CN111690639A - 全基因组结合靶向扩增建库方法和试剂及病原检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种全基因组结合靶向扩增建库方法和试剂及病原检测方法,建库方法包括:获取样品全基因组DNA片段化后两端连接上双链接头的接头连接产物,其包括任选存在的目标区域和非目标区域;以接头连接产物为模板,采用第一基因特异性引物和下游文库扩增通用引物进行第一PCR扩增获得第一扩增产物,第一基因特异性引物与目标区域结合,下游文库扩增通用引物与双链接头的第一链结合;以第一扩增产物为模板,采用第二基因特异性引物、下游文库扩增通用引物和上游文库扩增通用引物进行第二PCR扩增获得第二扩增产物,第二基因特异性引物与目标区域结合,上游文库扩增通用引物与双链接头的第二链结合。本方法富集目标区域,不影响非目标区域,检测成本低、效率高。
Description
技术领域
本发明涉及测序检测技术领域,具体涉及一种全基因组结合靶向扩增建库方法和试剂及病原检测方法。
背景技术
病原体检测项目是医院、疾控中心、出入境检验检疫局、海关等单位经常会用到的技术。目前,常规病原检测一般是通过实时荧光定量PCR技术、细菌分离培养以及免疫组化等方法对未知病原进行检测,这类技术常常存在检测灵敏度不足、无法检测新型变异以及未知病原体,从而导致漏检,造成假阴性。二代测序技术由于其通量大,检测灵敏度高,能够同时检测已知和未知病原而受到检测机构的青睐。
目前市场形势是病原体检测仍然以常规病原检测手段为主,但是随着二代测序技术成本、通量以及时间等因素的不断优化,且市场对于精准医学的需求越来越强烈,二代测序技术在病原体检测领域必然越来越广。
传统临床病原微生物检测的主要方法是培养,其作为临床诊断的金标准具有操作简单、成本低廉、无需昂贵设备等优点,但培养的阳性检出率不高(30%~40%),使用的培养条件不同会影响培养结果,而且部分微生物的培养时间较长,无法满足临床早期、快速诊断以指导治疗的需要。免疫学方法通过检测特异性的抗原或抗体确定是否感染某种微生物,实时荧光定量PCR技术(realtime fluorescence quantitative PCR,q-PCR)是1996年由美国AppliedBiosystems公司推出的一种新型定量分子检测技术,通过荧光染料或荧光标记的特异性探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应的软件对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。由于实时荧光定量PCR技术的扩增及分析等全过程可以在单管内封闭完成,并且可以对PCR扩增产物进行实时动态监测及自动分析结果,同时该技术可以通过在同一体系中添加标记不同荧光基团的探针实现多重检测,因此实时荧光定量PCR技术是一种具有实时、准确、快速、简便等特点的分子检测技术。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)可检测几百种病原体,但依赖于培养增菌,无法检测原样品或培养失败的样品,另外该方法需要积累大量不同菌株的蛋白指纹图谱构建数据库,图谱数量及代表性、广泛性将直接影响检测的准确性。
常规病原检测技术的优势是费用低,检测时间短,在检测过程中有较为广泛的应用市场。但也存在明显的不足之处,即只能对已知病原体进行检测,而无法检测未知病原体,且检测灵敏度也有一定的限制。以最为常见的实时荧光定量PCR技术为例,针对腹泻样本的检测,仅能检测一些常见的致病菌、病毒和寄生虫,针对一些罕见和未知的病原存在漏检情况,这部分病原所占的比例并不低。另一方面,某些样品如粪便样品中的成分非常复杂,细菌含量多,而基于荧光定量PCR技术也存在检测的灵敏度不够的情况,导致病原被漏检。
发明内容
本发明提供一种全基因组结合靶向扩增建库方法和试剂及病原检测方法,检测成本低,检测效率高。
根据第一方面,一种实施例中提供一种全基因组结合靶向扩增建库方法,包括:
获取样品全基因组DNA片段化后两端连接上双链接头的接头连接产物,上述接头连接产物包括任选存在的目标区域和非目标区域;
以上述接头连接产物为模板,采用第一基因特异性引物和下游文库扩增通用引物进行第一PCR扩增,获得第一扩增产物,其中上述第一基因特异性引物与上述目标区域结合,上述下游文库扩增通用引物与上述双链接头的第一链结合;和
