CN105463585A - 基于单链dna分子构建测序文库的方法及其应用 - Google Patents

基于单链dna分子构建测序文库的方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105463585A
CN105463585A CN201410466261.2A CN201410466261A CN105463585A CN 105463585 A CN105463585 A CN 105463585A CN 201410466261 A CN201410466261 A CN 201410466261A CN 105463585 A CN105463585 A CN 105463585A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
alternatively
sample
single strand
sequencing library
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201410466261.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105463585B (zh
Inventor
颉伟
尹强宗
吴婧怡
徐丰
彭旭
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Clinical Research Institute Of Agency For Science Technology And Research
Tsinghua University
Original Assignee
Clinical Research Institute Of Agency For Science Technology And Research
Tsinghua University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Clinical Research Institute Of Agency For Science Technology And Research, Tsinghua University filed Critical Clinical Research Institute Of Agency For Science Technology And Research
Priority to CN201410466261.2A priority Critical patent/CN105463585B/zh
Priority to US15/503,428 priority patent/US10400279B2/en
Priority to PCT/CN2015/088680 priority patent/WO2016037537A1/en
Publication of CN105463585A publication Critical patent/CN105463585A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105463585B publication Critical patent/CN105463585B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C12Q1/6874—Methods for sequencing involving nucleic acid arrays, e.g. sequencing by hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B50/00—Methods of creating libraries, e.g. combinatorial synthesis
    • C40B50/06—Biochemical methods, e.g. using enzymes or whole viable microorganisms

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了基于单链DNA分子构建测序文库的方法及其应用，其中，测序文库构建方法包括：(1)在单链DNA分子的3’末端形成poly(C)n尾部，其中，n代表碱基C的数目；(2)利用延伸引物，基于所述具有Poly(C)n尾部的单链DNA分子，获得双链DNA分子，其中，延伸引物在其3’末端包括H(G)m单元，H为碱基A、碱基T或碱基C，m为碱基G的数目；以及(3)在所述双链DNA分子远离H(G)m单元的一端连接接头，并对所得到的连接产物进行扩增，所述扩增产物构成所述测序文库。该方法能够有效地构建单链DNA分子的测序文库，特别是微量样本的测序文库。

Description

基于单链DNA分子构建测序文库的方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是基因测序领域。具体地，本发明涉及基于单链DNA分子构建测序文库的方法及其应用。更具体地，本发明涉及基于单链DNA分子构建测序文库的方法、用于基于单链DNA构建测序文库的装置、确定单链DNA分子的序列信息的方法、确定RNA样本的序列信息的方法、用于确定染色质目标区域的序列信息的方法以及用于确定基因组甲基化信息的方法。
背景技术
二代测序技术迅猛发展，解析并鉴定了许多人类和动植物正常和致病性状的基因，从全基因组的层面了解到前所未知的生物遗传和发育学问题。而测序前不可缺少的一步就是构建能够适用于二代测序平台的标准样品文库，简称建库。目前主要的建库方法是Illumia的Trueseq和Nextera系列建库方法，建库操作繁琐，并且操作过程中必须要补平末端、加碱基A和连接接头，而这三步反应都要求在纯化后的样品体系中进行，因此每个反应都必须进行纯化操作，而由于技术限制，纯化操作不可避免的会有一定量的样品损失，导致这些方法的DNA起始量大，至少在纳克水平以上，并且建库过程中DNA信息大量丢失。对于微量样品，例如珍贵稀缺的样品或者临床病人标本，传统的建库方法并不适用。因此，目前二代测序技术在构建基因文库的方法上仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种操作简单，高灵敏性，适于微量样品的基于单链DNA分子构建测序文库的方法及其应用。
需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：
发明人采用单链建库，利用DNA链3’端的Poly(C)n与含有Poly(G)m的延伸引物互补配对并进行延伸反应；尽量减少通过离心柱纯化的次数，仅在扩增前进行一步纯化，并且纯化通过磁珠与生物素亲和结合而进行的，显著减少样品损失；利用PCR反应连接接头，并且能在添加索引标签的同时对文库样本进行扩增，扩增产物构成测序文库。
因而，根据本发明的一个方面，本发明提供了一种基于单链DNA分子构建测序文库的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：(1)在单链DNA分子的3’末端形成poly(C)n尾部，以便获得具有Poly(C)n尾部的单链DNA分子，其中，n代表碱基C的数目，并且n为5～30之间的整数；(2)利用延伸引物，基于所述具有Poly(C)尾部的单链DNA分子，获得双链DNA分子，其中，延伸引物在其3’末端包括H(G)m单元，H为碱基A、碱基T或碱基C，m为碱基G的数目，并且m为5～15之间的整数；以及(3)在所述双链DNA分子远离H(G)m单元的一端连接接头，并对所得到的连接产物进行扩增，以便获得扩增产物，所述扩增产物构成所述测序文库。
利用根据本发明实施例的基于单链DNA分子构建测序文库的方法，能够有效地构建单链DNA分子的测序文库，特别是能够有效地构建微量样本的测序文库。利用DNA链3’端的Poly(C)n与含有Poly(G)m的延伸引物互补配对并进行单链DNA延伸反应，能避免延伸引物互补配对到基因组DNA而不是其3’端上的情况，减小偏差的同时也保留了DNA链的特异性，而且能应用于细胞的全基因组甲基化信息研究；并且仅进行一步纯化或不进行纯化，显著降低多步纯化产生的样品损失和基因信息大量丢失，从而大幅减少了建库DNA的起始量，进而能够高效、灵敏地应用于高通量测序技术，基于对测序结果的数据分析，就能够有效地获得基因序列信息。
根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种用于基于单链DNA构建测序文库的装置。根据本发明的实施例，该装置包括：尾部连接单元，所述尾部连接单元用于在单链DNA分子的3’末端形成poly(C)n尾部，以便获得具有Poly(C)n尾部的单链DNA分子，其中，n代表碱基C的数目，并且n为5～30之间的整数；延伸单元，所述延伸单元与所述尾部连接单元相连，并且用于基于所述具有Poly(C)尾部的单链DNA分子，获得双链DNA分子，其中，延伸引物在其3’末端包括H(G)m单元，H为碱基A、碱基T或碱基C，m为碱基G的数目，并且m为5～15之间的整数；接头连接单元，所述接头连接单元与所述延伸单元相连，并且用于在所述双链DNA分子远离H(G)m单元的一端连接接头；以及扩增单元，所述扩增单元与所述接头连接单元相连，并且用于对所述接头连接单元的连接产物进行扩增，以便获得扩增产物，所述扩增产物构成所述测序文库。
利用根据本发明实施例的用于基于单链DNA构建测序文库的装置，能够利用微量单链DNA样品进行测序文库的构建，并且保留了单链DNA链的特异性，样品损失少，基因信息保持完整，且能应用于细胞的全基因组甲基化DNA文库的构建。
根据本发明的又一方面，本发明提供了一种确定单链DNA分子的序列信息的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：基于所述单链DNA分子，根据前述方法构建测序文库；以及对所述测序文库进行测序，以便获得测序结果；基于所述测序结果，确定所述单链DNA分子的序列信息。
利用根据本发明实施例的确定单链DNA分子的序列信息的方法，能够灵敏、准确、高效地确定微量样本单链DNA分子的序列信息，并且能应用于细胞的全基因组甲基化DNA分子，从而实现对样品的全基因组或特定区域基因组的甲基化检测。
