CN112708662A - 抑制生物dna样本中非目标区域的核苷酸组合物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抑制生物DNA样本中非目标区域的核苷酸组合物及其应用,本发明的核苷酸链组合物特异性与非目标区域结合,使得非目标区域不被非特异性的扩增、识别、捕获等等;或者,核苷酸链组合物特异性与目标区域结合,进一步导致非目标区域被降解或者消除,使得非目标区域不被非特异性的扩增、识别、捕获等等。本发明公开的抑制生物DNA样本中非目标区域的核苷酸链组合物具有杂交速度快、特异性高、单碱基差异识别等优点,特别适用于异种染色质的去除、高度同源区域信息检测、真假基因信息辨别等分子检测领域。
Description
技术领域
本发明属于基因检测技术领域,尤其涉及一种抑制生物DNA样本中非目标区域的核苷酸组合物及其应用。
背景技术
随着科学技术的发展,研究者们越来越意识到,生物DNA样本通常都是一种复杂样本,比如说,唾液样本,大家都知道口腔中是有很多细菌的,还有食物残渣,从唾液样本中提取DNA,会有10%左右的DNA不是人源的;又比如说,血液样本,以前认为血液样本在自然情况下是无菌的,提取出来的DNA自然都是人源的,但是,随着检测技术的发展,分析认识的加深,现在在人类血液样本中的游离DNA中发现有部分游离DNA来自细菌或者其他微生物;即使是纯净的人源基因组DNA,基因组中也会存在极其相似的高度同源区域和假基因区域,更不用说占人类基因组大部分区域的LINE、Alu等常见的重复序列了,由此可见,以生物DNA为检测材料的技术方法都会或多或少面对非目标区域甚至相似物的干扰,本发明公开一种抑制生物DNA样本中非目标区域的核苷酸组合物和方法,适用于DNA核酸检测领域,有助于减少干扰,提高信噪比。
在实际的检测中,获取样本DNA中目标序列的信息通常有两种方式,一种是利用较长序列的寡核苷酸序列进行杂交捕获,比如在二代测序平台中使用的捕获探针,80~120nt长度,这一类探针的主要目的是为了获得与标准参考基因组序列(比如hg19、hg38)具有差异的目标序列,因此,在探针的特异性方面具有比较特殊的设计,即特异性设定得比较低,使其具有较高的差异容忍性,以期捕获到更多的信息,也就是说,对于研究者来说,具有意义的信息是那些与标准参考基因组序列信息不同的信息,比如***或者缺失了20个碱基、单个碱基或者数个碱基的突变等等这样的信息,因此那些依照标准参考基因组序列信息来设计的探针不能具有很强的特异性,如果特异性很强,这个探针就会遗漏掉那些***或者缺失了20个碱基的有意义的目标DNA片段了,可想而知,这些特异性不强的探针是很容易受到相似性较高的非目标序列的干扰的;获取目标序列的信息的另一种方式是利用短探针来获得目标片段的信息,具体来讲,比如荧光淬灭探针、特异性引物等等,这些应用很常规,这些探针引物的特异性比较强,但在实际的应用中,这些短探针严重依赖温度的差异来辨识序列的差异,依然有特异性不足、会引起非特异性扩增以及多重引物共同工作优化困难等特性。本发明公开的抑制非目标区域的核苷酸组合物方案,可以特异性帮助这些引物探针对序列差异的识别能力。
随着技术和分析方法的日益精细化和精确化,人们必然要求一种更精细辨别目标区域的方式,以减少获取目标信息的粗糙度,降低获取目标信息的成本,甚至要求在获取信息的前置阶段就能更准确的分辨目标信息,比如说,在癌症的靶标药物治疗领域,药物和靶标信息是一一对应的,其他不相关的DNA信息就算获得,也无法让医生做出更多的药物决策,病人也无法收益更多,因为药物的种类和适用范围是非常明确和有局限的,这就要求检测技术趋向于获得更具体明确的数据,而不是更广泛的数据,由此可知,同一个药物靶点上,比如EGFR 2390这个位置除了参考序列信息G之外,还可以有A/T/C三种变异方式,而这种三种变异方式,只有G>C和G>A的变化具有指导治疗的意义,而G>T的信息是在目前没有医疗价值的,但是,某些针对这个位置的检测方法,比如Taqman探针法,只能识别出这个G发生了变异,而无法确认是G>C、G>A和G>T的哪一种,这样就容易造成假阳性的结果。
发明内容
为解决上述技术问题,本发明提供一种抑制生物DNA样本中非目标区域的核苷酸组合物,核苷酸链组合物特异性与非目标区域结合,使得非目标区域不被非特异性的扩增、识别、捕获等等;或者,核苷酸链组合物特异性与目标区域结合,进一步导致非目标区域被降解或者消除,使得非目标区域不被非特异性的扩增、识别、捕获等等。
