CN110468057A - 一株植物内生盘双端毛孢属真菌m7sb 41及其应用 - Google Patents
一株植物内生盘双端毛孢属真菌m7sb 41及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110468057A CN110468057A CN201910822157.5A CN201910822157A CN110468057A CN 110468057 A CN110468057 A CN 110468057A CN 201910822157 A CN201910822157 A CN 201910822157A CN 110468057 A CN110468057 A CN 110468057A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- powdery mildew
- m7sb
- tobacco
- disk
- plant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000233866 Fungi Species 0.000 title claims abstract description 26
- 241000221785 Erysiphales Species 0.000 claims abstract description 70
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 37
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims description 2
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 claims 1
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 abstract description 58
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 abstract description 57
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 abstract description 46
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 abstract description 38
- 244000005700 microbiome Species 0.000 abstract description 6
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 abstract description 4
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 abstract description 4
- 241000896246 Golovinomyces cichoracearum Species 0.000 abstract description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 28
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 20
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 11
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 11
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 10
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 244000050053 Rosa multiflora Species 0.000 description 6
- 235000000656 Rosa multiflora Nutrition 0.000 description 6
- 229930002875 chlorophyll Natural products 0.000 description 6
- 235000019804 chlorophyll Nutrition 0.000 description 6
- ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M chlorophyll a Chemical compound C1([C@@H](C(=O)OC)C(=O)C2=C3C)=C2N2C3=CC(C(CC)=C3C)=[N+]4C3=CC3=C(C=C)C(C)=C5N3[Mg-2]42[N+]2=C1[C@@H](CCC(=O)OC\C=C(/C)CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)[C@H](C)C2=C5 ATNHDLDRLWWWCB-AENOIHSZSA-M 0.000 description 6
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 6