根据本发明的又一方面，本发明提供了一种确定单链DNA序列信息的***。根据本发明实施例，该***其包括：测序文库构建装置，采用前述方法制备样本基因的测序文库；测序装置，所述测序装置与所述测序文库制备单元相连，以便用于对所述样本的基因测序文库进行测序，获得所述样本DNA的测序结果；以及分析装置，对所述样本DNA的测序结果进行分析，以便获得所述单链DNA序列信息。
采用根据本发明实施例的确定单链DNA分子的序列信息的***，能够灵敏、准确、高效地确定微量样本单链DNA分子的序列信息，并且可以应用该***对全基因组甲基化DNA分子的序列进行分析，从而实现对样品的全基因组或特定区域基因组的甲基化检测。
根据本发明的再一方面，本发明提供了一种确定RNA样本的序列信息的方法。根据本发明实施例，该方法包括：对RNA样本进行反转录，以便获得单链DNA分子；基于所述单链DNA分子，通过根据前述的方法，构建测序文库；对所述测序文库进行测序；以及基于所述测序结果，确定所述RNA样本的序列信息。
利用根据本发明实施例的确定RNA样本的序列信息的方法，能够灵敏、准确、高效地确定微量样本单链DNA分子的序列信息，从而实现对样本的基因组的检测。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于确定染色质目标区域的序列信息的方法。根据本发明实施例，该方法包括：将染色质进行随机打断，以便获得长度为200bp～500bp的染色质样本；利用抗体对所述染色质样本进行染色质免疫共沉淀，所述抗体特异性识别所述目标区域，以便获得包含所述目标区域的双链DNA样本；对所述包含所述目标区域的双链DNA样本，进行变性处理，以便得到单链DNA分子；基于所述单链DNA分子，通过根据前述的方法，构建测序文库；对所述测序文库进行测序；以及基于所述测序结果，确定所述染色质目标区域的序列信息。
利用根据本发明实施例的确定染色质目标区域的序列信息的方法，能够灵敏、准确、高效地确定微量样本确定染色质目标区域的序列信息，从而实现对染色质样本的基因组目标区域的检测。
根据本发明的又一方面，本发明提供了一种用于获得基因组甲基化序列信息的方法。根据本发明实施例，该方法包括：将全基因组的至少一部分进行重亚硫酸盐处理，以便将所述全基因组中的碱基中非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，并且获得经过转换的基因组样本；将所述基因组样本进行随机打断，以便获得长度为200bp～500bp的双链DNA样本；对所述包含所述目标区域的双链DNA样本，进行变性处理，以便得到单链DNA分子；基于所述单链DNA分子，通过根据前述的方法，构建测序文库；对所述测序文库进行测序；以及基于所述测序结果，确定基因组甲基化序列的信息。
利用根据本发明实施例的确定基因组甲基化信息的方法，能够准确地确定样本全基因组或者特定区域基因组的甲基化信息，从而实现对样本全基因组或者特定区域基因组的甲基化检测。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了根据本发明一个实施例的基于单链DNA分子构建测序文库的方法的流程示意图；
图2显示了根据本发明一个实施例的尾部连接反应示意图；
图3显示了根据本发明一个实施例的延伸反应示意图；
图4显示了根据本发明一个实施例的尾部连接反应示意图；
图5显示了根据本发明一个实施例的第一轮PCR扩增反应示意图；
图6显示了根据本发明一个实施例的第二轮PCR扩增反应获得完整文库样本反应示意图；
图7显示了根据本发明一个实施例的用于基于单链DNA构建测序文库的装置示意图，
其中，
图7A显示了以单链DNA样本构建测序文库的装置示意图；
图7B显示了以RNA或染色质样本构建测序文库的装置示意图，
图8显示了根据本发明一个实施例的确定单链DNA序列信息的***的示意图；
图9显示了根据本发明一个实施例的确定RNA样本的序列信息的方法的示意图；
图10显示了根据本发明一个实施例的确定染色质目标区域的序列信息的方法的示意图；
图11显示了根据本发明一个实施例的确定基因组甲基化信息的方法的示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
基于单链DNA分子构建测序文库的方法
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种基于单链DNA分子构建测序文库的方法。参考图1，根据本发明的实施例，该方法可以包括以下步骤：
首先，在单链DNA分子的3’末端形成poly(C)n尾部，以便获得具有Poly(C)n尾部的单链DNA分子，其中，n代表碱基C的数目，并且n为5～30之间的整数。
其中，需要说明的是，在本发明中所使用的术语“DNA”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA。本领域的技术人员可以理解，基因组DNA的来源不受特别限制，可以从任何可能的途径获得，可以是通过市售直接获得，也可以是从其他实验室直接获取，还可以是直接从样本中提取的。根据本发明实施例，所述单链DNA分子可以通过对RNA进行逆转录而获得的。根据本发明一个实施例，所述单链DNA分子可以是通过对RNA进行逆转录而获得的cDNA分子。根据本发明实施例，所述单链DNA分子是可以通过对双链DNA样本进行变性而获得的。根据本发明一个具体实施例，所述单链DNA分子可以是通过对双链DNA样本进行热变性而获得的。发明人惊奇的发现，采用单链DNA构建测序文库，能够保留单链DNA的链特异性。根据本发明实施例，双链DNA的来源不受特别的限制，根据本发明一个具体实施例，所述双链DNA样本可以是通过染色质免疫共沉淀而获得的。根据本发明一个实施例，所述双链DNA样本可以是通过对DNA样本进行随机打断而获得的。根据本发明的实施例，在所述随机打断之后，可以利用探针对所述随机打断的产物进行筛选。根据本发明实施例，将DNA样品进行随机打断可以是利用物理方法进行的，由此不会破坏待测DNA的化学组成，从而提高后续测序的精确度和效率。物理方法进行随机打断的例子包括但不限于高压气体雾化处理、超声处理、水力剪切。根据本发明的具体示例，所述随机打断可以是通过超声处理进行的。根据本发明的实施例，所述单链DNA分子的长度可以为200～500nt。根据本发明实施例，在所述随机打断之后，如果是机械打断，先要对所述随机打断的产物进行末端修复处理。例如，末端修复反应体系为:32.6μlDNA样品，4μl10xT4ligase缓冲液(NEB,B0202S)，1.6μl10mMdNTPmix(NEB,N0447S)，0.8μlT4PNK(NEB,M0201S)，0.8μlT4DNA聚合酶(NEB,M0203S)和0.16μlKlenowfragment(NEB，M0210S)将该反应体系充分混匀，20℃条件下反应30分钟。产物用MinElutePCRpurificationkit(Qiagen，28006)进行纯化，即获得末端修复的双链DNA片段。根据本发明的实施例，单链DNA的量不受特别限制，根据本发明的具体示例，所述单链DNA分子的量为≥25pg。由此，本发明构建测序文库的起始量显著小于其他二代测序文库的起始量，适于微量样本构建测序文库，尤其适于珍贵稀缺的样品或者临床病人标本构建测序文库。根据本发明具体示例，所述单链DNA分子的量为25pg～10ng。由此，构建测序文库的效率高，准确度好。
根据本发明实施例，Poly(C)n尾部的n可以为15～25之间的整数。根据本发明具体示例，n可以为20。由此，与延伸引物结合的效果好。根据本发明实施例，Poly(C)n尾部添加至单链DNA分子3’末端的方式不受特别限制。根据本发明的具体示例，所述poly(C)n尾部可以是利用末端转移酶形成的，过程具体参考图2。单链DNA在末端转移酶(TdT)的作用下，DNA链的3’末端能连上若干个多聚胞嘧啶脱氧核苷酸Poly(C)n，反应过程为：预先混合28μlDNA溶液，1μl10xEX缓冲液(Takara，suppliedwithRR006A)，1μl1mMdCTP(NEB，N0446S)，高温使DNA变性，获得单链DNA分子。接着加入1μl末端转移酶(TdT；NEB，M0315S)，并在37℃条件下反应35min。反应结束后，加热至75℃保持20分钟，以使TdT失活，获得3’末端连接寡聚Poly(C)n的单链DNA分子。
然后，利用延伸引物，基于所述具有Poly(C)n尾部的单链DNA分子，获得双链DNA分子，其中，延伸引物在其3’末端包括H(G)m单元，H为碱基A、碱基T或碱基C，m为碱基G的数目，并且m为5～15之间的整数。由此，延伸引物能在Poly(C)n尾部上的合适位置起始退火配对。根据本发明实施例，H(G)m单元的m可以为9。由此，H(G)m单元与寡聚Poly(C)n起始退火配对的位置适宜。
根据本发明实施例，延伸引物的序列不受特别的限制，只要能保证DNA延伸能够进行即可。根据本发明具体示例，所述延伸引物可以由SEQIDNO：1所示的核苷酸构成，具体延伸过程如图3所示。由此，延伸引物易于与poly(C)n尾部配对，延伸反应效率高。其中，SEQIDNO：1的具体序列如下：
GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTGGGGGGGGGH(SEQIDNO：1)。
根据本发明实施例，可以利用KAPA2GRobustHS对单链DNA分子进行延伸，获得所述双链DNA分子。例如，延伸的反应体系为：上一步骤获得的3’末端连接寡聚Poly(C)n的单链DNA分子中，加入6.2μl水，0.8μlKAPA2GRobustHS(KAPA，KK5515)，12μl5xKAPA缓冲液A(KAPA，KK5515)，4.8μl2.5mMdNTP(Takara，RR006A)，以及6μl2μM延伸引物。根据本发明的具体实施例，延伸反应的程序为：(1)95℃3min；(2)47℃1min，68℃2min，16个循环；(3)72℃10min。反应结束后，再加入核酸外切酶I(ExoI)于37℃反应1小时，消化掉多余的延伸引物，获得延伸产物。其中说明的是，利用延伸反应获得的延伸链末端，即延伸链的3’端为碱基A，由此，便于与5’以碱基T为首端的半接头连接。