以上述第一扩增产物为模板,采用第二基因特异性引物、上述下游文库扩增通用引物和上游文库扩增通用引物进行第二PCR扩增,获得第二扩增产物,其中上述第二基因特异性引物与上述目标区域结合,上述上游文库扩增通用引物与上述双链接头的第二链结合。
在优选实施例中,上述目标区域包括多个目标基因,上述第一基因特异性引物包括多个引物,分别与上述多个目标基因结合;上述第二基因特异性引物包括多个引物,为上述第一基因特异性引物的内侧巢式引物,分别与上述多个目标基因结合。
在优选实施例中,上述第二基因特异性引物包括与上述目标区域结合的部分和位于5’端且与上述双链接头的第二链相同或部分相同的部分。
在优选实施例中,上述双链接头是双链鼓泡接头,上述第一链上包括样本标签序列,上述第二链中间部分包括一段与上述第一链不互补的序列形成的鼓泡结构。
在优选实施例中,上述第一PCR扩增的循环数是10至30个循环,优选15个循环;上述第二PCR扩增的循环数是10至30个循环,优选15个循环。
在优选实施例中,上述样品是疑似包含临床病原微生物的临床样品。
在优选实施例中,上述目标区域包括目标耐药基因、毒力基因、病原体基因和遗传病相关基因中的一种或多种。
在优选实施例中,上述接头连接产物通过如下方法得到:
采用物理打断或酶切打断的方法将上述样品全基因组DNA打断成小片段,优选地,上述小片段为200~400bp的小片段;
将打断的小片段进行末端修复、加A碱基和磷酸化处理,再采用连接酶在片段两端连接上述双链接头得到上述接头连接产物。
根据第二方面,一种实施例中提供一种全基因组结合靶向扩增建库试剂,包括下游文库扩增通用引物和上游文库扩增通用引物,其中上述下游文库扩增通用引物与建库用双链接头的第一链结合,上述上游文库扩增通用引物与建库用双链接头的第二链结合,上述下游文库扩增通用引物和上游文库扩增通用引物用于如下的全基因组结合靶向扩增建库方法:
获取样品全基因组DNA片段化后两端连接上双链接头的接头连接产物,上述接头连接产物包括任选存在的目标区域和非目标区域;
以上述接头连接产物为模板,采用第一基因特异性引物和下游文库扩增通用引物进行第一PCR扩增,获得第一扩增产物,其中上述第一基因特异性引物与上述目标区域结合,上述下游文库扩增通用引物与上述双链接头的第一链结合;和
以上述第一扩增产物为模板,采用第二基因特异性引物、上述下游文库扩增通用引物和上游文库扩增通用引物进行第二PCR扩增,获得第二扩增产物,其中上述第二基因特异性引物与上述目标区域结合,上述上游文库扩增通用引物与上述双链接头的第二链结合。
在优选实施例中,上述试剂还包括如下一种或多种:
双链接头,包括第一链和第二链,用于连接到样品全基因组DNA片段化产物的两端以得到上述接头连接产物;
第一基因特异性引物,与上述目标区域结合,用于与上述下游文库扩增通用引物一起作为扩增引物,以上述接头连接产物为模板,进行第一PCR扩增以获得第一扩增产物;
第二基因特异性引物,与上述目标区域结合,用于与上述下游文库扩增通用引物和上述上游文库扩增通用引物一起作为扩增引物,以上述第一扩增产物为模板,进行第二PCR扩增以获得第二扩增产物。
根据第三方面,一种实施例中提供一种非诊断目的的病原检测方法,包括:
获取病原样品,并通过第一方面的方法构建文库;和
对上述文库进行二代测序获取样品中病原的测序数据,并对上述测序数据进行分析,得到样品中病原的定性和/或定量结果。
本发明的全基因组结合靶向扩增建库方法,经过两次PCR扩增,使得目标区域DNA得以特异性扩增富集,而非目标区域DNA不受影响,与常规建库方法相比只增加一次PCR扩增,该扩增种非目标区域线性扩增,不会改变样品中非目标微生物的丰度,实现宏基因组正常检测的同时对目标区域进行富集,提高检出率。此外,在一些应用中,在低数据或短读长情况下,也可准确检测目标耐药基因、毒力基因及低丰度的重要病原体,同时不影响其他病原体的检测,并且能够一次获得多个检测结果,降低检测成本,提高检测效率。
附图说明
图1为本发明实施例中全基因组结合靶向扩增建库方法流程示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式结合附图对本发明作进一步详细说明。在以下的实施方式中,很多细节描述是为了使得本发明能被更好的理解。然而,本领域技术人员可以毫不费力的认识到,其中部分特征在不同情况下是可以省略的,或者可以由材料、方法所替代。
