不同的R₁可以选自相同或不同的基团。例如，n＝2，一个R₁可以选自取代或非取代的烷基，另一个R₁可以选自卤素；或者，n＝2，两个R₁可以均选自取代或非取代的烷基；其余类似情况同理。

R₂选自取代或非取代的烷基、取代或非取代的环烷基、取代或非取代杂烷基、取代或非取代的杂环烷基；

R₃选自氢、取代或非取代的烷基、取代或非取代的环烷基、取代或非取代杂烷基、取代或非取代的杂环烷基；

Y、R₁、R₂、R₃、R₄中所述取代的取代基选自氘、卤素、羟基、氰基、氨基、羧基、烷基、环烷基、杂烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、酯基、酰基、酰胺基、磺酰基、磷酰基；

n选自0、1、2、3、4、5；

当A为N且R₂为甲基时，Y不为

进一步地，Y选自取代或非取代的如下基团：

当A为N且R₂为甲基时，Y不为

进一步地，Y选自取代或非取代的如下基团：

当A为N且R₂为甲基时，Y不为

更进一步地，Y选自

在本发明的具体实施方式中，R₁选自氢、卤素、取代或非取代的C1～C6烷基；

进一步地，R₁选自卤素，n选自1、2、3；更进一步地，R₁选自F、Cl，n选自2、3。

进一步地，所述化合物具有式II所示结构或其互变异构体、内消旋体、外消旋体、对映异构体、非对映异构体或其混合物形式、药学上可接受的水合物、溶剂化物或盐：

在本发明的具体实施方式中，B选自O或NR₄，R₄选自H、取代或非取代的C1～C6烷基、取代或非取代2～6元N杂烷基，其中，取代基选自C1～C3烷基、卤素；

进一步地，R₄选自H、取代或非取代2～4元N杂烷基，其中，取代基选自C1～C3烷基；

更进一步地，B选自O、NH、NCH₂CH₂N(CH₃)₂，优选O、NH。

在本发明的具体实施方式中，R₂选自取代或非取代的C1～C3烷基，其中，取代基选自氘、卤素；

进一步地，R₂选自甲基、CD₃、CHF₂，优选甲基。

在本发明的具体实施方式中，R₃选自H、取代或非取代的C1～C6烷基、取代或非取代2～6元N杂烷基，其中，取代基选自C1～C3烷基、卤素；

更进一步地，R₃选自H、CH₂N(CH₃)₂，优选H。

在本发明中，所述“2～4元N杂烷基”是表示杂烷基的主链骨架原子的个数为2～4，其余类似情况同理。

在本发明的具体实施方式中，所述化合物结构选自如下之一：

本发明还提供了一种药用组合物，该药用组合物活性成份选自上述的化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、药学上可接受的盐或共晶中的一种或两种以上的组合。

本发明还提供了上述化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、药学上可接受的盐或共晶在制备表皮生长因子受体抑制剂中的用途；进一步地，所述表皮生长因子受体抑制剂为EGFR抑制剂。

本发明还提供了上述化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、药学上可接受的盐或共晶在制备治疗致使EGFR过度表达的疾病的药物中的用途。

本发明还提供了上述化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、药学上可接受的盐或共晶在制备治疗EGFR过度表达所致疾病的药物中的用途。

本发明还提供了上述化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、药学上可接受的盐或共晶在制备用于治疗癌症中的任意一种或多种疾病的药物中的用途。

本发明还提供了上述化合物的制备方法，包括如下内容：

(1)将化合物c与化合物d在碱的作用下反应得到化合物e；

进一步地，所述碱可以选自碳酸钠、碳酸钾等等，在本发明的具体实施方式中，所述碱为碳酸钾。

(2)将化合物e脱去Boc保护基团，生成化合物f；

脱除Boc保护基团为有机合成领域的常规反应，凡是本领域可实现Boc基团脱除的方法均可适用于本发明；在本发明的具体实施方式中，是通过在三氟乙酸的条件下脱除Boc基团。

(3)将化合物f在碱性条件下与化合物g反应生成化合物h。

步骤(3)中加入的碱可以碳酸钠、碳酸钾等等，在本发明的具体实施方式中，步骤(3)中加入的碱为碳酸钠，溶剂为THF/water体积比为5/1的混合溶剂。

本发明还提供了上述化合物另一种制备方法，包括如下内容：

(1)将化合物i与化合物b在酸性条件下生成化合物j；

在本发明的具体实施方式中，是通过添加盐酸促使化合物i与化合物b反应。

(2)将化合物j中的卤素与化合物k中的氨基进行交叉偶联反应生成化合物l；

在本领域内，能够使卤代芳烃与胺发生反应的方法有很多，均可以适用于本发明中，如Buchwald偶联等。

(3)将化合物l脱去Boc保护基团，生成化合物m；

(4)将化合物m在碱性条件下与化合物g反应生成化合物n。

步骤(4)中加入的碱可以碳酸钠、碳酸钾等等，在本发明的具体实施方式中，步骤(4)中加入的碱为碳酸钠，溶剂为THF/water体积比为5/1的混合溶剂。

本发明还提供了上述化合物的又一种制备方法，包括如下内容：

R₂不为甲基；

(1)将化合物c脱除甲基得化合物o；

脱除甲氧基上的甲基为有机合成领域的常规反应，凡是本领域可实现甲氧基上的甲基脱除的方法均可适用于本发明；在本发明的具体实施方式中，是通过化合物c与吡啶盐酸盐混合，升温至170℃左右的条件下脱除甲基。