根据本发明实施例，所述延伸引物可以具有筛选标记，其中，所述筛选标记形成于所述延伸引物的5’末端。由此，通过筛选标记高效地对延伸后的双链DNA进行筛选、纯化，获得目的基因。根据本发明具体示例，所述筛选标记可以为生物素。由此，采用连接有生物素的DNA片段与磁珠结合的方法对延伸的双链DNA产物的纯化，显著减少纯化过程中DNA的损失。根据本发明具体示例，生物素与磁珠结合的过程如下：预先用1xBinding&Wash(B&W)缓冲液(10mMTris-HClpH8.0、0.5mMEDTA，1MNaCl)清洗magneticstreptavidinC1磁珠(Invitrogen，650.01)，然后和延伸后的产物混合后在温控混匀仪上的孵育，条件为：23℃1400rpm震荡(震荡频率：震荡10s，停止10s)30min。反应结束后，结合了DNA的磁珠用100μl1xB&W缓冲液洗一次，150μlEBT缓冲液(10mMTris-HClpH8.0，0.02％TritonX-100)洗三次，最后用8.4μlelution缓冲液(EB；10mMTris-HClpH8.0)重悬，用于之后的连接反应。
最后，在所述双链DNA分子远离H(G)m单元的一端连接接头，并对所得到的连接产物进行扩增，以便获得扩增产物，所述扩增产物构成所述测序文库。根据本发明实施例，具体过程参照图4，该步骤可以进一步包括：将分别具有由SEQIDNO：2-3所示核苷酸序列的单链核酸分子进行退火，以便获得半接头，将所述半接头与所述双链DNA分子的一端进行连接，以便获得连接有半接头的双链DNA分子。需要说明的是，若珠子与双链DNA的一端相连，则产生阻碍作用，因此半接头与远离双链DNA珠子连接端的一端相连。其中，半接头SEQIDNO：2-3的3’端都有磷酸基团修饰以防止其自连，半接头连接引物所示核苷酸序列具体如下：
Adp_A：GACGCTCTTCCGATCT(SEQIDNO：2)；
Adp_B：GATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT(SEQIDNO：3)
根据本发明具体示例，连接反应的条件为：将1μl快速连接酶(NEB，M2200L)，10μl2x快速连接缓冲液，8.4μl重悬的结合有延伸产物的磁珠以及0.6μl10mM接头，置于离心管中，充分混匀。将离心管置于旋转培养器上以防磁珠沉降，整个反应在4℃条件下过夜进行(约15小时)，获得连接接头的双链DNA分子。由此，连接的背景小，并且连接效率高。根据本发明实施例，在所述双链DNA分子连接接头之后，进行扩增之前，对所述连接有接头的双链DNA分子进行纯化。根据本发明的实施例，纯化的方式不受特别的限制。根据本发明具体示例，纯化可以是利用特异性识别生物素的珠子进行的。根据本发明的另一具体示例，所述珠子可以为磁珠，其中，所述磁珠上连接有链霉亲和素。由此，采用磁珠与连接有生物素的DNA片段结合的方法对延伸的双链DNA产物的纯化，纯化效果好，并且能够显著减少纯化过程中DNA的损失。根据本发明实施例，纯化后可以采用超纯蒸馏水72℃加热进行洗脱，连接有半接头的双链DNA分子即在洗脱液中，获得纯化的连接有半接头的双链DNA分子。由此，含有连接有半接头的双链DNA分子的洗脱液可直接用于下一步的扩增产物，减少中间操作步骤，避免DNA损失。
获得连接有半接头的双链DNA分子后，对其进行扩增，以便获得扩增产物，所述扩增产物构成所述测序文库。根据本发明实施例，扩增的方式不受特别的限制，可以根据需要采用一轮PCR或多轮PCR。例如，本方法采用两轮PCR，第一轮PCR，具体过程参考图5，利用由SEQIDNO：4-5所示的核苷酸作为引物，对所述连接有半接头的双链DNA分子进行扩增，由此，DNA分子的扩增效率高；第二轮PCR，具体过程参考图6，根据本发明实施例，第二轮PCR利用由SEQIDNO：4-5所示的核苷酸作为引物。由此，DNA分子的扩增效率高。其中，扩增引物的具体核苷酸序列如下：
扩增引物：
第一轮PCR：
MP24_G5：GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTGGGGG(SEQIDNO：4)，
P1_FL：AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT(SEQIDNO5)；
第二轮PCR：
P1_Sh：AATGATACGGCGACCACCGA(SEQIDNO：6)
去除标签的Index序列：CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNGTGACTGGAGTTCAGACG(SEQIDNO：7)
根据本发明实施例，所述扩增单元中，可以采用包含标签序列的引物，对所述连接产物进行扩增，由此，能在一次高通量测序中测多个不同的样品。例如，在DNA文库的一端被加上了可区别的索引序列标签，该文库可用于Illumina高通量测序的标准文库样本的建立。
在本发明中所使用的术语“标签序列引物”是指在PCR引物序列中嵌入了序列标签，由此，在利用标签序列引物进行扩增反应的过程中，能够将标签序列引物引入到目的片段的一端，既可以将核酸标签引入到5’端，也可以将标签引入到3’端。例如，参考图6，当采用标签PCR引物作为上游引物，即在目的片段的5’端引入序列标签时，标签序列引物特异性地识别5’接头的序列，进而下游引物可以采用特异性地识别3’接头的序列。通过标签序列引物与DNA分子相连，可以精确地表征DNA分子的样品来源。由此，利用上述核酸标签，可以同时构建多种DNA分子的用于测序的DNA文库，从而可以通过将来源于不同样品的DNA文库进行混合，同时进行测序，基于标签序列对DNA序列进行分类，获得多种DNA分子的序列信息。从而可以充分利用高通量的测序技术，例如利用Solexa测序技术，同时对多种DNA分子进行测序，从而提高DNA分子测序的效率和通量。根据本发明实施例，序列标签的具体序列不受特别的限制，可以根据自己的需要进行设计，只要能区分序列来源即可。例如，采用如表1中SEQIDNO:8～19任一项所示的核苷酸构成的PCR引物作为标签PCR引物，由此，测序的准确度和精确度进一步提高。在本说明书中，核酸标签分别被命名为IndexN，其中N＝1-12中的任意整数，其序列如下表1所示：
表1：核酸标签序列引物Index1-12的序列
由此，可以方便地同时构建多种样本的基因测序文库，并能够有效地应用于高通量测序平台，从而在对测序结果进行数据分析后，基于标签的序列信息，能够准确地区分多种样本的基因测序文库的序列信息，进而，能够充分地利用高通量测序平台，且节省时间、降低成本。
基于单链DNA构建测序文库的装置
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种用于基于单链DNA构建测序文库的装置1000。参考图7A，根据本发明实施例，该装置可以包括：尾部连接单元100、延伸单元200、接头连接单元300以及扩增单元400。
尾部连接单元100，尾部连接单元100用于在单链DNA分子的3’末端形成poly(C)n尾部，以便获得具有Poly(C)n尾部的单链DNA分子，其中，n代表碱基C的数目，并且n为5～30之间的整数。根据本发明实施例，在所述尾部连接单元可以设置有末端转移酶，由此，高效地将Poly(C)n尾部添加至单链DNA分子的3’末端。
延伸单元200，所述延伸单元200与所述尾部连接单元100相连，并且用于基于所述具有Poly(C)尾部的单链DNA分子，获得双链DNA分子，其中，延伸引物在其3’末端包括H(G)m单元，H为碱基A、碱基T或碱基C，m为碱基G的数目，并且m为5～15之间的整数。根据本发明实施例，所述延伸单元中可以设置有KAPA2GRobustHS，以便获得所述双链DNA分子。根据本发明实施例，所述延伸引物可以由SEQIDNO：1所示的核苷酸构成。根据本发明实施例，所述延伸单元中设置的所述延伸引物，可以具有筛选标记，其中，所述筛选标记形成于所述延伸引物的5’末端。根据本发明具体示例，所述筛选标记为生物素。
接头连接单元300，接头连接单元300与所述延伸单元200相连，并且用于在所述双链DNA分子远离H(G)m单元的一端连接接头。根据本发明实施例，所述接头连接单元300可以进一步包括：半接头形成模块，将分别由SEQIDNO：2-3所示核苷酸序列的单链核酸分子进行退火，以便获得半接头；以及连接模块，所述连接模块用于将所述半接头与所述双链DNA分子进行连接，以便获得连接有半接头的双链DNA分子。由此，将半接头连接至双链DNA分子远离H(G)m单元的一端，有效地避免接头序列过长降低连接效率。
以及扩增单元400，所述扩增单元400与所述接头连接单元300相连，并且用于对所述接头连接单元300的连接产物进行扩增，以便获得扩增产物，所述扩增产物构成所述测序文库。根据本发明实施例，扩增的方式不受特别的限制，可以根据需要采用一轮PCR或多轮PCR。例如，本装置采用两轮PCR，第一轮PCR，利用由SEQIDNO：4-5所示的核苷酸作为引物，对所述连接有半接头的双链DNA分子进行扩增，由此，DNA分子的扩增效率高；第二轮PCR，根据本发明实施例，所述扩增单元中，采用包含标签序列的引物，对所述连接产物进行扩增，由此，能在一次高通量测序中测多个不同的样品。例如，在DNA文库的一端被加上了可区别的索引序列标签，该文库可用于Illumina高通量测序的标准文库样本的建立。根据本发明实施例，序列标签的具体序列不受特别的限制，可以根据自己的需要进行设计，只要能区分序列来源即可。并且根据本发明的具体示例，采用如表1中SEQIDNO:8～19任一项所示的核苷酸构成的PCR引物作为标签PCR引物。由此，可以方便地同时构建多种样本的基因测序文库，并能够有效地应用于高通量测序平台，从而在对测序结果进行数据分析后，基于标签的序列信息，能够准确地区分多种样本的基因测序文库的序列信息，进而，能够充分地利用高通量测序平台，且能够节省时间、降低成本。
本领域技术人员能够理解的是，可以采用本领域中已知的任何适于进行上述操作的装置作为上述各个单元的组成部件。在本文中所使用的术语“相连”应作广义理解，可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。
利用根据本发明实施例的用于基于单链DNA构建测序文库的装置，能够利用微量单链DNA样品进行测序文库的构建，并且保留了DNA链的特异性，样品损失少，基因信息保持完整，而且能应用于细胞的全基因组甲基化DNA文库的构建。
