CN109294961B - 一株防治荔枝霜疫病的生防菌株pnc25及其应用 - Google Patents

一株防治荔枝霜疫病的生防菌株pnc25及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株防治荔枝霜疫病的生防菌株PNC25及其应用。一株防治荔枝霜疫病的生防菌株PNC25，为乙酰微小杆菌(Exiguobacterium acetylicum)，于2016年11月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为GDMCC No.60108。本发明的乙酰微小杆菌对荔枝霜疫病菌有抑制作用，在多个实验条件下表现优异的防治荔枝霜疫病的生防作用，本发明所述的生防菌剂能在防治荔枝霜疫病中应用。同时，本发明的乙酰微小杆菌对荔枝具有良好的保鲜效果，可用于制备荔枝保鲜制剂。

Description

一株防治荔枝霜疫病的生防菌株PNC25及其应用
技术领域
本发明属于植物保护技术领域，涉及一株防治荔枝霜疫病的生防菌株PNC25及其应用。
背景技术
荔枝(Litchi chinensis Sonn)是南方地区重要的亚热带经济作物，素有“中华之珍果”的美称，其经济价值高，是我国在国际市场上最具竞争力的果品之一。但是在我国荔枝主产区，由荔枝霜疫病菌(Peronophythora litchii Chen ex Ko et al.)引起的霜疫霉病是引起荔枝减产的最主要的病害之一。该病害的流行具有间接性爆发的特点，受气候影响较大，在适宜发病的年份，可引起荔枝80％以上的损失。目前，对荔枝霜疫病害控制的有效措施主要以化学防治为主，但是由于化学农药的大量使用所诱发的环境污染问题和病原物的抗药性问题日显突出，因而研究和开发低毒、无残留的生物源农药用于荔枝病害的防治，对于控制农残量、确保食用安全性和提高产品国际竞争力具有十分重要的意义。
微小杆菌属细菌是一种常见的细菌，目前方法用于防治污染。201110195307.8公开了一株微小杆菌属菌株MG2，该菌株具有很高的脱色高效性，能作为降解三苯甲烷类染料孔雀绿的应用。201610012010.6公开了一株墨西哥微小杆菌2a，2a对原油中胶质及沥青质的最大降解率达到72.8％及57.9％，可使原油粘度降低11.1％；可使固体石蜡在正己烷中的溶解度显著提高，可溶解石蜡量为石蜡总量的62.0％，结晶石蜡量较对照组降低64.7％，使清蜡率及防蜡率分别达77.1％及96.9％；其细胞呈高疏水性，并能较牢靠的附着在金属表面，形成生物膜，防止蜡结晶沉积。200810063812.5公开了一株生物除锰功能菌MB4(Exiguobacterium sp.)属于微小杆菌属，具有去除水中Mn2+的能力，Mn2+去除率高于91％。目前尚未见乙酰微小杆菌具有防治荔枝霜疫病功能的相关报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供了一株防治荔枝霜疫病的生防菌株PNC25。
本发明的另一目的是提供该菌株的应用。
本发明的又一目的是提供含有该菌株的菌剂及其制备方法。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
一株防治荔枝霜疫病的生防菌株PNC25，为乙酰微小杆菌(Exiguobacteriumacetylicum)，于2016年11月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为GDMCCNo.60108。
本发明所述的保藏号为GDMCC No.60108的生防菌株PNC25在制备防治荔枝霜疫病的药物中的应用。
一种防治荔枝霜疫病的生防菌剂，以所述的保藏号为GDMCC No.60108的乙酰微小杆菌PNC25为有效成分，其中所述的乙酰微小杆菌PNC25的活菌浓度为1×108～109CFU/mL。
