CN112662731A - 一种冠状病毒样本保存液及其应用 - Google Patents

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黄琦
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Abstract

本发明涉及一种冠状病毒样本保存液及其应用。该冠状病毒样本保存液包括细胞保存液、细胞膜保护剂、RNA酶抑制剂、病毒代谢抑制剂、病毒灭活剂和抑菌剂；所述病毒灭活剂为灭活剂为辛酸钠；所述抑菌剂为芬母多肽。该保存液中的抑菌剂选用生物型芬母多肽，可广谱抑制各种微生物的生长，并且对冠状病毒的核酸检测无干扰，选用的病毒灭活剂不影响任何厂家生产的新冠核酸扩增试剂的检测，RNA酶抑制剂使保存和运输过程中的RNA酶不能降解样本中的RNA，该保存液从各环节对采集的冠状病毒样本进行全方位的保护，在保存和运输过程中使样本保持原始状态，在2‑8℃环境下保存5天，仍然能保持样本的原始性，获得与原样一致的检测结果。

Description

一种冠状病毒样本保存液及其应用
技术领域
本发明涉及生物学检测技术领域，特别是涉及一种冠状病毒样本保存液及 其应用。
背景技术
核酸检测是确诊新型冠状病毒感染的关键性技术。冠状病毒感染人体后， 病变主要发生在上下呼吸道和肺部，通常采集咽拭子进行核酸检测是新冠筛查 中的常用手段。采集的样本在运输和存储过程中的不规范操作等可使病毒RNA 降解，造成假阴性结果。因此，如何在运输和储存过程中保护病毒样本RNA不 降解，成为样本采集后重点关注的问题。
发明内容
基于此，本发明的目的在于提供一种冠状病毒样本保存液，使冠状病毒样 本在运输和储存过程中得到有效保护，提高冠状病毒样本的检测准确性。
为达到上述目的，本发明采用以下方案：
一种冠状病毒样本保存液，包括细胞保存液、细胞膜保护剂、RNA酶抑制 剂、病毒代谢抑制剂、病毒灭活剂和抑菌剂；所述病毒灭活剂为辛酸钠；所述 抑菌剂为芬母多肽。
在其中一些实施例中，所述抑菌剂在所述冠状病毒样本保存液中的终浓度 为0.8-1.2mg/L。
在其中一些实施例中，所述病毒灭活剂在所述冠状病毒样本保存液中的终 浓度为15-17mmol/L。
在其中一些实施例中，所述细胞保存液由氨基酸和电解质组成；所述氨基 酸包括如下组分：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、 脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰 胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸；所述电解质包括 如下组分：NaCl、MgSO4、KCl、MgCl2、CaCl2、Na2HPO4、KH2PO4、葡萄糖、 EDTA、柠檬酸钠。
在其中一些实施例中，所述氨基酸的总添加量在所述冠状病毒样本保存液 中的终浓度为10-30mmo/L，每种氨基酸的添加量在所述冠状病毒样本保存液中 的终浓度为0.5-1.5mmo/L。
在其中一些实施例中，所述电解质的总添加量在所述冠状病毒样本保存液 中的终浓度为2.8-3.3mmol/L，所述电解质中每种组分的添加量在所述冠状病毒 样本保存液中的终浓度为NaCl 2.5-3mmol/L、MgSO47-9μmol/L)、KCl 105-109μmol/L、MgCl27-8μmol/L)、CaCl223-28μmol/L、Na2HPO48-10μmol/L、 KH2PO48-10μmol/L、葡萄糖100-120μmol/L。
在其中一些实施例中，所述细胞膜保护剂在所述冠状病毒样本保存液中的 终浓度为4-6mmo/L。
在其中一些实施例中，所述RNA酶抑制剂在所述冠状病毒样本保存液中的 终浓度为5-7mmo/L。
在其中一些实施例中，所述病毒代谢抑制剂在所述冠状病毒样本保存液中 的终浓度为1-3mmo/L。
在其中一些实施例中，所述细胞膜保护剂由鼠李糖和海澡糖组成。
在其中一些实施例中，所述鼠李糖在所述冠状病毒样本保存液中的终浓度 为2-3mmo/L；所述海澡糖在所述冠状病毒样本保存液中的终浓度为2-3mmo/L。
在其中一些实施例中，所述RNA酶抑制剂由二硫苏糖醇和磷酸二羟丙酮组 成。
在其中一些实施例中，所述二硫苏糖醇在所述冠状病毒样本保存液中的终 浓度为2.5-3.5mmo/L；所述磷酸二羟丙酮在所述冠状病毒样本保存液中的终浓 度为2.5-3.5mmo/L。