本发明的第一个目的是提供一种抑制生物DNA样本中非目标区域的核苷酸组合物,包括核苷酸链I和核苷酸链II;
其中,所述的核苷酸链I上设有与非目标区域或目标区域特异性结合的第一序列,以及与第一序列相连的第二序列,所述的第一序列和第二序列是针对非目标区域与目标区域的差异序列区域进行设计;
所述的核苷酸链II上设有与非目标区域和目标区域结合的第三序列,以及与第三序列相连的第四序列,所述的第三序列是针对非目标区域与目标区域的差异序列区域的上游序列或下游序列进行设计;
所述的第二序列与第四序列的碱基序列相同,且与非目标区域或目标区域碱基互补配对;
在50mM NaCl、25℃条件下,所述的第一序列的△G°在-23.4~-234.7kcal/mol区间内;第三序列与第四序列的△G°总和在-20.5~-203.9kcal/mol区间内;第二序列或第四序列的△G°在-2.9~-30.8kcal/mol区间内。
进一步地,所述核苷酸链I或核苷酸链II的一端或两端设有用于识别、捕获的功能基团。
进一步地,所述的功能基团为羟基、荧光基团、淬灭基团、生物素基团、氨基、C3spacer、C6 spacer或双脱氧核糖核苷酸。
进一步地,第一序列与非目标区域或目标区域的碱基互补配对程度>=60%;第三序列与非目标区域或目标区域的碱基互补配对程度>=80%。
进一步地,所述的核苷酸链I或核苷酸链II中50%~100%的磷酸二酯键碳被硫代修饰。
进一步地,所述的核苷酸链I和核苷酸链II的浓度比为1:100~100:1。
进一步地,所述的核苷酸链I的浓度为10fg/μL~100mg/μL,核苷酸链II的浓度为10fg/μL~100mg/μL。
本发明的第二个目的是提供所述的核苷酸组合物在抑制生物DNA样本中非目标区域中的应用,所述的应用是在非聚合酶扩增过程中,采用含有核苷酸组合物的体系与生物DNA样本进行杂交反应,阻碍非目标区域被非特异性地扩增、识别或捕获。
进一步地,所述的的体系中还包括0.001%~1%tween-20或者10ng/μL~500ng/μL的Carrier RNA。
进一步地,所述的体系中还包括核酸酶I或核酸外切酶I。
在本发明中,抑制生物DNA样本中非目标区域主要通过空间占位方式或目标区域富集方式进行抑制;空间占位方式是指,核苷酸链组合物特异性地与非目标区域结合,与目标区域的结合有差异、或者结合弱、或者结合数量少,进一步阻碍非目标区域被非特异性地扩增、识别、捕获等等,从而富集、放大、凸显了目标区域的存在;目标区域富集方式是指,核苷酸链组合物特异性与非目标区域结合,进一步导致非目标区域被降解或者消除,使得非目标区域不被非特异性的扩增、识别、捕获等等;或者,核苷酸链组合物特异性与目标区域结合,进一步导致非目标区域被降解或者消除,使得非目标区域不被非特异性的扩增、识别、捕获。
借由上述方案,本发明至少具有以下优点:
本发明公开的抑制生物DNA样本中非目标区域的核苷酸链组合物具有杂交速度快、特异性高、单碱基差异识别等优点,特别适用于异种染色质的去除、高度同源区域信息检测、真假基因信息辨别等分子检测领域。
上述说明仅是本发明技术方案的概述,为了能够更清楚了解本发明的技术手段,并可依照说明书的内容予以实施,以下以本发明的较佳实施例并配合详细说明如后。
附图说明
图1为核苷酸组合物典型结构;
图2在Excel表中实现吉布斯自由能的计算;
图3 PKD1外显子7区域富集实验sanger结果对比图;
图4 PKD1外显子17区域富集实验sanger结果对比图;
图5 PKD1外显子23区域富集实验sanger结果对比图;
图6 PKD1外显子28区域富集实验sanger结果对比图;
图7在不同条件下富集目标区域的sanger结果对比图;
图8核酸酶富集流程PCR产物sanger对比图。
具体实施方式
本发明中的核苷酸组合物典型结构如图1所示,图中三角形(△)用来分隔不同的区域,其中13代表的是需要被抑制的、非目标区域的DNA模板单链。
核苷酸链I分成4个部分,分别依次由图中区域12/5/6/8代表;
核苷酸链II分成4个部分,分别依次由图中区域1/2/7/11代表;
区域6中的碱基与区域9的碱基互补配对程度>=60%;
区域2中的碱基与区域4的碱基互补配对程度>=80%。
区域7和区域14能够互补,区域5和区域14能够互补;区域1、区域11、区域12、区域8可以不含有碱基,只含有化学基团,例如,羟基、常见的荧光基团、常见的淬灭基团、生物素基团、氨基、C3 spacer、C6 spacer等间隔子、双脱氧核糖核苷酸等。
实施例1:计算核苷酸序列的吉布斯自由能