(2)将化合物o与化合物d在碱的作用下生成化合物p；

(3)将化合物p在碱的作用下与CD3I或2-氯-2,2-二氟-1-苯基乙烷-1-酮反应生成化合物q；

(4)将化合物q脱去Boc保护基团，生成化合物r；

(5)将化合物r在碱性条件下与化合物g反应生成化合物s。

步骤(5)中加入的碱可以碳酸钠、碳酸钾等等，在本发明的具体实施方式中，步骤(5)中加入的碱为碳酸钠，溶剂为THF/water体积比为5/1的混合溶剂。

含有本发明化合物或其立体异构体、溶剂化物、水合物、药学上可接受的盐或共晶的药物组合物中，可以含有药学上可接受的辅料。

本发明中所述“药学上可接受的”是指包括任意不干扰活性成分的生物活性的有效性且对它被给予的宿主无毒性的物质。

本发明所述药学上可接受的辅料，是药物中除主药以外的一切附加材料的总称，辅料应当具备如下性质：(1)对人体无毒害作用，几无副作用；(2)化学性质稳定，不易受温度、pH、保存时间等的影响；(3)与主药无配伍禁忌，不影响主药的疗效和质量检查；(4)不与包装材料相互发生作用。本发明中辅料包括但不仅限于填充剂(稀释剂)、润滑剂(助流剂或抗粘着剂)、分散剂、湿润剂、粘合剂、调节剂、增溶剂、抗氧剂、抑菌剂、乳化剂、崩解剂等。粘合剂包含糖浆、***胶、明胶、山梨醇、黄芪胶、纤维素及其衍生物(如微晶纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素或羟丙甲基纤维素等)、明胶浆、糖浆、淀粉浆或聚乙烯吡咯烷酮等；填充剂包含乳糖、糖粉、糊精、淀粉及其衍生物、纤维素及其衍生物、无机钙盐(如硫酸钙、磷酸钙、磷酸氢钙、沉降碳酸钙等)、山梨醇或甘氨酸等；润滑剂包含微粉硅胶、硬脂酸镁、滑石粉、氢氧化铝、硼酸、氢化植物油、聚乙二醇等；崩解剂包含淀粉及其衍生物(如羧甲基淀粉钠、淀粉乙醇酸钠、预胶化淀粉、改良淀粉、羟丙基淀粉、玉米淀粉等)、聚乙烯吡咯烷酮或微晶纤维素等；湿润剂包含十二烷基硫酸钠、水或醇等；抗氧剂包含亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、二丁基苯酸等；抑菌剂包含0.5％苯酚、0.3％甲酚、0.5％三氯叔丁醇等；调节剂包含盐酸、枸橼酸、氢氧化钾(钠)、枸橼酸钠及缓冲剂(包括磷酸二氢钠和磷酸氢二钠)等；乳化剂包含聚山梨酯-80、没酸山梨坦、普流罗尼克F-68，卵磷酯、豆磷脂等；增溶剂包含吐温-80、胆汁、甘油等。术语“药学上可接受的盐”指本发明化合物与酸或碱所形成的适合用作药物的盐。上述酸碱为广义的路易斯酸碱。适合形成盐的酸包括但并不限于：盐酸、氢溴酸、氢氟酸、硫酸、硝酸、磷酸等无机酸，甲酸、乙酸、丙酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苦味酸、甲磺酸、苯甲磺酸，苯磺酸等有机酸；以及天冬氨酸、谷氨酸等酸性氨基酸。

本发明化合物或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。

用于口服给药的固体剂型包括胶囊剂、片剂、丸剂、散剂和颗粒剂。在这些固体剂型中，活性化合物与至少一种常规惰性赋形剂(或载体)混合，如柠檬酸钠或磷酸二钙，或与下述成分混合：(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和***胶；(c)保湿剂，例如，甘油；(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；(e)缓溶剂，例如石蜡；(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；(h)吸附剂，例如，高岭土；和(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。

固体剂型如片剂、糖丸、胶囊剂、丸剂和颗粒剂可采用包衣和壳材制备，如肠衣和其它本领域公知的材料。它们可包含不透明剂，并且，这种组合物中活性化合物或化合物的释放可以延迟的方式在消化道内的某一部分中释放。可采用的包埋组分的实例是聚合物质和蜡类物质。必要时，活性化合物也可与上述赋形剂中的一种或多种形成微胶囊形式。

用于口服给药的液体剂型包括药学上可接受的乳液、溶液、悬浮液、糖浆或酊剂。除了活性化合物外，液体剂型可包含本领域中常规采用的惰性稀释剂，如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，例如，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。

除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。

除了活性化合物外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

用于局部给药的本发明化合物的剂型包括软膏剂、散剂、贴剂、喷射剂和吸入剂。活性成分在无菌条件下与生理上可接受的载体及任何防腐剂、缓冲剂，或必要时可能需要的推进剂一起混合。

本发明化合物同样可以用于注射制剂。其中，所述注射剂选自液体注射剂(水针)、注射用无菌粉末(粉针)或注射用片剂(系指药物用无菌操作法制成的模印片或机压片，临用时用注射用水溶解，供皮下或肌肉注射之用)。

其中，所述注射用粉剂的中除含有上述化合物外，还至少含有赋形剂。本发明中所述赋形剂，为有意加到药物中的成分，其在所用的量上不应具有药理学特性，但是，赋形剂可以有助于药物的加工、溶解或溶出、通过靶向给药途径递药或有助于稳定性。

“取代”是指分子中的氢原子被其它不同的原子或分子所替换。

“烷基”，是指脂肪族烃基团，指饱和烃基。烷基部分可以是直链烷基，亦可以是支链烷基。典型的烷基包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、己基等等。

本发明中使用的C1～Cn包括C1～C2、C1～C3……C1～Cn，n为大于一的整数；作为取代基的前缀表示取代基中碳原子个数的最小值和最大值，例如，“C1～C6烷基”是指含有一个至6个碳原子的直链或支链的烷基。

“杂烷基”是指含有一个或多个N、O、S、P、B等杂原子的烷基。

“酰胺基”是具有式-C(O)NHR或-NHC(O)R的化学结构，其中R可选自烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基等。

“磺酰基”是具有式-S(＝O)₂R的化学结构，包括磺酰胺基，其中R可选自烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、氨基等；

“磷酰基”是具有式-P(＝O)RR’的化学结构，其中R、R’可别独立选自烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、羟基、氨基等；

“酯基”是指具有式-COOR的化学结构，其中R选自烷基、杂烷基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基。

“环烷基”指饱和或不饱和的环状烃取代基例如，“C3～C6环烷基”指环骨架结构碳原子数为3～6的环烷基。

“杂环烷基”指环骨架上含有至少一个杂原子的环烷基。

杂原子包括但不限于O、S、N、P、Si等。

“环”是指任意的共价封闭结构，包括例如碳环(例如芳基或环烷基)、杂环(例如杂芳基或杂环烷基)、芳香基(如芳基或杂芳基)、非芳香基(如环烷基或杂环烷基)。本发明中所述“环”可以是单环也可以是多环，可以是并环、螺环或桥环。