在其中一些实施例中，所述病毒代谢抑制剂由氟化钠和亮抑酶肽组成。
在其中一些实施例中，所述氟化钠在所述冠状病毒样本保存液中的终浓度 为0.5-1.5mmo/L；所述亮抑酶肽在所述冠状病毒样本保存液中的终浓度为 0.5-0.5mmo/L。
在其中一些实施例中，所述冠状病毒样本保存液包括如下终浓度的组分：
1.3mmo/L甘氨酸、1mmo/L丙氨酸、0.8mmo/L缬氨酸、0.7mmo/L亮氨酸、 0.7mmo/L异亮氨酸、0.5mmo/L甲硫氨酸、0.5mmo/L脯氨酸、0.5mmo/L色氨酸、 1mmo/L丝氨酸、0.9mmo/L酪氨酸、0.5mmo/L半胱氨酸、0.9mmo/L苯丙氨酸、 1.3mmo/L天冬酰胺、0.5mmo/L谷氨酰胺、0.5mmo/L苏氨酸、0.8mmo/L天冬氨 酸、1mmo/L谷氨酸、1.5mmo/L赖氨酸、0.8mmo/L精氨酸、1mmo/L组氨酸、 2.738mmol/L NaCl、8μmol/L MgSO4、8μmol/L KCl、7.5μmol/L MgCl2、25μmol/L CaCl2、8.7μmol/LNa2HPO4、8.8μmol/L KH2PO4、111μmol/L葡萄糖、2.5mmo/L 鼠李糖、2.5mmo/L海澡糖、3mmo/L二硫苏糖醇、3mmo/L磷酸二羟丙酮、1mmo/L 氟化钠、1mmo/L亮抑酶肽、16mmol/L辛酸钠和1mg/L芬母多肽。
本发明还提供了上述冠状病毒样本保存液的应用。
具体技术方案如下：
上述的冠状病毒样本保存液在制备冠状病毒COVID-19保存试剂中的应用。
本发明还提供了一种冠状病毒样本的保存方法。
具体技术方案如下：
一种冠状病毒样本的保存方法，包括以下步骤：采集冠状病毒样本，置于 上述的冠状病毒样本保存液中，保存。
在其中一些实施例中，所述冠状病毒为冠状病毒COVID-19。
在其中一些实施例中，所述保存的温度为2-8℃，保存时间不超过5天。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
冠状病毒的检测成功与否(即检测结果是否准确)与以下几个方面相关：首 先是保存液应该保护采集样本中的细胞有完整形态和活性，能预防样本中的 RNA酶的降解，保存液中的病毒灭活剂不能影响核酸扩增试剂的检测，同时保 存液中的抑菌剂必须对检测无影响，且能广谱抑制其它微生物的生长。本发明 提供的冠状病毒样本保存液满足上述所有要求，该保存液从各环节对采集的冠 状病毒样本进行全方位的保护，能保持样本中冠状病毒上皮细胞的完整性。该 保存液中含有细胞生长的基本营养成分，使细胞离体后有较好的生存环境；在 样本保存液中添加了RNA酶抑制剂，使存在耗材、空气和实验室检测过程中的 RNA酶不能降解样本中的RNA；该保存液中含有的病毒代谢抑制剂可控制病毒 ***，使样本保持原始状态；该保存液中使用的病毒灭活剂为非异硫氰酸胍， 不影响任何厂家生产的新冠核酸扩增试剂的检测，采集的样本可以在各种品牌 的新冠核酸扩增试剂盒上应用，均能获得准确的检测结果；该保存液中的抑菌 剂选用生物型芬母多肽，可广谱抑制各种微生物的生长，并且对冠状病毒的核 酸检测无干扰；各组分相互配合，使所得冠状病毒样本保存液对冠状病毒样本 具有全方位的保护作用，无需在很低温度下，在2-8℃环境下保存5天，仍然能 保持样本的原始性，不影响冠状病毒样本的检测准确性，能够获得与原样一致的检测结果。本发明提供的冠状病毒样本保存液有效解决了冠状病毒样本采样、 运输以及保存过程中需要较低温度(常规情况下，24小时内无法检测的样本应 置于-70℃或以下保存)且保存时间较短等问题。
进一步地，对冠状病毒样本保存液中的细胞保存液、细胞膜保护剂、RNA 酶抑制剂、病毒代谢抑制剂、病毒灭活剂和抑菌剂的用量进行进一步的优化筛 选，结合特定种类和成分的细胞保存液、细胞膜保护剂、RNA酶抑制剂、病毒 代谢抑制剂，使所得冠状病毒样本保存液对冠状病毒样本具有更好的保护效果， 保存时间更长，检测结果更准确。
附图说明
图1为实施例4中2号样本冠状病毒样本保存液对冠状病毒样本保存24小 时的核酸检测结果。
图2为实施例4中2号样本冠状病毒样本保存液对冠状病毒样本保存48小 时的核酸检测结果。
图3为实施例4中2号样本冠状病毒样本保存液对冠状病毒样本保存72小 时的核酸检测结果。
图4为实施例4中2号样本冠状病毒样本保存液对冠状病毒样本保存96小 时的核酸检测结果。
图5为实施例4中2号样本冠状病毒样本保存液对冠状病毒样本保存120 小时的核酸检测结果。