虽然吉布斯自由能的计算是一个公共知识,但为了更好的支持本发明公开的内容,我们将在这里展示吉布斯自由能的计算过程,以及在excel中的实现方式,本发明公开的内容中的吉布斯自由能均由此计算过程计算获得。
1、首先,我们选择的是双碱基估算模型,此模型在SantaLucia,J.团队的文献中有详细的描述,比如1998年发表在Biochemistry的《Thermodynamic parameters for anexpanded nearest-neighbor model for formation for formation of RNA duplexeswith Watson-Crick pairs》,简单来说,涉及到以下公式:
a)ΔS1=ΔS0+0.368*log(Salinity);
b)ΔG1=ΔH0-Temp*ΔS1/1000;
2、ΔH0和ΔS0是个来自SantaLucia,J.等人经过研究获得的经验常数,不同碱基对的经验常数如下表所示:
Model | ΔH0(kcal/mol) | ΔS0 |
AA | -7.6 | -21.3 |
AT | -7.2 | -20.4 |
AC | -8.4 | -22.4 |
AG | -7.8 | -21 |
TA | -7.2 | -21.3 |
TT | -7.6 | -21.3 |
TC | -8.2 | -22.2 |
TG | -8.5 | -22.7 |
CA | -8.5 | -22.7 |
CT | -7.8 | -21 |
CC | -8 | -19.9 |
CG | -10.6 | -27.2 |
GA | -8.2 | -22.2 |
GT | -8.4 | -22.4 |
GC | -9.8 | -24.4 |
GG | -8 | -19.9 |
3、其中Salinity的单位是mol/L,Temp的是开尔文温度等于273.15+摄氏度度数,比如25度,那么Temp=273.15+25=298.15。
4、那么根据ΔS1和ΔG1的公式,在Salinity=0.05mol/L,Temp=298.15的条件下,可以计算出不同碱基对的ΔG1值,如下表所示;此外,还可以在Excel中建立公式,计算其他不同Salinity和Temp条件下的ΔG1值。
Model | ΔH0(kcal/mol) | ΔS0 | ΔS1 | ΔG1 |
AA | -7.6 | -21.3 | -22.4024 | -0.92072 |
AT | -7.2 | -20.4 | -21.5024 | -0.78905 |
AC | -8.4 | -22.4 | -23.5024 | -1.39275 |
AG | -7.8 | -21 | -22.1024 | -1.21016 |
TA | -7.2 | -21.3 | -22.4024 | -0.52072 |
TT | -7.6 | -21.3 | -22.4024 | -0.92072 |
TC | -8.2 | -22.2 | -23.3024 | -1.25238 |
TG | -8.5 | -22.7 | -23.8024 | -1.40331 |
CA | -8.5 | -22.7 | -23.8024 | -1.40331 |
CT | -7.8 | -21 | -22.1024 | -1.21016 |
CC | -8 | -19.9 | -21.0024 | -1.73813 |
CG | -10.6 | -27.2 | -28.3024 | -2.16163 |
GA | -8.2 | -22.2 | -23.3024 | -1.25238 |
GT | -8.4 | -22.4 | -23.5024 | -1.39275 |
GC | -9.8 | -24.4 | -25.5024 | -2.19645 |
GG | -8 | -19.9 | -21.0024 | -1.73813 |
5、有了上表之后,比如要计算50mM NaCl、25℃条件下序列ACGTCGA的吉布斯自由能,就需要将ACGTCGA拆分成AC+CG+GT+TC+CG+GA,从上表中查询获得各个碱基对的ΔG1,就可以获得该序列的吉布斯自由能ΔG就是各个ΔG1的总和,ΔG=-1.39275-2.16163-1.39275-1.25238-2.16163-1.25238=-9.61。
6、同理,我们可以在Excel表中建立计算流程,如图2所示。
a)先在A3~A28中输入连续的数字;
