CN111748498A - 一种具有防治白粉病、赤星病功能的芽孢杆菌复配菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种具有防治白粉病、赤星病功能的芽孢杆菌复配菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明实施例提供了一种具有防治白粉病、赤星病功能的芽孢杆菌复配菌剂及其制备方法和应用，涉及微生物技术领域，该复配菌剂是由发明人精心挑选的芽孢杆菌菌株按照特定比例配置而成，不仅可直接作为真菌杀菌剂使用，也可添加养分及助剂制成具有防病功能的叶面肥肥料产品进行使用。对白粉病、赤星病具有较佳的防治效果，可成为植物内生菌，长期具有防控效果，节约成本，提高经济效益。并且，该芽孢杆菌复配菌剂的制备方法简单方便，可以进行规模化的生产，适合进行大面积推广应用。

Description

一种具有防治白粉病、赤星病功能的芽孢杆菌复配菌剂及其 制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体而言，涉及一种具有防治白粉病、赤星病功能的芽孢杆菌复配菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
烟草白粉病是由专性寄生菌二孢白粉菌侵染所致的气传真菌性病害，俗称“上硝”、“上灰”、“发白”或“下霜”。自1919 年泽田兼吉在我国台湾省发现烟草白粉病以来，我国大陆在贵州、云南、山西、四川和广西等地也发现了烟草白粉病。烟草白粉病可发生于烟草整个生育期，主要危害烟草叶片，严重时也可蔓延到茎杆、花枝、萼片上。受害烟叶烘烤后叶色深褐，缺乏弹性和香味，且易破碎，轻则损失10%~20%，重则损失80% 以上，造成严重减产及品质降低。受病害侵染的烟叶，经调制后，颜色棕褐，叶面有明显点状病斑，身份薄，油分少，香气严重缺乏，杂气重，破损度大，造碎率高，工业可用性差，而失去经济价值。
烟草赤星病是由链格孢属真菌侵染引起的叶斑病害，特别是在烟叶采收中后期，成为影响烟叶成熟度的障碍因素。该病具有潜育期短、流行速度快的特点，烟株现蕾后至成熟期为易感病阶段，在环境条件适宜的情况下，短时间内即可大面积发生流行。病害从烟株下部叶片开始发生，随着叶片的成熟，病斑自下而上逐步发展，病斑质脆易破，病害严重时，许多病斑相互连接合并成大斑块枯焦。严重时还会危害茎杆、花梗和蒴果，影响烟叶产量和品质，不利于优质烟叶生产，但至今除了化学农药外，尚无有效的防治手段。
烟草白粉病和赤星病是烟草生产过程中主要的两种叶部真菌病害，当前这两种病害的控制最主要依赖于化学农药。由于化学农药防治存在农药残留、病原菌易产生抗性等缺点，同时易降低烟叶品质，破坏生态环境和影响人类健康。所以，从烟叶安全和对环境友好角度出发，一种具有防治白粉病、赤星病功能的生物制剂对烟草产业的绿色可持续发展尤为重要。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种具有防治白粉病、赤星病功能的芽孢杆菌复配菌剂，其可作为真菌杀菌剂使用，也可添加养分及助剂制成具有防病功能的叶面肥肥料产品进行使用，对白粉病、赤星病具有较佳的防治效果，可成为植物内生菌，长期具有防控效果，节约成本，提高经济效益。
本发明的第二目的在于提供一种上述芽孢杆菌复配菌剂的制备方法，其操作简单方便，可以快速高效地制备上述芽孢杆菌复配菌剂。
本发明的第三目的在于提供一种上述芽孢杆菌复配菌剂的应用，其可以被用在烟草的白粉病和赤星病的防治中，具有较高的应用价值。
本发明的实施例是这样实现的：
一种具有防治白粉病、赤星病功能的芽孢杆菌复配菌剂，其包括贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、第一解淀粉芽孢杆菌、以及第二解淀粉芽孢杆菌；
其中，贝莱斯芽孢杆菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.19886；
枯草芽孢杆菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.19887；