另外,说明书中所描述的特点、操作或者特征可以以任意适当的方式结合形成各种实施方式。同时,方法描述中的各步骤或者动作也可以按照本领域技术人员所能显而易见的方式进行顺序调换或调整。因此,说明书和附图中的各种顺序只是为了清楚描述某一个实施例,并不意味着是必须的顺序,除非另有说明其中某个顺序是必须遵循的。
本文中为特征所编序号本身,例如“第一”、“第二”等,仅用于区分所描述的对象,不具有任何顺序或技术含义。
目前的荧光定量PCR技术检测病原微生物,主要存在两方面的局限:一是无法覆盖罕见和未知的病原;二是已知病原的检测灵敏度在检测复杂样本时也存在灵敏度不够的问题。
新一代高通量测序技术(NGS)是近年来发展迅速的一种病原体检测技术,其一次性可并行检测几十万到几百万条DNA分子而受到关注。随着高通量测序技术成本的降低与普及,高通量测序在临床病原体检测方面的优势也越加突显。在临床病人不明感染或突发急性传染性病发生的时候,应用宏基因组测序技术可快速找到可疑致病病原体,为临床治疗提供方向与依据。
本发明的方法具有广泛的用途,例如可用于耐药基因、毒力基因、病原体基因和遗传病相关基因的检测等。当用于病原微生物检测时,可检测范围覆盖2700余种病原,包括细菌、真菌、病毒、衣原体、支原体、立克次氏体、寄生虫等,可直接检测原始样品而不需要富集培养,适用样品类型广泛,包括血浆、痰液、肺泡灌洗液、脑脊液、粪便等临床常见样品,2-3个工作日即可完成检测。
如图1所示,本发明实施例中全基因组结合靶向扩增建库方法,包括如下步骤:
(1)采用物理打断或酶切打断的方法将样品全基因组DNA(例如,临床样品病原体DNA)打断成小片段,小片段的长度可以是200~400bp。
(2)将打断产物进行末端修复、加“A”碱基和磷酸化处理,再采用连接酶(例如,T4DNA连接酶)在DNA片段两端连接上文库接头,得到接头连接产物。接头连接产物包括任选存在的目标区域和非目标区域。目标区域一般是指包含已知基因序列的区域,例如在一个实施例中,目标区域包括目标耐药基因、毒力基因、病原体基因和遗传病相关基因中的一种或多种。当本方法用于病原微生物检测时,目标区域一般包括目标耐药基因、毒力基因、病原体基因中的一种或多种。非目标区域一般是指包含已知基因序列或未知基因序列(例如,未知临床病原体)的区域。需要说明的是,本发明方法的一个重要应用方面是检测临床样品,因此在一个优选实施例中,样品是疑似包含临床病原微生物的临床样品。这样的样品可能包含已知或未知的病原微生物,因此,上述目标区域和非目标区域是“任选存在的”,即存在或不存在。然而,无论是否存在目标区域和非目标区域,在使用本发明的方法检测之前,对于临床样品中病原微生物的存在情况(包括是否存在和存在的数量)都是不明确的,而使用本发明的方法能够得到样品中病原微生物的定性和/或定量结果。
本发明实施例中,文库接头是双链接头,包括第一链和第二链,该双链接头是测序所需要的接头,根据不同的测序平台和测序策略,可以采用相应结构形式的双链接头,例如Y型接头或鼓泡接头等。在本发明一个实施例中,测序采用BGI测序平台,双链接头是双链鼓泡接头,第一链上包括样本标签序列(Sample Barcode),该样本标签序列用于区分不同样本来源,样本标签序列按本领域常用方式即可,在一个实施例中,样本标签序列是一段位于第一链中间部分的随机序列,其长度可以是6至12个碱基;第二链中间部分包括一段与第一链不互补的序列形成的鼓泡结构。
(3)获得接头连接产物以后,以上述接头连接产物为模板,加入第一基因特异性引物和下游文库扩增通用引物进行第一PCR扩增,获得第一扩增产物,其中第一基因特异性引物与目标区域结合,下游文库扩增通用引物与双链接头的第一链结合。
需要说明的是,第一基因特异性引物可以是针对一个目标区域(或目标基因)的一条引物,也可以是针对多个目标区域(或目标基因)的多条引物,多条引物组成基因特异性引物混合物1(GSP1pool)。在本发明一个实施例中,加入可与多个目标区域(如目标耐药基因、毒力基因、病原体鉴定基因)相结合的基因特异性引物混合物1和下游文库扩增通用引物(UP1)进行第一次PCR扩增,含有目标区域的病原体DNA片段将通过两端的两条引物进行指数扩增,而不含有目标区域的病原体DNA片段只通过一端的下游文库扩增通用引物(UP1)进行线性扩增。在一个实施例中,第一PCR扩增的循环数可以是10至30个循环,优选15个循环。