图6为实施例4中2号样本冠状病毒样本对照原始管的核酸检测结果。
图7为图1对应的冠状病毒核酸检测结果曲线图。
图8为图2对应的冠状病毒核酸检测结果曲线图。
图9为图3对应的冠状病毒核酸检测结果曲线图。
图10为图4对应的冠状病毒核酸检测结果曲线图。
图11为图5对应的冠状病毒核酸检测结果曲线图。
图12为图6对应的冠状病毒核酸检测结果曲线图。
具体实施方式
下面通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应 该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技 术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是 为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。
本发明的术语“包括”和“具有”以及它们任何变形，意图在于覆盖不排他的包 含。例如包含了一系列步骤的过程、方法、装置、产品或设备没有限定于已列 出的步骤或模块，而是可选地还包括没有列出的步骤，或可选地还包括对于这 些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤。
在本发明中提及的“多个”是指两个或两个以上。“和/或”，描述关联对象的 关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A， 同时存在A和B，单独存在B这三种情况。字符“/”一般表示前后关联对象是一 种“或”的关系。
1、以下实施例中所用原料、试剂以及仪器如下：
氨基酸：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)、 脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰 胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，购自于Sigma公 司；
电解质：NaCl、MgSO4、KCl、MgCl2、CaCl2、Na2HPO4、KH2PO4、葡萄 糖，购自于吴江市汇通化工有限公司；
细胞膜保护剂：鼠李糖、海澡糖，购自于上海翊圣生物科技有限公司；
RNA酶抑制剂：二硫苏糖醇、磷酸二羟丙酮，购自于上海翊圣生物科技有 限公司；
病毒代谢抑制剂：氟化钠、亮抑酶肽，购自于Leupeptinhemisulfate公司；
病毒灭活剂：辛酸钠，购自于购自于吴江市汇通化工有限公司；
抑菌剂：芬母多肽，购自于RaystarBiosystems；
AutoSAT核酸提取仪：上海仁度生物科技有限公司；
iPonatic核酸检测分析仪：圣湘科技生物科技有限公司；
ABI7500荧光定量PCR仪：默飞世尔科技(中国)有限公司；MA6000荧 光定量PCR仪：雅睿生物技术有限公司产品。
2、以下实施例中检测方法如下：
2.1样本要求
2.1.1适用样本类型：咽拭子、肺泡灌洗液、痰液、粪便、肛拭子、血清或 血浆样本。
2.1.2样本采集：按照常规样本采集方法进行采集，或按照《新型冠状病毒 感染的肺炎防控方案》文件中《新型冠状病毒感染的肺炎实验室技术指南》“样 本采集方法”相关规定执行。
2.1.3受检人群：新型冠状病毒肺炎疑似病例、确诊病例或与上述二者有密 切接触史者。
2.1.4样本保存和运送：待测样本可立即用于处理，能在24小时内检测的 标本可置于4℃保存；24小时内无法检测的标本则应置于-70℃或以下保存(如 无-70℃保存条件，待测样本可于-20℃保存10天，核酸样本-20℃保存15天)。 应避免反复冻融。标本运送采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行运输。
2.2检测试剂
方案一：湖南圣湘RNA样本释放剂、湖南圣湘2019-nCoV-PCR反应液、 湖南圣湘2019-nCoV-PCR-酶混合液。
方案二：中山大学达安基因股份有限公司《2019新型冠状病毒 (2019-nCoV)(ORF1ab/N)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)》
Figure BDA0002810423140000071
方案三：上海科华生物工程股份有限公司《核酸提取试剂》
2.3实验室空间分为洁净区，半洁净区，半污染区，污染区。
按照不同区域分别穿戴不同的防护服。进行实验操作。