第一解淀粉芽孢杆菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.19888；
第二解淀粉芽孢杆菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.19889。
一种上述芽孢杆菌复配菌剂的制备方法，其包括：
将贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、第一解淀粉芽孢杆菌、以及第二解淀粉芽孢杆菌的保存液分别进行菌种活化、菌种纯化、扩大培养，得到贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、第一解淀粉芽孢杆菌、以及第二解淀粉芽孢杆菌的发酵液；
将贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、第一解淀粉芽孢杆菌、以及第二解淀粉芽孢杆菌的发酵液混合得到芽孢杆菌复配菌剂。
一种上述芽孢杆菌复配菌剂在治疗烟草的白粉病和赤星病中的应用。
本发明实施例的有益效果是：
本发明实施例提供了一种具有防治白粉病、赤星病功能的芽孢杆菌复配菌剂及其制备方法和应用，该复配菌剂是由发明人精心挑选的芽孢杆菌菌株按照特定比例配置而成，不仅可直接作为真菌杀菌剂使用，也可添加养分及助剂制成具有防病功能的叶面肥肥料产品进行使用。对白粉病、赤星病具有较佳的防治效果，可成为植物内生菌，长期具有防控效果，节约成本，提高经济效益。并且，该芽孢杆菌复配菌剂的制备方法简单方便，可以进行规模化的生产，适合进行大面积推广应用。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本发明实施例的一种具有防治白粉病、赤星病功能的芽孢杆菌复配菌剂及其制备方法和应用进行具体说明。
本发明实施例提供了一种具有防治白粉病、赤星病功能的芽孢杆菌复配菌剂，其包括贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、第一解淀粉芽孢杆菌、以及第二解淀粉芽孢杆菌；
其中，贝莱斯芽孢杆菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.19886；
枯草芽孢杆菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.19887；
第一解淀粉芽孢杆菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.19888；
第二解淀粉芽孢杆菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.19889。
以上四株菌株经过发明的精心筛选，在按照特定比例进行复配之后，对于烟草的白粉病和赤星病具有明显的防治效果。
其中，贝莱斯芽孢杆菌于2020年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：中国北京，分类命名为：贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis，保藏编号为：CGMCC No.19886。
枯草芽孢杆菌于2020年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：中国北京，分类命名为：枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis，保藏编号为：CGMCC No.19887。
第一解淀粉芽孢杆菌于2020年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：中国北京，分类命名为：解淀粉芽孢杆菌 Bacillusamyloliquefaciens，保藏编号为：CGMCC No.19888。
第二解淀粉芽孢杆菌于2020年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：中国北京，分类命名为：解淀粉芽孢杆菌 Bacillusamyloliquefaciens，保藏编号为：CGMCC No.19889。