b)B1单元格中存放需要计算吉布斯自由能的序列;
c)在B列中用MID函数将序列截取成双字符,=MID($B$1,A3,2);
d)N1和N2中分别存放盐离子浓度和摄氏度,N3是开尔文度数;
e)E~H列是碱基模式和常数,I和J列是根据公式计算出来的ΔS1和ΔG1;
f)在K列中,用Countif函数计算E列中不同Model在B列中的个数,=COUNTIF(B$3:B$28,E3);
g)在J列中是对应J列单元格和K列单元个的乘积,=K3*J3;
h)最终序列的吉布斯自由能ΔG=SUM(L3:L18)放在单元格K20中。
实施例2:利用空间占位方式抑制并驱除PKD1假基因,提高PKD1真基因区域的检出
1、PKD1基因有7种假基因,同源性在95%左右,为了更好的获得PKD1真基因的信息,我们针对PKD1外显子7、17、23、28等位置设计了一组核苷酸链组合物,如下表所示,其中,核苷酸序列I序列设计在PKD1真假基因有序列差异的地方,在核苷酸链I上面修饰有生物素,核苷酸链II和核苷酸链I的比例是1:10;核苷酸链I与假基因完全匹配,经过杂交之后,用亲和素磁珠结合生物素标记的核苷酸链,同时也将假基因抓取了下去,最后用普通的PCR方法(不具备鉴别真假基因的能力)去检测和验证上清液中的PKD1真基因的比例。
1、将基因组DNA超声打断至700~1000bp左右备用;
2、将核苷酸链I和核苷酸链II用0.1×TE溶液稀释至100μM,按照下列步骤进行抑制和驱除PKD1假基因的工作:
a)配置5×Oligo mix1体系的配置
组分 | 引物浓度(μM) | 体积(μL) |
核苷酸链I | 100 | 200 |
核苷酸链II | 100 | 20 |
0.1×TE | 补齐至1000μL | |
Total | 1000μL |
b)配置杂交体系
试剂组成 | 用量 |
5×Oligo Mix 1 | 6μL |
NaCl溶液 | 终浓度180mM |
基因组DNA | 900ng |
Nuclease Free Water | 补齐至30μL |
c)杂交反应体系先95℃变性10分钟,然后在60℃孵育2小时,加入链霉亲和素磁珠,按照厂家要求进行操作;
d)丢弃含有假基因序列的磁珠沉淀,保留含有PKD1真基因的上清,取3uL做PCR,同时设置对照组,对照组是直接加入未经过上述处理的基因组DNA;
e)5×Oligo mix 2体系的配置
组分 | 引物浓度(μM) | 体积(μL) |
核苷酸链II | 100 | 20 |
RP序列 | 100 | 20 |
0.1×TE | 补齐至1000μL | |
Total | 1000μL |
f)PCR体系的配置
试剂组成 | 体积(μL) |
5×Oligo Mix 2 | 6μL |
2×DNA聚合酶Master Mix | 15μL |
DNA模板 | ~90ng |
Nuclease Free Water | 补齐至30μL |
g)PCR过程条件
4、将实验组和对照组的PCR产物进行sanger测序;
5、Sanger测序结果分析如图3、4、5、6所示,其中实验组PCR产物标记为抑制和驱除了假基因的体系的扩增产物,对照组PCR产物标记为不抑制不驱除假基因的体系的扩增产物。
在PKD1 Exon7中所展示的51个碱基序列,同源相似性在48/51~50/51,即94.1%~98.0%之间,可以看到202G位置上,有3个假基因在此位置是202A,A/G占比是3:5,这个比例也能在不抑制假基因的体系的扩增产物的sanger测序结果中体现出来,在205A位置上,假基因在该位置全部都是G,A/G占比是1:7,真基因信息占比12.5%,在216C位置上,有3个假基因是碱基T,可以看出,没有经过假基因抑制的体系,很难直接和明显地获得真基因的信息;相反的,在经过本发明的抑制非目标区域的探针设计方法预处理过的样本DNA,相同引物扩增出来的PCR产物,经过Sanger测序之后,得到很纯的真基因产物,证明了抑制和驱除假基因的体系起到了应有的作用。
在PKD1_exon17的展示区域中同源性为45/46=97.8%,在不抑制假基因的体系中的156T位置,测序结果以碱基C为主,占比7/8=87.5%,在sanger结果中以碱基C的峰为主,而在抑制了假基因的体系的扩增产物中,则是以真基因的碱基T的峰为主,说明假基因得到了很大程度的抑制驱除。
同样的,在PKD1_exon23中,真基因的293G、305G、312T在抑制了假基因的体系的扩增产物中信号最高,说明假基因得到了很大程度的抑制驱除。