2.4防护级别
A转运样本、试剂配制、PCR扩增及结果分析人员采用二级防护：一级防 护。
B样本处理区和灭活区实验人员采用三级防护：
2.5标本接收
2.5.1标本箱交接：二级防护服；灭活岗交接三级防护服。
2.5.2整理灭活
按照三级防护进行样本灭活，灭活时间和温度为65℃灭活10分钟。
2.5.3标本编号
标本编号按照(名字+编号)，双人复效校对。做好登记记录；如需辅助组 进行确认则第一时间联系，拍照等。
2.5.4标本分发
将一定数量的标本置于标本架上，用转运袋进行包装密封、喷洒消毒，递 交给提取岗(注意消毒)，并在工作记录上写清楚标本交接时间、个数。
2.6样本处理
2.6.1试剂配制(试剂配制区)
A取出试剂盒中的各组分，室温放置，待其温度平衡至室温，混匀后备用；
B根据待测样本、阴性对照、阳性对照的数量，按比例(2019-nCoV-PCR反 应液26μL/人份+2019-nCoV-PCR-酶混合液4μL/人份)取相应量的反应液、酶 混合液，充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用。
2.6.2样本前处理(样本处理区)
样本前处理及核酸提取操作的工作人员应进行三级防护，并在生物安全柜 中进行。在实验开始前用75％乙醇对生物安全柜的空间和台面以及核酸提取仪 进行消毒，并用紫外线照射30min。在生物安全柜操作台面铺一层吸水纸。
肺泡灌洗液样本预处理：如果肺泡灌洗液非常粘稠，可根据实际样本情况， 补充一定量的生理盐水，进行充分震荡混匀后，取1ml混合液，3000rpm离心 30秒后，留取上清液作为待测样本使用。
肛拭子样本预处理：肛拭子样本采集后，保存于1ml生理盐水中，充分震 荡混匀后，留取上清液作为待测样本使用。如果肛拭子混入过多粪便，则应该 保存于1ml生理盐水中，充分震荡混匀后，取1ml混合液，3000rpm离心30秒 后，留取上清液作为待测样本使用。
粪便样本预处理：选取部分粪便样本，加入适量生理盐水，充分震荡混匀 后，取1ml混合液，3000rpm离心30秒后，留取上清液作为待测样本使用。
血清或血浆样本预处理：根据复查等检测情况需要，留存200ul—1000ul血 清或血浆作为待测样本使用。
痰液样本预处理：痰液保存容器内加入4倍体积的4％NaOH液化30分钟 以上直到凝块液化充分后作为待测样本使用。
标本预处理过后采用75％乙醇对生物安全柜、工作台面、移液器等用品进 行消毒。
口咽拭子和鼻咽拭子无需特殊预处理。
2.6.3核酸提取
2.6.3.1方案一试剂实验流程：
准备一套离心管，编号，提前准备好圣湘试剂盒，室温解冻释放剂。
A、在生物安全柜里核对编号，在对应编号的离心管中加入100～200ul样 本；
B、12000rpm离心10分钟；
C、弃去上清(由于沉淀肉眼不易看见，所以底部要留下少量液体)；
D、加入500ul生理盐水振荡后12000rpm，离心10分钟，弃上清。释放剂 充分震荡混匀后轻甩，向每个离心管中加入50ul释放剂；
E、震荡充分混匀，静置十分钟；
F、加样上机：取液面下2-3mm处上清20ul，加到已配制好的试剂中，微 离，传送至样本至感染区与扩增区之间的传递窗。
2.6.3.2方案二试剂实验流程：
A、在1.5ml的无菌离心管内加入50μl的蛋白酶K；
B、再加入200μl的裂解工作液(即已含Carrier RNA的病毒裂解液)；
C、取样本(或阴阳性质控品)200μl加入离心管中；盖紧管盖，漩涡振荡 15秒以充分混匀，高速离心10秒(防止温育时产生气泡)，72℃10分钟。同 时可将洗脱液置于72℃预热；
D、瞬时离心后，再加入250μl无水乙醇，盖紧管盖，振荡15秒，再瞬时 离心；
E、将混合液全部吸至离心柱，室温下12,000rpm离心1分钟，将离心柱 装至新的收集管；
F、将500μl的抑制物去除液加入离心柱，室温下12,000rpm离心1分钟， 将离心柱装至新的收集管；
G、将500μl的去离子液加入离心柱，室温下12,000rpm离心1分钟，将 离心柱装至新的收集管；再次将500μl的去离子液加入离心柱，室温下 12,000rpm离心1分钟，将离心柱装至新的收集管；
H、将离心柱-收集管于室温下14,000rpm离心3分钟以除去残余的乙醇；
I、将离心柱取出，放置于新的1.5ml离心管。打开离心柱盖子，72℃放置 2分钟(使用干式恒温器，不能使用水浴锅)；
J、在离心柱的膜的正上方小心加入72℃预热的洗脱液50μl，盖紧离心柱管 盖，室温静置1分钟后，14,000rpm离心1分钟。离心管内即为病毒核酸溶液， 建议立即使用，如需保存，置于-20℃。