第一PCR扩增过程中加入基因特异性引物混合物1(GSP1pool)及下游文库扩增通用引物(UP1),实现了PCR方法对目标区域的深度富集,同时非目标区域(WGS区域)线性扩增,保证了目标区域扩增的特异性和灵敏度,同时线性扩增提升了WGS区域的拷贝数,增加第二次PCR扩增的拷贝数,从而一定程度上提升了扩增效率。
(4)第一PCR扩增完成后,以第一扩增产物为模板,再加入第二基因特异性引物(为第一基因特异性引物的内侧巢式引物)、下游文库扩增通用引物(UP1)和上游文库扩增通用引物(UP2)进行第二PCR扩增,获得第二扩增产物,其中第二基因特异性引物与目标区域结合,上游文库扩增通用引物(UP2)与双链接头的第二链结合。
需要说明的是,与第一基因特异性引物相对应,第二基因特异性引物可以是针对一个目标区域(或目标基因)的一条引物,也可以是针对多个目标区域(或目标基因)的多条引物,多条引物组成基因特异性引物混合物2(GSP2pool)。在本发明一个实施例中,加入基因特异性引物混合物2(GSP2pool)、下游文库扩增通用引物(UP1)和上游文库扩增通用引物(UP2)进行第二次PCR扩增,含有目标区域的第一扩增产物将以基因特异性引物混合物2(GSP2pool)和下游文库扩增通用引物(UP1)特异性扩增,不含目标区域的DNA片段将以下游文库扩增通用引物(UP1)和上游文库扩增通用引物(UP2)进行普通的通用扩增。在一个实施例中,第二基因特异性引物包括与目标区域结合的部分和位于5’端且与双链接头的第二链相同或部分相同的部分,这样的第二基因特异性引物的扩增产物保留了接头序列,利于后续测序分析。在一个实施例中,第二PCR扩增的循环数可以是10至30个循环,优选15个循环。
第二PCR扩增中加入基因特异性引物混合物2(GSP2pool)进一步提升了目标区域的特异性和产量,新加入的上游文库扩增通用引物(UP2),将与下游文库扩增通用引物(UP1)一起,对WGS区域进行扩增,实现WGS区域的指数扩增。两轮PCR实现了目标区域和WGS区域的同步扩增。
经过两次PCR扩增,目标区域进行两轮靶向PCR扩增,WGS区域进行一轮PCR扩增,使得目标区域DNA得以特异性扩增富集,而非目标区域的DNA不受影响,与常规建库方法相比只增加了第一次PCR扩增反应,而该反应对于非目标区域是线性扩增,不会改变样品中非目标微生物的丰度,实现宏基因组正常检测的同时对目标区域进行富集,提高检出率。通过调整两次PCR循环数,可以使目标区域PCR产物和WGS区域PCR产物产量达到理想的比例,使检测结果更加灵敏、可靠。
靶向PCR结合WGS扩增技术在病原检测中属于首次应用,对于未知病原体和多个目标区域(如耐药基因、毒力基因、病原体鉴定基因)进行同时检测,为病原检测提供了更多的选择。
本发明的一个实施例提供一种全基因组结合靶向扩增建库试剂,包括下游文库扩增通用引物和上游文库扩增通用引物,其中上述下游文库扩增通用引物与建库用双链接头的第一链结合,上述上游文库扩增通用引物与建库用双链接头的第二链结合,上述下游文库扩增通用引物和上游文库扩增通用引物用于如下的全基因组结合靶向扩增建库方法:获取样品全基因组DNA片段化后两端连接上双链接头的接头连接产物,上述接头连接产物包括任选存在的目标区域和非目标区域;以上述接头连接产物为模板,采用第一基因特异性引物和下游文库扩增通用引物进行第一PCR扩增,获得第一扩增产物,其中上述第一基因特异性引物与上述目标区域结合,上述下游文库扩增通用引物与上述双链接头的第一链结合;以及以上述第一扩增产物为模板,采用第二基因特异性引物、上述下游文库扩增通用引物和上游文库扩增通用引物进行第二PCR扩增,获得第二扩增产物,其中上述第二基因特异性引物与上述目标区域结合,上述上游文库扩增通用引物与上述双链接头的第二链结合。
在优选实施例中,上述试剂还包括如下一种或多种:双链接头,包括第一链和第二链,用于连接到样品全基因组DNA片段化产物的两端以得到上述接头连接产物;第一基因特异性引物,与上述目标区域结合,用于与上述下游文库扩增通用引物一起作为扩增引物,以上述接头连接产物为模板,进行第一PCR扩增以获得第一扩增产物;第二基因特异性引物,与上述目标区域结合,用于与上述下游文库扩增通用引物和上述上游文库扩增通用引物一起作为扩增引物,以上述第一扩增产物为模板,进行第二PCR扩增以获得第二扩增产物。