同样的道理,在PKD1_exon28中,125G是假基因,在不抑制假基因的体系的扩增产物中,显示出G/A双峰,但在抑制了假基因的体系的扩增产物中,显示真基因的碱基A纯峰,抑制驱除假基因的效果明显。
实施例3:比较不同比例的核苷酸链I和核苷酸链II对假基因的抑制效果
具体过程与实例2相同,不同在于,核苷酸链I和核苷酸链II的比例不同,结果也显示了对假基因的抑制效果不同,如图7外显子11位置的sanger结果所示,其中,核苷酸链II:核苷酸链I的分子数之比是:浓度条件a=1:10,浓度条件b=1:30。
Sanger测序结果分析如图7所示,其中实验组PCR产物标记为抑制了假基因的体系的扩增产物,对照组PCR产物标记为不抑制假基因的体系的扩增产物。
从浓度条件a和浓度条件b的对比来看,在1:30的比例情况下,真基因306T和323A的信号更接近于纯合峰,而1:10的情况下,这两个位置的信号要远优于对照组的杂合峰,说明1:30的比例更加有利于在同等条件下抑制和驱除假基因,暗示我们在其他具体应用中有可能需要根据不同的上下游区域来优化核苷酸链I和核苷酸链II的序列和比例,以期达到最佳的效果。
实施例4:利用目标区域富集方式,抑制去除非目标片段信息
1、在本实例中,我们利用核苷酸链I和核苷酸链II有目的的保护两种序列上有细微差异的模板中的一种,比如说模板C2369G2A,然后利用核酸酶去除另一种模板,比如说模板C2367C2T,从而达到富集模板C2369G2A的目的;质粒模板序列如下:
C2369G2A序列如下:
C2367C2T序列如下:
注:符号“/”之间的序列是是为了使得序列区分更加明显而加入的符号,t59和t61表示这两种质粒模板不同的碱基位置,为了方便理解,数字和sanger图中的相对位置保持一致。斜体部分序列是为了让两个质粒模板有更大的差异和区分,在本实例中,这部分序列并不用来设计任何核苷酸序列。
2、根据质粒模板序列设计下表中的核苷酸链,其中-s-表示硫代修饰,3SpC3代表spacer 3修饰;
3、两种质粒模板先用核苷酸链I和RP序列在Biorad ddPCR仪器上进行定量,调整至10e5 copies/μL,质粒模板C2369G2A按照1%和5%的分子数比例与质粒模板C2367C2T进行混合,混合物进行超声波打断,片段长度峰值在300bp左右,4℃保存备用;
4、基于消除的富集过程
a)配置5×Oligo mix3体系的配置。
组分 | 引物浓度(μM) | 体积(μL) |
核苷酸链I | 100 | 200 |
核苷酸链II | 100 | 20 |
0.1×TE | 补齐至1000μL | |
Total | 1000μL |
b)配置杂交体系
试剂组成 | 用量 |
5×Oligo Mix 3 | 6μL |
NaCl溶液 | 终浓度180mM |
基因组DNA | 1e6 copies |
Nuclease Free Water | 补齐至30μL |
c)杂交反应体系先95℃变性10分钟,然后在60℃孵育2小时,冷却到室温,加入2U核酸酶,37℃孵育20min,75℃灭活15min,纯化按照厂家要求进行操作;
d)上述经过核酸酶处理的反应为实验组,取3μL做PCR,同时设置对照组,对照组是直接加入未经过上述处理的质粒模板DNA(1%C2369G2A)
e)5×Oligo mix 4体系的配置
组分 | 引物浓度(μM) | 体积(μL) |
核苷酸链II | 100 | 20 |
RP序列 | 100 | 20 |
0.1×TE | 补齐至1000μL | |
Total | 1000μL |
f)PCR体系的配置
g)PCR过程条件
5、将实验组和对照组的PCR产物进行sanger测序,结果如图8所示。
在图8结果中,对照组的59A和61G位置的碱基信息为比例占优的C2367C2T质粒模板信息,说明没有发生富集作用,C2369G2A的1%的比例没有发生改变;在实验组A的PCR产物中,可以看到,C2369G2A质粒模板1%的比例得到了很大的富集,在对应的sanger结果中,59G的信号占比约30%,61A的信号占比45%左右,意味着,我们将C2369G2A质粒模板从1%的比例提升到了30%~45%左右,富集效果很显著;同样的道理,在实验组B的PCR产物中,5%的C2369G2A质粒模板被富集至90%以上,说明原始模板混合物中占大比例的C2367C2T被显著消除了。