典型的杂环烷基包括但不限于：

“芳基”，是指平面环具有离域的π电子***并且含有4n+2个π电子，其中n是整数。芳基环可以由五、六、七、八、九或多于九个原子构成。芳基包括但不限于苯基、萘基、菲基、蒽基、芴基和茚基等。

典型的杂芳基包括但不限于：

“卤素”或“卤”是指氟、氯、溴或碘。

文中所述烷基、杂烷基、环基、杂环基、氨基、酯基、羰基、酰胺基、磺酰基、磷酰基、硼酸基、硼酸酯基、胍基、酰胍基、芳基、杂芳基等，可以是非取代的烷基、杂烷基、环基、杂环基、氨基、酯基、羰基、酰胺基、磺酰基、磷酰基、硼酸基、硼酸酯基、胍基、酰胍基、芳基、杂芳基，也可以是取代的烷基、杂烷基、环基、杂环基、氨基、酯基、羰基、酰胺基、磺酰基、磷酰基、硼酸基、硼酸酯基、胍基、酰胍基、芳基、杂芳基。

上文中，除已经指明的外，所述“取代”是指所提及的基团可以被一个或多个额外的基团取代，所述额外的基团各自并且独立地选自烷基、环烷基、芳基、羧基、杂芳基、杂环烷基、羟基、烷氧基、烷硫基、芳氧基、硝基、酰基、卤素、卤代烷基、氨基等等。

本发明的有益效果是：

(1)本发明提供了一系列具有抑制EGFR活性的化合物，试验表明其对EGFR的具有明显的抑制作用，为以EGFR为治疗的靶点的疾病如恶性肿瘤疾病等的治疗提供新的方案，可用于制备治疗相关疾病的药物，具有广阔的应用前景。

(2)本发明化合物相对于波奇替尼对蛋白质激酶抑制剂活性更好或相当，肝微粒体稳定性更佳，具有较大的开发价值。

具体实施方式

下面对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中，化合物的结构是通过质谱(MS)或核磁共振(1HNMR)设备来确定的。术语“室温”是指10℃～25℃之间。化学缩写简称具有以下意义：

NMP：N-甲基吡咯烷酮；

EA：乙酸乙酯；

THF：四氢呋喃；

DMA：N,N-二甲基乙酰胺；

DMF：N,N-二甲基甲酰胺；

TLC：薄层色谱；

PE是指石油醚(沸点60～90℃)；

DCM：二氯甲烷；

H₂O：蒸馏水；

DMSO:二甲基亚砜；

TFA：三氟乙酸；

Pd₂(dba)₃：3,3,6,6-四甲基-9-(1,2,3,4-四羟基丁基)-4,5,7,9-四氢-2H-杂蒽-1,8-二酮)；

x-phos：2-二环己基磷-2,4,6-三异丙基联苯；

1,4-dioxane：1,4-二氧六环。

中间体的制备

中间体1：4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-醇的制备

步骤1：4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-乙酸酯的制备

将化合物4-氯-7-甲氧基喹唑啉-6-乙酸酯(4.00g，15.87mmol)溶于NMP(60mL)中，向其中加入3,4-二氯-2-氟苯胺(2.84g，15.87mmol)，升温至110℃搅拌4小时。TLC点板检测，原料反应完毕后，将反应液冷却至室温。向反应液中加入水(600mL)，采用EA萃取3次。合并有机相并用饱和NaCl水溶液洗涤1次。Na₂SO₄干燥后浓缩至干，将得到的粗品直接用于下一步反应中。

EM(计算值)：395.0；MS(ESI)m/z(M+H)+：396.0

步骤2：4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-醇的制备将粗品4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-乙酸酯分散于乙腈(100mL)中，体系呈灰白色悬浊液。向体系中滴加氨水(50mL,28％in H₂O)，于室温下搅拌40分钟。将反应液过滤，滤饼依次用少量水和乙腈洗涤，干燥后，得到目标化合物(4.90g，两步反应收率为87.5％)，呈灰白色固体。

EM(计算值)：353.0；MS(ESI)m/z(M+H)⁺：354.0

中间体2：4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹啉-6-醇的制备

步骤1：6-(苄氧基)-N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-7-甲氧基喹啉-4-胺的制备

将化合物6-(苄氧基)-4-氯-7-甲氧基喹啉(5.00g，16.72mmol)溶于NMP(50mL)中，向其中加入3,4-二氯-2-氟苯胺(2.99g，16.72mmol)，溶解后再加入浓盐酸(10mL)，升温至110℃搅拌过夜。反应完毕后，将反应液冷却至室温，在冰水浴下搅拌并向其中缓慢加入乙腈(50mL)。析出大量固体，过滤收集固体并用少量乙腈淋洗，干燥后得到目标化合物(4.46g，收率为60.3％)，呈白色固体。

EM(计算值)：442.1；MS(ESI)m/z(M+H)⁺：443.2

步骤2：4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹啉-6-醇的制备

将化合物6-(苄氧基)-N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-7-甲氧基喹啉-4-胺(4.40g，9.95mmol)溶于THF/MeOH(44mL,10/1)中，向其中加Pd/C(440mg，10％W/W)，于室温下搅拌3小时。反应完毕后，将反应液过滤，将滤饼用少量的甲醇洗涤。将滤液浓缩至干，得到目标化合物(3.12g，收率为89.2％)，呈棕色固体。

EM(计算值)：352.0；MS(ESI)m/z(M+H)⁺：353.1

中间体3：6-溴-N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺的制备

将化合物6-溴-4-氯-7-甲氧基喹唑啉(2.50g，9.19mmol)溶于溶于NMP(20mL)中，向其中加入3,4-二氯-2-氟苯胺(2.84g，9.19mmol)，升温至110℃搅拌6小时。反应完毕，将反应液冷却后，向其中加入水(200mL)，用EA萃取3次。合并有机相并用饱和NaCl水溶液洗涤1次。无水Na₂SO₄干燥后，浓缩至干，将得到的粗品采用柱层析纯化(PE/EA＝3/1～1/1),得到目标化合物(1.68g，收率为44.1％)，呈黄色固体。