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 6
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 6
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 6
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 5
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001573925 Gleba Species 0.000 description 4
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 4
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 4
- 238000007598 dipping method Methods 0.000 description 4
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 4
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000004382 potting Methods 0.000 description 3
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 241000235349 Ascomycota Species 0.000 description 2
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 2
- 244000271144 Crinum americanum Species 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000192128 Gammaproteobacteria Species 0.000 description 2
- 208000031888 Mycoses Diseases 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 241000351911 Seimatosporium Species 0.000 description 2
- 241001557892 Xylaria sp. Species 0.000 description 2
- 238000005452 bending Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 239000010451 perlite Substances 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 238000002864 sequence alignment Methods 0.000 description 2
- QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N streptomycin sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O.CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@@H](N=C(N)N)[C@H](O)[C@H]1O QTENRWWVYAAPBI-YCRXJPFRSA-N 0.000 description 2
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 244000260524 Chrysanthemum balsamita Species 0.000 description 1
- 235000005633 Chrysanthemum balsamita Nutrition 0.000 description 1
- 241001266001 Cordyceps confragosa Species 0.000 description 1
- 241000221787 Erysiphe Species 0.000 description 1
- 108020000949 Fungal DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 206010039509 Scab Diseases 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 230000036579 abiotic stress Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 235000019504 cigarettes Nutrition 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 239000003205 fragrance Substances 0.000 description 1
- 244000000004 fungal plant pathogen Species 0.000 description 1
