CN110396485B

CN110396485B - 产生生长素的类短短芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN110396485B
Application number: CN201910507692.1A
Authority: CN
Inventors: 魏士平; 刘贝贝
Original assignee: China University of Geosciences Beijing
Current assignee: China University of Geosciences Beijing
Priority date: 2019-06-12
Filing date: 2019-06-12
Publication date: 2020-12-01
Anticipated expiration: 2039-06-12
Also published as: CN110396485A

Abstract

产生生长素的类短短芽孢杆菌及其应用。本发明公开了一株类短短芽孢杆菌Brevibacillus parabrevis菌株及其应用。所述类短短芽孢杆菌Brevibacillus parabrevis为类短短芽孢杆菌Brevibacillus parabrevis BIO7 CGMCC NO.17202。该类短短芽孢杆菌Brevibacillus parabrevis BIO7能够产生植物生长素，在添加了0.05％色氨酸的Tryptone的培养基中，其生长素产量可达36.1μg/ml，可用于发酵工业，生产与制备植物生长素。也可作为一种微生物制剂直接应用于农业上，用于促进作物的生长。

Description

产生生长素的类短短芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及产生生长素的类短短芽孢杆菌及其应用。

背景技术

植物生长素是调节植物生长的重要激素。它的化学性质是吲哚乙酸，这是最早发现的促进植物生长的激素。它影响植物细胞的***，伸长和分化，控制植物的生根和萌发，并影响植物器官的生长，成熟和衰老。最重要的天然生长素是β-吲哚乙酸。虽然植物内源激素含量很低，但是它们在植物的生长发育中起着非常重要的作用。由于植物内源激素含量低，因此不可能大量提取它们并将其用于农业生产。因此通过其他途径生成或者合成与植物激素具有相同生理效应的物质已成为当代农业的发展趋势。

Barazani和Friedman(1999)发现在土壤中有很多可以产生生长素的细菌类别[16]；Finnie和Van Staden(1985)发现多种土壤微生物包括细菌、真菌等能够产生植物生长素，这可能会与植物的生长发育建立一定的联系；现有研究表明，细菌产生的生长素对于植物的生长具有一定的促进作用，Mohite(2013)研究发现从植物根际土壤中分离得到的细菌能生产植物生长素，并能显著增加小麦幼苗的植株高度、茎长、根长以及叶绿素含量；Sun等人(2014)发现由酵母菌产生的生长素能增加拟南芥侧根的数量并降低了根伸长率，并且促进了根毛的形成；Shahab等人(2009)从土壤中分离得到的产生长素的细菌菌株能促进大豆的根茎伸长并促进根毛的形成。Barbieri等人(1986)发现接种了细菌的小麦幼苗的侧根的数量和长度都有明显的增加；Glick等人(1986)发现用细菌处理油菜种子，使得油菜幼苗的根的长度增加了2到3倍；Caron等人(1995)发现从根际土壤中分离出来的细菌，无论在存在或者不存在生理前体物质色氨酸(Trp)的前提下，都具有在体外合成生长素的能力。

海洋是一个巨大的资源宝库，它含有丰富的生物与化学资源。相比于通过施肥提高土壤营养、喷洒农药来促进农作物生长，提高产量的原始方法来说，将来自于海洋中的产生长素的细菌作为制剂应用于农业，不仅无污染，而且可持续利用，符合绿色发展观，不会造成土壤环境以及水环境的污染，这在提倡绿色生活，保护环境的当下是极为重要的，它势必会成为未来提高农业产值的主要突破点，有着极高的发展前景，或将成为未来农业的发展形势。

发明内容

本发明的目的是提供一株类短短芽孢杆菌及其在产生生长素中的应用。

本发明所提供类短短芽孢杆菌为类短短芽孢杆菌Brevibacillus parabrevisBIO7 CGMCC No.17202。

所述类短短芽孢杆菌Brevibacillus parabrevis BIO7，已于2019年01月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)的保藏编号为CGMCC NO.17202。

所述类短短芽孢杆菌Brevibacillus parabrevis BIO7分离自北戴河新河口海洋沉积物，为***。该细菌在牛肉膏蛋白胨培养基上能形成乳白色的菌落，菌落圆形，边缘规则，圆形菌落中央凸起，表面湿润。能产生脂酶、纤维素酶、蛋白酶和铁载体(siderophore)。