芽孢杆菌复配菌剂中，贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、第一解淀粉芽孢杆菌、以及第二解淀粉芽孢杆菌的活菌数比为1：2.8~3.2：0.9~1.1：2.8~3.2；优选地，贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、第一解淀粉芽孢杆菌、以及第二解淀粉芽孢杆菌的活菌数比为1：3：1：3；更为优选地，芽孢杆菌复配菌剂的有效活菌数大于2.0×1010 cfu/g。按照上述比例配置下，芽孢杆菌复配菌剂的防治效果较佳。
本发明实施例还提供了一种上述芽孢杆菌复配菌剂的制备方法，其包括：
S1. 将贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、第一解淀粉芽孢杆菌、以及第二解淀粉芽孢杆菌的保存液分别进行菌种活化、菌种纯化、扩大培养，得到贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、第一解淀粉芽孢杆菌、以及第二解淀粉芽孢杆菌的发酵液；
S2. 将贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、第一解淀粉芽孢杆菌、以及第二解淀粉芽孢杆菌的发酵液混合得到芽孢杆菌复配菌剂。
菌种活化是将保存液接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基，在33~37℃，150~180 rpm的搅拌转速下，培养48~60 h，得到活化培养液；保存液与牛肉膏蛋白胨液体培养基的体积比为1：90~120。其中，按照重量份数计，牛肉膏蛋白胨液体培养基包括：牛肉膏2~4份、蛋白胨8~11份、氯化钠4~6份、水900~1000份；牛肉膏蛋白胨液体培养基的pH为6~8。
菌种纯化是将活化培养液接种到牛肉膏蛋白胨固体平板进行划线培养，在33~37℃下培养72~80 h，选取菌落特征符合的单一较大菌落作为活化后的种子菌落。其中，按照重量份数计，牛肉膏蛋白胨固体平板包括：牛肉膏2~4份、蛋白胨8~11份、氯化钠4~6份、琼脂15~25份、水900~1000份；牛肉膏蛋白胨固体平板的pH为6~8。
扩大培养是将种子菌落接种到牛肉蛋白胨液体培养基中，在33~37℃，150~180rpm的搅拌转速下，培养60~72 h，得到种子液；再将种子液按照2~2.5‰的比例接种到发酵培养液中，在33~37℃，100~150 rpm的搅拌转速下，培养36~48 h，得到发酵液。其中，按照重量份数计，发酵培养液包括：黄豆粉2~4份、蔗糖0.5~1份、牛肉膏1~3份、玉米粉2~3份、碳酸钙0.8~1.5份、鱼粉1~2份、磷酸二氢钾0.05~0.1份、磷酸氢二钾0.05~0.1份、氯化钠1~5份、消泡剂0.1~0.3份；发酵培养液的pH为6.8~7.5。
上述制备方法的操作简单，可以快速高效地培养所需的发酵液。需要说明的是，为了避免引入杂菌，上述步骤中的所有转移操作均采用无菌接种环进行操作。此外，对于各培养基的pH调节采用盐酸和氢氧化钠来进行。
本发明实施例还提供了一种上述芽孢杆菌复配菌剂在治疗烟草的白粉病和赤星病中的应用。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种具有防治白粉病、赤星病功能的芽孢杆菌复配菌剂，其制备步骤如下：
S1. 菌种活化：将-80℃条件下采用甘油保存的贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、第一解淀粉芽孢杆菌、以及第二解淀粉芽孢杆菌的保存液各取0.1 ml分别接种到10 ml的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在温度为35℃、转速为160 rpm条件下活化培养48 h，得到四株菌种的活化培养液；
其中，牛肉膏蛋白胨液体培养基的组成成分及其配比为：牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、氯化钠5.0 g、水1000 ml，采用盐酸和氢氧化钠调节pH在6~8之间。