根据本发明实施例，本装置可以进一步包括下述单元的任一种或多种：逆转录单元、变性单元、片段打断单元、产物筛选单元、末端修复单元、免疫共沉淀单元以及纯化单元。根据样本的具体情况采用不同单元，按照步骤对样本处理，构建测序文库，参考图7B，具体过程如下：
首先，对样本进行处理，获得的用于建库的单链DNA的一系列单元。根据本发明实施例，单链DNA的来源不受特别限制。样本若为RNA，采用逆转录单元1200，对RNA进行逆转录，以便获得所述单链DNA分子；样本若为细胞，则需裂解细胞释放染色质，从染色质中提取DNA，采用免疫共沉淀单元600，通过染色质免疫共沉淀而获得所述双链DNA样本。片段打断单元700与免疫共沉淀单元600相连，若样本为全基因组DNA或长链DNA，以及免疫共沉淀单元600获得的双链DNA，采用片段打断单元700对DNA进行随机打断，以便获得的所述双链DNA样本。根据本发明实施例，随机打断的方式不受特别限制，根据本发明具体示例，所述随机打断单元700是通过超声打断进行所述打断的。然后，末端修复单元800与片段打断单元700相连，利用末端修复单元800在所述随机打断之后，对所述随机打断的产物进行末端修复处理。接下来根据需要可以通过筛选获得目的片段，根据本发明实施例，获得目的片段的手段不受特别限制，只要能获得目的片段即可，例如，产物筛选单元900与末端修复单元800相连，利用产物筛选单元900在所述随机打断之后，利用探针对所述随机打断的产物进行筛选，以便获得目的片段。最后，变性单元与产物筛选单元900相连，采用变性单元1100对双链DNA进行变性，以便获得所述单链DNA分子。根据本发明实施例，变性的方式不受特别的限制。根据本发明具体示例，通过对双链DNA样本进行热变性而获得所述单链DNA，以便高效地获得单链DNA，并且对DNA分子的损伤小。
然后，尾部连接单元100与变性单元1100和逆转录单元1200相连，在变性单元1100和逆转录单元1200获得的单链DNA分子的3’末端形成poly(C)n尾部的单元。根据本发明实施例，在所述尾部连接单元中设置有末端转移酶，以便高效地将poly(C)n尾部连接至单链DNA分子的3’末端。
接下来，基于所述具有Poly(C)n尾部的单链DNA分子，获得双链DNA分子的一系列单元。根据本发明具体示例。延伸单元200中可以设置有KAPA2GRobustHS，以便获得所述双链DNA分子。由此，DNA延伸的效率高，准确性好。根据本发明实施例，延伸引物的序列不受特别的限制，只要能保证DNA延伸能够进行即可。根据本发明具体示例，所述延伸引物可以由SEQIDNO：1所示的核苷酸构成。由此，易于与poly(C)n尾部配对，促进延伸反应进行。根据本发明实施例，用于DNA链延伸的DNA聚合酶的不受特别的限制。进一步地，根据本发明实施例，所述延伸单元中设置的所述延伸引物，具有筛选标记，其中，所述筛选标记形成于所述延伸引物的5’末端。根据本发明具体示例，所述筛选标记为生物素。
再次，接头连接单元300与延伸单元200相连，利用接头连接单元300在所述双链DNA分子远离H(G)m单元的一端连接接头。根据本发明实施例，所述接头连接单元可以进一步包括：半接头形成模块，将分别由SEQIDNO：2-3所示核苷酸序列的单链核酸分子进行退火，以便获得半接头；以及连接模块，所述连接模块用于将所述半接头与所述双链DNA分子进行连接，以便获得连接有半接头的双链DNA分子。根据本发明实施例，本装置可以进一步包括：纯化单元500，纯化单元500与接头连接单元300相连，所述纯化单元500对所述连接有接头的双链DNA分子进行纯化，其中，所述纯化是利用特异性识别生物素的珠子进行的。根据本发明具体示例，所述珠子可以为磁珠，其中，所述磁珠上连接有链霉亲和素。根据本发明实施例，纯化单元500可以进一步包含洗脱模块，所述洗脱模块利用超纯蒸馏水72摄氏度加热，将与珠子结合的连接有接头的双链DNA分子进行分离。由此，含有连接有半接头的双链DNA分子的洗脱液可直接加入扩增单元400中，进行扩增，减少中间操作步骤，避免DNA损失。
最后，所述扩增单元400与所述纯化单元500相连，用于对纯化后的连接有半接头的双链DNA分子进行扩增，以便获得扩增产物，所述扩增产物构成所述测序文库。根据本发明实施例，扩增的方式不受特别的限制，可以根据需要采用一轮PCR或多轮PCR。例如，本装置采用两轮PCR，第一轮PCR，利用由SEQIDNO：4-5所示的核苷酸作为引物，对所述连接有半接头的双链DNA分子进行扩增，由此，DNA分子的扩增效率高；第二轮PCR，根据本发明实施例，所述扩增单元中，采用包含标签序列的引物，对所述连接产物进行扩增，由此，能在一次高通量测序中测多个不同的样品。例如，在DNA文库的一端被加上了可区别的索引序列标签，该文库可用于Illumina高通量测序的标准文库样本的建立。并且根据本发明的具体示例，采用如表1中SEQIDNO:8～19任一项所示的核苷酸构成的PCR引物作为标签PCR引物。
关于这些装置所实施处理的优点，前面已经进行了详细描述，在此不再详述。本领域技术人员能够理解的是，可以采用本领域中已知的任何适于进行上述操作的装置作为上述各个单元的组成部件。在本文中所使用的术语“相连”应作广义理解，可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。
利用根据本发明实施例的用于基于单链DNA构建测序文库的装置，能够通过RNA逆转录，和免疫共沉淀获得的双链DNA变性获得单链DNA，利用获得的单链DNA样品进行测序文库的构建，并且保留了DNA链的特异性，样品损失少，基因信息保持完整，而且能应用于细胞的全基因组甲基化DNA文库的构建。
确定单链DNA分子的序列信息的方法和***
根据本发明的一个方面，本发明提出了一种确定单链DNA分子的序列信息的方法。根据本发明实施例，该方法可以包括：基于所述单链DNA分子，根据本发明实施例前述方法构建测序文库；对所述测序文库进行测序，以便获得测序结果；以及基于所述测序结果，确定所述单链DNA分子的序列信息。关于构建测序文库，前面已经进行了详细描述，在此不再赘述。根据本发明的实施例，对测序文库进行测序的方法和装置不受特别限制，考虑到技术的成熟度，根据本发明的实施例，可以采用第二代测序技术，诸如SOLEXA、SOLID和454测序技术。当然，也可以采用正在开发或者尚未开发的新型测序技术，例如单分子测序技术，诸如：Helicos公司的TrueSingleMoleculeDNAsequencing技术，PacificBiosciences公司的thesinglemolecule，real-time(SMRT.TM.)技术，以及OxfordNanoporeTechnologies公司的纳米孔测序技术等(Rusk,Nicole(2009-04-01).CheapThird-GenerationSequencing.NatureMethods6(4):244–245)。
发明人惊奇地发现，利用根据本发明实施例的确定单链DNA分子的序列信息的方法，能够灵敏、准确、高效地确定微量样本单链DNA分子的序列信息，并且能应用于细胞的全基因组甲基化DNA分子，从而实现对样品的全基因组或特定区域基因组的甲基化检测。
根据本发明的又一方面，本发明提供了一种确定单链DNA序列信息的***10000。根据本发明实施例，参考图8，该***可以包括：测序文库构建装置1000，采用本发明实施例前述方法制备样本基因的测序文库；测序装置2000，所述测序装置2000与所述测序文库制备装置1000相连，以便用于对所述样本的基因测序文库进行测序，获得所述样本DNA的测序结果；以及分析装置3000，对所述样本DNA的测序结合进行分析，以便获得所述单链DNA序列信息。
本领域技术人员能够理解的是，可以采用本领域中已知的任何适于进行上述操作的装置作为上述各个单元的组成部件。在本文中所使用的术语“相连”应作广义理解，可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。
发明人惊奇地发现，采用根据本发明实施例的确定单链DNA分子的序列信息的***，能够灵敏、准确、高效地确定微量样本单链DNA分子的序列信息，并且可以应用该***对全基因组甲基化DNA分子的序列进行分析，从而实现对样品的全基因组或特定区域基因组的甲基化检测。
确定RNA、染色质和基因组甲基化样本的序列信息的方法
根据本发明的再一方面，本发明提供了一种确定RNA样本的序列信息的方法。根据本发明实施例，参考图9，该方法可以包括：对RNA样本进行反转录，以便获得单链DNA分子；基于所述单链DNA分子，通过根据根据本发明实施构建测序文库的方法，构建测序文库；对所述测序文库进行测序；以及基于所述测序结果，确定所述RNA样本的序列信息。
发明人惊奇地发现，利用根据本发明实施例的确定RNA样本的序列信息的方法，能够灵敏、准确、高效地确定微量样本单链DNA分子的序列信息，从而实现对样本的基因组的检测。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种用于确定染色质目标区域的序列信息的方法。根据本发明实施例，参考图10，该方法可以包括：将染色质进行随机打断，以便获得长度为200bp～500bp的染色质样本；利用抗体对所述染色质进行染色质免疫共沉淀，所述抗体特异性识别所述目标区域，以便获得包含所述目标区域的双链DNA样本；对所述包含所述目标区域的双链DNA样本，进行变性处理，以便得到单链DNA分子；基于所述单链DNA分子，通过根据根据本发明实施构建测序文库的方法，构建测序文库；对所述测序文库进行测序；以及基于所述测序结果，确定所述染色质目标区域的序列信息。
发明人惊奇地发现，利用根据本发明实施例的确定染色质目标区域的序列信息的方法，能够灵敏、准确、高效地确定微量样本确定染色质目标区域的序列信息，从而实现对染色质样本的基因组目标区域的检测。
根据本发明的又一方面，本发明提供了一种用于获得基因组甲基化信息的方法。根据本发明实施例，参考图11，该方法可以包括：将全基因组的至少一部分进行重亚硫酸盐处理，以便将所述全基因组中的碱基中非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，并且获得经过转换的基因组样本；将所述基因组样本进行随机打断，以便获得长度为200bp～500bp的双链DNA样本；对所述包含所述目标区域的双链DNA样本，进行变性处理，以便得到单链DNA分子；基于所述单链DNA分子，通过根据根据本发明实施构建测序文库的方法，构建测序文库；对所述测序文库进行测序；以及基于所述测序结果，确定基因组甲基化信息。