- KQPBSBAEBKRAAU-UHFFFAOYSA-N hypochlorous acid;sodium Chemical compound [Na].ClO KQPBSBAEBKRAAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000010977 jade Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 239000002068 microbial inoculum Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000013370 mutualism Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000447 pesticide residue Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
- C12N1/145—Fungal isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一株植物内生盘双端毛孢属真菌（Seimatosporiumsp.）M7SB 41，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.18114；所述菌株可应用于烟草白粉病的防治，对由二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearum DC）引起的烟草白粉病具有较好的拮抗作用，并能显著促进染病烟草生长，提高其防病抗病能力；本发明在生物防治白粉病领域具有广阔的应用前景，为白粉病生防制剂的研制与应用提供菌种资源及理论依据。
Description
技术领域
本发明属于植物病害生物防治技术领域，具体涉及一株植物内生盘双端毛孢属真菌（Seimatosporium sp.）M7SB 41及其应用。
背景技术
烟草白粉病（Tobacco Powdery Mildew）是烟叶生产的主要病害之一，它是由二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearum DC.）感染引起的真菌病害，全国范围内均有发生。病发部位通常从下部叶片开始，自下而上蔓延，严重时叶片全部脱落，仅留叶脉（郭齐汤等，2009）。病叶烘烤后颜色棕褐，叶面有明显点状病斑，薄如纸，油分少，香气严重缺乏，杂气重，破损度大，造碎率高，严重影响烟叶的产量和品质(刘彩云等，2018)。目前，培育抗病品种、加强田间栽培管理、采用药剂防治是防治烟草白粉病病害的主要措施（蔡璘等，2017）。然而，化学药剂的长期使用不仅会增强病原菌抗性，导致农药残留增加，影响吸烟者安全，还会对生态环境造成污染与破坏。因此，人们对现代农业的防治技术提出了更高要求。生物防治因其无污染、无残留、成本低等优点，近年来备受关注 (Li et al., 2015；Xie etal.，2016)。关于白粉病生物防治，国内外已有报道，而且许多菌株已实现商业化生产并在实际应用中取得了良好的收益。如Ampelomycesquisqualis Ces, Lecanicillium lecaniiZimm, Bacillus subtilis, Bacillus velezensis CC09 和 Gjaerumia minor Nyland等在白粉病控制中效果显著(Nasir et al., 2014; Mmbaga et al., 2016; Cai et al.,2017)。
植物内生菌（endophyte）指一类生活在健康植物组织内部而不引起植物组织明显症状改变的微生物 (Arnold et al., 2000)。由于内生菌长期生活在植物组织内部，与宿主植物协同进化，植物为内生菌提供生长所需环境和营养物质，内生菌则通过代谢出众多的生物活性物质来促进宿主植物的生长发育，提高其对各种生物和非生物胁迫的抵抗能力（Strobel & Daisy, 2003），其中受到关注最多的是内生菌增强宿主植物对各种病原菌的抵抗力（O’Keeffe et al., 2017)。如 Mmbaga等（2008）研究发现酵母内生菌Rhodosporidium spp.可有效拮抗山茱萸白粉病的发生。近年的研究发现内生真菌Mycosphaerella punctiformis可能是橡树白粉病病原菌Erysiphe alphitoides 的有效拮抗剂（Jakuschkin, et al., 2016)。然而，有关内生菌在烟草白粉病防治方面的研究较少。目前，国内外尚未见盘双端毛孢属真菌在烟草白粉病防治中的应用报道。
发明内容
本发明目的在于提供一株植物内生盘双端毛孢属真菌（Seimatosporiumsp.）M7SB41，其于2019年7月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.18114，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明另一目的是提供上述植物内生盘双端毛孢属真菌M7SB 41的新用途，即针对目前白粉病药剂防治技术的缺陷和不足，将植物内生盘双端毛孢真菌M7SB 41应用在植物白粉病防治中，本发明所提供的盘双端毛孢属真菌M7SB 41经实验验证对烟草白粉病具有较好的防治效果，并能促进染病烟草的生长，增强其抗病能力。
为了实现以上目的，本发明采取以下技术措施：
A、采集白粉病抗性野生蔷薇大理紫花和白粉病易感野生蔷薇七姐妹的带叶枝段，于自来水下冲洗干净；