本发明所述的生防菌剂的制备方法，由乙酰微小杆菌PNC25经液体发酵制备得到，具体包含以下步骤：将乙酰微小杆菌PNC25接种至LB培养液中培养，即可获得所述的生防菌剂。
其中，所述LB培养液的pH值优选7.0-7.2。
所述的培养优选28～30℃，摇床震荡速率为180～200rpm下培养24h。
本发明所述的保藏号为GDMCC No.60108的生防菌株PNC25在防治荔枝霜疫病中的应用。
本发明所述的生防菌剂在防治荔枝霜疫病中的应用。
所述的生防菌剂在防治荔枝霜疫病时可在田间荔枝65-75％成熟喷雾使用，或者采后室温贮藏过程喷雾使用。
本发明所述的保藏号为GDMCC No.60108的乙酰微小杆菌PNC25在荔枝保鲜中的应用。
本发明所述的生防菌剂在荔枝保鲜中的应用。
本发明的有益效果：
本发明得到的乙酰微小杆菌来源于荔枝内生细菌，能很好地在荔枝果实表面定殖；另外本发明从荔枝上筛选到的内生菌，将其用于荔枝病害的防治，表现为特定种群间某种微生物数量的增长或消减，并未改变荔枝上微生物种群的类别从而影响种群的稳定性，另外由于其与荔枝长期共存，互惠共生，形成了一系列与其相似的生存机制，将其喷施到荔枝果实表面用于病害的防治，对荔枝的食用及其加工产品来说更加安全可靠。
本发明的乙酰微小杆菌对荔枝霜疫病菌有抑制作用，在多个实验条件下表现优异的防治荔枝霜疫病的生防作用，而且本发明是专门针对荔枝霜疫病开发的生防制剂。由于是生物制剂，完全没有因化学农药的使用所带来的一系列问题，因而有利于荔枝的无公害生产，农民可以不用或减少其他化学农药的用量，这不仅可为农民节省开支，而且有利于水果的出口。同时，本发明的乙酰微小杆菌对荔枝具有良好的保鲜效果，可用于制备荔枝保鲜制剂。
本发明得到的乙酰微小杆菌，培养条件要求低，具有很好的开发应用前景。
生物样品保藏信息
生防菌株PNC25，分类名为Exiguobacterium acetylicum，于2016年11月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，地址为菌种保藏号为GDMCC No.60108。
具体实施方式
实施例1
菌株来源：PNC25由广东省揭阳市惠来某荔枝果园“园糯”果肉内部分离得到。
采集后的样品迅速装入写好编号的塑料袋中带回实验室进行分离。剪取果肉3g，用1％的次氯酸钠1mL浸5min，70％酒精浸2min，无菌水清洗3次。(取最后一次清洗的溶液0.1mL涂R2A，或取0.1mL最后一次清洗液加入R2A培养液，30℃振荡培养，若48h后无菌生长则认为表面消毒干净)。用灭菌的研砵分别研碎表面消毒好的果肉，加3mL无菌水，无菌棉布过滤，用无菌水稀释10倍，取0.1mL依次稀释，分别取10-4、10-5、10-6三个梯度0.1mL涂R2A平板，28℃培养48h，选取菌落数在50-300之间的平板，计数且挑取所有菌落，纯化，-70℃，40％甘油保存备用(Berg et al.,2000)。
平板颉颃活性测定采用对峙培养法，将保存于20℃中的霜疫霉菌接种到胡萝卜(CA)平板上活化，待真菌长满平板后用灭菌的打孔器从菌落外边缘均匀的打成直径为5mm的圆形菌块。将菌丝块接种在1:1体积混合的CA-PDA培养基中心，在其四周距中心约27mm处接种一株细菌，四个重复。25℃培养5d，待对照菌丝长满平板后，记录抑菌带大小。
菌株水解酶和代谢产物活性测定蛋白酶(Yang et al.,2008)、几丁质酶(Robertsand Selitrennikoff，1988)，β-1,3-葡聚糖酶(Yang 2011)、纤维素酶(Ghose T.K 1987)、嗜铁素活性(Shin et al.,2001)、吲哚乙酸活性(Sawar and Kremer 1992)测定参考以上相关文献方法完成。结果显示，该菌株可产生蛋白酶和β-1,3-葡聚糖酶及嗜铁素，对霜疫霉菌无平板颉颃活性(表1)。
表1菌株基本特性分析
Figure BDA0001888061870000041