EM(计算值)：414.9；MS(ESI)m/z(M+H)⁺：416.0。

中间体4：6-溴-N-(3-氯-4-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺的制备

将化合物6-溴-4-氯-7-甲氧基喹唑啉(1.00g，3.68mmol)溶于溶于NMP(20mL)中，向其中加入3-氯-4-氟苯胺(0.53g，3.68mmol)，升温至110℃搅拌过夜。反应完毕，将反应液冷却后，向其中加入水(200mL)，用EA萃取3次。合并有机相并用饱和NaCl水溶液洗涤1次。无水Na₂SO₄干燥后，浓缩至干，将得到的粗品采用柱层析纯化(PE/EA＝3/1～1/1),得到目标化合物(737mg，收率为52.6％)，呈黄色固体。

EM(计算值)：381.0；MS(ESI)m/z(M+H)⁺：382.0。

中间体5：6-溴-N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-7-甲氧基喹啉-4-胺的制备

将化合物6-溴-4-氯-7-甲氧基喹啉(3.00g，11.07mmol)溶于NMP(30mL)中，向其中加入3,4-二氯-2-氟苯胺(1.98g，11.07mmol)，溶解后再加入浓盐酸(5mL)，升温至110℃搅拌过夜。反应完毕后，将反应液冷却至室温，在冰水浴下搅拌并向其中缓慢加入乙腈(30mL)。析出大量固体，过滤收集固体并用少量乙腈淋洗，干燥后得到目标化合物(2.60g，收率为56.8％)，呈黄色固体。

EM(计算值)：413.9；MS(ESI)m/z(M+H)⁺：415.0

中间体6：4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)喹唑啉-6,7-二醇的制备

将化合物4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-醇(500mg，1.42mmol)与吡啶盐酸盐(2.00g，17.39mmol)混合，氮气保护下升温至170℃搅拌4小时。反应完毕后，将反应液冷却至室温，搅拌下向其中加入水(10mL)。析出大量固体，过滤收集固体，干燥后得到目标化合物(252mg，收率为52.3％)，呈灰白色固体。

EM(计算值)：339.0；MS(ESI)m/z(M+H)⁺：340.0

实施例1

1-(1R,5S)-(3-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)丙-2-烯-1-酮的制备

步骤1：(1R,5S)-3-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-叔丁基甲酸酯的制备

将化合物4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-醇(200mg，0.57mmol)和(1R,5S)-3-(对甲苯氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-叔丁酯甲酸酯(328mg，0.86mmol)加入到DMF(10mL)中，向其中加入碳酸钾(157mg，1.14mmol)，升温至70℃搅拌过夜。反应完毕后，将反应液冷却至室温，向其中加入水(100mL)。用EA萃取3次。合并有机相并用饱和NaCl水溶液洗涤1次。无水Na₂SO₄干燥后浓缩至干，将得到的粗品采用柱层析纯化(PE/EA＝10/1～1/1),得到目标化合物(80mg，收率为25.0％)，呈白色固体。

EM(计算值)：562.2；MS(ESI)m/z(M+H)⁺：563.2

步骤2：6-((1R,5S)-8-氮杂二环[3.2.1]辛烷-3-基)氧基)-N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺.三氟乙酸盐的制备

将化合物(1R,5S)-3-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-叔丁基甲酸酯(80mg，0.14mmol)溶于DCM(5mL)中，向其中加入TFA(1mL)，于室温下搅拌2小时。反应完毕后，将反应液浓缩至干，将得到的粗品直接用于下一步反应中。

EM(计算值)：462.1；MS(ESI)m/z(M+H)⁺：463.2

步骤3：1-(1R,5S)-(3-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)丙-2-烯-1-酮的制备

将化合物6-((1R,5S)-8-氮杂二环[3.2.1]辛烷-3-基)氧基)-N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺.三氟乙酸盐(粗品)溶于THF/water(5mL，5/1)中，向其中加入碳酸钠(74mg，0.70mmol)并于冰水浴下搅拌10分钟。将丙烯酰氯(13mg，0.14mmol)滴加到反应体系中，将反应液升至室温，继续搅拌1小时。反应完毕后，向反应体系中加入水(10mL)，用EA萃取3次。合并有机相并用无水Na₂SO₄干燥。浓缩至干，将得到的粗品采用柱层析纯化(PE/EA＝10/1),得到目标化合物(45mg，两步反应总收率为62.3％)，呈白色固体。

EM(计算值)：516.1；MS(ESI)m/z(M+H)⁺：517.2

1H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ1.86-1.88(1H,m),1.99-2.06(3H,m),2.10-2.19(2H,m),2.25-2.27(2H,m),3.97(3H,s),4.54-4.56(2H,m),4.85-4.88(1H,m),5.68-5.71(1H,m),6.21(1H,d,J＝2.0Hz),6.70-6.75(1H,m),7.27(1H,s),7.59-7.62(2H,m),7.74(1H,s),8.40(1H,s),9.61(1H,s).

实施例2～5的化合物参照实施例1所示方法合成：

表1

实施例6

1-(4-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹啉-6-基)氧基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮

步骤1：4-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧喹啉-6-基)氧基)哌啶-1-羧酸叔丁酯的制备

将化合物4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹啉-6-醇(120mg，0.34mmol)和4-(对氧基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(181mg，0.51mmol)加入到DMF(4mL)中，向其中加入碳酸钾(94mg，0.68mmol)，升温至70℃搅拌过夜。反应完毕后，将反应液冷却至室温，向其中加入水(100mL)。用EA萃取3次。合并有机相并用饱和NaCl水溶液洗涤1次。无水Na₂SO₄干燥后浓缩至干，将得到的粗品采用柱层析纯化(PE/EA＝10/1～3/1),得到目标化合物(60mg，收率为33.0％)，呈棕色固体。

EM(计算值)：535.1；MS(ESI)m/z(M+H)⁺：536.2

步骤2：N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-7-甲氧基-6-(哌啶-4-基氧基)喹啉-4-胺.三氟乙酸盐的制备