K、将混好的反应体系，按20ul体系分装到每个反应管中。
L、于上述PCR反应管中分别加入处理后的阴性质控品、待测标本核酸、 阳性质控品各5μl，盖紧管盖，8,000rpm离心数秒后转移至扩增检测区。
2.6.3.3方案三试剂实验流程：
待测样品处理(将[阴性对照]、[工作标准品①]、[工作标准品②]、[工作标 准品③]、[工作标准品④]与待测标本同步进行处理)
A、准备4块深孔板和1个浅孔板，分别编号为1、2、3、4、5。
B、按照实验数量，使用最大量程为1000μl的移液器，装上带滤芯吸嘴， 吸取410μl工作裂解液于1号深孔板的孔中。
C、使用最大量程为1000μl的移液器，装上带滤芯吸嘴，吸取680μl的[洗 涤液A]加入到2号深孔板的孔中
D、使用最大量程为1000μl的移液器，装上带滤芯吸嘴，吸取680μl的[洗 涤液B]加入到3号深孔板的孔中。
E、使用最大量程为200μl的移液器，装上带滤芯吸嘴，吸取60μl的[洗脱 液]加入到4号浅孔板的孔中。
F、使用最大量程为200μl的移液器，装上带滤芯吸嘴，在加有工作裂解液 的1号深孔板的孔中按实验布局分别加入200μl待测样本、[阳性对照]、[阴 性对照]和[工作标准品①～⑤]，加样时核对实验号，加样完毕后，将磁套 ***1号深孔板中，上下移动磁套1～2次以起到混匀效果。
G、开启核酸提取仪，放置上述带磁套的1号深孔板于核酸提取仪样品台上， 并按仪器提示操作，运行裂解程序；
H、结束后取走1号深孔板，放入2号深孔板运行洗涤程序；
I、结束后取走2号深孔板，放入3号深孔板运行洗涤程序；
J、结束后取走3号深孔板，放入4号浅孔板运行洗脱程序；
K、运行完成后，将5号浅孔板取出，放于磁力架上静置1min，此即PCR 反应模板；其余耗材废弃，置垃圾袋包扎后统一处理。
L、加样后，对已加样本进行再次核对，保证结果顺序准确无误。
注：DP1000在裂解或洗涤时，可能会出现掉磁珠现象，每完成一步后，应 检查深孔板各孔是否有磁珠残留，若有，则再重复一次该步骤。
2.7PCR扩增(扩增检测分析区)
2.7.1方案一试剂扩增程序设置：
A、将PCR反应管放入扩增仪样本槽，按对应顺序设置阳性对照、阴性对 照及待测样本，并设置样本名称。
B、荧光检测通道选择
a、选择FAM(ORF-1ab)和ROX(N基因)(Reporter:FAM/ROX，Quencher:none) 通道检测2019-nCoV病毒核酸；
b、选择HEX或VIC通道(Reporter:HEX/VIC，Quencher:none)检测内 标；
c、设置Sample Volume为50。
C、仪器参数程序设计(见表1)
表1目的基因扩增程序
Figure BDA0002810423140000111
Figure BDA0002810423140000121
注：由于ABI7500仪器原因，不能设置为30秒，可以设置为31秒。设 置完毕，保存文件，运行反应程序。
2.7.2方案二试剂扩增程序设置：
A、打开Set up窗口，按样本对应位置设置阴性质控NTC未知样本 Unknow，并在Sample Name一栏中设置样本名称；探针检测模式设置为： Reporter Dye1:FAM,QuencherDye1:NONE；Reporter Dye2:VIC,Quencher Dye2:none；Reporter Dye3：Cy5，QuencherDye3：NONE；Passive Reference:NONE
B、打开instrument窗口，设置循环条件如下：
50℃15分钟1个循环
95℃15分钟1个循环
94℃15秒→55℃45秒(收集荧光)→45个循环(采集荧光)
保存文件，运行。
2.7.3方案三与方案一程序相同。
2.8实验室消毒
用75％乙醇对核酸提取仪进行处理并紫外线照射30分钟，在实验室空气中 喷洒75％乙醇，10min后开启通风装置通风10min，再开启实验室紫外灯照射 30min，紫外线照射后，工作人员用1mol/L的稀盐酸处理工作台面和地面，并 开启实验室通风装置通风，用清水清洁台面和地面。
2.9结果分析
PCR反应结束后自动保存结果，对检测靶标以及内标的扩增曲线分别进行 分析。根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(可根 据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，调整阴性对 照的扩增曲线使其平直或低于阈值线)，点击Analyze进行分析，使各项参数 符合下述“2.10质量控制”中的要求，然后到Plate窗口下记录定性结果。