发明人惊奇地发现，利用根据本发明实施例的确定基因组甲基化信息的方法，能够准确地确定样本全基因组或者特定区域基因组的甲基化信息，从而实现对样本全基因组或者特定区域基因组的甲基化检测。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品，例如可以采购自Illumina公司。
实施例
在下面实施例中使用了下列引物
实施例1构建测序文库
1、用于建库的DNA先于Qubitfluorometer(Invitrogen，Q32857)准确定量。若是双链DNA，则用QubitdsDNAHSassaykit(Invitrogen，Q32854)定量；单链DNA，则用QubitssDNAHSassaykit(Invitrogen，Q10212)定量。对于建库的DNA可用25pg--10ng作为起始量，然后按照以下所述的TELP标准化建库步骤进行。
若是机械打断(如超声打断)的少量双链DNA(如ChIP-SeqDNA)，先要对机械损伤的DNA的5’端和3’端进行末端修复，反应体系为：32.6μlDNA样品，4μl10xT4ligase缓冲液(NEB，B0202S)，1.6μl10mMdNTPmix(NEB，N0447S)，0.8μlT4PNK(NEB，M0201S)，0.8μlT4DNA聚合酶(NEB，M0203S)和0.16μlKlenowfragment(NEB，M0210S)充分混匀，20℃条件下反应30min。产物用MinElutePCRpurificationkit(Qiagen，28006)进行纯化。
DNA末端修复反应的反应体系和反应条件总结于下表中
2、尾部连接：DNA3’端添加若干个胞嘧啶脱氧核苷酸(Poly-C)
在末端转移酶(TdT)的作用下，DNA链的3’末端能连上若干个(实际约为20个)多聚胞嘧啶脱氧核苷酸(Poly-C)，反应过程为：预先混合28μlDNA溶液，1μl10xEX缓冲液(Takara，suppliedwithRR006A)，1μl1mMdCTP(NEB，N0446S)，高温使DNA变性。接着加入1μl末端转移酶(TdT；NEB，M0315S)，并在37℃条件下反应35min。反应结束后，加热至75°保持20min以使TdT失活。
尾部连接反应的反应体系以及反应条件总结于下表中：
3、链延伸反应：3’端带有Poly-C的单链DNA经过一次延伸反应行成双链DNA
加有Poly-C结构的DNA需要再经过一次延伸，能够得到可用的双链DNA，反应体系为：来自于上一步TdT反应的产物，加入6.2μl水，0.8μlKAPA2GRobustHS(KAPA，KK5515)，12μl5xKAPA缓冲液A(KAPA，KK5515)，4.8μl2.5mMdNTP(Takara，RR006A)，6μl2μM带有生物素(biotin)的延伸引物(biotin-labeledanchorprimer)。其中的延伸引物设计在3’端有9个连续的鸟嘌呤脱氧核苷酸(G)以及一个H(H代表A、T或C)，以此来确保引物能在Poly-C上的合适位置起始退火配对。延伸反应的程序为：(1)95℃3min；(2)47℃1min，68℃2min，16个循环；(3)72℃10min。反应结束后，再加入核酸外切酶I(ExoI)于37℃反应1小时，消化掉多余的延伸引物。
预先用1xBinding&Wash(B&W)缓冲液(10mMTris-HClpH8.0，0.5mMEDTA，1MNaCl)清洗magneticstreptavidinC1磁珠(Invitrogen，650.01)，然后和延伸后的产物混合后在温控混匀仪上的孵育，条件为：23℃1400rpm震荡(10secon，10secoff)30min。反应结束后，结合了DNA的磁珠用100μl1xB&W缓冲液洗一次，150μlEBT缓冲液(10mMTris-HClpH8.0，0.02％TritonX-100)洗三次，最后用8.4μl洗缓冲液(EB；10mMTris-HCl，pH8.0)重悬，用于之后的连接反应。
链延伸反应的反应体系和反应条件总结于下表
磁珠分离条件总结于下表：
4、在另一端接上接头
先用Adp_A和Adp_B退火形成用于连接的接头，这两个引物的3’端都有磷酸基团修饰以防止其自连。连接反应的条件为：将1μlQuick连接酶(NEB，M2200L)，10μl2xQuickligation缓冲液，8.4μl重悬的结合有延伸产物的磁珠以及0.6μl10mM接头，充分混匀。将EP管置于旋转培养器上以防磁珠沉降，整个反应在4℃条件下过夜进行(约15小时)。次日，连接产物先于100μl1xB&W缓冲液洗一次，再用150μlEBT缓冲液洗三次。最后用30μl的含有0.02％TritonX-100的水重悬磁珠，于温控混匀仪上1400rpm震荡(10secon，10secoff)、65℃洗脱30min。
连接反应的反应体系和反应条件总结于下表：
4.1.4PCR(扩增)：利用两步PCR反应把完整的接头序列连接到DNA两端
a、第一轮PCR反应体系：
按照下列体系和条件进行第一轮PCR反应以便获得最终测序文库。
有时，为了能在一次高通量测序中测多个不同的样品，我们需要在DNA文库上加入不同的索引(Index)序列标签进行区别。由此，通过第二轮PCR反应，DNA文库的一端被加上了可区别的索引序列标签，至此便完成了可用于Illumina高通量测序的标准文库样本的建立。
关于第二轮PCR反应的反应体系和反应条件总结于下表：
实施例2RNA-Seq(cDNA测序)
按照与实施例1相同的步骤实施本实施例，只是区别在于：
细胞总RNA用TRIzolreagent(Invitrogen)提取，microPoly(A)PuristKit(Ambion,，AM1919)纯化后，用DNaseI消化掉多余DNA，用Poly-Tprimer(T18)和M-MLVReverseTranscriptase(Invitrogen)进行反转录。超声打断到合适的长度后，加入RNaseA消化掉RNA模板链，留下cDNA链，纯化后得到单链cDNA。此时，此单链cDNA即可用TELP技术进行标准化建库(单链DNA可跳过末端修复这一步骤，直接进行Tailing及以下的步骤)，从而保留了链的特异性。
实施例3ChIP-Seq(染色质免疫共沉淀测序)
按照与实施例1相同的步骤实施本实施例，只是区别在于：
用于ChIP的细胞先经过1％甲醛37℃条件下交联10min，裂解细胞使染色质释放。经过超声打断到200-500bp片段大小。对于每个ChIP反应，加入2-5μg相应的抗体，于4℃条件下孵育过夜。最后得到富集后的双链DNA片段，用Qubit定量后，取一定量的DNA进行TELP标准化建库。对于此ChIP-Seq的应用，建库步骤完全与实施例1所描述的相同，我们的实验证明能用此方法能成功高效地针对低至25pg-1ng的DNA建立标准文库。
实施例4Whole-GenomeMethyl-Seq(甲基化测序)
1、细胞全基因组DNA提取
首先，用直径20μm的口吸管在解剖镜下挑选状态良好的细胞，置于干净的PCR管底部并保证管内液体体积不超过0.5μl，以便提取细胞基因组DNA。向管中加入20μlCellLysis缓冲液(Qiagen，158908)，同时按1：30质量体积比加入RNaseA(Roch，10109169001)，混匀后于37℃孵育过夜。次日，向体系中加入1/3体积比的ProteinPrecipitate缓冲液(Qiagen，158912)，剧烈震荡20s使DNA从蛋白上洗脱下来，此时会出现大量白沫。再于14000rpm、室温条件下离心10min，于冰上放置5min，此时能在管底看到明显的白色蛋白质沉淀，而DNA存在于上清中。取上清，加入20μl异丙醇，充分混匀直至不再产生絮状物，再加入少量RNA-Free的糖原以定位DNA。之后再14000rpm、室温条件下离心10min，DNA会以白色或半透明状存在于管底。去上清，加入80％乙醇溶液漂洗，14000rpm室温离心5min。重复80％乙醇漂洗一次，室温烘干若干分钟后，加入20μl去离子水溶解DNA。
2、重亚硫酸盐转化未甲基化的胞嘧啶
向20μlDNA溶液中加入130μl配制好的重亚硫酸盐(bisulfite)试剂(EZDNAMethylation-DirectTMKit提供，D5020)，并同时参入1：200的λDNA用于检测甲基化转化率。反应条件为：98℃8min，64℃3.5h。反应后的产物可在4℃保存(可长至20小时)。向纯化柱中加入600μlM-Binding缓冲液，再加入上一步反应产物，颠倒混匀数次后离心。用100μlM-Wash缓冲液洗一次，向离心柱中加入200μlM-Desulphonation缓冲液，室温下(20-30℃)反应15-20min。
反应结束后，离心去废液，用200μlM-Wash缓冲液洗两次。稍干片刻，加入10μlElution缓冲液和40μl去离子水分别洗脱DNA，最后得到50μlDNA溶液(此时DNA为由于不能配对，以单链形式存在于溶液中)。
3、Covaris超声破碎DNA
将上步的50μlDNA溶液转移至Covaris微量超声管中，根据以下参数选择恰当条件进行超声剪切：
目标峰值(bp) 150 200 250 300 350 400 500 800
能量(W) 50 50 50 50 50 50 50 50
负载 20％ 20％ 20％ 20％ 20％ 20％ 20％ 20％
循环脉冲 200 200 200 200 200 200 200 200
处理时间(s) 375 175 120 80 65 50 32 25
温度(℃) 20 20 20 20 20 20 20 20
样品体积(μl) 50 50 50 50 50 50 50 50
4、按照与实施例1相同的步骤实施本实施例，只是区别在于：
采用一步PCR反应完成完整索引序列的添加，且此PCR反应所用的DNA聚合酶为KAPA2GHS。PCR反应条件为：
完成PCR扩增后，再加入2μlExoI和6μl10xExoI缓冲液消化掉多余的引物。此时拿到的连有接头的DNA的长度在200-700bp，为了去掉大于400bp的片段以及PCR过程中可能产生的引物二聚体，我们选择用AmpureXPbeads来筛选一定大小的目的片段，具体参数见下表：
最后把DNA洗脱于20μl去离子水中，取1μl稀释100倍后用KAPA定量试剂盒测定样品的摩尔浓度，取1μl用于Agilent2100检测片段的平均长度。准确定量后于Illumina高通量平台深度测序，测序结果显示文库构建成功。