将化合物4-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧喹啉-6-基)氧基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(60mg，0.11mmol)溶于DCM(5mL)中，向其中加入TFA(1mL)，于室温下搅拌2小时。反应完毕后，将反应液浓缩至干，将得到的粗品直接用于下一步反应中。

EM(计算值)：435.1；MS(ESI)m/z(M+H)⁺：436.1

步骤3：1-(4-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹啉-6-基)氧基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮的制备

将化合物N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-7-甲氧基-6-(哌啶-4-基氧基)喹啉-4-胺.三氟乙酸盐(粗品)溶于THF/water(5mL，5/1)中，向其中加入碳酸钠(58mg，0.55mmol)并于冰水浴下搅拌10分钟。将丙烯酰氯(10mg，0.11mmol)滴加到反应体系中，将反应液升至室温，继续搅拌1小时。反应完毕后，向反应体系中加入水(10mL)，用EA萃取3次。合并有机相并用无水Na₂SO₄干燥。浓缩至干，将得到的粗品采用柱层析纯化(PE/EA＝10/1),得到目标化合物(12mg，两步反应总收率为22.3％)，呈类白色固体。

EM(计算值)：489.1；MS(ESI)m/z(M+H)⁺：490.1

1H NMR(400MHz,CDCl₃)δ1.85-1.95(2H,m),2.06-2.17(2H,m),3.61-3.66(2H,m),3.84-3.92(1H,m),3.90(3H,s),4.03-4.11(1H,m),5.00-5.09(1H,m),5.70-5.73(1H,m),6.27-6.31(1H,m),6.42(1H,s),6.58-6.65(1H,m),7.20-7.22(1H,m),7.33-7.36(2H,m),7.44(1H,s),7.95-8.05(2H,m).

实施例7的化合物参照实施例6所示方法合成：

表2

实施例8 1-((1R,5S)-3-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)丙-2-烯-1-酮的制备

步骤1：(1R,5S)-3-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-叔丁基甲酸酯的制备

将化合物6-溴-N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4-胺(200mg，0.48mmol)，(1R，5S)-3-3-氨基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羧酸叔丁酯(163mg，0.72mmol)，Pd₂(dba)₃(46mg，0.05mmol)，x-phos(48mg，0.10mmol)和叔丁醇钠(92mg，0.96mmol)分散于DMA(8mL)中，氮气保护下置于预热到100℃的油浴锅中，搅拌2小时。反应完毕后，将反应液冷却至室温，向其中加入水(80mL)，搅拌5分钟。用EA萃取3次，合并有机相并用饱和NaCl水溶液洗涤1次。Na₂SO₄干燥后浓缩至干，将得到的粗品采用柱层析纯化(DCM/MeOH＝50/1),得到目标化合物(137mg，收率为51.1％)，呈白色固体。

EM(计算值)：561.2；MS(ESI)m/z(M+H)⁺：562.2

步骤2：N⁶-((1R,5S)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-N⁴-(3,4-二氯-2-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4,6-二胺.三氟乙酸盐的制备

将化合物(1R,5S)-3-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-叔丁基甲酸酯(135mg，0.24mmol)溶于DCM(15mL)中，向其中加入TFA(2mL)，于室温下搅拌2小时。反应完毕后，将反应液浓缩至干，将得到的粗品直接用于下一步反应中。

EM(计算值)：461.1；MS(ESI)m/z(M+H)⁺：462.1

步骤3：1-((1R,5S)-3-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)丙-2-烯-1-酮的制备

将化合物N⁶-((1R,5S)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-N⁴-(3,4-二氯-2-氟苯基)-7-甲氧基喹唑啉-4,6-二胺.三氟乙酸盐(粗品)溶于THF/water(10mL，5/1)中，向其中加入碳酸钠(127mg，1.20mmol)并于冰水浴下搅拌10分钟。将丙烯酰氯(22mg，0.24mmol)滴加到反应体系中，将反应液升至室温，继续搅拌1小时。反应完毕后，向反应体系中加入水(10mL)，用EA萃取3次。合并有机相并用无水Na₂SO₄干燥。浓缩至干，将得到的粗品采用柱层析纯化(DCM/MeOH＝100/1),得到目标化合物(47mg，两步反应总收率为37.9％)，呈黄色固体。

EM(计算值)：515.1；MS(ESI)m/z(M+H)⁺：516.1

1H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ1.51-1.56(1H,m),1.60-1.66(1H,m),1.88-1.94(1H,m),1.99-2.13(5H,m),3.93(3H,s),4.05-4.10(1H,m),4.57-4.59(2H,m),5.37(1H,d,J＝9.2Hz),5.69(1H,dd,J＝10.4Hz,2.4Hz),6.16-6.21(1H,m),6.70-6.76(1H,m),7.07(1H,s),7.13(1H,s),7.58(1H,dd,J＝8.0Hz,1.2Hz),7.64-7.68(1H,m),8.25(1H,s),9.33(1H,s).

实施例9、10、15、16的化合物参照实施例8所示方法合成：

表3

实施例11

1-((1R,5S)-3-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹啉-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)丙-2-烯-1-酮的制备

步骤1：(1R,5S)-3-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹啉-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-叔丁基甲酸酯的制备

将化合物6-溴-N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-7-甲氧基喹啉-4-胺(300mg，0.72mmol)，(1R,5S)-3-氨基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羧酸叔丁酯(244mg，1.08mmol)，Pd₂(dba)₃(64mg，0.07mmol)，x-phos(67mg，0.14mmol)和叔丁醇钠(138mg，1.44mmol)分散于1,4-dioxane(20mL)中，氮气保护下置于预热到100℃的油浴锅中，搅拌4小时。反应完毕后，将反应液冷却至室温并浓缩至干，将得到的粗品采用柱层析纯化(DCM/MeOH＝50/1),得到目标化合物(192mg，收率为47.6％)，呈黄色固体。

EM(计算值)：560.2；MS(ESI)m/z(M+H)⁺：561.2

步骤2：N⁶-((1R,5S)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-N⁴-(3,4-二氯-2-氟苯基)-7-甲氧基喹啉-4,6-二胺.三氟乙酸盐的制备

将化合物(1R,5S)-3-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹啉-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-叔丁基甲酸酯(190mg，0.34mmol)溶于DCM(15mL)中，向其中加入TFA(2mL)，于室温下搅拌2小时。反应完毕后，将反应液浓缩至干，将得到的粗品直接用于下一步反应中。

EM(计算值)：460.1；MS(ESI)m/z(M+H)⁺：461.1

步骤3：1-((1R,5S)-3-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-甲氧基喹啉-6-基)氨基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)丙-2-烯-1-酮的制备

将化合物N⁶-((1R，5S)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-3-基)-N⁴-(3,4-二氯-2-氟苯基)-7-甲氧基喹啉-4,6-二胺.三氟乙酸盐(粗品)溶于THF/water(15mL，5/1)中，向其中加入碳酸钠(180mg，1.70mmol)并于冰水浴下搅拌10分钟。将丙烯酰氯(31mg，0.34mmol)滴加到反应体系中，将反应液升至室温，继续搅拌1小时。反应完毕后，向反应体系中加入水(10mL)，用EA萃取3次。合并有机相并用无水Na₂SO₄干燥。浓缩至干，将得到的粗品采用柱层析纯化(DCM/MeOH＝100/1),得到目标化合物(53mg，两步反应总收率为30.3％)，呈类白色固体。

EM(计算值)：514.1；MS(ESI)m/z(M+H)⁺：515.1

1H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ1.50-1.62(2H,m),1.83-1.87(2H,m),1.91-2.06(4H,m),3.94(3H,s),3.97-4.04(1H,m),4.52-4.54(2H,m),5.47(1H,d,J＝9.2Hz),5.69(1H,dd,J＝10.4Hz,2.4Hz),6.18(1H,dd,J＝16.8Hz,2.4Hz),6.56(1H,dd,J＝6.0Hz,2.0Hz),6.69-6.75(1H,m),7.02(1H,s),7.20(1H,s),7.32-7.36(1H,m),7.58(1H,dd,J＝9.0Hz,1.4Hz),8.24(1H,d,J＝5.6Hz),9.21(1H,brs).

实施例12的化合物参照实施例11所示方法合成：

表4

实施例13

1-(4-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-(二氟甲氧基)喹唑啉-6-基)氧基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮的制备

步骤1：4-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-羟基喹唑啉-6-基)氧基)哌啶-1-叔丁基甲酸酯的制备

将化合物4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)喹唑啉-6,7-二醇(200mg，0.59mmol)和4-(对氧基)哌啶-1-羧酸叔丁酯(188mg，0.53mmol)加入到DMF(10mL)中，向其中加入碳酸钾(98mg，0.71mmol)，升温至50℃搅拌过夜。反应完毕后，将反应液冷却至室温，向其中加入水(100mL)。用EA萃取3次。合并有机相并用饱和NaCl水溶液洗涤1次。无水Na₂SO₄干燥后浓缩至干，将得到的粗品采用柱层析纯化(PE/EA＝1/1),得到目标化合物(93mg，收率为30.2％)，呈白色固体。

EM(计算值)：522.1；MS(ESI)m/z(M+H)⁺：523.2

步骤2：4-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-(二氟甲氧基)喹唑啉-6-基)氧基)哌啶-1-叔丁基甲酸酯的制备

将化合物4-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-羟基喹唑啉-6-基)氧基)哌啶-1-叔丁基甲酸酯(70mg，0.13mmol)和2-氯-2,2-二氟-1-苯基乙烷-1-酮(49mg，0.26mmol)加入到乙腈/水(10mL，5/1)中，向其中加入碳酸钾(36mg，0.26mmol)，升温至80℃搅拌1小时。反应完毕后，将反应液冷却至室温，向其中加入水(50mL)。用EA萃取3次，无水Na₂SO₄干燥后浓缩至干，将得到的粗品采用柱层析纯化(DCM/MeOH＝70/1),得到目标化合物(30mg，收率为40.5％)，呈黄色固体。

EM(计算值)：572.1；MS(ESI)m/z(M+H)⁺：573.2

步骤3：N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-7-(二氟甲氧基)-6-(哌啶-4-氧基)喹唑啉-4-胺.三氟乙酸盐的制备

将化合物4-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-(二氟甲氧基)喹唑啉-6-基)氧基)哌啶-1-叔丁基甲酸酯(30mg，0.05mmol)溶于DCM(5mL)中，向其中加入TFA(1mL)，于室温下搅拌2小时。反应完毕后，将反应液浓缩至干，将得到的粗品直接用于下一步反应中。

EM(计算值)：472.1；MS(ESI)m/z(M+H)⁺：473.1

步骤4：1-(4-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-(二氟甲氧基)喹唑啉-6-基)氧基)哌啶-1-基)丙-2-烯-1-酮的制备

将化合物N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-7-(二氟甲氧基)-6-(哌啶-4-氧基)喹唑啉-4-胺.三氟乙酸盐(粗品)溶于THF/water(5mL，5/1)中，向其中加入碳酸钠(27mg，0.25mmol)并于冰水浴下搅拌10分钟。将丙烯酰氯(5mg，0.05mmol)滴加到反应体系中，将反应液升至室温，继续搅拌30分钟。反应完毕后，向反应体系中加入水(5mL)，用EA萃取3次。合并有机相并用无水Na₂SO₄干燥。浓缩至干，将得到的粗品采用TLC纯化(DCM/MeOH＝60/1),得到目标化合物(10mg，两步反应总收率为38.0％)，呈类白色固体。

EM(计算值)：526.1；MS(ESI)m/z(M+H)⁺：527.1

1H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ1.67-1.77(2H,m),1.96-2.08(2H,m),3.48-3.57(2H,m),3.78-3.85(2H,m),4.99-5.05(1H,m),5.68-5.71(1H,m),6.10-6.15(1H,m),6.82-6.89(1H,m),7.19(1H,t,J＝73.6Hz),7.51-7.53(2H,m),7.55-7.59(2H,m),8.04(1H,brs),8.30(1H,s),8.45(1H,s).