2.10质量控制
2.10.1每批检测设立2个阴性质控，2个阳性质控，并随机放在临床待检样 本中间。
2.10.2阳性质控测定为阳性，阴性质控测定为阴性，视为在控。反之，则 为失控，不可发出报告，应分析原因并采取纠正措施，必要时对样本进行复查。
2.10.3 2019-nCoV-PCR-FAST-阴性对照：FAM、ROX及内标(HEX)通道均 无Ct值或Ct＞40。
2.10.4 2019-nCoV-PCR-FAST-阳性对照：FAM、ROX及内标(HEX)通道 均Ct≤35；
2.10.5以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重 新进行。
2.11结果判读
2.11.1先分析内标在HEX/VIC通道是否有扩增曲线，且Ct≤40，若有，表 示本次检测有效，可继续进行后续分析:
A)若FAM或ROX通道检测到典型的S型扩增曲线，且Ct≤40，标注该样 本实验号，使用博杰试剂复查(硕世试剂提取)，若结果一致为阳性，则可判 读阳性，若博杰试剂结果为阴性则判读阴性，若博杰试剂结果同样为某一个通 道信号阳性，则判读为疑似，建议重新采样检测；
B)若FAM及ROX通道均未检测到典型的S型扩增曲线(No Ct)，或Ct ＞40，表示2019-nCoV病毒为阴性。
C)若FAM和ROX通道同时检测到典型的S型扩增曲线，且Ct≤40，标注 该样本实验号，使用圣湘或达安试剂双复查，若结果一致，可判读为阳性，若 结果不一致则需再次复查。
2.11.2若内标在VIC通道没有检测到Ct或Ct＞40，表示本次检测样本浓 度太低或者有干扰物质抑制反应，需重新提取核酸进行检测。若Ct值在38至 40之间，同样采用圣湘试剂复查。若圣湘试剂复查结果VIC通道仍然没有检测 到Ct或Ct＞40，则提取失败建议重新采样。
2.11.3灰度区结果判定：如果某样本在FAM或ROX通道荧光信号有明显增 幅，但Ct值大于40，则该样本处于灰度区，需要复检。如复检结果仍处于灰度 区，则判断为阳性。
以下为具体实施例。
实施例1冠状病毒样本保存液的配制
本实施例提供的冠状病毒样本保存液的配方如表2所示，按照表2配方组 成和浓度配制冠状病毒样本保存液。
表2冠状病毒样本保存液的配方
Figure BDA0002810423140000141
Figure BDA0002810423140000151
实施例2冠状病毒样本保存液对冠状病毒样本的保存效果比较
本实验分为3组，分别为实施例1配制的冠状病毒样本保存液组，Hank’S液 组和对照组(生理盐水)。
(1)冠状病毒样本保存液组：取20μl新型冠状病毒COVID-19(滴度为0.1- 1×105copies/ml)与2ml实施例1配制的冠状病毒样本保存液混合，混匀后置 于2-8℃下保存。分别在保存1-5天内进行核酸提取(每天一次)，用圣湘 COVID-19新型冠状病毒特异性的PCR引物做荧光定量PCR检测。
(2)Hank’S组：取20μl新型冠状病毒COVID-19(滴度为0.1- 1×105copies/ml)与2ml Hank’s保存液混合，混匀后置于2-8℃下保存。分别在 保存1-5天内进行核酸提取(每天一次)，然后用圣湘新型冠状病毒COVID-19 特异性的PCR引物做荧光定量PCR检测。
(3)对照组(生理盐水)：取20μl新型冠状病毒COVID-19(滴度为 0.1-1×105copies/ml)与2ml生理盐水混合，混匀后置于2-8℃下保存。分别在 保存1-5天内进行核酸提取(每天一次)，然后用圣湘新型冠状病毒COVID-19 特异性的PCR引物做荧光定量PCR检测。
检测结果如表3所示：用相同核酸扩增试剂盒检测后各种病毒样本保存液 中的新型冠状病毒COVID-19的检测结果有一定的差异，以实施例1配制的冠 状病毒样本保存液的检测结果最为稳定，于2-8℃下保存5天后，检测结果没有 明显变化，生理盐水的结果稳定性最低。
表3常用三种病毒样本保存液对新冠病毒检测结果比较
Figure BDA0002810423140000152
Figure BDA0002810423140000161
注：自配灭活保存液是指实施例1配制的冠状病毒样本保存液。
实施例3不同冠状病毒样本保存液对冠状病毒样本的保存效果比较