S2. 菌种纯化：采用灭菌接种环将活化培养液中的菌种分别接种到牛肉膏蛋白胨固体平板上，进行纯化划线培养，在温度为35℃的培养箱中培养3天，选取菌落特征符合功能菌种菌落特征的单一较大菌落作为活化后的种子菌落；
其中，牛肉膏蛋白胨固体平板的组成成分及其配比为：牛肉膏3.0 g、蛋白胨10.0 g、氯化钠5.0 g、琼脂25 g、水1000 ml，采用盐酸和氢氧化钠调节pH在6-8之间。
S3. 扩大培养：用无菌接种环刮取一环第一步中活化的种子菌落接种到50 ml 牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在温度为35℃、转速为160 rpm条件下活化培养72 h，得四株菌种的种子液；按照2‰的比例将菌种种子液接种到发酵罐中的发酵培养液中，在温度为35℃，转速为120 rpm条件下培养36 h，得到四株菌种的发酵液；
其中，按重量份数计，发酵培养液的组成为：黄豆粉2份、蔗糖1份、牛肉膏1份、玉米粉3份、碳酸钙0.8份、鱼粉2份、磷酸二氢钾0.05份、磷酸氢二钾0.1份、氯化钠1份、消泡剂0.3份。采用盐酸、氢氧化钠调节pH至6.8~7.5。
S4：复配：将贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、第一解淀粉芽孢杆菌、以及第二解淀粉芽孢杆菌的发酵液，按照活菌数比为1：3：1：3进行复配，得到所需的芽孢杆菌复配菌剂。
实施例2
本实施例提供了一种具有防治白粉病、赤星病功能的芽孢杆菌复配菌剂，其制备步骤如下：
S1. 菌种活化：将-80℃条件下采用甘油保存的贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、第一解淀粉芽孢杆菌、以及第二解淀粉芽孢杆菌的保存液各取0.1 ml分别接种到10 ml的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在温度为37℃、转速为180 rpm条件下活化培养60 h，得到四株菌种的活化培养液；
其中，牛肉膏蛋白胨液体培养基的组成成分及其配比为：牛肉膏4.0 g、蛋白胨8.0 g、氯化钠6.0 g、水900 ml，采用盐酸和氢氧化钠调节pH在6~8之间。
S2. 菌种纯化：采用灭菌接种环将活化培养液中的菌种分别接种到牛肉膏蛋白胨固体平板上，进行纯化划线培养，在温度为37℃的培养箱中培养80 h，选取菌落特征符合功能菌种菌落特征的单一较大菌落作为活化后的种子菌落；
其中，牛肉膏蛋白胨固体平板的组成成分及其配比为：牛肉膏4.0 g、蛋白胨8.0 g、氯化钠6.0 g、琼脂20 g、水900 ml，采用盐酸和氢氧化钠调节pH在6-8之间。
S3. 扩大培养：用无菌接种环刮取一环第一步中活化的种子菌落接种到50 ml 牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在温度为37℃、转速为180 rpm条件下活化培养60 h，得四株菌种的种子液；按照2.5‰的比例将菌种种子液接种到发酵罐中的发酵培养液中，在温度为37℃，转速为150 rpm条件下培养48 h，得到四株菌种的发酵液；
其中，按重量份数计，发酵培养液的组成为：黄豆粉4份、蔗糖0.5份、牛肉膏3份、玉米粉2份、碳酸钙1.5份、鱼粉1份、磷酸二氢钾0.1份、磷酸氢二钾0.05份、氯化钠3份、消泡剂0.1份。采用盐酸、氢氧化钠调节pH至6.8~7.5。
S4：复配：将贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、第一解淀粉芽孢杆菌、以及第二解淀粉芽孢杆菌的发酵液，按照活菌数比为1：2.8：1.1：3.2进行复配，得到所需的芽孢杆菌复配菌剂。
实施例3
本实施例提供了一种具有防治白粉病、赤星病功能的芽孢杆菌复配菌剂，其制备步骤如下：