以上仅是本发明的优选实施方式,并不用于限制本发明,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明技术原理的前提下,还可以做出若干改进和变型,这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 阅尔基因技术(苏州)有限公司
<120> 抑制生物DNA样本中非目标区域的核苷酸组合物及其应用
<160> 20
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 29
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 1
ttgggagatc tctgaagcag tggggatat 29
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 2
atcctccacg ggtcccccag acaaaa 26
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 3
ccccagctcc tctccggcca ggaaaa 26
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 4
ccttgagtgc gcggaggcca aagctatat 29
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 5
ggggccatag gttgggagat 20
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 6
tttgggagca gcatcctcc 19
<210> 7
<211> 17
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 7
ttctccgtgg cccccag 17
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 8
cctgtgtggc tccttgagtg 20
<210> 9
<211> 17
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 9
tcctcctcag cccaggc 17
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 10
cctgtcagcc ccacttctg 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 11
ccctcatgcg catcctcat 19
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 12
gcttgtcaaa gaagccacgc 20
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 13
ccctcatccg tcgtgcaggg aaaa 24
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 14
ctgcgtgtcc accctcatc 19
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 15
gcagtgctac cactgagaac a 21
<210> 16
<211> 295
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 16
gaagccacac tgacgtgcct ctccctccct ccaggaagcc tacgtgatgg ccagcgtgga 60
caacccccac gtgtgccgcc tgctgggcat ctgcctcacc tccaccgtgc agctcatcat 120
gcagctcatg cccttcggct gcctcctgga ctatgtccgg gaacacaaag acaatattgg 180
ctcccagtac ctgctcaact ggtgtgtgca gatcgcaaag gtaatcaggg aagggagata 240
cggggagggg agataaggag ccaggatcct cacatgcggt ctgcgctcct gggat 295