B、将植物样品分为茎、叶两部分分别进行表面消毒，首先用体积浓度75%的乙醇溶液浸泡3~5min，无菌水冲洗3~5次，再用有效氯浓度为5%的次氯酸钠溶液浸泡2~3min，无菌水冲洗3~5次，冲洗完后将其置于无菌滤纸上吸干水分；将茎、叶组织块剪成片段并贴于含有0.5g/L硫酸链霉素和0.5g/L青霉素的PDA培养基上培养，24~26℃培养40~50天，隔天观察，见组织块周围有菌落长出则挑取，分离纯化后获得内生真菌菌株，并将内生真菌菌株制成菌悬液；
C、盆栽无菌烟苗接种内生真菌菌悬液，之后人工感染白粉菌，观察喷施白粉菌孢子悬液10天后内生真菌对烟苗白粉病发病情况的影响，挑选出对白粉病抗性较好的菌株4~5株进行复筛，获得菌株M7SB 41；
D、菌株M7SB 41的鉴定
M7SB 41形态学特征：初期菌落呈黄白色，近圆形，不透明，后期培养菌落呈褐色，菌落与培养基连接紧密；显微镜下观察产孢体为分生孢子盘，近圆形，由褐色的角胞组织构成，顶端不规则开列；分生孢子梗圆柱形，细长，有少数顶端层出；分生孢子纺锤形到弯曲，一般4个细胞，2个末端细胞无色，中间细胞暗色，顶端附属四单生。
分子鉴定：采用试剂盒提取该菌株总DNA，经检测后送测序公司进行序列测定，将测序结果与NCBI上序列进行比对；
结合形态学特征和分子鉴定结果，最终将该菌株鉴定为子囊菌门、粪壳菌纲、炭角菌目、圆孔壳科，盘双端毛孢属（Seimatosporium）真菌。
本发明植物内生盘双端毛孢属真菌M7SB 41和/或菌株代谢产物可以制成微生物菌剂。
本发明将植物内生盘双端毛孢属真菌M7SB 41应用在烟草白粉病防治中，所述白粉病为二孢白粉菌（Erysiphe cichoracearum DC）引起的真菌病害；通过温室盆栽试验，将盆栽无菌烟苗随机分为2组，每组10个重复，处理组接种内生菌M7SB 41的菌悬液，对照组接种M7SB 41菌悬液的灭活物（菌悬液于115℃灭菌20分钟制成），之后人工感染白粉菌，分别观察喷施白粉菌孢子悬液第7天、第10天内生菌菌株M7SB 41对烟苗白粉病发病情况的影响；实验结果显示：与对照组相比，无论是染病后的第7天，还是第10天，处理组（接种菌株M7SB 41）烟苗的病情指数显著低于对照组（菌株M7SB 41灭活物），菌株M7SB 41能有效控制烟苗白粉病的病情发展。
另外，本发明菌株M7SB 41还能显著促进感染白粉病烟草生长，可提高植物在逆境条件下的适应性，通过温室盆栽试验，将盆栽无菌烟苗随机分为2组，每组10个重复，处理组接种内生菌菌株M7SB 41菌悬液，对照组接种该内生菌灭活物，之后人工感染白粉菌，分别于喷施白粉菌孢子悬液第7天测定两组植物的叶绿素含量；并在喷施白粉菌孢子悬液第14天收割烟苗，测定株高、根长、干重等生物量；实验结果显示：与对照组相比，处理组的株高、根长、干重以及叶绿素含量都有较大提高。
因此本发明所提供的盘双端毛孢属真菌M7SB 41可以作为一种植物病原真菌拮抗菌，有效抑制植物白粉病病情的发展并显著促进染病植物的生长，增强其抗病能力，为植物白粉病的防治提供新的解决办法，具有广阔的应用前景。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）盘双端毛孢属真菌M7SB 41对二孢白粉菌引起的烟草白粉病病情有明显的抑制作用，为植物白粉病的防治提供一种新的生物防治方法，其接种于染病植物后，能显著促进植物生长，提高其抗病能力，是一株非常有潜力的抗病菌株；菌株M7SB 41来源于白粉病高抗野生蔷薇大理紫花的茎，长期生长于植物体内，与宿主植物协同进化，互利共生；与传统化学药剂防治白粉病相比，生物防治更加环保、安全；
（2）通过简单液体发酵即可获得大量可用于白粉病防治的菌丝体，菌体易获取，成本低廉，拥有商业化应用的潜能。
附图说明
图1为盘双端毛孢属真菌M7SB 41 在PDA培养基上的菌落形态，其中a图为菌株M7SB 41在PDA培养基上生长7天的形态，b图为菌株M7SB 41在PDA培养基上能观察到产孢体时的形态；
图2为处理组与对照组烟草白粉病发病情况，其中a图为对照组，b图为处理组；
图3为接种盘双端毛孢属真菌M7SB 41后对烟草白粉病病情的影响；
图4为接种盘双端毛孢属真菌M7SB 41后对烟草叶绿素含量的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。
实施例1：盘双端毛孢属真菌M7SB 41的分离、筛选与鉴定
1、采集植物样品
白粉病抗性野生蔷薇大理紫花和白粉病易感野生蔷薇七姐妹均采自云南省大理市苍山地区；样品按S形进行采集，设置三个重复；具体采样方法为：用无菌剪刀剪下长度约0.5m的带叶枝段20个，采集后立即置于无菌袋中，贴好标签，带回实验室并于采样后24h内完成内生菌的分离工作；
2、 将上述采集的植物样品于自来水下冲洗干净，分为茎、叶两部分并进行表面消毒：首先用体积浓度75%的乙醇溶液浸泡3min，无菌水冲洗4次，再用有效氯浓度为5%的次氯酸钠溶液浸泡2min，无菌水冲洗4次，冲洗完后将其置于无菌滤纸上吸干水分；将茎、叶组织块剪成0.5×0.5cm的片段并贴于含有0.5g/L硫酸链霉素和0.5g/L青霉素的PDA培养基上，25℃培养45天，隔天观察，见组织块周围有菌落长出则挑取，分离纯化后获得该植物的内生真菌菌株52株；
3、将上述分离得到的内生真菌菌株接种到PDA平板培养基上，培养7-10天后，待菌丝长满平板后，用无菌手术刀沿平板表面刮取菌丝体，用无菌手术剪刀剪碎后加入20mL无菌水中，混匀，制成内生菌菌悬液；将菌悬液平均分为2份，一份直接作为接种剂，另一份于115℃灭菌20min制成灭活物；用无菌剪刀剪取感染二孢白粉菌的烟草K326烟叶，白粉菌菌斑大小为1.0×1.0cm，溶于250mL无菌水中，制成二孢白粉菌孢子悬液备用；烟草K326种子由玉溪中烟种子有限责任公司提供，产品批号：20170301，于4℃保存备用。按V腐殖土：V珍珠岩=7:3的比例制备混合土壤，121℃灭菌15min，隔天重复灭菌1次，共灭菌3次备用；