实施例5Specific-RegionMethyl-Seq(特定区域的甲基化测序)
首先，按照实施例4的步骤，提取细胞全基因组DNA，选择适合参数用Covaris把DNA打断成2.5-5kb长的片段。用Qubit定量后，分取至少500ng用于DNA和探针的杂交反应，此时应把DNA浓缩至3.4μl，浓度约为147ng/μL。然后向DNA溶液中加入5.6μL特定区域的探针混合物(一般探针设计为24bp带有Biotin的有特征序列DNA)以及40μL杂交反应缓冲液(100mMTris-HClpH7.0，100mMNaCl)。配好杂交混液后，在PCR仪里进行一下反应：95℃5min，65℃24h。此反应可在65℃条件下孵育长至72h，但需保证在此过程中溶液的蒸发损失不超过4μL。预先用1xBinding&Wash(B&W)缓冲液(10mMTris-HClpH8.0，0.5mMEDTA，1MNaCl)清洗magneticstreptavidinC1磁珠(Invitrogen，650.01)，再用上一步杂交反应产物重悬磁珠，用1xBinding&Wash(B&W)调体积于200μL，于室温下1400rpm震荡(10secon，10secoff)孵育30min。反应结束后，结合了DNA的磁珠用100μl1xB&W缓冲液洗一次，150μlEBT缓冲液(10mMTris-HClpH8.0，0.02％TritonX-100)洗三次。最后将捕获的DNA洗脱于20μL洗脱液(H2O+0.02％triton)。
经过特定探针富集后的DNA由重亚硫酸盐(bisulfite)试剂(EZDNAMethylation-DirectTMKit提供，D5020)进行甲基转化。此时所得的DNA片段长度大概在300-500bp，可以直接按照实施例1的方法构建测序文库。准确定量后于Illumina高通量平台深度测序，测序结果显示文库构建成功。
总结
通过实施例1～5验证了我们的实验证明能用能成功高效地针对低至25pg-1ng的DNA建立标准文库。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.一种基于单链DNA分子构建测序文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)在单链DNA分子的3’末端形成poly(C)n尾部，以便获得具有Poly(C)n尾部的单链DNA分子，其中，n代表碱基C的数目，并且n为5～30之间的整数；
(2)利用延伸引物，基于所述具有Poly(C)n尾部的单链DNA分子，获得双链DNA分子，其中，延伸引物在其3’末端包括H(G)m单元，H为碱基A、碱基T或碱基C，m为碱基G的数目，并且m为5～15之间的整数；以及
(3)在所述双链DNA分子远离H(G)m单元的一端连接接头，并对所得到的连接产物进行扩增，以便获得扩增产物，所述扩增产物构成所述测序文库，
可选地，所述单链DNA分子是通过对RNA进行逆转录而获得的，
可选地，所述单链DNA分子是通过对RNA进行逆转录而获得的cDNA分子，
可选地，所述单链DNA分子是通过对双链DNA样本进行变性而获得的，
可选地，所述单链DNA分子是通过对双链DNA样本进行热变性而获得的，
可选地，所述双链DNA样本是通过染色质免疫共沉淀而获得的，
可选地，所述双链DNA样本是通过对DNA样本进行随机打断而获得的，
可选地，在所述随机打断之后，利用探针对所述随机打断的产物进行筛选，
任选地，所述随机打断是通过超声处理进行的，
可选地，在所述随机打断之后，对所述随机打断的产物进行末端修复处理，可选地，所述单链DNA分子的量为≥25pg，任选地，所述单链DNA分子的量为25pg～1000pg，
可选地，所述单链DNA分子的长度为200～500nt，
可选地，n为15～25之间的整数，优选地n为20，
可选地，所述poly(C)n尾部是利用末端转移酶形成的，
可选地，在步骤(2)中，利用KAPA2GRobustHS获得所述双链DNA分子，
可选地，m为9，
可选地，所述延伸引物由SEQIDNO：1所示的核苷酸构成，
可选地，所述延伸引物具有筛选标记，其中，所述筛选标记形成于所述延伸引物的5’末端，
可选地，所述筛选标记为生物素，
可选地，在步骤(3)中，在所述双链DNA分子连接接头之后，进行扩增之前，对所述连接有接头的双链DNA分子进行纯化，其中，所述纯化是利用特异性识别生物素的珠子进行的，
可选地，所述珠子为磁珠，其中，所述磁珠上连接有链霉亲和素，
可选的，通过超纯蒸馏水72摄氏度加热对所述纯化产物进行洗脱，以便获得纯化的接有接头的双链DNA分子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)进一步包括：
(3-1)将分别具有由SEQIDNO：2-3所示核苷酸序列的单链核酸分子进行退火，以便获得半接头；
(3-2)将所述半接头与所述双链DNA分子的一端进行连接，以便获得连接有半接头的双链DNA分子；
(3-3)利用由SEQIDNO：4-7所示的核苷酸作为引物，对所述连接有半接头的双链DNA分子进行扩增，
可选地，通过快速连接酶将所述半接头连接至所述双链DNA分子而获得连接有半接头的双链DNA分子，
可选地，在步骤(3)中，采用包含标签序列的引物，对所述连接产物进行扩增，
可选地，所述含标签序列的引物为一组标签序列引物的一种，其中，所述一组标签序列引物由SEQIDNO：8-19所示的核苷酸构成。
3.一种用于基于单链DNA构建测序文库的装置，其特征在于，包括：
尾部连接单元，所述尾部连接单元用于在单链DNA分子的3’末端形成poly(C)n尾部，以便获得具有Poly(C)n尾部的单链DNA分子，其中，n代表碱基C的数目，并且n为5～30之间的整数；
延伸单元，所述延伸单元与所述尾部连接单元相连，并且用于基于所述具有Poly(C)尾部的单链DNA分子，获得双链DNA分子，其中，延伸引物在其3’末端包括H(G)m单元，H为碱基A、碱基T或碱基C，m为碱基G的数目，并且m为5～15之间的整数；
接头连接单元，所述接头连接单元与所述延伸单元相连，并且用于在所述双链DNA分子远离H(G)m单元的一端连接接头；以及
扩增单元，所述扩增单元与所述接头连接单元相连，并且用于对所述接头连接单元的连接产物进行扩增，以便获得扩增产物，所述扩增产物构成所述测序文库，
可选地，进一步包括：
逆转录单元，所述逆转录单元适于对RNA进行逆转录，以便获得所述单链DNA分子，
可选地，进一步包括：变性单元，所述变性单元适于对双链DNA进行变性，以便获得所述单链DNA分子，
可选地，进一步包括：所述变性单元适于通过对双链DNA样本进行热变性而获得所述单链DNA，
可选地，进一步包括：片段打断单元，所述片段打断单元用于对DNA样本进行随机打断，以便获得的所述双链DNA样本，
可选地，所述打断单元是超声打断装置，
可选地，进一步包括：产物筛选单元，所述产物筛选单元用于在所述随机打断之后，利用探针对所述随机打断的产物进行筛选，以便获得目的片段，
可选地，进一步包括：末端修复单元，所述末端修复单元用于在所述随机打断之后，对所述随机打断的产物进行末端修复处理，
可选地，进一步包括：免疫共沉淀单元，所述免疫共沉淀单元用于，通过染色质免疫共沉淀而获得所述双链DNA样本。
4.根据权利要求3所述的装置，其特征在于，在所述尾部连接单元中设置有末端转移酶，
可选地，所述延伸单元中设置有KAPA2GRobustHS，以便获得所述双链DNA分子，
可选地，所述延伸引物由SEQIDNO：1所示的核苷酸构成，
可选地，所述延伸单元中设置的所述延伸引物，具有筛选标记，其中，所述筛选标记形成于所述延伸引物的5’末端，
可选地，所述筛选标记为生物素。
5.根据权利要求3所述的装置，其特征在于，进一步包括：纯化单元，所述纯化对所述连接有接头的双链DNA分子进行纯化，其中，所述纯化是利用特异性识别生物素的珠子进行的，
可选地，所述珠子为磁珠，其中，所述磁珠上连接有链霉亲和素，
可选地，所述纯化单元进一步包括：洗脱模块，所述洗脱模块利用超纯蒸馏水72摄氏度加热，将与珠子结合的连接有接头的双链DNA分子进行分离，
可选地，所述接头连接单元进一步包括：
半接头形成模块，将分别由SEQIDNO：2-3所示核苷酸序列的单链核酸分子进行退火，以便获得半接头；以及
连接模块，所述连接模块用于将所述半接头与所述双链DNA分子进行连接，以便获得连接有半接头的双链DNA分子，
可选地，所述连接模块内设置有快速连接酶，以便获得连接有半接头的双链DNA分子，
可选地，利用由SEQIDNO：4-7所示的核苷酸作为引物，对所述连接有半接头的双链DNA分子进行扩增，
可选地，所述扩增单元中，采用包含标签序列的引物，对所述连接产物进行扩增，
可选地，所述含标签序列的引物为一组标签序列引物的一种，其中，所述一组标签序列引物由SEQIDNO：8-19所示的核苷酸构成。
6.一种确定单链DNA分子的序列信息的方法，其包括：
基于所述单链DNA分子，根据权利要求1或2所述方法构建测序文库；
对所述测序文库进行测序，以便获得测序结果；以及
基于所述测序结果，确定所述单链DNA分子的序列信息。
7.一种确定单链DNA序列信息的***，其包括
测序文库构建装置，所述测序文库构建装置为权利要求3～5任一项所述的；
测序装置，所述测序装置与所述测序文库制备装置相连，以便用于对所述样本的基因测序文库进行测序，获得所述样本DNA的测序结果；以及
分析装置，对所述样本DNA的测序结合进行分析，以便获得所述单链DNA序列信息。
8.一种确定RNA样本的序列信息的方法，其特征在于，包括：
对RNA样本进行反转录，以便获得单链DNA分子；
基于所述单链DNA分子，通过根据权利要求1或2所述的方法，构建测序文库；
对所述测序文库进行测序；以及
基于所述测序结果，确定所述RNA样本的序列信息。
9.一种用于确定染色质目标区域的序列信息的方法，其特征在于，包括：
将染色质进行随机打断，以便获得长度为200bp～500bp的染色质样本；
利用抗体对所述染色质样本进行染色质免疫共沉淀，所述抗体特异性识别所述目标区域，以便获得包含所述目标区域的双链DNA样本；
对所述包含所述目标区域的双链DNA样本，进行变性处理，以便得到单链DNA分子；
基于所述单链DNA分子，通过根据权利要求1或2所述的方法，构建测序文库；
对所述测序文库进行测序；以及
基于所述测序结果，确定所述染色质目标区域的序列信息。