所述类短短芽孢杆菌Brevibacillus parabrevis BIO7 CGMCC No.17202在生产生长素中的应用也属于本发明的保护范围。

所述类短短芽孢杆菌Brevibacillus parabrevis BIO7 CGMCC No.17202在制备植物生长调节制剂中的应用也属于本发明的保护范围。

本发明的类短短芽孢杆菌Brevibacillus parabrevis BIO7 CGMCC No.17202还可以作为在制备促进植物生长的微生物菌肥中的应用。

本发明还提供一种促进植物生长的生物菌剂，其特征在于，其生物活性成分为类短短芽孢杆菌Brevibacillus parabrevis BIO7 CGMCC No.17202。

本发明还提供一种促进植物生长的微生物菌肥，包括所述的生物菌剂。

优选地，所述微生物菌肥还包括色氨酸。

本发明还提供一种植物生长调节制剂，包括类短短芽孢杆菌Brevibacillusparabrevis BIO7 CGMCC No.17202。

优选的，所述植物生长调节制剂还包括色氨酸。

在本发明的一个实施方式中，所述色氨酸为质量百分浓度为5％的色氨酸溶液。

本发明还提供类短短芽孢杆菌Brevibacillus parabrevis BIO7 CGMCCNo.17202的培养方法，其特征在于，将类短短芽孢杆菌Brevibacillus parabrevis BIO7接种于含色氨酸的Tryptone培养基中，在于30℃震荡培养箱中培养；所述Tryptone培养基为含有Tryptone(胰蛋白胨，英国OXOID,货号LP0042)10g/L，NaCl 5g/L的液体培养基；所述色氨酸的终质量百分浓度优选为0.05％；所述培养的时间优选为4天。

所述震荡培养的转数优选为150rpm/min。

本研究以海洋中的细菌为研究对象，通过细菌的分离、筛选，可获得产生植物生长素的细菌，用细菌发酵生产植物生长素，可制备植物生长素化合物，用于扦插植物和种子的生根；也可作为一种微生物制剂直接应用于农业，这将是未来绿色农业可持续发展的新形式。分别通过该细菌所产生的生长素以及该细菌直接作为菌剂对种子生根、发芽、盆栽等实验，对其在植物生长的促进作用上进行了探讨，将其制成植物生长调节剂产品应用于农业生产，具有极大的发展前景。

附图说明

图1为生长素标准样品颜色反应。

图2为生长素标准曲线。

图3培养基和色氨酸对颜色反应的影响(A：YMD培养基；B：Tryptone培养基；C：LB培养基；D：CM培养基。1：原始培养基；2：原始培养基中接种了BIO7；3：原始培养基中添加了0.05％的色氨酸；4：添加了0.05％色氨酸的原始培养基中接种了BIO7。

图4为细菌产生的生长素对小麦根长、株高的观察(A：小麦的离土培养，分别加入生长素标准品溶液或BIO7细菌产生的生长素粗品；B：生长素标准品处理的小麦苗子；C：BIO7细菌产生的生长素粗品处理的小麦苗子)。

图5为细菌BIO7对小麦根长、株高的观察。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

实施例1、生产生长素的菌株类短短芽孢杆菌Brevibacillus parabrevis BIO7CGMCC No.17202的筛选和鉴定

一、样品的采集与稀释

1、以北戴河新河口海洋沉积物为样品；

2、制备沉积物样品稀释溶液，利用无菌操作技术在超净台中进行该步骤：称取10g沉积物放入盛有90ml无菌水的锥形瓶中，使用振荡器机械震荡10min，使沉积物分散均匀，得到稀释浓度为10^-1的样品；

3、用等梯度稀释法对沉积物悬液进行系列稀释，得到稀释度为10^-2，10^-3，10^-4，10^-5的沉积物样品溶液。

二、沉积物样品中细菌的分离与纯化

1、培养基的配制：配制牛肉膏蛋白胨固体培养基(牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，琼脂20g/L)，CM液体培养基(酪蛋白7.5g/L，酵母10g/L，柠檬酸钠3g/L，MgSO₄·7H₂O5g/L，KCl 2g/L，FeSO₄·7H₂O 0.05g/L，NaCl 5g/L)于121℃条件下高压蒸汽灭菌20min，冷却后倒平板备用；

2、细菌的分离：取冷却的固体牛肉膏蛋白胨培养基平板，将稀释度为10^-2，10^-3，10^-4，10^-5的沉积物样品溶液各吸取100μL滴在平板中央，使用灭菌后的涂布器涂布均匀。将培养基封口并倒置，将接种细菌的培养基置于恒温培养箱中，于30℃下培养2天。待菌落长出后，挑选合适稀释度进行菌落计数和单菌落的挑取；

3、细菌的纯化：为防止所挑取单菌落的混杂，将上述所挑取的单菌落进行平板划线纯化，于30℃下培养2天，获得细菌的纯培养物。最后得到纯培养细菌61株。

三、纯培养细菌的保存

采用液体冷冻的方法保存细菌，具体的操作过程如下：

1、配制液体CM液体培养基，于121℃高压蒸汽灭菌20min后待用；

2、于1.5mL无菌离心管中加入灭菌的液体CM培养基1mL，刮下牛肉膏蛋白胨固体培养基上各细菌纯培养菌苔，放入上述离心管中；然后加入终浓度为20％的无菌甘油，涡旋震荡均匀，后置于-70℃冰箱中保存。

四、生长素产生细菌的筛选和鉴定

1、生长素的测定

以35％HClO₄溶液和0.5mol/L FeCl₃溶液以50：1的比例混合得到Salkowski试剂，细菌的液体培养物与Salkowski试剂以体积比为1∶2的比例混合均匀。在室温下，避光保存30min，Salkowski试剂与生长素(吲哚乙酸IAA)会发生颜色反应，如混合液出现粉红色，即表示菌液中含有生长素。可根据所产生的粉红色物质的最大吸收波长为530纳米，对细菌培养物中所产生的生长素进行定量分析。

2、生长素产生菌的筛选

(1)生长素产生菌的定性初筛：用移液枪各吸取50μL步骤三中保存的菌液接种于装有5ml YMD培养基(酵母4g/L，麦芽根浸粉10g/L，葡萄糖4g/L，K₂HPO₄ 2g/L，色氨酸0.5g/L)的试管中，于30℃的震荡培养箱中培养2天后，取50μL菌悬液与100μL Salkowski试剂混合均匀(以不加菌株的YMD培养基与Salkowski试剂的1∶2混合溶液为空白对照)，在室温下，避光保存30min后观察液体颜色变化，出现粉红色即表示能产生生长素IAA。

(2)生长素产生菌的定量复筛：

生长素标准曲线的制作。称取10mg IAA标准样品，用少量乙醇溶解，加入100mL蒸馏水，混匀后稀释至0，0.5，1.0，5.0，10.0，15.0，20.0，25.0μg/mL的IAA标准溶液，与Salkowski试剂以1：2的体积比混合，室温下避光放置30分钟，分别测量各梯度的OD530值(作为蒸馏水和Salkowski试剂的1：2混合溶液作为空白对照)。最后以IAA浓度为横坐标，OD530为纵坐标作图，即得到IAA标准曲线。观察颜色变化(图1)，并分别测量各梯度的OD530值(作为蒸馏水和Salkowski试剂的1：2混合溶液作为空白对照)。最后以IAA浓度为横坐标，OD530为纵坐标作图，即得到IAA标准曲线(图2)。得到IAA标准曲线方程为Y＝0.0287X，其中R²＝0.9942。

菌液中生长素浓度的测定。将步骤三种保存的菌株进行活化，吸取保存的对应菌株溶液2μL接种到牛肉膏蛋白胨平板上，于30℃培养2天后，用无菌接种环挑取一环，接种于5mL YMD液体试管中，于30℃、150rpm/min摇床上培养3天，然后按1％的接种量接入装有100mL YMD液体培养基中，加入过滤除菌的色氨酸溶液使其终浓度为0.1％。在30℃，150rpm/min的震荡培养箱中摇培2-4天。取2mL菌液，于离心速度为10000rpm/min的条件下离心5min，然后取1.9mL上清液与3.8mL Salkowski试剂混合均匀，在室温下，避光保存30min(以不加菌株的YMD培养基与Salkowski试剂的1∶2混合溶液为空白对照)，分别测量光密度，并且从IAA浓度和OD530的标准曲线计算相应的IAA浓度。每组实验设置三个重复。

结果发现，在海洋沉积物中分离的细菌有一小部分可以产生生长素，各细菌所产生生长素的能力大小有强有弱。其中获得一株编号为BIO7的菌株产生生长素能力最高。

3、菌株的生理生化特征及鉴定

1)菌株生理生化特征

菌落颜色与形态。取保存的BIO7菌株，用灼烧灭菌的接种环蘸取菌液，用平板划线法在牛肉膏蛋白胨平板上划线，该平板于30℃培养箱中倒置培养，直至出现单菌落。

菌株产酶检测。脂酶检测培养基(1L)：牛肉膏3g，蛋白胨10g，三丁酸甘油酯6ml，NaCl 10g。琼脂20g。纤维素检测培养基(1L)；羧甲基纤维素5g，NaNO₃ 1g，K₂HPO₄ 2g，KCl1g，MgSO₄.7H₂O 0.5g，酵母粉2g，葡萄糖1g，NaCl 10g，琼脂20g。蛋白酶检测培养基(1L)：脱脂奶粉15g，酵母粉2g，NaCl 10g，琼脂20g。淀粉酶检测培养基(1L)：淀粉5g，酵母粉2g，(NH₄)₂SO₄ 1.4g，K₂KPO₄ 2g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，NaCl 10g，琼脂20g。将活化的BIO7菌株分别接种到脂酶检测、纤维素酶检测、蛋白酶检测和淀粉酶检测平板的中央，于30℃培养箱中倒置培养5天。如该菌株在脂酶检测培养基和蛋白酶检测培养基上形成肉眼可见的透明圈，则表示产生脂酶和蛋白酶；纤维素酶检测平板用0.1％的刚果红冲洗，如菌落周围出现透明圈，则表明该菌产生纤维素酶；淀粉酶检测平板用0.3％的碘液冲洗，如菌落周围出现透明圈，则表明该菌产生淀粉酶。

菌株产铁载体检测。铁载体的检测已成为筛选植物促生细菌的一个重要指标。CAS培养基(1L)：1mM的MgSO₄ 10mL,1mM的CaCl₂ 10mL,MM9(K₂HPO₄ 6g，KH₂PO₄ 0.3g，NaCl 0.5g，NH₄Cl 1g,去离子水100mL)5mL,20％的C₆H₁₂O₆溶液10mL,10％的水解酪蛋白30mL,琼脂16g。灭菌后，待培养基冷却到50-60℃时，加入CAS溶液(0.06g铬天青溶于50mL水得溶液1；0.073g HDTMA溶于40mL水得溶液2；向溶液2中加入10mL FeCl₃得溶液3；将溶液1缓慢加入溶液3得到CAS溶液)50mL。将活化后的BIO7菌株接到CAS固体培养基平板中央，于30℃培养箱中倒置培养5天，该菌落周围出现黄色晕圈，则说明该菌株可产生铁载体。

生理生化检测结果如下：

该菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上形成乳白色的菌落，菌落圆形，边缘规则，圆形菌落中央凸起，表面湿润。

该菌株可产生脂酶、纤维素酶、蛋白酶和铁载体，不产生淀粉酶；其结果见表1。

表1 BIO7的产酶检测

酶种类	产酶	透明圈直径(mm)
			脂酶	+	19.5±0.35
纤维素酶	+	5.0±0.03
			蛋白酶	+	18.8±1.06
淀粉酶	-	-
			铁载体	+	0.5±0.05

注：“+”表示产生；“-”表示不产生；实验设三个重复。

2)菌株分类鉴定

提取细菌BIO7的基因组DNA，以此DNA作为模板，利用细菌的通用16S rRNA引物来进行PCR扩增：

上游引物27f:5’-GTTTGATCCTGGCTCAG-3’。

下游引物1492r:5’-CTACGGCTACCTTGTT-3’。

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳和切胶回收纯化后，分别用27f和1492r引物进行双测序，序列经Chromas校正，并通过DANMAN软件进行拼接，得到1420bp的序列，序列如序列表中序列1所示。将该序列在NCBI数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中进行比对分析，结果显示该菌株的16S rRNA序列与数据库中Brevibacillus parabrevis NAP3(KJ872854)和Brevibacillus parabrevis IFO 12334(NR_040981)的同源性达到99.86％。

该类短短芽孢杆菌Brevibacillus parabrevis BIO7，已于2019年01月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号)的保藏编号为CGMCC NO.17202。

实施例2、类短短芽孢杆菌Brevibacillus parabrevis BIO7产生生长素的条件选择

一、培养基和色氨酸对细菌产生生长素的影响

由于各种培养基所含的营养成分不同，其固有的颜色也不同，为了减少培养基颜色对生长素颜色反应的干扰，便于对产生生长素细菌的筛选，我们分别对4种培养基进行了对比：CM培养基、YMD培养基、LB培养基(NaCl 5g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L)、Tryptone培养基(Tryptone(胰蛋白胨，英国OXOID,货号LP0042)10g/L，NaCl 5g/L)。另外，由于生长素合成的直接前体物质是色氨酸(Trp),我们同时对比了以上4种培养基中分别加入0.05％(质量百分浓度)色氨酸和不加入色氨酸对产生生长素的影响。

取50μL保存菌液接种于装有5ml上述各培养基的试管中，以不接菌的培养基作为对照。于30℃震荡培养箱中培养2天。菌液离心后取1.9ml上清液，不接菌的则直接取1.9ml培养基，分别与3.8ml Salkowski试剂混合均匀，在室温下，避光保存30min后观察液体颜色变化，出现粉红色即表示能产生IAA。然后测量其OD₅₃₀值，得到其对应的IAA含量。

以上4种培养基在添加色氨酸与不添加色氨酸以及在接种Brevibacillusparabrevis BIO7与不接种Brevibacillus parabrevis BIO7共16种组合，经培养后，进行生长素的颜色反应及定量测定。颜色反应结果见图3。从图3中可以看出，当4种培养基中添加了色氨酸后(A3，A4，B3，B4，C3，C4，D3，D4)，都比不添加色氨酸的相应培养基的颜色要深。另外还可以看出，当4种培养基中接入了Brevibacillus parabrevis BIO7后(A2，A4，B2，B4，C2，C4，D2，D4)，都比没有接入Brevibacillus parabrevis BIO7的相应的培养基颜色要深，并且有的出现了明显的肉眼可见的粉色反应(图3B2，3B4)。经对比，我们可以看出YMD培养基颜色较深(图3A)，掩盖了粉色反应，不容易观察到颜色变化；Tryptone培养基颜色较浅(图3B)，容易观察到颜色变化；LB培养基虽然染色较浅(图3C)，但接入了Brevibacillusparabrevis BIO7未出现明显的粉色反应；CM培养基颜色较浅(图3D)，较容易观察到颜色变化。经对比，Tryptone培养基接入Brevibacillus parabrevis BIO7(图3B2，3B4)，都产生了粉色甚至更深的颜色反应，说明该培养基适于用来产生生长素的细菌筛选，并且当该培养基加入色氨酸后，粉色颜色进一步加深，说明色氨酸对细菌产生生长素有明显的影响。

为进一步定量Brevibacillus parabrevis BIO7在各种培养基中所产生的生长素的含量，测定了4种培养基加入色氨酸与不加入色氨酸细菌所产生的生长素的含量，结果见表2，YMD、Tryptone和CM培养基中当加入色氨酸后，其生长素的产量明显增加，其发酵液中生长素的产量分别为11.8μg/ml、24.1μg/ml、13.8μg/ml(表2)；而LB培养基在加入色氨酸后，其生长素产量与对照相比反而降低。因此，Tryptone培养基加入0.05％的色氨酸是产生生长素较适合的培养基，可用于生长素的发酵生产。

表2培养基和色氨酸对生长素产量的影响

二、培养时间对细菌产生生长素的影响

选用Tryptone培养基加入0.05％的色氨酸，接入BIO7菌株，进行培养，于30℃震荡培养箱(150rpm/min)中，培养2天时，其生长素产量达24.1μg/ml；培养4天时，生长素产量可达36.1μg/ml；但随着培养时间的进一步延长，其生长素产量略有下降，因此采用发酵4天的方式制备生长素较好。

实施例3、BIO7细菌产生的生长素对小麦生长的影响实验

一、Brevibacillus parabrevis BIO7细菌产生的生长素对离土培养的小麦植株生长的影响

1、培养BIO7细菌产生含生长素的发酵液

配制牛肉膏蛋白胨固体培养基和添加了0.05％色氨酸的Tryptone培养基。BIO7菌株活化及种子培养基的制备同菌液中生长素浓度的测定，按1％的接种量接入装有100mL添加了0.05％色氨酸的Tryptone液体培养基中，在30℃的条件下摇培4天，将菌液在转速为8000rpm/min的条件下离心5min，上清液即为含有生长素的发酵液。将上述上清液进行10倍的等梯度稀释，稀释到10^-1-10^-5；同时将生长素IAA标准品溶液也做等梯度稀释到10^-1-10^-9。