S1. 菌种活化：将-80℃条件下采用甘油保存的贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、第一解淀粉芽孢杆菌、以及第二解淀粉芽孢杆菌的保存液各取0.1 ml分别接种到10 ml的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在温度为33℃、转速为150 rpm条件下活化培养48 h，得到四株菌种的活化培养液；
其中，牛肉膏蛋白胨液体培养基的组成成分及其配比为：牛肉膏2.0 g、蛋白胨11.0 g、氯化钠4.0 g、水1000 ml，采用盐酸和氢氧化钠调节pH在6~8之间。
S2. 菌种纯化：采用灭菌接种环将活化培养液中的菌种分别接种到牛肉膏蛋白胨固体平板上，进行纯化划线培养，在温度为34℃的培养箱中培养72 h，选取菌落特征符合功能菌种菌落特征的单一较大菌落作为活化后的种子菌落；
其中，牛肉膏蛋白胨固体平板的组成成分及其配比为：牛肉膏2.0 g、蛋白胨11.0 g、氯化钠4.0 g、琼脂23 g、水1000 ml，采用盐酸和氢氧化钠调节pH在6-8之间。
S3. 扩大培养：用无菌接种环刮取一环第一步中活化的种子菌落接种到50 ml 牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在温度为34℃、转速为150 rpm条件下活化培养72 h，得四株菌种的种子液；按照2‰的比例将菌种种子液接种到发酵罐中的发酵培养液中，在温度为34℃，转速为100 rpm条件下培养36 h，得到四株菌种的发酵液；
其中，按重量份数计，发酵培养液的组成为：黄豆粉2份、蔗糖1份、牛肉膏2份、玉米粉2份、碳酸钙1份、鱼粉1.5份、磷酸二氢钾0.08份、磷酸氢二钾0.06份、氯化钠5份、消泡剂0.2份。采用盐酸、氢氧化钠调节pH至6.8~7.5。
S4：复配：将贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、第一解淀粉芽孢杆菌、以及第二解淀粉芽孢杆菌的发酵液，按照活菌数比为1：3.2：0.9：2.8进行复配，得到所需的芽孢杆菌复配菌剂。
试验例1
采用实施例1~3所提供的芽孢杆菌复配菌剂，测试其对于烟草白粉病和赤星病的抑制效果，具体的测试方法如下：
1.试验地点：
云南省昆明市安宁市青龙镇云南省微生物发酵工程研究中心有限公司实验室。
2.试验材料
供试培养基：PSA培养基（活化烟草赤星病病原菌）、LB培养基（培养功能复配菌剂）、2%水琼脂培养基。
供试材料：实施例1~3的芽孢杆菌复配菌剂（加水稀释至有效活菌数约为1×107 cfu/mL），白粉病、赤星病病原菌。
3.试验方法
烟草白粉病：配制2%的水琼脂培养基，灭菌后在超净工作台中将水琼脂倒在洁净的载玻片上薄薄一层，照紫外灯，冷却后备用。将清水、芽孢杆菌复配菌剂各吸取0.15 ml加到琼脂玻片上，刮取白粉孢子撒在琼脂玻片上与复配菌剂或者清水混合，涂布在琼脂玻片上，然后将其放置在皿底和皿盖都贴有湿润滤纸的无菌培养皿中，并将培养皿放在25℃真菌培养箱中暗培养24小时后镜检，芽管长度超过孢子短直径的1/2视为萌发，每个浓度镜检150个孢子，每个玻片镜检两次。
烟草赤星病：在涂布了赤星病病原真菌的PSA培养板上距中心3 cm处的4个点上接种功能复配菌剂，以只涂赤星病病原菌作为对比，将培养板暗培养至对照平板赤星病菌长满全皿时，测量并记录抑菌带，每个处理重复5个板。抑菌率（%）＝[﹙对照菌落直径－处理菌落直径﹚÷对照菌落直径] ×100。
测试结果如表1和表2所示。
表1. 白粉病防治效果测试
处理 萌发孢子平均数(个) 镜检孢子总数(个) 萌发率(%) 抑制率(%)
清水 32.5 150 21.67 -
实施例1 13.5 150 9.00 58.46
实施例2 15.5 150 10.33 52.33
实施例3 16.0 150 10.67 50.76
表2. 赤星病防治效果测试
处理 平均抑菌带宽度/㎜ 抑菌率/%
对照组 - -
实施例1 10.5±0.58 56.70±1.27
实施例2 8.3±0.42 44.86±1.35
实施例3 7.9±0.46 42.70±1.25
由表1和表2可以看出，本发明实施例1~3所提供的芽孢杆菌复配菌剂对对于白粉孢子的萌发、赤星病菌丝的生长具有明显的抑制作用，可以直观地知道，其对烟草白粉病、赤星病具有较好的防治效果，则对病原真菌的生长繁殖具有较好的抑制效果，对真菌病害有较好的防治作用。