10.一种用于确定基因组甲基化信息的方法，其特征在于，包括：
将全基因组的至少一部分进行重亚硫酸盐处理，以便将所述全基因组中的碱基中非甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，并且获得经过转换的基因组样本；
将所述基因组样本进行随机打断，以便获得长度为200bp～500bp的双链DNA样本；
对所述包含所述目标区域的双链DNA样本，进行变性处理，以便得到单链DNA分子；
基于所述单链DNA分子，通过根据权利要求1或2所述的方法，构建测序文库；
对所述测序文库进行测序；以及
基于所述测序结果，确定所述基因组甲基化序列信息。
CN201410466261.2A 2014-09-12 2014-09-12 基于单链dna分子构建测序文库的方法及其应用 Active CN105463585B (zh)

Priority Applications (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410466261.2A CN105463585B (zh) 2014-09-12 2014-09-12 基于单链dna分子构建测序文库的方法及其应用
US15/503,428 US10400279B2 (en) 2014-09-12 2015-08-31 Method for constructing a sequencing library based on a single-stranded DNA molecule and application thereof
PCT/CN2015/088680 WO2016037537A1 (en) 2014-09-12 2015-08-31 Method for constructing a sequencing library based on a single-stranded dna molecule and application thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410466261.2A CN105463585B (zh) 2014-09-12 2014-09-12 基于单链dna分子构建测序文库的方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105463585A true CN105463585A (zh) 2016-04-06
CN105463585B CN105463585B (zh) 2018-04-20

Family

ID=55458341

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410466261.2A Active CN105463585B (zh) 2014-09-12 2014-09-12 基于单链dna分子构建测序文库的方法及其应用

Country Status (3)

Country Link
US (1) US10400279B2 (zh)
CN (1) CN105463585B (zh)
WO (1) WO2016037537A1 (zh)

Cited By (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105754995A (zh) * 2016-04-19 2016-07-13 清华大学 构建待测基因组的dna测序文库的方法及其应用
CN106987585A (zh) * 2017-03-15 2017-07-28 深圳市海普洛斯生物科技有限公司 一种针对cfDNA的单链DNA二代测序文库构建方法
CN107022622A (zh) * 2017-05-04 2017-08-08 河海大学常州校区 一种基于长链非编码rna的分子标记物鉴定方法
CN107904668A (zh) * 2018-01-02 2018-04-13 上海美吉生物医药科技有限公司 一种微生物多样性文库构建方法及其应用
CN108166068A (zh) * 2018-01-02 2018-06-15 上海美吉生物医药科技有限公司 一种新型dna建库试剂盒及其应用
CN108203847A (zh) * 2016-12-16 2018-06-26 深圳华大智造科技有限公司 用于二代测序质量评估的文库、试剂及应用
CN108315824A (zh) * 2017-01-16 2018-07-24 刘月星 一种rna高通量测序文库的构建方法
CN108315320A (zh) * 2017-01-16 2018-07-24 李辉辉 一种rna高通量测序文库的制备方法
WO2019052322A1 (zh) * 2017-09-18 2019-03-21 苏州吉赛基因测序科技有限公司 一种基于高通量测序分析寡核苷酸序列杂质的方法及应用
CN110305946A (zh) * 2019-07-18 2019-10-08 重庆大学附属肿瘤医院 基于高通量测序的dna甲基化检测方法
CN110551794A (zh) * 2018-06-04 2019-12-10 完整基因有限公司 对rna分子进行处理的方法及试剂盒和复合体
CN110607353A (zh) * 2019-08-29 2019-12-24 上海英基生物科技有限公司 一种利用高效地连接技术快速制备dna测序文库的方法和试剂盒
CN110734908A (zh) * 2019-11-15 2020-01-31 福州福瑞医学检验实验室有限公司 高通量测序文库的构建方法以及用于文库构建的试剂盒
CN110791813A (zh) * 2018-08-01 2020-02-14 广州华大基因医学检验所有限公司 对单链dna进行处理的方法及应用
CN111074353A (zh) * 2018-10-18 2020-04-28 深圳华大智造科技有限公司 全基因组甲基化文库单链建库方法和得到的全基因组甲基化文库
CN111455469A (zh) * 2020-04-07 2020-07-28 深圳易倍科华生物科技有限公司 一种单链快速建库方法及建库仪器
CN111575347A (zh) * 2020-05-19 2020-08-25 清华大学 构建用于同时获得血浆中游离dna甲基化和片段化模式信息的文库的方法
CN112680796A (zh) * 2021-01-18 2021-04-20 深圳市睿法生物科技有限公司 一种靶标基因富集建库方法
WO2021184146A1 (zh) * 2020-03-16 2021-09-23 深圳华大智造科技有限公司 一种待测样本rna的测序文库的构建方法
WO2023240610A1 (zh) * 2022-06-17 2023-12-21 深圳华大智造科技股份有限公司 单链核酸分子测序文库构建方法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108588197A (zh) * 2018-06-14 2018-09-28 珠海市人民医院 一种检测痕量单链dna片段的方法
CN110760936B (zh) * 2018-07-26 2023-04-28 深圳华大生命科学研究院 构建dna甲基化文库的方法及其应用
JP2022548000A (ja) * 2019-09-11 2022-11-16 パランカ・リミテッド シーケンシングライブラリーの多重製造方法
EP4077716A1 (en) * 2019-12-20 2022-10-26 William Marsh Rice University Methods for extracting and sequencing single-stranded dna and rna from non-treated biospecimens
CN111979583B (zh) * 2020-09-10 2023-09-12 杭州求臻医学检验实验室有限公司 一种单链核酸分子高通量测序文库的构建方法及其应用
CN113774496A (zh) * 2021-10-11 2021-12-10 湖南大地同年生物科技有限公司 一种液相捕获文库构建方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004081225A2 (en) * 2003-03-07 2004-09-23 Rubicon Genomics, Inc. Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a dna polymerization process
US20100035249A1 (en) * 2008-08-05 2010-02-11 Kabushiki Kaisha Dnaform Rna sequencing and analysis using solid support
US20120157343A1 (en) * 2000-03-09 2012-06-21 Genetag Technology, Inc. System and Methods to Quantify and Amplify Both Signaling and Probes for cDNA Chips and Gene Expression Microarrays

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20120157343A1 (en) * 2000-03-09 2012-06-21 Genetag Technology, Inc. System and Methods to Quantify and Amplify Both Signaling and Probes for cDNA Chips and Gene Expression Microarrays
WO2004081225A2 (en) * 2003-03-07 2004-09-23 Rubicon Genomics, Inc. Amplification and analysis of whole genome and whole transcriptome libraries generated by a dna polymerization process
US20100035249A1 (en) * 2008-08-05 2010-02-11 Kabushiki Kaisha Dnaform Rna sequencing and analysis using solid support

Cited By (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105754995B (zh) * 2016-04-19 2019-03-29 清华大学 构建待测基因组的dna测序文库的方法及其应用
WO2017181880A1 (zh) * 2016-04-19 2017-10-26 清华大学 构建待测基因组的dna测序文库的方法及其应用
CN105754995A (zh) * 2016-04-19 2016-07-13 清华大学 构建待测基因组的dna测序文库的方法及其应用
CN108203847B (zh) * 2016-12-16 2022-01-04 深圳华大智造科技股份有限公司 用于二代测序质量评估的文库、试剂及应用
CN108203847A (zh) * 2016-12-16 2018-06-26 深圳华大智造科技有限公司 用于二代测序质量评估的文库、试剂及应用
CN108315824A (zh) * 2017-01-16 2018-07-24 刘月星 一种rna高通量测序文库的构建方法
CN108315320A (zh) * 2017-01-16 2018-07-24 李辉辉 一种rna高通量测序文库的制备方法
CN106987585A (zh) * 2017-03-15 2017-07-28 深圳市海普洛斯生物科技有限公司 一种针对cfDNA的单链DNA二代测序文库构建方法
CN106987585B (zh) * 2017-03-15 2019-11-12 深圳市海普洛斯生物科技有限公司 一种针对cfDNA的单链DNA二代测序文库构建方法
CN107022622A (zh) * 2017-05-04 2017-08-08 河海大学常州校区 一种基于长链非编码rna的分子标记物鉴定方法
CN109517889A (zh) * 2017-09-18 2019-03-26 苏州吉赛基因测序科技有限公司 一种基于高通量测序分析寡核苷酸序列杂质的方法及应用
JP7034299B2 (ja) 2017-09-18 2022-03-11 蘇州吉賽基因測序科技有限公司 ハイスループットシークエンシングに基づくオリゴヌクレオチド配列不純物の分析方法及び使用
WO2019052322A1 (zh) * 2017-09-18 2019-03-21 苏州吉赛基因测序科技有限公司 一种基于高通量测序分析寡核苷酸序列杂质的方法及应用
CN109517889B (zh) * 2017-09-18 2022-04-05 苏州吉赛基因测序科技有限公司 一种基于高通量测序分析寡核苷酸序列杂质的方法及应用
US11597922B2 (en) 2017-09-18 2023-03-07 Suzhou Genesci Co., Ltd Method for analyzing impurities of oligonucleotide sequence based on high-throughput sequencing and application
JP2020534868A (ja) * 2017-09-18 2020-12-03 蘇州吉賽基因測序科技有限公司 ハイスループットシークエンシングに基づくオリゴヌクレオチド配列不純物の分析方法及び使用
CN108166068A (zh) * 2018-01-02 2018-06-15 上海美吉生物医药科技有限公司 一种新型dna建库试剂盒及其应用
CN107904668A (zh) * 2018-01-02 2018-04-13 上海美吉生物医药科技有限公司 一种微生物多样性文库构建方法及其应用
CN110551794B (zh) * 2018-06-04 2023-05-30 完整基因有限公司 对rna分子进行处理的方法及试剂盒和复合体
CN110551794A (zh) * 2018-06-04 2019-12-10 完整基因有限公司 对rna分子进行处理的方法及试剂盒和复合体
CN110791813A (zh) * 2018-08-01 2020-02-14 广州华大基因医学检验所有限公司 对单链dna进行处理的方法及应用
CN110791813B (zh) * 2018-08-01 2023-06-16 广州华大基因医学检验所有限公司 对单链dna进行处理的方法及应用
CN111074353A (zh) * 2018-10-18 2020-04-28 深圳华大智造科技有限公司 全基因组甲基化文库单链建库方法和得到的全基因组甲基化文库
CN111074353B (zh) * 2018-10-18 2023-10-13 深圳华大智造科技股份有限公司 全基因组甲基化文库单链建库方法和得到的全基因组甲基化文库
CN110305946A (zh) * 2019-07-18 2019-10-08 重庆大学附属肿瘤医院 基于高通量测序的dna甲基化检测方法
CN110607353B (zh) * 2019-08-29 2022-11-22 上海英基生物科技有限公司 一种利用高效地连接技术快速制备dna测序文库的方法和试剂盒
CN110607353A (zh) * 2019-08-29 2019-12-24 上海英基生物科技有限公司 一种利用高效地连接技术快速制备dna测序文库的方法和试剂盒
CN110734908A (zh) * 2019-11-15 2020-01-31 福州福瑞医学检验实验室有限公司 高通量测序文库的构建方法以及用于文库构建的试剂盒
CN110734908B (zh) * 2019-11-15 2021-06-08 福州福瑞医学检验实验室有限公司 高通量测序文库的构建方法以及用于文库构建的试剂盒
WO2021184146A1 (zh) * 2020-03-16 2021-09-23 深圳华大智造科技有限公司 一种待测样本rna的测序文库的构建方法
CN111455469B (zh) * 2020-04-07 2023-08-18 深圳易倍科华生物科技有限公司 一种单链快速建库方法及建库仪器
CN111455469A (zh) * 2020-04-07 2020-07-28 深圳易倍科华生物科技有限公司 一种单链快速建库方法及建库仪器
CN111575347A (zh) * 2020-05-19 2020-08-25 清华大学 构建用于同时获得血浆中游离dna甲基化和片段化模式信息的文库的方法
CN112680796A (zh) * 2021-01-18 2021-04-20 深圳市睿法生物科技有限公司 一种靶标基因富集建库方法
WO2023240610A1 (zh) * 2022-06-17 2023-12-21 深圳华大智造科技股份有限公司 单链核酸分子测序文库构建方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20170226582A1 (en) 2017-08-10
CN105463585B (zh) 2018-04-20
US10400279B2 (en) 2019-09-03
WO2016037537A1 (en) 2016-03-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN105463585A (zh) 基于单链dna分子构建测序文库的方法及其应用
Zhong et al. High-throughput illumina strand-specific RNA sequencing library preparation
CN107002292B (zh) 一种核酸的双接头单链环状文库的构建方法和试剂
JP6925424B2 (ja) 短いｄｎａ断片を連結することによる一分子シーケンスのスループットを増加する方法
Batut et al. RAMPAGE: Promoter Activity Profiling by Paired‐End Sequencing of 5′‐Complete cDNAs
US11339390B2 (en) DNA microscopy methods
JP2016525344A5 (zh)
CN102181943B (zh) 一种配对双末端文库构建方法及用该文库进行基因组测序的方法
CN105349675B (zh) 基于双酶切的大黄鱼全基因组SNP和InDel分子标记方法
CN101278058A (zh) 使用高通量测序技术对复杂基因组测序的改良策略
CN105648537A (zh) Dna5-甲基胞嘧啶与5-羟甲基胞嘧啶基因图谱测序方法
CN107217309A (zh) 构建待测基因组的dna测序文库的方法及其应用
CN103571822B (zh) 一种用于新一代测序分析的多重目的dna片段富集方法
CN104894233B (zh) 一种多样本多片段dna甲基化高通量测序方法
CN105899682B (zh) 用邻接标签序列复制dna用于基因组和表观基因组测序
CN104630211A (zh) 一种Small RNA cDNA文库的构建方法
CN104947197B (zh) 一种构建高通量测序文库的方法
US10590451B2 (en) Methods of constructing a circular template and detecting DNA molecules
CN105087560A (zh) 一种基于高通量测序构建猪bcr重链文库的多重pcr引物和方法
US20150133310A1 (en) Nucleic acid sequencing systems and methods
WO2018107481A1 (zh) 一种用于核酸样品标识的基因标签、试剂盒及其应用
CN116287124A (zh) 单链接头预连接方法、高通量测序文库的建库方法及试剂盒
KR101648252B1 (ko) 염기서열 확인 과정에서 분리된 핵산 단편들을 회수하는 방법
WO2012037879A1 (zh) 核酸标签及其应用
CN104962551A (zh) 一种焦磷酸测序文库的构建方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant