CN111662843B - 一株解淀粉芽孢杆菌及其分离筛选方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌，该菌株于2020年4月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No：19565；采用本发明所提供的一株解淀粉芽孢杆菌，对椰子茎腐病和花生果腐病的抑制率达到79％，对槟榔炭疽病、椰子灰斑病、槟榔心腐病、油棕心腐病、板栗疫病、油茶叶斑病等致病菌的抑制率超过70％，且该菌株发酵液的抗菌活性在80℃下处理120min后无显著变化，热稳定性强。该菌株在热区作物病害的生物防治中具有较大的应用潜力。

Description

一株解淀粉芽孢杆菌及其分离筛选方法和应用
技术领域
本发明属于微生物资源技术领域，具体为一株解淀粉芽孢杆菌及其分离筛选方法和应用。
背景技术
芽孢杆菌具有耐热、耐旱、抗紫外线、耐电磁辐射和对某些种类的化学物质引起的不良条件具有耐受性等特性，利用芽孢杆菌防治植物病害是目前农业生产上常用的生物防治技术之一。茶枯是茶籽榨油后剩下的残渣，我国的年产量超过100万吨，是常用的有机肥原料。茶枯富含茶皂素，茶皂素是一种溶血性毒素，常用来防治螺害等。将茶枯与生防芽孢杆菌结合，同时发挥茶皂素和芽孢杆菌的抗菌作用，有利于提高植物病虫害的防治效果。因此，筛选具有广谱抗菌活性且耐茶皂素的芽孢杆菌具有重要意义。
发明内容
目前，还没有报道过同时具有耐茶皂素的具有广谱抗菌活性的芽孢杆菌资源。本发明从茶枯中分离筛选出了一株解淀粉芽孢杆菌，该菌具有广谱抗菌活性且耐热耐茶皂素。
鉴于此，本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌，分类命名为解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens，该菌株于2020年4月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号：CGMCC No：19565。
本发明还提供了一株解淀粉芽孢杆菌在防治香蕉枯萎病、椰子茎腐病、花生果腐病、槟榔炭疽病、椰子灰斑病、槟榔心腐病、油棕心腐病、板栗疫病、油茶叶斑病、油茶炭疽病和菜心炭疽病中的一种或几种的应用。
本发明还提供了一株解淀粉芽孢杆菌的分离筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)油茶枯45℃发酵培养24h制成油茶枯饼发酵液，茶皂素浓度为20g/L。
2)称取1g油茶枯发酵液，加入到10ml无菌水中，震荡培养30min，再用灭菌水依次稀释至10-1、10-2、10-3倍，分别取0.1ml涂布于LB培养基上，45℃培养2d左右，选取单菌落进行纯化培养。
有益效果：
在菌丝生长速率法试验中，ck-05菌株发酵液对香蕉枯萎病致病的抑制率达82％，对椰子茎腐病和花生果腐病的抑制率达到79％，对槟榔炭疽病、椰子灰斑病、槟榔心腐病、油棕心腐病、板栗疫病、花生果腐病、油茶叶斑病等致病菌的抑制率超过70％。ck-05菌株发酵液的抗菌活性在80℃下处理120min后无显著变化，热稳定性强。
附图说明
图1为本发明解淀粉芽孢杆菌ck-05在LB平板上的菌落形态图；
图2为本发明解淀粉芽孢杆菌ck-05的显微形态图；
图3为本发明解淀粉芽孢杆菌ck-05***发育树图；
图4为本发明解淀粉芽孢杆菌ck-05发酵液的热稳定性数据图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明作进一步的描述：
实施例1：
解淀粉芽孢杆菌ck-05的分离与鉴定
1)油茶枯45℃发酵培养24h制成油茶枯饼发酵液，茶皂素浓度为20g/L。
2)称取1g油茶枯发酵液，加入到10ml无菌水中，震荡培养30min，再用灭菌水依次稀释至10-1、10-2、10-3倍，分别取0.1ml涂布于LB培养基上，45℃培养2d左右，选取单菌落进行纯化培养。
3)形态形态：在LB培养基上培养2d后，如图1和图2所示，菌落为白色，圆形，表面干燥粗糙有褶皱，小而突起，边缘较整齐，在光学显微镜下观察为短杆状，革兰氏染色为阳性，芽孢椭圆形。
4)主要生理生化特征：菌株ck-05接触酶试验、过氧化氢酶试验、V-P试验、吲哚试验、水解淀粉和酪素试验、硝酸盐还原试验、柠檬酸盐利用试验、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖发酵试验均呈阳性；甲基红试验呈阴性。菌株ck-05的生理生化特征与蜡状芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens基本一致。
5)分子生物学鉴定：采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取目的菌株的DNA作为模板，通用引物27F和1492R进行PCR扩增。取50ml PCR产物用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，将PCR产物送至北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。将序列通过在NCBI网站上进行Blast对比，采用BioEdit、Mega5.0等软件对菌株进行***发育分析，采用邻接(Neighbour-joining，NJ法)构建***发育树，如图3所示，结果表明菌株ck-05为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens，登录号：MK592621)。
实施例2：解淀粉芽孢杆菌ck-05菌株发酵液的抗菌谱测定
1)采用菌丝生长速率法。取ck-05菌株无菌发酵滤液10ml与90ml冷却至40℃的PDA培养基混合均匀，制成含菌株ck-05无菌发酵液的培养基平板。在平板中央分别接入供试病原菌菌块(5mm)，每种病原菌为1个处理，每处理重复3次。以无菌水与PDA培养基混合的为对照，放置于28℃的恒温培养箱培养，待对照组菌落长满培养皿时，采用十字交叉法测量处理组菌落直径，计算无菌滤液的抑菌率。
抑菌率＝(对照菌落生长直径-处理菌落生长直径)/对照菌落生长直径×100％
由表1可知，ck-05菌株发酵液对11种供试病原菌均有较强的抑制作用，除对菜心炭疽病的抑菌作用为43.47％外，对其他10种供试病原菌的抑菌率均达到50％以上，其中对香蕉枯萎病的抑制作用最强，抑菌率达82.22％，其次为花生果腐病和椰子茎腐病，抑菌率分别为 79.44％和78.89％。由此可见，ck-05菌株发酵液抗菌范围较广。
表1 ck-05菌株发酵液对11种病原菌的抑制作用
Figure RE-GDA0002594958410000031
实施例3：解淀粉芽孢杆菌ck-05的抑菌作用热稳定性测定
1)在40、60、80、100℃条件下，分别将ck-05菌株无菌发酵液处理30、60、120min 和121℃高压蒸汽灭菌处理30min，以香蕉枯萎病尖孢镰刀菌为指示菌，测定无菌发酵液经不同温度处理后的抑菌率。每处理重复3次，以未处理发酵液为对照。待对照组菌丝长满培养皿时测量处理组菌落直径，然后计算抑菌率。
由图4可知，ck-05菌株发酵液经不同温度处理后仍具有较强的抑菌作用，80℃以下温度处理30、60、120min后抑菌作用无显著变化，但经100℃高温处理后其抑菌活性明显下降， 100℃处理30min抑菌率仍可达41.48％，而100℃处理120min抑菌率为31.48％。另外，ck-05 菌株发酵液经121℃高压蒸汽灭菌处理20min后抑菌活性迅速下降，抑菌率仅为19.26％。图 4可清晰地反映出ck-05菌株发酵液在温度升高到100℃后其抑菌率明显降低，这可能是由于温度高于100℃时导致ck-05菌株发酵液中的抑菌活性物质结构发生变化，最终导致抑菌活性下降，但温度低于80℃时则具有较好的热稳定性，说明ck-05菌株抗菌物质具有较强的热稳定。
序列表
<110> 中国热带农业科学院椰子研究所
<120> 一株解淀粉芽孢杆菌及其分离筛选方法和应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1435
<212> DNA
<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)
<400> 1
cggcctatac tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga 60
cgggtgagta acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg 120
ctaataccgg atggttgtct gaaccgcatg gttcagacat aaaaggtggc ttcggctacc 180
acttacagat ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcga 240
cgatgcgtag ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac 300
tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg 360
ccgcgtgagt gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtgc 420
cgttcaaata gggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc 480
cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc 540
tcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg 600
gaaactgggg aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg 660
cgtagagatg tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg 720
aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg 780
atgagtgcta agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac 840
tccgcctggg gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca 900
agcggtggag catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat 960
cctctgacaa tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg 1020
gttgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg 1080
atcttagttg ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg 1140
aaggtgggga tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca 1200
atggacagaa caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc 1260
agttcggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat 1320
cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccgacgag 1380
agtttgtaac acccgaagtc ggtgaggtaa ccttttatgg agccagcccg cccct 1435

Claims (2)

1.一株解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）ck-05，其特征在于，该菌株于2020年4月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCCNo：19565。
2.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌在防治香蕉枯萎病、椰子茎腐病、花生果腐病、槟榔炭疽病、椰子灰斑病、槟榔心腐病、油棕心腐病、板栗疫病、油茶叶斑病、油茶炭疽病和菜心炭疽病中的一种或几种的菌剂的应用。
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