2、含生长素发酵液对离土栽培小麦生长的影响

将小麦种子放于盛有一定量蒸馏水的锥形瓶中，洗涤5到10次后浸泡过夜。将浸泡过夜的小麦种子催芽，待种子胚处露白后，选择发芽程度相近、大小相似的小麦，以保证小麦活力大致相同，排除由于小麦自身因素所导致的可能会在后续处理中带来的影响。将催芽后的小麦种子点种于盛有水琼脂的试管中，待小麦芽长到一定程度后转移到正常光照条件下。并每隔两天分别加入上述相对应的细菌发酵稀释液，和10倍等梯度稀释的生长素标准品溶液，以原始培养基溶液各100μl，每组实验及对照各设置三个重复。

小麦离土培养10天后(图4A)，将试管里的水琼脂连同整棵小麦取出，小心剥去琼脂，得到完整的小麦植株(图4B，4C)。然后对每一稀释梯度的小麦进行综合评价，测量小麦根长和株高。从图4可以明显看出，用不同梯度稀释度的生长素标准品处理的小麦表现出明显的效果，即在高生长素浓度时，对小麦根有明显的抑制作用，随着生长素标准品的稀释，小麦根的总体长度逐渐增加，当生长素标准品稀释至1.6×10^-2μg/ml时(表3)，能明显促进小麦根的伸长；而对应于每个梯度处理的小麦的株高则没有明显的区别。这与生长素对于作物生长的本质特性有关，即高浓度下抑制根的生长，低浓度下促进根的伸长；而作物茎的增高对生长素的反应，则在高浓度下促进茎的生产，但实验中我们并没有观察到茎的增高，说明生长素标准品的浓度还没有达到能促进小麦茎伸长的浓度。同样，小麦植株的根、茎对生长素浓度的敏感性不一样，所以导致了使用不同稀释度梯度的生长素标准品的处理的小麦植株之间有着一定的差异。当用含有生长素的发酵液处理小麦时，和对照相比，加入了不同梯度稀释度的菌的发酵液的小麦对根有着一定的促进或者抑制作用，和生长素标准品处理的小麦有着极高的相似性，即在高浓度时对根有明显的抑制作用，随着发酵液的稀释，根的总体长度先是有了明显的增加，当稀释度为10^-3时，其生长素浓度为3.61×10^-2μg/ml(表3)，其处理的小麦的根总体最长，与对照相比增高了25.0％；随着发酵液的进一步稀释，小麦根长与对照没有明显区别。发酵液低度与高度稀释都为观察到对小麦植株高的促进作用。

表3生长素发酵液和生长素标准品对小麦根长和株高的影响

二、土壤中直接接种Brevibacillus parabrevis BIO7细菌对小麦生长的影响实验

1、实验小麦的准备

取土壤若干，研磨粉碎后过筛，使土质均匀。使用加热后的铁丝在一次性塑料杯底部均匀地钻出5个直径大小相当的小孔，将冷却后的土壤分装等量称量到这些一次性塑料杯中。之后用报纸将这些一次性塑料杯包住，用来保证植株生长过程中的土壤底部的黑暗环境。把处理后的这些一次性塑料杯放于平板中。之后将在121℃条件下高压蒸汽灭菌20min冷却后的无菌水倒入平板中，利用水的渗透作用浸湿整个塑料杯中土壤。保存待用。

将小麦种子浸泡过夜后催芽，催芽后选择发芽程度相近、大小相似的小麦分装到上述盛有灭菌土壤的一次性塑料杯中，以保证小麦活力大致相同，大致排除了由于小麦自身因素所导致的可能会在后续处理中带来的影响。分装完毕后称取4g无菌土壤均匀撒到塑料杯土壤表面，将小麦种子覆盖完全，之后置于黑暗条件下培养，待小麦芽长到一定程度后转移到正常光照条件下。

2、Brevibacillus parabrevis BIO7细菌制剂的制备

BIO7菌株在牛肉膏蛋白胨平板上进行划线培养，然后用无菌水将长出的菌落洗下，转入无菌离心管中，用无菌水洗涤2-3次，最后悬浮在无菌水中，调节其细胞浓度至10⁹个/ml，将均匀的菌液放于装有一定量无菌水的锥形瓶中稀释至细菌细胞数10⁷个/ml，备用。

3、Brevibacillus parabrevis BIO7细菌制剂对小麦生长的影响

取实验小麦，设置3组实验，每组实验三个重复。实验处理如下：待小麦苗子长到1-2cm时，分别将50ml的无菌水、50ml的BIO7细菌制剂和添加了0.05％的Trp的50ml的BIO7细菌制剂分别注入实验小麦的塑料杯里。然后每天检查，根据塑料杯底部培养皿中的水分的多少，各处理补充等量的无菌水，以保持土壤湿润。

实验小麦在室温下培养14天后，将土壤从塑料杯中取出并冲洗掉小麦根上的土壤，将对应每一实验的小麦进行综合评价，测量小麦根长与株高。从图5可以看出，加入了BIO7菌液的小麦长势较好，尤其是在根长方面，比对照组以及加了色氨酸的实验组中小麦的根长有明显的增加。小麦与株高的统计结果见表4，加入了BIO7细菌制剂的小麦根长达到26.2±4.1cm，比对照组中小麦的根长平均增长了1.2％；而加入了色氨酸并且接种BIO7的实验组，其小麦的根长与对照组相比出现了抑制作用，这可能是由于有色氨酸的存在，其细菌合成的生长素浓度稍高，对小麦根的伸长起到一定抑制作用。由此可见BIO7细菌作为微生物制剂可直接添加多土壤中便可促进小麦的生长，无需补充色氨酸。另外，三组实验中小麦株高未有明显的差异，由于该实验培养14天，时间较短，相信随着时间的延长，该微生物BIO7制剂对小麦的根和株高会有更明显的影响。

表4细菌BIO7对小麦生长的影响

处理	小麦总根长/株(cm)	小麦总株高/株(cm)
			无菌水	23.4±4.2	23.9±4.2
BIO7	26.2±4.1	24.9±2.8
			BIO7+Trp	21.8±3.1	23.9±3.8

结论

本实验从海洋沉积物中分离的细菌中经筛选，获得一株产生生长素能力相对较强的菌株，其16S rRNA序列与Brevibacillus parabrevis的16S rRNA序列的相似性为99.86％，命名为Brevibacillus parabrevis BIO7。以该菌株为实验对象，分别探究了培养基和色氨酸、培养时间、以及制备生长素粗产品，评价了该细菌产生的生长素的生理作用，并且将该菌株制成生物制剂，应用于盆栽实验，观察记录对植物生长的促进作用。结果表明：Tryptone液体培养基有利于产生生长素细菌的筛选，并在添加0.05％色氨酸的Tryptone液体培养基中，生长素的产量比其它培养基要高，培养两天，其生长素产量达到24.1μg/ml，当培养4天时可达到36.1μg/ml。

将Brevibacillus parabrevis BIO7细菌发酵制备的生长素粗品，进行10倍的梯度稀释，在离土条件下观察了它们对小麦的根长和株高的影响。BIO7细菌发酵液当稀释至10^-3稀释度时，生长素浓度为3.61×10^-2μg/ml，能明显促进小麦根的伸长；低稀释度中，即生长素浓度高时，则对小麦根的伸长具有抑制作用。无论生长素标准品还是BIO7细菌生长素粗品，对小麦株高都没有明显的影响。通常情况下，对作物茎促进的生长素浓度为促进根生长浓度的100倍，说明细菌产生的生长素浓度还没有达到能明显促进茎生长所需要的浓度。

Brevibacillus parabrevis BIO7细菌直接作为微生物制剂施用于土壤中，结果表明：BIO7细菌作为生物制剂直接添加到土壤中，可促进小麦根的伸长；添加加色氨酸处理的小麦与对照没有明显区别，而添加色氨酸并接入细菌BIO7的处理中，小麦的根受倒一定程度的抑制，这可能是细菌将色氨酸转化为了生长素，从而造成生长素浓度的增加，在一定程度上抑制了根的伸长。

综上所述，Brevibacillus parabrevis BIO7是一株能产生生长素的菌株，其发酵产物以及菌剂本身，都可以促进小麦根的伸长，可用于工业发酵制备生长素化合物加以应用，也可以直接作为生物制剂应用于农业生产。

以上说明对本发明而言只是说明性的，而非限制性的，本领域普通技术人员理解，在不脱离所附权利要求所限定的精神和范围的情况下，可做出许多修改、变化或等效，但都将落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 中国地质大学（北京）

<120>产生生长素的类短短芽孢杆菌及其应用

<130>WHOI190073

<170> Patent-In 3.5

<160> 1

<210> 1

<211> 1420

<212> DNA

<213> 类短短芽孢杆菌（ Brevibacillus parabrevis）

<400> 1

atgcagtcga gcgagggttt tcggacccta gcggcggacg ggtgagtaac acgtaggcaa 60

cctgcctctc agaccgggat aacataggga aacttatgct aataccggat aggtttttgg 120

attgcatgat ccgaaaagaa aagatggctt cggctatcac tgggagatgg gcctgcggcg 180

cattagctag ttggtggggt aacggcctac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag 240

ggtgaccggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg 300

gaattttcca caatggacga aagtctgatg gagcaacgcc gcgtgaacga tgaaggtctt 360

cggattgtaa agttctgttg tcagggacga acacgtgccg ttcgaatagg gcggtacctt 420

gacggtacct gacgagaaag ccacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag 480

gtggcaagcg ttgtccggat ttattgggcg taaagcgcgc gcaggcggct atgtaagtct 540

ggtgttaaag cccggagctc aactccggtt cgcatcggaa actgtgtagc ttgagtgcag 600

aagaggaaag cggtattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca 660

gtggcgaagg cggctttctg gtctgtaact gacgctgagg cgcgaaagcg tggggagcaa 720

acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaggt gttgggggtt 780

tcaataccct cagtgccgca gctaacgcaa taagcactcc gcctggggag tacgctcgca 840

agagtgaaac tcaaaagaat tgacgggggc ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat 900

tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatccc gctgaccgct ctggagacag 960

agcttccctt cggggcagcg gtgacaggtg gtgcatggtt gtcgtcagct cgtgtcgtga 1020

gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatct ttagttgcca gcattcagtt 1080

gggcactcta gagagactgc cgtcgacaag acggaggaag gcggggatga cgtcaaatca 1140

tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg gttggtacaa cgggatgcta 1200

cctcgcgaga ggacgccaat ctctgaaaac caatctcagt tcggattgta ggctgcaact 1260

cgcctacatg aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag catgccgcgg tgaatacgtt 1320

cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac cacgggagtt tgcaacaccc gaagtcggtg 1380

aggtaaccgc aaggagccag ccgccgaagg tgggtgcaaa 1420

Claims

1.一株类短短芽孢杆菌 Brevibacillus parabrevis，其特征在于，名称为类短短芽孢杆菌 Brevibacillus parabrevis BIO7，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC No. 17202。

2.类短短芽孢杆菌 Brevibacillus parabrevis BIO7 CGMCC No.17202在生产生长素中的应用。

3.类短短芽孢杆菌 Brevibacillus parabrevis BIO7 CGMCC No.17202在制备植物生长调节制剂中的应用。

4.类短短芽孢杆菌 Brevibacillus parabrevis BIO7 CGMCC No.17202在制备促进植物生长的微生物菌肥中的应用。

5.一种促进植物生长的生物菌剂，其特征在于，其生物活性成分为类短短芽孢杆菌Brevibacillus parabrevis BIO7 CGMCC No.17202。

6.一种促进植物生长的微生物菌肥，包括权利要求5所述的生物菌剂。

7.根据权利要求6所述的微生物菌肥，其特征在于：所述微生物菌肥还包括色氨酸。

8.一种植物生长调节制剂，包括类短短芽孢杆菌 Brevibacillus parabrevis BIO7CGMCC No.17202。

9.根据权利要求8所述的植物生长调节制剂，其特征在于：所述植物生长调节制剂还包括色氨酸。

10.类短短芽孢杆菌 Brevibacillus parabrevis BIO7 CGMCC No.17202的培养方法，其特征在于：将类短短芽孢杆菌 Brevibacillus parabrevis BIO7接种于含色氨酸的Tryptone培养基中，在于30℃震荡培养箱中培养；所述Tryptone培养基为含有胰蛋白胨10g/L，NaCl 5 g/L的液体培养基；所述色氨酸的终质量百分浓度为0.05%；所述培养的时间为4天。