试验例2
采用实施例1所提供的芽孢杆菌复配菌剂测试其在烟草生长过程中，对烟草白粉病和赤星病的防控效果，具体测试方法如下：
1试验基本情况
试验在云南省昆明市安宁市青龙镇云南省微生物发酵工程研究中心有限公司试验大棚进行。
2供试材料
在小盆栽中培育出4-5片真叶的云烟87，实施例1所提供的芽孢杆菌复配菌剂，纯发酵液（没接种），白粉病、赤星病病原菌孢子液。将功能复配菌剂和纯发酵液都稀释200倍备用。
3试验方法
3.1试验设计
本试验通过对云烟87烟叶进行处理，每处理设置4个重复，各处理具体如下：
白粉病防治：
处理1：喷施10 mL清水，干燥后，接种白粉病病原菌孢子
处理2：喷施10 mL纯发酵液稀释液，干燥后，接种白粉病病原菌孢子
处理3：喷施10 mL芽孢杆菌复配菌剂稀释液，干燥后接种白粉病病原菌孢子
赤星病防治：对烟叶进行赤星病孢子接种，待烟叶出现病斑时，记录每片叶子上赤星病病斑的个数，再进行处理。
处理4：喷施10 mL清水
处理5：喷施10 mL纯发酵液稀释液
处理6：喷施10 mL芽孢杆菌复配菌剂稀释液
复配菌剂有效活菌数为1.0×107 cfu/mL。
3.2试验过程
筛选出长势相近的烟草植株进行试验。按照上述处理布置试验，白粉病防控中，在接种后的7、14、21 d分别按国家烟草白粉病病害严重度分级标准调查各处理白粉病发病情况，计算出病情指数和相对防效；赤星病防控中，处理后，间隔5d进行再次喷施，共喷施3次，分别在喷施后的第5天进行防效调查。
3.3调查方法
白粉病以叶片为单位分级调查：
0级：无病斑
1级：病斑面积占叶片面积的5%以下。
3级：病斑面积占叶片面积的6%～10%。
5级：病斑面积占叶片面积的11%～20%。
7级：病斑面积占叶片面积的21%～40%。
9级：病斑面积占叶片面积的41%以上。
病情指数=∑（各级病叶数×病级代表值）×100/（调查总叶数×9）
防治效果（%）＝［（对照病情指数－处理病情指数）/对照病情指数］×100
赤星病：以叶片为单位分级调查。
0级：全叶无病
1级：病斑面积占叶片面积的1%以下。
3级：病斑面积占叶片面积的2%-5%。
5级：病斑面积占叶片面积的6%-10%。
7级：病斑面积占叶片面积的11%-20%。
9级：病斑面积占叶片面积的21%以上。
病情指数=∑（各级病叶数×病级代表值）×100/（调查总叶数×9）
防治效果（%）＝［（对照病情指数－处理病情指数）/对照病情指数］×100
上述试验结果如表3和表4所示。
表3. 白粉病防治效果
Figure RE-RE-DEST_PATH_IMAGE001
表4. 赤星病防治效果
Figure RE-DEST_PATH_IMAGE002
由表3和表4可以看出，本发明实施例所提供的芽孢杆菌复配菌剂对于白粉病的相对防效在7天内可以达到83.28%，21天后仍有45.54的防效。同时，其对于赤星病的防效在每次给药后的5天时间可以达到74.2%~79.4%。充分说明本发明实施例的芽孢杆菌复配菌剂能够对烟草白粉病、赤星病起到一定的防控效果，可以有效抑制病原真菌的生长，防治真菌性病害发生，对烟叶品质的提高具有良好的效果。
综上所述，本发明实施例提供了一种具有防治白粉病、赤星病功能的芽孢杆菌复配菌剂及其制备方法和应用，该复配菌剂是由发明人精心挑选的芽孢杆菌菌株按照特定比例配置而成，不仅可直接作为真菌杀菌剂使用，也可添加养分及助剂制成具有防病功能的叶面肥肥料产品进行使用。对白粉病、赤星病具有较佳的防治效果，可成为植物内生菌，长期具有防控效果，节约成本，提高经济效益。并且，该芽孢杆菌复配菌剂的制备方法简单方便，可以进行规模化的生产，适合进行大面积推广应用。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种具有防治白粉病、赤星病功能的芽孢杆菌复配菌剂，其特征在于，包括贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、第一解淀粉芽孢杆菌、以及第二解淀粉芽孢杆菌；
其中，所述贝莱斯芽孢杆菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.19886；