随机挑出烟草K326种子100粒，用体积浓度75%的乙醇溶液浸泡2min，无菌水冲洗3次，然后用有效氯浓度为5%的次氯酸钠溶液浸泡1min，无菌水冲洗3次，清洗完的种子置于无菌滤纸上吸干水分；向无菌花盘中加入150g无菌混合土壤并铺平，将表面消毒后的种子均匀地播撒在其中，置于室温下（18-25℃），自然光周期进行萌发，每3d浇100mL无菌水。
待无菌烟苗长出4~5片真叶时，将烟苗移栽至直径为14.5 cm的花盆中(1棵/盆)并随机分为2组，每组3个重复；在烟苗移栽后的第7天和第14天，处理组烟苗接种内生菌M7SB 41的菌悬液，对照组接种该内生菌菌悬液的灭活物（121℃高压蒸汽灭菌15min），共接种两次，具体是用无菌棉签蘸取菌悬液后均匀涂抹到烟叶正反面和地上根茎部位。
在第二次接种内生菌菌悬液或其灭活物后的第5天，人工感染白粉菌，具体为喷雾接种二孢白粉菌孢子悬液一次；在喷施白粉菌后的第7天观察白粉病发病情况，按以下标准对每片烟叶评分，按以下病情分级标准计算病情指数。
病情分级标准：
0级：叶片无病斑；
1级：病斑面积占整个叶片面积的5%以下；
3级：病斑面积占整个叶片面积的6%~10%；
5级：病斑面积占整个叶片面积的11%~20%；
7级：病斑面积占整个叶片面积的21%~40%；
9级：病斑面积占整个叶片面积的41%以上及死亡。
病情指数= ∑[（各级病叶数×相应级数值）/(调查总叶数×发病最高级数值)]×100。
4、从52株（涵盖21个内生真菌菌属）内生真菌中筛选出有拮抗作用的菌株8株（平均病情指数< 25），挑选出抗性较好的菌株5株后进行复筛，其中抗性最好的菌株为内生真菌M7SB 41，其分离自抗性野生蔷薇大理紫花；
本实施例前期曾用白粉病蔷薇的离体叶片做过抗白粉病的有效菌株筛选，但没有筛选到有功能的菌株；可能的原因是白粉菌属于专性活体营养寄生菌，在离体培养的情况下，可能生长状态并不理想。其次，某些菌株发挥抗性，可能需要通过宿主植物的代谢过程才能发挥作用，故本实例采用盆栽实验，通过模式植物烟草对白粉病功能菌株进行筛选。
5、内生真菌M7SB 41鉴定
（1）形态学特点：将分离到的内生真菌菌株M7SB 41接种于PDA平板上，见图1，图1中a图为菌株M7SB 41在PDA培养基上生长7天的形态，b图为菌株M7SB 41在PDA培养基上能观察到产孢体时的形态。初期菌落呈黄白色，近圆形，不透明，后期培养菌落呈褐色，菌落与培养基连接紧密；显微镜下观察产孢体为分生孢子盘，近圆形，由褐色的角胞组织构成，顶端不规则开列；分生孢子梗圆柱形，细长，有少数顶端层出；分生孢子纺锤形到弯曲，一般4个细胞，2个末端细胞无色，中间细胞暗色，顶端附属四单生。
（2）分子鉴定：将菌株M7SB 41接种到PDA培养基斜面培养后，送至昆明硕擎生物科技有限公司进行测序；采用北京百泰克生物技术有限公司生产的新型快速真菌DNA大量提取试剂盒提取该菌株的总DNA后，经PCR扩增后测序，测序结果在NCBI上利用NucleotideBLAST进行序列比对；序列比对时发现，和NCBI上已知的序列有差异，同源度为98%；
结合形态学特征和分子鉴定结果，最终将该菌株鉴定为子囊菌门、粪壳菌纲、炭角菌目、圆孔壳科，盘双端毛孢属（Seimatosporium）菌株。
实施例2：盘双端毛孢属真菌M7SB 41对烟草白粉病的防治作用
本实施例旨在证明盘双端毛孢属菌M7SB 41对由二孢白粉菌引起的烟草白粉病的防治作用，其实验过程如下：
A、盘双端毛孢属菌株M7SB 41菌悬液的制备：将盘双端毛孢属菌株M7SB 41接种到PDA平板培养基上，25℃恒温培养10天后，用无菌手术刀沿平板表面刮取菌丝体，取3g菌丝体，用无菌手术剪刀剪碎后加入20mL无菌水中，混匀，制成15g/100mL活菌丝体的M7SB 41菌悬液备用；
B、二孢白粉菌孢子悬液制备：用无菌剪刀剪取感染二孢白粉菌的烟草K326烟叶，白粉菌菌斑大小为1.0×1.0cm，溶于250mL无菌水中，制成孢子悬液备用；
C、温室盆栽防效实验：烟草K326种子购自玉溪中烟种子有限责任公司，产品批号：20170301，于4℃保存备用。按V腐殖土：V珍珠岩=7:3的比例制备混合土壤，121℃灭菌15min，隔天重复灭菌1次，共灭菌3次备用；随机挑出烟草K326种子100粒，先用体积浓度75%的乙醇溶液浸泡2min，无菌水冲洗3次，然后用有效氯浓度为5%的次氯酸钠浸泡1min，无菌水冲洗3次，冲洗后种子置于无菌滤纸上吸干水分；在无菌花盘中加入150g无菌混合土壤并铺平，将表面消毒后的种子均匀地播撒在其中，置于室温下（18-25℃），自然光周期进行萌发，每3d浇100mL无菌水；
待无菌烟苗长至4~5片真叶时，将烟苗移栽至直径为14.5 cm的花盆中(1棵/盆)并随机分为2组，每组10个重复。在烟苗移栽后的第7天和第14天，处理组烟苗接种内生菌M7SB 41的菌悬液，对照组接种该内生菌菌悬液的灭活物（121℃高压蒸汽灭菌15min），共接种两次，具体是用无菌棉签蘸取菌悬液后均匀涂抹到烟叶正反面和地上根茎部位。在第二次接种内生菌菌悬液或其灭活物后的第5天，人工感染白粉菌，具体喷雾接种二孢白粉菌孢子悬液一次；在喷施白粉菌后的第7天、第10天观察白粉病发病情况，病情评分标准与病情指数的计算公式同实施例1。