<210> 17
<211> 295
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 17
gaagccacac tgacgtgcct ctccctccct ccaggaagcc tacgtgatgg ccagcgtgga 60
caacccccac gtgtgccgcc tgctgggcat ctgcctcacc tccaccgtgc agctcatcac 120
gtagctcatg caggacgacc acagaggacg tgaggctggg gaacacaaag acaatattgg 180
ctcccagtac ctgctcaact ggtgtgtgca gatcgcaaag gtaatcaggg aagggagata 240
cggggagggg agataaggag ccaggatcct cacatgcggt ctgcgctcct gggat 295
<210> 18
<211> 17
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 18
cctcacctcc accgtgc 17
<210> 19
<211> 30
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 19
ccgtgcagct catcacgtag caaaaaaaaa 30
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> (人工序列)
<400> 20
gggagccaat attgtctttg tgttc 25
Claims (10)
1.一种抑制生物DNA样本中非目标区域的核苷酸组合物,其特征在于,包括核苷酸链I和核苷酸链II;
其中,所述的核苷酸链I上设有与非目标区域或目标区域特异性结合的第一序列,以及与第一序列相连的第二序列,所述的第一序列和第二序列是针对非目标区域与目标区域的差异序列区域进行设计;
所述的核苷酸链II上设有与非目标区域和目标区域结合的第三序列,以及与第三序列相连的第四序列,所述的第三序列是针对非目标区域与目标区域的差异序列区域的上游序列或下游序列进行设计;
所述的第二序列与第四序列的碱基序列相同,且与非目标区域或目标区域碱基互补配对;
在50mM NaCl、25℃条件下,所述的第一序列的△G°在-23.4~-234.7kcal/mol区间内;第三序列与第四序列的△G°总和在-20.5~-203.9kcal/mol区间内;第二序列或第四序列的△G°在-2.9~-30.8kcal/mol区间内。
2.根据权利要求1所述的核苷酸组合物,其特征在于,所述的核苷酸链I或核苷酸链II的一端或两端设有用于识别、捕获的功能基团。
3.根据权利要求2所述的核苷酸组合物,其特征在于,所述的功能基团为羟基、荧光基团、淬灭基团、生物素基团、氨基、C3 spacer、C6 spacer或双脱氧核糖核苷酸。
4.根据权利要求1所述的核苷酸组合物,其特征在于,第一序列与非目标区域或目标区域的碱基互补配对程度>=60%;第三序列与非目标区域或目标区域的碱基互补配对程度>=80%。
5.根据权利要求1所述的核苷酸组合物,其特征在于,所述的核苷酸链I或核苷酸链II中50%~100%的磷酸二酯键碳被硫代修饰。
6.根据权利要求1所述的核苷酸组合物,其特征在于,所述的核苷酸链I和核苷酸链II的浓度比为1:100~100:1。
7.根据权利要求6所述的核苷酸组合物,其特征在于,所述的核苷酸链I的浓度为10fg/μL~100mg/μL,核苷酸链II的浓度为10fg/μL~100mg/μL。
8.权利要求1-7任一项所述的核苷酸组合物在抑制生物DNA样本中非目标区域中的应用,其特征在于,所述的应用是在非聚合酶扩增过程中,采用含有核苷酸组合物的体系与生物DNA样本进行杂交反应,阻碍非目标区域被非特异性地扩增、识别或捕获。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述的体系中还包括0.001%~1%tween-20或者10ng/μL~500ng/μL的Carrier RNA。
10.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述的体系中还包括核酸酶I或核酸外切酶I。
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