选择4家有药监备案的保存液(灭活保存液：默乐生物和微米生物WM-1 型；非灭活保存液：圣相和微米生物WM-2型)与实施例1配制的冠状病毒样 本保存液对冠状病毒样本的保存效果进行结果验证比较，保存方法按上述新冠 核酸采集、保存和运送的方法进行。原始样本采集后置于生理盐水中，在24小 时之内从原始样本(滴度为0.1-1×105IU/ml)取20μl新型冠状病毒COVID-19分 别加入2ml保存液中，混匀后置于2-8℃下保存。在保存72小时后进行核酸提 取，用圣湘COVID-19冠状病毒特异性的PCR引物做荧光定量PCR检测。
检测结果如表4所示：灭活型保存液对检测结果影响非常大，大多标本不 能检出N基因，且内标VIC也不扩增；实施例1配制的冠状病毒样本保存液中 新冠病毒的检测结果与对照原液基本一致。
表4不同病毒样本保存液中新冠病毒的检测结果
Figure BDA0002810423140000162
Figure BDA0002810423140000171
注：自配灭活保存液是指实施例1配制的冠状病毒样本保存液。
实施例4冠状病毒样本保存液对冠状病毒样本保存不同时间的保存效果
选择5份经检测已经确诊的新型冠状病毒阳性患者。原始样本采集后置生 理盐水中，在24小时之内从原始样本(滴度为0.1-1×105IU/ml)中取20μl与2ml 实施例1配制的冠状病毒样本保存液混合，保存方法按上述新冠核酸采集、保 存和运送的方法进行。采集的样本放置于2-8℃冰箱，分别于1天、2天、3天、 4天和5天后用圣湘新冠核酸扩增试剂盒进行检测，方法如上述。
结果见表5和图1-图12：本实施例选择了3份ORF-lab和N基因双阳性样 本、1份单独N基因和1份N基因和ORF-lab均阴性的样本，应用实施例1配 制的冠状病毒样本保存液对样本保存不同时间的新型冠状病毒的检测结果进行 比较。实施例1配制的冠状病毒样本保存液在2-8℃环境下保存待测样本1-5天 后检测结果未见明显改变，说明应用本保存液保存5天后的样本对新型冠状病 毒的结果检测无影响。
表5冠状病毒样本保存液对采集样本保存不同时间的检测结果
Figure BDA0002810423140000172
Figure BDA0002810423140000181
实施例5冠状病毒样本保存液对不同来源的冠状病毒样本的保存效果
按照上述操作规程分别采集已经确诊为新冠病毒感染者且新冠核酸病毒检 测为阳性患者的咽拭子、粪便、肺泡灌洗液各1份，分别置于不同冠状病毒保 存液中，按上述新冠核酸采集、保存和运送的方法进行。采集的样本放置2-8℃ 冰箱，分别于24小时后用圣湘新冠核酸扩增试剂盒进行检测，方法如上述。
检测结果如表6所示：实施例1配制的冠状病毒样本保存液对不同样本中 的冠状病毒均能检出，检出的阳性率明显高于4家有药监备案的保存液的检测 结果，且各指标与对照组(原管)比较一致。
表6冠状病毒样本保存液对不同来源的冠状病毒样本的检测结果比较
Figure BDA0002810423140000182
Figure BDA0002810423140000191
注：自配灭活保存液是指实施例1配制的冠状病毒样本保存液。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对 上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技 术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细， 但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的 普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改 进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权 利要求为准。

Claims (20)

1.一种冠状病毒样本保存液，其特征在于，包括细胞保存液、细胞膜保护剂、RNA酶抑制剂、病毒代谢抑制剂、病毒灭活剂和抑菌剂；所述病毒灭活剂为辛酸钠；所述抑菌剂为芬母多肽。
2.根据权利要求1所述的冠状病毒样本保存液，其特征在于，所述抑菌剂在所述冠状病毒样本保存液中的终浓度为0.8-1.2mg/L。
3.根据权利要求1所述的冠状病毒样本保存液，其特征在于，所述病毒灭活剂在所述冠状病毒样本保存液中的终浓度为15-17mmol/L。