温室盆栽防效实验结果显示：接种M7SB41菌悬液后，烟苗的病情指数显著降低；对照组在接种烟草白粉菌第7天和第10天的病情指数分别为54.58和67.86，而处理组的病情指数分别为23.31和47.62。无论接种白粉菌后第7天还是第10天，处理与对照的发病情况均存在显著差异（P< 0.001），接种M7SB41显著增强了烟苗的白粉病抗性，如图2和图3所示。
实施例3：接种盘双端毛孢属菌M7SB 41对染病烟草生长的影响
实验过程和技术方法同实施例2，所不同的是在观察白粉病发病情况的同时，增加了烟苗生物量的测定；即在喷施白粉菌孢子悬液第7天测定对照组和处理组植物的叶绿素含量；于喷施白粉菌孢子悬液第14天收割烟苗，测定株高、根长、干重等生物量。
盆栽实验结果如表1和图4所示，接种盘双端毛孢属菌株M7SB 41对感染白粉菌的烟苗生长有显著的促进作用；与对照组相比，处理组的株高、干重以及叶绿素含量都有较大提高，但根长的增加不显著（P > 0.05），而株高、干重与叶绿素含量的增加均达到显著差异（P < 0.01）。
表1 接种盘双端毛孢属菌M7SB 41对染病烟草生长的影响
上述实施案例的结果说明本发明中分离获取的盘双端毛孢属菌菌株M7SB 41能显著抑制烟草白粉病病情发展；同时，接种该内生真菌可显著促进染病烟草的生长，增强其抗病能力，达到了有效防治烟草白粉病的目的，是一株非常有开发潜力的菌株。
Claims (2)
1.一株植物内生盘双端毛孢属真菌（Seimatosporiumsp.）M7SB 41，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.18114。
2.权利要求1所述的植物内生盘双端毛孢属真菌M7SB 41在植物白粉病防治中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910822157.5A CN110468057B (zh) | 2019-09-02 | 2019-09-02 | 一株植物内生盘双端毛孢属真菌m7sb 41及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910822157.5A CN110468057B (zh) | 2019-09-02 | 2019-09-02 | 一株植物内生盘双端毛孢属真菌m7sb 41及其应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110468057A true CN110468057A (zh) | 2019-11-19 |
| CN110468057B CN110468057B (zh) | 2021-09-24 |
Family
ID=68514672
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910822157.5A Active CN110468057B (zh) | 2019-09-02 | 2019-09-02 | 一株植物内生盘双端毛孢属真菌m7sb 41及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110468057B (zh) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112094760A (zh) * | 2020-10-13 | 2020-12-18 | 昆明理工大学 | 一株植物内生真菌土栖棘壳孢d2g24及其应用 |
| CN112358974A (zh) * | 2020-12-09 | 2021-02-12 | 昆明理工大学 | 一株植物内生真菌黑附球菌fzt214及其应用 |
| CN113439763A (zh) * | 2021-07-28 | 2021-09-28 | 广西壮族自治区农业科学院 | 内生真菌菌株x22在防治白粉病上的应用 |
| CN114703081A (zh) * | 2022-01-03 | 2022-07-05 | 昆明理工大学 | 一株短波单胞菌st3cs3及其应用 |
Citations (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20130090062A (ko) * | 2012-02-03 | 2013-08-13 | 고려대학교 산학협력단 | 세이마토스포리움 디스코시오이데스에서 분리된 신규 폴리하이드록실레이티드 마크로라이드 유도체 및 이의 용도 |
| CN104822257A (zh) * | 2012-09-13 | 2015-08-05 | Fb科技控股公司 | 抑制真菌的组合物和方法 |
| WO2015117563A1 (en) * | 2014-02-07 | 2015-08-13 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal heterobicyclic derivatives |
| WO2015132133A1 (en) * | 2014-03-04 | 2015-09-11 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal heterobicyclic derivatives |
| WO2015162268A1 (en) * | 2014-04-25 | 2015-10-29 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal imidazole derivatives |