实施例14

1-((1R,5S)-3-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-(甲氧基-d₃)喹唑啉-6-基)氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)丙-2-烯-1-酮的制备

步骤1：(1R,5S)-3-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-羟基喹唑啉-6-基)氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-叔丁基甲酸酯的制备

将化合物4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)喹唑啉-6,7-二醇(250mg，0.74mmol)和(1R,5S)-3-(对甲苯氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-羧酸叔丁酯(252mg，0.66mmol)加入到DMF(10mL)中，向其中加入碳酸钾(153mg，1.11mmol)，升温至50℃搅拌过夜。反应完毕后，将反应液冷却至室温，向其中加入水(100mL)。用EA萃取3次。合并有机相并用饱和NaCl水溶液洗涤1次。无水Na₂SO₄干燥后浓缩至干，将得到的粗品采用柱层析纯化(PE/EA＝1/1),得到目标化合物(107mg，收率为29.6％)，呈白色固体。

EM(计算值)：548.1；MS(ESI)m/z(M+H)⁺：549.2

步骤2：(1R,5S)-3-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-(甲氧基-d₃)喹唑啉-6-基)氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-叔丁基甲酸酯的制备

将化合物(1R,5S)-3-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-羟基喹唑啉-6-基)氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-叔丁基甲酸酯(105mg，0.19mmol)和碳酸钾(40mg，0.29mmol)加入到乙腈(10mL)中，向其中加入氘代碘甲烷(28mg，0.19mmol)，于室温下搅拌3小时。反应完毕后，将反应液冷却至室温，向其中加入水(50mL)。用EA萃取3次，无水Na₂SO₄干燥后浓缩至干，将得到的粗品采用柱层析纯化(DCM/MeOH＝100/1),得到目标化合物(60mg，收率为56.1％)，呈黄色固体。

EM(计算值)：565.2；MS(ESI)m/z(M+H)⁺：566.2

步骤3：6-((1R,5S)-8-氮杂二环[3.2.1]辛烷-3-基)氧基)-N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-7-(甲氧基-d₃)喹唑啉-4-胺.三氟乙酸盐的制备

将化合物(1R,5S)-3-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-(甲氧基-d₃)喹唑啉-6-基)氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-叔丁基甲酸酯(60mg，0.11mmol)溶于DCM(6mL)中，向其中加入TFA(1mL)，于室温下搅拌2h。反应完毕后，将反应液浓缩至干，将得到的粗品直接用于下一步反应中。

EM(计算值)：465.1；MS(ESI)m/z(M+H)⁺：466.2

步骤4：1-((1R,5S)-3-((4-((3,4-二氯-2-氟苯基)氨基)-7-(甲氧基-d₃)喹唑啉-6-基)氧基)-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷-8-基)丙-2-烯-1-酮的制备

将化合物6-((1R,5S)-8-氮杂二环[3.2.1]辛烷-3-基)氧基)-N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-7-(甲氧基-d₃)喹唑啉-4-胺.三氟乙酸盐(粗品)溶于THF/water(5mL，5/1)中，向其中加入碳酸钠(58mg，0.55mmol)并于冰水浴下搅拌10分钟。将丙烯酰氯(10mg，0.11mmol)滴加到反应体系中，将反应液升至室温，继续搅拌30分钟。反应完毕后，向反应体系中加入水(5mL)，用EA萃取3次。合并有机相并用无水Na₂SO₄干燥。浓缩至干，将得到的粗品采用TLC纯化(DCM/MeOH＝60/1),得到目标化合物(14mg，两步反应总收率为24.6％)，呈类白色固体。

EM(计算值)：519.1；MS(ESI)m/z(M+H)⁺：520.1

1H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ1.83-1.87(1H,m),1.96-2.08(4H,m),2.12-2.23(3H,m),4.52-4.53(2H,m),4.97(1H,s),5.70(1H,dd,J＝10.0Hz,2.4Hz),6.17-6.22(1H,m),6.70-6.77(1H,m),7.14(1H,s),7.56-7.61(2H,m),7.82(1H,s),8.38(1H,s),9.72(1H,s).

试验例1化合物对激酶的活性抑制效应

1：试验材料：

EGFR(Carna,No.13CBS-00055),EGFR T790M(Carna,No.08CBS-0510N),EGFRT790M/L858R(Carna,No.12CBS-0765H),Kinase substrate22(GL,No.P190917-CL112393),DMSO(Sigma,No.SHBG3288V),384-well plate(Corning,No.12619003).

2：实验方法:

2.1化合物配制

化合物由管理员接收并溶解在100％DMSO中，配制成10mM储存液，于氮气柜中避光储存。

2.2激酶反应过程

(1)配制1×Kinase buffer。

(2)化合物浓度梯度的配制：受试化合物测试浓度为1000nM，在384source板中稀释成100倍终浓度的100％DMSO溶液，用Precision 3倍稀释化合物，10个浓度。使用分液器Echo 550向目的板OptiPlate-384F转移250nL 100倍终浓度的化合物。

(3)用1×Kinase buffer配制2.5倍终浓度的激酶溶液。

(4)在化合物孔和阳性对照孔分别加10μL的2.5倍终浓度的激酶溶液；在阴性对照孔中加10μL的1×Kinase buffer。

(5)1000rpm离心30秒，反应板振荡混匀后室温孵育10分钟。

(6)用1×Kinase buffer配制5/3倍终浓度的ATP和Kinase substrate22的混合溶液。

(7)加入15μL的5/3倍终浓度的ATP和底物的混合溶液，起始反应。

(8)将384孔板1000rpm离心30秒，振荡混匀后室温孵育相应的时间。

(9)加入30μL终止检测液停止激酶反应，1000rpm离心30秒，振荡混匀。

(10)用Caliper EZ Reader读取转化率。

2.3数据分析

计算公式

其中：Conversion％_sample是样品的转化率读数；Conversion％_min：阴性对照孔均值，代表没有酶活孔的转化率读数；Conversion％_max：阳性对照孔比值均值，代表没有化合物抑制孔的转化率读数。

拟合量效曲线：

以浓度的log值作为X轴，百分比抑制率为Y轴，采用分析软件GraphPad Prism5的log(inhibitor)vs.response–Variable slope拟合量效曲线，从而得出各个化合物对酶活性的IC50值。计算公式是：