本发明的一个实施例提供一种非诊断目的的病原检测方法,包括:获取病原样品,并通过本发明的方法构建文库;以及对上述文库进行二代测序获取样品中病原的测序数据,并对上述测序数据进行分析,得到样品中病原的定性和/或定量结果。
以下通过实施例详细说明本发明的技术方案,应当理解,实施例仅是示例性的,不能理解为对本发明保护范围的限制。
本发明实施例中采用的引物由北京六合华大有限公司合成,采用的片段化酶(fragmentase)为NEB公司采购,T4DNA聚合酶(polymerase)、T4PNK激酶(Kinase)、Klenow片段(Fragment)、rTaq均来自BGI公司的商业酶。
实施例1病原的检测
以下表1中的组分按照一定比例配制成参考品,然后将炎黄(YH)基因组:大肠杆菌基因组:参考品基因组按照9:90:1的比例进行混合,制备模拟样本用于后续实验。
表1
病原 | 性质 |
猪疱疹病毒(Suid herpesvirus) | dsDNA |
鸡痘病毒(Fowlpox virus) | dsDNA |
产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca) | 格兰式阴性菌(-) |
粪肠球菌(Enterococcus faecalis) | 格兰式阳性菌(+) |
光滑念珠菌(Candida glabrata) | 真菌 |
(1)DNA片段化:
配置如下表2的反应体系,在37℃孵育25min。
表2
组分 | 用量 |
10×反应缓冲液(reaction buffer) | 2μL |
片段化酶(fragmentase)(NEB) | 0.5μL |
模拟样本 | 10μL |
水 | 7.5μL |
总量 | 20μL |
(2)补平加A反应
配置如下表3的反应体系,37℃孵育30min,75℃孵育15min,0.1℃/s降温至4℃保温。
表3
组分 | 用量 |
10×PNK缓冲液 | 5μL |
dATP/dNTP(20:1) | 1.2μL |
T4DNA聚合酶(polymerase) | 0.4μL |
T4PNK激酶(Kinase) | 0.6μL |
Klenow片段(Fragment) | 0.2μL |
rTaq | 0.2μL |
水 | 2.4μL |
总量 | 10μL |
(3)加测序接头
配置如下表4的反应体系,将反应体系置于PCR仪中23℃反应1h。
表4
(4)第一次(1st)PCR反应
配置如下表5的反应体系,按照表6所示的程序进行反应。
表5
表6
反应完成后,加入75μL Ampure磁珠(1.5X)纯化,然后用20μL DNA洗脱液溶解。
(5)第二次(2nd)PCR反应
配置如下表7的反应体系,按照表8所示的程序进行反应。
表7
表8
加入75μL Ampure磁珠(1.5X)纯化,然后用25μL DNA洗脱液溶解。
以上实施例用到的引物信息如下表9:
表9
(6)测序及数据分析
对上述第二次(2nd)PCR反应产物进行上机测序和数据分析。
数据分析具体方法如下:
(a)对下机数据进行序列比对以进行病原鉴定,此步骤是为了获得样本包含靶向病原的所有病原信息,鉴定序列数目(WGS结果);
(b)以SP2(靶向引物对内侧)引物序列及下游100bp序列作为参考序列,与数据过滤(SOAPnuke软件过滤低质量序列,去除宿主序列,以及snap软件去除rRNA序列)后的清洁读长(clean reads)进行比对,获得靶向序列的数据和数目(靶向结果);
(c)统计WGS结果与靶向区域所占的读长(reads)数,WGS结果与靶向区域占比。
(7)分析结果
(a)细菌检出结果如下表10所示:
表10
(b)病毒检出结果如下表11所示:
表11
(c)寄生虫检出结果如下表12所示:
表12
以上应用了具体个例对本发明进行阐述,只是用于帮助理解本发明,并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员,依据本发明的思想,还可以做出若干简单推演、变形或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉华大智造科技有限公司
<120> 全基因组结合靶向扩增建库方法和试剂及病原检测方法
<130> 19I27856
<160> 16
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttgtcttcct aaggaacgac atggctacga tccgactt 38
<210> 2
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agtcggaggc caagcggtct taggaagaca ata 33
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ggtccgatca actccttggc tcaca 25
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gaacgacatg gctacga 17
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aaaccaccgt agcagacgca cg 22
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gcatcgacag ccatgccgct at 22
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
aggttggggc tgtggctcag aa 22
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
tcgacaaacg cgtcgccgta aa 22
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cgcatccact gcgccgatat gt 22
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
acgcgctgtt agcgcttctt gt 22
<210> 11
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
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gaacgacatg gctacgatcc gacttcgtct ttttcgccgc acgcaaa 47
<210> 12
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gaacgacatg gctacgatcc gacttcgaca tcttgtaaag cgcgcgc 47
<210> 13
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
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gaacgacatg gctacgatcc gactttccga cttctcggtg ggtgctt 47
<210> 14
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gaacgacatg gctacgatcc gacttcgttg cccgctgata aatgcgc 47
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gaacgacatg gctacgatcc gactttatcg acgagggcgt gggtgtt 47
<210> 16
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
gaacgacatg gctacgatcc gactttggac gctggatggc gaacaac 47
Claims (10)
1.一种全基因组结合靶向扩增建库方法,其特征在于,所述方法包括:
获取样品全基因组DNA片段化后两端连接上双链接头的接头连接产物,所述接头连接产物包括任选存在的目标区域和非目标区域;
以所述接头连接产物为模板,采用第一基因特异性引物和下游文库扩增通用引物进行第一PCR扩增,获得第一扩增产物,其中所述第一基因特异性引物与所述目标区域结合,所述下游文库扩增通用引物与所述双链接头的第一链结合;和
以所述第一扩增产物为模板,采用第二基因特异性引物、所述下游文库扩增通用引物和上游文库扩增通用引物进行第二PCR扩增,获得第二扩增产物,其中所述第二基因特异性引物与所述目标区域结合,所述上游文库扩增通用引物与所述双链接头的第二链结合。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述目标区域包括多个目标基因,所述第一基因特异性引物包括多个引物,分别与所述多个目标基因结合;所述第二基因特异性引物包括多个引物,为所述第一基因特异性引物的内侧巢式引物,分别与所述多个目标基因结合。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述第二基因特异性引物包括与所述目标区域结合的部分和位于5’端且与所述双链接头的第二链相同或部分相同的部分。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述双链接头是双链鼓泡接头,所述第一链上包括样本标签序列,所述第二链中间部分包括一段与所述第一链不互补的序列形成的鼓泡结构。
5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述第一PCR扩增的循环数是10至30个循环,优选15个循环;所述第二PCR扩增的循环数是10至30个循环,优选15个循环。
6.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述样品是疑似包含临床病原微生物的临床样品。
7.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述目标区域包括目标耐药基因、毒力基因、病原体基因和遗传病相关基因中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述接头连接产物通过如下方法得到:
采用物理打断或酶切打断的方法将所述样品全基因组DNA打断成小片段,优选地,所述小片段为200~400bp的小片段;
将打断的小片段进行末端修复、加A碱基和磷酸化处理,再采用连接酶在片段两端连接所述双链接头得到所述接头连接产物。
9.一种全基因组结合靶向扩增建库试剂,其特征在于,所述包括下游文库扩增通用引物和上游文库扩增通用引物,其中所述下游文库扩增通用引物与建库用双链接头的第一链结合,所述上游文库扩增通用引物与建库用双链接头的第二链结合,所述下游文库扩增通用引物和上游文库扩增通用引物用于如下的全基因组结合靶向扩增建库方法:
获取样品全基因组DNA片段化后两端连接上双链接头的接头连接产物,所述接头连接产物包括任选存在的目标区域和非目标区域;
以所述接头连接产物为模板,采用第一基因特异性引物和下游文库扩增通用引物进行第一PCR扩增,获得第一扩增产物,其中所述第一基因特异性引物与所述目标区域结合,所述下游文库扩增通用引物与所述双链接头的第一链结合;和
以所述第一扩增产物为模板,采用第二基因特异性引物、所述下游文库扩增通用引物和上游文库扩增通用引物进行第二PCR扩增,获得第二扩增产物,其中所述第二基因特异性引物与所述目标区域结合,所述上游文库扩增通用引物与所述双链接头的第二链结合;
优选地,所述试剂还包括如下一种或多种:
双链接头,包括第一链和第二链,用于连接到样品全基因组DNA片段化产物的两端以得到所述接头连接产物;
第一基因特异性引物,与所述目标区域结合,用于与所述下游文库扩增通用引物一起作为扩增引物,以所述接头连接产物为模板,进行第一PCR扩增以获得第一扩增产物;
第二基因特异性引物,与所述目标区域结合,用于与所述下游文库扩增通用引物和所述上游文库扩增通用引物一起作为扩增引物,以所述第一扩增产物为模板,进行第二PCR扩增以获得第二扩增产物。
10. 一种非诊断目的的病原检测方法,其特征在于,所述方法包括:
获取病原样品,并通过权利要求1-8任一项所述的方法构建文库;和
对所述文库进行二代测序获取样品中病原的测序数据,并对所述测序数据进行分析,得到样品中病原的定性和/或定量结果。
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