菌株PNC25在LB固体培养基上28du培养24-48h，菌落圆形，大小中等，扁平，不透明，菌落黄色，粘稠，边缘不规则，表明光滑。经革兰氏染色显示蓝紫色，形态为短杆状，培养48h菌体近似球形，细胞有周生鞭毛；芽孢染色为红色，为营养体细胞，无明显的着色呈绿色的芽孢形成。接触酶为阳性，能分解淀粉，也可以液化明胶。
16S r DNA基因片段序列测序将该菌株鉴定为Exiguobacterium acetylicum(表2)。
表2测序比对结果
Figure BDA0001888061870000042
实施例2菌剂制备
(1)种子菌液的培养：将PNC25(GDMCC No.60108)接种到LB培养液中，在28℃200rpm振荡培养24h培养，16h后在超净工作台中每隔3h取样测600nm处的OD值，测定过程中以未接菌的培养液来调零，直到种子菌液OD值均在0.5～0.8之间时结束培养，获得种子菌液；
(2)湿菌制备：将种子菌液以1：500体积比加入装有LB培养液中，28℃、200rpm振荡培养24小时，获得生防菌剂，活菌浓度为1×108～109CFU/mL。
实施例3生防菌PNC25对荔枝果实/叶片的室内(LT,laboratory trial)防病效果评价
将田间采摘的健康荔枝进行如下处理：A.生防菌原液稀释成终浓度为5*107CFU/mL，喷雾果实/稀释成终浓度1*107CFU/mL喷雾叶片；B.同等稀释倍数的LB溶液。每处理设3个重复，每个重复30个果实/5个枝条，果实/枝条放在保鲜盒(盒底铺上灭菌滤纸，直径18cm，灭菌水润湿，保鲜盒规格为323*220*100mm，厂家为佛山市禅城区华隆塑料厂)。菌液和对照组每个处理(3个重复)总喷施300mL。24hpt(hours post treatment)喷雾接种病原菌P.litchii(5*104个孢子囊/mL)。调查病情指数,计算生防效果。
病害调查方法(蔡学清，2010)：0级：无病症；1级：接种点有轻微病斑,坏死面积5％以下；3级：坏死面积5％-10％；5级：坏死面积10％-25％；7级：坏死面积25％-50％；9级：坏死面积超过50％或全部白霉(果实)或褐变(叶片)。病情指数和生防效果统计计算方法：病情指数(％)＝[∑(病级数×该病级果数)/(最高病级×总果数)]×100；生防效果(％)＝[(对照病情指数-处理组病情指数)/对照病情指数]×100。
本实验防效分析测定内容包括：LT2016-1，材料来自广州花都某果园的健康“淮枝”果实，成熟度约为85％，采摘到实验室进行PNC25喷雾处理24h后病原菌喷雾接种观察防效；LT2016-2，材料来自广州花都某果园的染病“淮枝”果实，成熟度约为85％，采摘到实验室进行PNC25喷雾处理24h后病原菌喷雾接种观察防效；LT2016-3A/3B，材料来自广州花都某果园的健康叶片“桂味”和“淮枝”，采到实验室进行PNC25喷雾处理24h后病原菌喷雾接种观察防效；LT2017-1，材料来自海南儋州某果园的健康“妃子笑”果实，成熟度约为80％，采摘到实验室进行PNC25喷雾处理24h后病原菌喷雾接种观察防效；LT2017-2，材料来自广州花都某果园的健康“妃子笑”果实，成熟度约为85％，采摘到实验室进行PNC25喷雾处理24h后病原菌喷雾接种观察防效。
实验数据显示，PNC25在两年实验测试中，对荔枝果实均表现较好防效，在LT2016-1、LT2017-1/2中平均防效分别为29.05％、44.56％和43.54％(表3)，和对照组相比，病情指数和对照组达到显著差异的时间点分别为1、4、5个(表3)。
表3生防菌PNC25对荔枝霜疫病(LDB)室内果实防效分析(LT 2016-1,LT2017-1,LT2017-2)
Figure BDA0001888061870000051
Figure BDA0001888061870000061
y LT(laboratory trial),室内实验；FLT(field plus lab trial),田间-室内实验；FT,(field trial)，田间试验；hpi(hours post inoculation)，接种病原菌后小时数.
x1生防菌发酵稀释液(5×107CFU/mL)喷雾预处理荔枝果实‘Huaizhi’(85％成熟度，田间采摘到实验室保鲜盒)，室温培养(25℃).24hpt(hours post treatment)喷雾接种病原菌P.litchii(5×104sporangium/mL)。
x2生防菌发酵稀释液(5×107CFU/mL)喷雾预处理荔枝果实‘Feizixiao’(80％成熟度,海南儋州)as fruit sprays(FS)室温培养(25℃)，24hpt(hours post treatment)喷雾接种病原菌P.litchii(5×104sporangium/mL)。
x3生防菌发酵稀释液(5×107CFU/mL)喷雾预处理荔枝果实(85％成熟度,广东广州)as fruit sprays(FS)室温培养(25℃)，24hpt(hours post treatment)喷雾接种病原菌P.litchii(5×104sporangium/mL)。
Z AE,average efficacy，表示平均防效。数据为三次重复的平均值，数据后的英文字母表示处理间95％水平上的显著差异性(Duncan’test)。
在LT2016-2实验中，数据显示，PNC25对荔枝果实依然表现防效，平均防效为23.32％，(表4)，和对照组相比，病情指数和对照组达到显著差异的时间点分别为2个(表4)。
表4生防菌PNC25对自然侵染P.litchii的果实防效分析(LT2016-2)
Figure BDA0001888061870000062
x自然条件下被病原菌P.litchii侵染荔枝果实，采摘到实验室后在12-24hpt果面发现白色霉层；生防菌液稀释液(5×107CFU/mL)喷雾预处理果实‘Huaizhi’(85％成熟度)。数据为三次重复的平均值，数据后的英文字母表示处理间95％水平上的显著差异性(Duncan’test)。
Z AE,表示平均防效。
在LT2016-3A/3B实验中，PNC25对荔枝叶片“桂味”和“淮枝”平均防效分别为20.81和24.17％(表5)，和对照组相比，病情指数和对照组达到显著差异的时间点分别为2和1个(表5)。
表5菌株PNC25对荔枝叶片LDB的防效分析(LT2016-3)
Figure BDA0001888061870000071
x生防菌液稀释液(1×107CFU/mL)喷雾预处理室内保鲜盒中荔枝叶片；24hpt喷雾接种病原菌P.litchii(5×104sporangium/mL).数据为三次重复的平均值，数据后的英文字母表示处理间95％水平上的显著差异性(Duncan’test)。
Z AE,表示平均防效。
实施例4田间-室内(FLT)条件下生防菌对荔枝果实防效测定
实验设计为：2016年广州，生防菌喷雾预处理田间75％成熟度果实“糯米糍”3d后采摘到实验室摆放到保鲜盒，24h接种病原菌P.litchii。2017年，生防菌喷雾预处理田间65％成熟度果实“糯米糍”7d后采摘到实验室摆放到保鲜盒，24h接种病原菌P.litchii.每个处理3个重复，每重复30个果实。36hpi开始观察病害严重度。
本实验测试实验内容为：FLT2016，材料来自广州花都某果园的健康“糯米糍”果实(成熟度约为75％)喷雾预处理果实，3d后采摘(约85％成熟度)到实验室进行病原菌喷雾接种观察防效；FLT2017-1，材料来自海南儋州某果园的健康“妃子笑”果实(成熟度约65％)喷雾预处理果实，7d后采摘(成熟度约85％)到实验室进行病原菌喷雾接种观察防效。
在FLT2016和FLT2017-1实验中，PNC25对荔枝果实平均防效分别为55.67％和66.32％(表6)，和对照组相比，病情指数和对照组达到显著差异的时间点分别为2和2个(表6)。
表6菌株对荔枝果实LDB防效分析(FLT2016and FLT-2017-1)
Figure BDA0001888061870000081
x1生防菌液稀释液(5×107CFU/mL)喷雾预处理田间荔枝果实“Nuomici”(75％成熟度,广东广州)；3dpt采摘荔枝果实到实验室放在保鲜盒(大约85％成熟度)；24h后喷雾接种病原菌P.litchii(5×104sporangium/mL).
X2生防菌液稀释液(5×107CFU/mL)喷雾预处理田间荔枝果实“Feizixiao”(65％成熟度,海南儋州)；7dpt,采摘荔枝果实到实验室放在保鲜盒(大约85％成熟度),24h后喷雾接种病原菌P.litchii(5×104sporangium/mL).
Z AE,average efficacy，表示平均防效。数据为三次重复的平均值，数据后的英文字母表示处理间95％水平上的显著差异性(Duncan’test)。
实施例5生防菌对荔枝果实的田间(FT)防效评价
2016年度大田防效品种为广州花都区花东某农户家“淮枝”(约75％成熟荔枝)，田间喷雾预处理生防菌3d(约85％成熟度)后喷雾接种病原菌，待果实出现白霉，每天观察一次病情指数。
在FT2016实验中，PNC25对荔枝果实平均防效为46.73％(表7)，和对照组相比，病情指数和对照组达到显著差异的时间点为4个(表7)。此菌株在田间条件下其防效表现较好。
表7菌株对荔枝果实LDB田间防效分析(FT2016)
Figure BDA0001888061870000082
X生防菌液稀释液(5×107CFU/mL)喷雾预处理田间荔枝果实Huaizhi”(75％成熟度，广东广州)；3dpt将果实采摘到实验室放在保鲜盒中(约85％成熟度)，24h后喷雾接种病原菌P.litchii(5×104sporangium/mL).数据为三次重复的平均值，数据后的英文字母表示处理间95％水平上的显著差异性(Duncan’test)。
实施例6生防菌PNC25对荔枝果实的保鲜效果评价
将田间采摘的健康果实进行如下处理：A.生防菌原液稀释成终浓度5*107CFU/mL喷雾果实；B.同等稀释倍数的LB溶液。每处理设3个重复，每个重复30个果实，果实放在保鲜盒(盒底铺上灭菌滤纸，直径18cm，灭菌水润湿，保鲜盒规格为323*220*100mm，厂家为佛山市禅城区华隆塑料厂)。菌液和对照组每个处理(3个重复)喷施300mL。
果实采摘批次同实施案例3(LT2017-3/4)和实施案例4(FLT2017-2)，采摘到实验室进行相应处理，但不接种病原菌。观察果实褐变情况。褐变指数的测定参照蒋跃明等(2000)方法，褐变级数的确定：l级果：全红，3级果：果皮轻微褐变，5级果：5％≤果皮褐变面积＜25％，7级果：25％≤果皮褐变面积＜50％，9级果：果皮褐变面积大于50％。褐变指数＝∑(褐变级数×果数)/(最高级×总果数)；保鲜效果(％)＝[(对照褐变指数-处理组褐变指数)/对照褐变指数]×100。
本实施案例测定以下三个内容：LT2017-3，材料来自海南儋州某果园的健康“妃子笑”果实(成熟度约为80％)，采摘到实验室进行保鲜效果观察；LT2017-4，材料来自广州花都某果园的健康“妃子笑”果实(成熟度约为85％)，采摘到实验室进行保鲜效果观察；FLT2017-2，材料来自海南儋州某果园的健康“妃子笑”果实(成熟度约为65％)喷雾预处理果实，7d后采摘(约成熟度85％)到实验室进行保鲜观察。
实验数据显示，PNC25在两年实验测试中，对荔枝果实均表现较好保鲜作用，在LT2017-3、LT2017-4和FLT2017-2中平均防效分别为21.95％，44.60％和68.98％(表8)，和对照组相比，病情指数和对照组达到显著差异的时间点分别为2，1，1个(表8)。
表8：菌株对荔枝果实保鲜效果分析(LT2017-3,LT2017-4,and FLT2017-2)
Figure BDA0001888061870000091
Figure BDA0001888061870000101
y LT,laboratory trial；hpt,hours post treatment.
x1生防菌液稀释液(5×107CFU/mL)室内喷雾预处理荔枝果实‘Feizixiao’(约80％成熟度，海南儋州)；但不接种病原菌P.litchii.
x2生防菌液稀释液(5×107CFU/mL)室内喷雾预处理荔枝果实‘Feizixiao’(85％成熟度，广东广州)；但不接种病原菌P.litchii.
X3生防菌液稀释液(5×107CFU/mL)田间预处理荔枝果实‘Feizixiao’(65％成熟度，海南儋州)；7dpt,果实(约85％成熟度)采摘到实验室放在保鲜盒中,不接种病原菌P.litchii.
Z AE，表示平均防效.数据为三次重复的平均值，数据后的英文字母表示处理间95％水平上的显著差异性(Duncan’test)。
实施例7生防菌PNC25对果实品质效果分析
PNC25喷雾预处理田间荔枝果实(海南“妃子笑”和广州“淮枝”，约65％成熟度)，18d采摘荔枝果实(约90％成熟度)到实验室，进行下列项目的检测：可溶性蛋白Pr(μg/g)、可溶性糖含量(μg/g)、游离氨基酸(mg/g)、维C(μg/g)。荔枝果实在各处理组中随机取样，每组三个重复，每个重复5个果实；依据
Figure BDA0001888061870000102
和韩雅珊(1992)的方法测定。
分析数据表明，PNC25处理对儋州“妃子笑”果实品质表现分别为，游离氨基酸含量(7.02mg/g)高于对照(5.46mg/g)，可溶性蛋白含量(25.43μg/g)高于对照(5.98μg/g)，维生素c含量含量(18.02μg/g)高于对照(16.35μg/g)(表9)。广州“淮枝”果实品质呈现相似规律，PNC25处理的果实可溶性蛋白含量(15.83μg/g)高于对照(28.01μg/g)；维生素c含量(9.99μg/g)高于对照(8.58μg/g)(表9)。可见PNC25处理荔枝果实18d，对果实品质并无影响，说明PNC25喷雾预处理果实安全可靠。
表9：生防菌PNC25对荔枝果实品质测定
Figure BDA0001888061870000111

Claims (8)

1.一株防治荔枝霜疫霉病的生防菌株PNC25，为乙酰微小杆菌(Exiguobacteriumacetylicum)，于2016年11月15日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌种保藏号为GDMCCNo. 60108。
2.权利要求1所述的生防菌株PNC25在制备防治荔枝霜疫霉病的药物中的应用。
3.一种防治荔枝霜疫霉病的生防菌剂，其特征在于：以保藏号为GDMCC No. 60108的乙酰微小杆菌PNC25为有效成分，其中活菌浓度为1×108～109 CFU/ml。
4.权利要求3所述的生防菌剂的制备方法，其特征在于：由乙酰微小杆菌PNC25经液体发酵制备得到，具体包含以下步骤：将乙酰微小杆菌PNC25接种至LB培养液中培养，即可获得所述的生防菌剂。
5.根据权利要求4 所述的制备方法，其特征在于：所述LB 培养液的pH值为7.0-7.2。
6.根据权利要求4 所述的制备方法，其特征在于：所述的培养指在28 ～ 30℃，摇床震荡速率为180 ～ 200 rpm 下培养24 h。
7.权利要求1 所述的生防菌株PNC25在防治荔枝霜疫霉病中的应用。
8.权利要求3所述的生防菌剂在防治荔枝霜疫霉病中的应用。
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