4.根据权利要求1所述的冠状病毒样本保存液，其特征在于，所述细胞保存液由氨基酸和电解质组成；所述氨基酸包括如下组分：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸；所述电解质包括如下组分：NaCl、MgSO4、KCl、MgCl2、CaCl2、Na2HPO4、KH2PO4、葡萄糖。
5.根据权利要求4所述的冠状病毒样本保存液，其特征在于，所述氨基酸的总添加量在所述冠状病毒样本保存液中的终浓度为10-30mmo/L，每种氨基酸的添加量在所述冠状病毒样本保存液中的终浓度为0.5-1.5mmo/L。
6.根据权利要求4所述的冠状病毒样本保存液，其特征在于，所述电解质的总添加量在所述冠状病毒样本保存液中的终浓度为2.8-3.3mmol/L，所述电解质中每种组分的添加量在所述冠状病毒样本保存液中的终浓度为NaCl2.5-3mmol/L、MgSO47-9μmol/L)、KCl 105-109μmol/L、MgCl27-8μmol/L)、CaCl223-28μmol/L、Na2HPO48-10μmol/L、KH2PO48-10μmol/L、葡萄糖100-120μmol/L。
7.根据权利要求1所述的冠状病毒样本保存液，其特征在于，所述细胞膜保护剂在所述冠状病毒样本保存液中的终浓度为4-6mmo/L。
8.根据权利要求1所述的冠状病毒样本保存液，其特征在于，所述RNA酶抑制剂在所述冠状病毒样本保存液中的终浓度为5-7mmo/L。
9.根据权利要求1所述的冠状病毒样本保存液，其特征在于，所述病毒代谢抑制剂在所述冠状病毒样本保存液中的终浓度为1-3mmo/L。
10.根据权利要求1-9任一项所述的冠状病毒样本保存液，其特征在于，所述细胞膜保护剂由鼠李糖和海澡糖组成。
11.根据权利要求10所述的冠状病毒样本保存液，其特征在于，所述鼠李糖在所述冠状病毒样本保存液中的终浓度为2-3mmo/L；所述海澡糖在所述冠状病毒样本保存液中的终浓度为2-3mmo/L。
12.根据权利要求1-9任一项所述的冠状病毒样本保存液，其特征在于，所述RNA酶抑制剂由二硫苏糖醇和磷酸二羟丙酮组成。
13.根据权利要求12所述的冠状病毒样本保存液，其特征在于，所述二硫苏糖醇在所述冠状病毒样本保存液中的终浓度为2.5-3.5mmo/L；所述磷酸二羟丙酮在所述冠状病毒样本保存液中的终浓度为2.5-3.5mmo/L。
14.根据权利要求1-9任一项所述的冠状病毒样本保存液，其特征在于，所述病毒代谢抑制剂由氟化钠和亮抑酶肽组成。
15.根据权利要求14所述的冠状病毒样本保存液，其特征在于，所述氟化钠在所述冠状病毒样本保存液中的终浓度为0.5-1.5mmo/L；所述亮抑酶肽在所述冠状病毒样本保存液中的终浓度为0.5-0.5mmo/L。
16.根据权利要求1所述的冠状病毒样本保存液，其特征在于，所述冠状病毒样本保存液包括如下终浓度的组分：
1.3mmo/L甘氨酸、1mmo/L丙氨酸、0.8mmo/L缬氨酸、0.7mmo/L亮氨酸、0.7mmo/L异亮氨酸、0.5mmo/L甲硫氨酸、0.5mmo/L脯氨酸、0.5mmo/L色氨酸、1mmo/L丝氨酸、0.9mmo/L酪氨酸、0.5mmo/L半胱氨酸、0.9mmo/L苯丙氨酸、1.3mmo/L天冬酰胺、0.5mmo/L谷氨酰胺、0.5mmo/L苏氨酸、0.8mmo/L天冬氨酸、1mmo/L谷氨酸、1.5mmo/L赖氨酸、0.8mmo/L精氨酸、1mmo/L组氨酸、2.738mmol/L NaCl、8μmol/L MgSO4、8μmol/L KCl、7.5μmol/L MgCl2、25μmol/L CaCl2、8.7μmol/LNa2HPO4、8.8μmol/L KH2PO4、111μmol/L葡萄糖、2.5mmo/L鼠李糖、2.5mmo/L海澡糖、3mmo/L二硫苏糖醇、3mmo/L磷酸二羟丙酮、1mmo/L氟化钠、1mmo/L亮抑酶肽、16mmol/L辛酸钠和1mg/L芬母多肽。
17.权利要求1-16任一项所述的冠状病毒样本保存液在制备冠状病毒COVID-19保存试剂中的应用。
18.一种冠状病毒样本的保存方法，其特征在于，包括以下步骤：采集冠状病毒样本，置于权利要求1-16任一项所述的冠状病毒样本保存液中，保存。
19.根据权利要求18所述的冠状病毒样本的保存方法，其特征在于，所述冠状病毒为冠状病毒COVID-19。
20.根据权利要求18或19所述的冠状病毒样本的保存方法，其特征在于，
所述保存的温度为2-8℃，保存时间不超过5天。
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