所述枯草芽孢杆菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.19887；
所述第一解淀粉芽孢杆菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.19888；
所述第二解淀粉芽孢杆菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.19889。
2.根据权利要求1所述的芽孢杆菌复配菌剂，其特征在于，所述芽孢杆菌复配菌剂中，所述贝莱斯芽孢杆菌、所述枯草芽孢杆菌、所述第一解淀粉芽孢杆菌、以及所述第二解淀粉芽孢杆菌的活菌数比为1：2.8~3.2：0.9~1.1：2.8~3.2；优选地，所述贝莱斯芽孢杆菌、所述枯草芽孢杆菌、所述第一解淀粉芽孢杆菌、以及所述第二解淀粉芽孢杆菌的活菌数比为1：3：1：3；优选地，所述芽孢杆菌复配菌剂的有效活菌数大于2.0×1010 cfu/g。
3.一种如权利要求1或2所述的芽孢杆菌复配菌剂的制备方法，其特征在于，包括：
将所述贝莱斯芽孢杆菌、所述枯草芽孢杆菌、所述第一解淀粉芽孢杆菌、以及所述第二解淀粉芽孢杆菌的保存液分别进行菌种活化、菌种纯化、扩大培养，得到所述贝莱斯芽孢杆菌、所述枯草芽孢杆菌、所述第一解淀粉芽孢杆菌、以及所述第二解淀粉芽孢杆菌的发酵液；
将所述贝莱斯芽孢杆菌、所述枯草芽孢杆菌、所述第一解淀粉芽孢杆菌、以及所述第二解淀粉芽孢杆菌的所述发酵液混合得到所述芽孢杆菌复配菌剂。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，菌种活化是将所述保存液接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基，在33~37℃，150~180 rpm的搅拌转速下，培养48~60 h，得到活化培养液；所述保存液与所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的体积比为1：90~120。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，按照重量份数计，所述牛肉膏蛋白胨液体培养基包括：牛肉膏2~4份、蛋白胨8~11份、氯化钠4~6份、水900~1000份；所述牛肉膏蛋白胨液体培养基的pH为6~8。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，菌种纯化是将所述活化培养液接种到牛肉膏蛋白胨固体平板进行划线培养，在33~37℃下培养72~80 h，选取菌落特征符合的单一较大菌落作为活化后的种子菌落。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，按照重量份数计，所述牛肉膏蛋白胨固体平板包括：牛肉膏2~4份、蛋白胨8~11份、氯化钠4~6份、琼脂15~25份、水900~1000份；所述牛肉膏蛋白胨固体平板的pH为6~8。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，扩大培养是将所述种子菌落接种到所述牛肉蛋白胨液体培养基中，在33~37℃，150~180 rpm的搅拌转速下，培养60~72 h，得到种子液；再将所述种子液按照2~2.5‰的比例接种到发酵培养液中，在33~37℃，100~150 rpm的搅拌转速下，培养36~48 h，得到所述发酵液。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，按照重量份数计，所述发酵培养液包括：黄豆粉2~4份、蔗糖0.5~1份、牛肉膏1~3份、玉米粉2~3份、碳酸钙0.8~1.5份、鱼粉1~2份、磷酸二氢钾0.05~0.1份、磷酸氢二钾0.05~0.1份、氯化钠1~5份、消泡剂0.1~0.3份；所述发酵培养液的pH为6.8~7.5。
10.一种如权利要求1或2所述的芽孢杆菌复配菌剂在治疗烟草的白粉病和赤星病中的应用。
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