Y＝Bottom+(Top-Bottom)/(1+10^((LogIC50-X)*HillSlope))

测试结果见表5：

表5化合物对EGFR WT及突变型T790M、T790M/L858R激酶的抑制活性(IC50)

实施例编号	WT(nM)	T790M(nM)	T790M/L858R(nM)
				1	0.26	1.7	2.2
2	0.35	72	192
				3	0.57	105	/
4	0.90	43	/
				5	2.0	52	/
6	1.0	1.0	1.0
				7	1.5	1.2	2.03
8	0.30	0.34	0.52
				9	0.32	0.60	1.02
10	20.0	/	/
				11	0.86	0.70
12	4.5	2.3	/
				13	34	883	>1000
14	21	470	/
				15	0.63	1.22	2.53
16	0.92	1.39	1.98
				Pozitinib	0.28	0.79	0.81

试验例2化合物对细胞的活性抑制效应

1：细胞系

细胞系	细胞类型	细胞数量/孔	培养基
				BaF<sub>3</sub> EGFR-D770-N771ins_SVD	悬浮	3000	RPMI-1640+10％FBS

置于37℃、5％CO₂、95％湿度条件下培养。

2：试剂和耗材

胎牛血清FBS(GBICO,Cat#10099-141)

CellTiter-

Luminescent Cell Viability Assay(Promega,Cat#G7573)

96孔透明平底黑壁板(

Cat#165305)

RPMI-1640(Hyclone，Cat#SH30809.01)

3：细胞培养和接种：

收获处于对数生长期的细胞并采用血小板计数器进行细胞计数。用台盼蓝排斥法检测细胞活力，确保细胞活力在90％以上；

调整细胞浓度；分别添加90μL细胞悬液至96孔板中；

将96孔板中的细胞置于37℃、5％CO2、95％湿度条件下培养过夜。

4：药物稀释和加药：

配制10倍药物溶液，最高浓度为10μM，9个浓度，3.16倍稀释，在接种细胞的96孔板中每孔加入10μL药物溶液，每个药物浓度设置三个复孔，化合物作用终浓度为1μM，9个浓度，3.16倍稀释，DMSO终浓度为0.1％；

将已加药的96孔板中的细胞置于37℃、5％CO2、95％湿度条件下继续培养72小时，之后进行CTG分析。

5：终点读板：

融化CTG试剂并平衡细胞板至室温30分钟；

每孔加入等体积的CTG溶液；

在定轨摇床上振动5分钟使细胞裂解；

将细胞板放置于室温20分钟以稳定冷光信号；

读取冷光值。

6：数据处理

使用GraphPad Prism 7.0软件分析数据，利用非线性S曲线回归来拟合数据得出剂量-效应曲线，并由此计算IC50值。

细胞存活率(％)＝(Lum待测药-Lum培养液对照)/(Lum细胞对照-Lum培养液对照)×100％。

测试结果见表6：

表6化合物对BaF₃ EGFR-D770-N771ins_SVD细胞的抑制活性IC50(nm)

实施例编号	BaF<sub>3</sub> EGFR-D770-N771ins_SVD
		1	3.07
6	33.53
		7	22.83
8	1.50
		9	28.78
11	17.15
		12	397.10
15	15.38
		16	20.94
Pozitinib	3.23

试验例3检测化合物肝微粒体稳定性测试

1：材料和方法

缓冲液：

(1)100mM的磷酸钾缓冲液,pH 7.4；(2)10mM MgCl2。

化合物溶液的配制:

(1)100μM工作溶液的配制：取5μL测试组或对照组的储备液(10mM)，用495μL甲醇稀释，所得化合物浓度为100μM(99％MeOH)。

(2)10μM工作溶液的配制：取50μL100μM工作溶液，用450μL 100mM的磷酸钾缓冲液稀释，所得化合物浓度为10μM(9.9％MeOH)。

NADPH(原型辅酶Ⅱ)再生体系的组成成分(异柠檬酸脱氢酶在培养液中的终浓度为1.0unit/mL)：

β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，供应商：Chem-impex international货号：N00616肝微粒体溶液的制备(最终浓度为0.5mg蛋白/mL)，肝微粒体种类见表7：

表7

终止液:

含有100ng/mL甲苯磺丁脲和100ng/mL拉贝洛尔为内标物的乙腈冰***液。

操作步骤：

(1)除空白基质板位孔外，其他各板孔(T0、T5、T10、T20、T30、T60以及NCF60)中均加入10μL测试或对照药物的工作液。

(2)用Apricot将80μL/孔微粒体溶液分配到每个平板上，在37℃下孵育微粒体溶液和化合物的混合物约10分钟。

(3)向NCF60中加入10μL100mM磷酸钾缓冲液/孔，37℃孵育，启动定时器1，时间见表8。

表8

(4)预热后，用Apricot将10μL/孔的NADPH再生***分配到每个平板上以开始反应。

表9孵育培养基中每种成分的最终浓度

(5)37℃孵育，启动计时器2，数据见表10。

表10

(6)每孔加入4℃预冷的终止液(含内标物甲苯磺丁脲100ng/mL和柳胺苄心定100ng/mL)终止反应。

(7)然后样品板在摇扳机上摇动约10分钟。

(8)将样品在4℃以4000rpm的速度离心20min。

(9)另取96孔板，每孔均加入300μL HPLC级别的水，取100μL离心所得的上清液加入相应孔位，两者混匀后用于LC/MS/MS检测。

数据分析：

根据一级消除动力学计算t1/2和Clint(mic)值

一级消除动力学方程式为：

部分化合物肝微粒体稳定性试验结果见表11：

表11

从以上成药性研究数据可以看出，本发明化合物对蛋白质激酶抑制剂活性具有明显的抑制作用，与临床二期的Pozitinib相比，激酶活性和细胞活性更好或相当，可用作蛋白质激酶抑制剂；本发明化合物半衰期更长，清除率更低，60min后的残留量更多，在肝微粒体稳定性方面具有更加明显的优势，可减少药物的施用量和使用频率，具有广阔的抗恶性肿瘤疾病或炎症疾病的应用前景。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。