| CN105072891A (zh) * | 2013-03-06 | 2015-11-18 | 格拉斯兰兹技术有限公司 | 改进的内生真菌 |
| CN106591156A (zh) * | 2017-01-16 | 2017-04-26 | 昆明理工大学 | 一株黑附球菌fxz2及其应用 |
| CN107105666A (zh) * | 2015-01-13 | 2017-08-29 | 先正达参股股份有限公司 | 新颖的杀微生物剂 |
| CN108135170A (zh) * | 2015-10-14 | 2018-06-08 | 先正达参股股份有限公司 | 杀真菌组合物 |
| CN106754897B (zh) * | 2017-03-15 | 2019-06-21 | 昆明理工大学 | 一种提取野生蔷薇内生真菌基因组的方法 |
| CN111315216A (zh) * | 2017-06-08 | 2020-06-19 | 免疫生物防治法国公司 | 前沟藻醇对作物和种子的致病真菌、卵菌和/或细菌的杀真菌和/或杀细菌活性的用途 |
| CN111748498A (zh) * | 2020-07-08 | 2020-10-09 | 云南省烟草公司曲靖市公司 | 一种具有防治白粉病、赤星病功能的芽孢杆菌复配菌剂及其制备方法和应用 |
| CN112358974A (zh) * | 2020-12-09 | 2021-02-12 | 昆明理工大学 | 一株植物内生真菌黑附球菌fzt214及其应用 |
-
2019
- 2019-09-02 CN CN201910822157.5A patent/CN110468057B/zh active Active
Patent Citations (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20130090062A (ko) * | 2012-02-03 | 2013-08-13 | 고려대학교 산학협력단 | 세이마토스포리움 디스코시오이데스에서 분리된 신규 폴리하이드록실레이티드 마크로라이드 유도체 및 이의 용도 |
| CN104822257A (zh) * | 2012-09-13 | 2015-08-05 | Fb科技控股公司 | 抑制真菌的组合物和方法 |
| CN105072891A (zh) * | 2013-03-06 | 2015-11-18 | 格拉斯兰兹技术有限公司 | 改进的内生真菌 |
| WO2015117563A1 (en) * | 2014-02-07 | 2015-08-13 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal heterobicyclic derivatives |
| CN106103444A (zh) * | 2014-03-04 | 2016-11-09 | 先正达参股股份有限公司 | 杀微生物的杂二环衍生物 |
| WO2015132133A1 (en) * | 2014-03-04 | 2015-09-11 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal heterobicyclic derivatives |
| WO2015162268A1 (en) * | 2014-04-25 | 2015-10-29 | Syngenta Participations Ag | Microbiocidal imidazole derivatives |
| CN107105666A (zh) * | 2015-01-13 | 2017-08-29 | 先正达参股股份有限公司 | 新颖的杀微生物剂 |
| CN108135170A (zh) * | 2015-10-14 | 2018-06-08 | 先正达参股股份有限公司 | 杀真菌组合物 |
| US10631539B2 (en) * | 2015-10-14 | 2020-04-28 | Syngenta Participations Ag | Fungicidal compositions |
| CN106591156A (zh) * | 2017-01-16 | 2017-04-26 | 昆明理工大学 | 一株黑附球菌fxz2及其应用 |
| CN106754897B (zh) * | 2017-03-15 | 2019-06-21 | 昆明理工大学 | 一种提取野生蔷薇内生真菌基因组的方法 |
| CN111315216A (zh) * | 2017-06-08 | 2020-06-19 | 免疫生物防治法国公司 | 前沟藻醇对作物和种子的致病真菌、卵菌和/或细菌的杀真菌和/或杀细菌活性的用途 |
| CN111748498A (zh) * | 2020-07-08 | 2020-10-09 | 云南省烟草公司曲靖市公司 | 一种具有防治白粉病、赤星病功能的芽孢杆菌复配菌剂及其制备方法和应用 |
| CN112358974A (zh) * | 2020-12-09 | 2021-02-12 | 昆明理工大学 | 一株植物内生真菌黑附球菌fzt214及其应用 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| SATOSHI HATAKEYAMA等: ""A new species of Discostroma and its anamorph Seimatosporium with two morphological types of conidia, isolated from the stems of Paeonia suffruticosa"", 《MYCOSCIENCE》 * |
| 何运转等: "《中草药主要病虫害原色图谱》", 31 January 2019, 中国医药科技出版社 * |
| 冯泉清等: ""盘双端毛孢属中国一新纪录种"", 《大理学院学报》 * |
| 熊帜: ""不同白粉病抗性野生蔷薇内生真菌群落结构比较研究"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》 * |
| 白维晓等: ""两种不同白粉病抗性野生蔷薇内生真菌群落结构"", 《微生物学通报》 * |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112094760A (zh) * | 2020-10-13 | 2020-12-18 | 昆明理工大学 | 一株植物内生真菌土栖棘壳孢d2g24及其应用 |
| CN112094760B (zh) * | 2020-10-13 | 2022-01-28 | 昆明理工大学 | 一株植物内生真菌土栖棘壳孢d2g24及其应用 |
| CN112358974A (zh) * | 2020-12-09 | 2021-02-12 | 昆明理工大学 | 一株植物内生真菌黑附球菌fzt214及其应用 |
| CN112358974B (zh) * | 2020-12-09 | 2022-06-10 | 昆明理工大学 | 一株植物内生真菌黑附球菌fzt214及其应用 |
| CN113439763A (zh) * | 2021-07-28 | 2021-09-28 | 广西壮族自治区农业科学院 | 内生真菌菌株x22在防治白粉病上的应用 |
| CN113439763B (zh) * | 2021-07-28 | 2022-05-10 | 广西壮族自治区农业科学院 | 内生真菌菌株x22在防治白粉病上的应用 |
| CN114703081A (zh) * | 2022-01-03 | 2022-07-05 | 昆明理工大学 | 一株短波单胞菌st3cs3及其应用 |
| CN114703081B (zh) * | 2022-01-03 | 2023-04-28 | 昆明理工大学 | 一株短波单胞菌st3cs3及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110468057B (zh) | 2021-09-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110468057A (zh) | 一株植物内生盘双端毛孢属真菌m7sb 41及其应用 | |
| CN101851597B (zh) | 一株抗苜蓿病害灰黄链霉菌及其筛选方法 | |
| CN103160442B (zh) | 一株对柑橘木虱具强致病力的淡紫拟青霉菌株 | |
| CN106119155B (zh) | 用于防治花生根腐病的菌株wxx-2及菌剂 | |
| CN105543132A (zh) | 一种甲基营养型芽孢杆菌yb-f7及其在防治植物病害中的应用 | |
| CN107779420A (zh) | 一种两株拮抗烟草青枯病的内生贝莱斯芽胞杆菌及其应用 | |
| CN103981102A (zh) | Dse菌株24l-4及其在铁皮石斛生产上的应用 | |
| CN104805019B (zh) | 一株能促进千年桐营养元素吸收的内生真菌 | |
| CN109112069B (zh) | 一种生防内生真菌及其应用 | |
| CN112342173A (zh) | 贝莱斯芽孢杆菌及其应用 | |
| CN103146609B (zh) | 一株荧光假单胞菌及其对辣椒疫霉病的防治方法 | |
| CN109971656B (zh) | 一株生姜内生绿色木霉及其应用 | |
| CN113444651B (zh) | 一种西红花内生真菌及其在防治球茎腐烂病中的应用 | |
| CN110343621A (zh) | 一种棘孢木霉菌株及其应用 | |
| CN110551637A (zh) | 一种来自黄芪根部的高效抑制番茄灰霉病菌的棘壳孢菌及其应用 | |
| CN110317747A (zh) | 一种解淀粉芽孢杆菌jt68及其在防治茶炭疽病的应用 | |
| CN111363691B (zh) | 一株多粘类芽孢杆菌及其应用 | |
| CN102018000B (zh) | Bz6-1菌株在制备治疗植物花生青枯病药物中的应用 | |
| CN104593266B (zh) | 一种番茄内生真菌交织枝顶孢及其在番茄根结线虫病生防中的应用 | |
| CN114032182B (zh) | 一株兼具拮抗大蒜根腐病病原菌和促生功能的真菌 | |
| CN114480143B (zh) | 防治向日葵菌核病的哈茨木霉m6及其应用 | |
| CN114933980B (zh) | 一种防治黄精根腐病的浅紫链霉菌hjb-xtbg45及其应用 | |
| CN105462893A (zh) | 越南槐内生细菌b29在防治三七根腐病中的应用 | |
| CN105483041A (zh) | 越南槐内生细菌b22在防治三七黑斑病中的应用 | |
| CN105462890A (zh) | 越南槐内生细菌b22在防治三七根腐病中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |