CN112458212B - 同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒 - Google Patents
同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及PCR检测技术领域,尤其涉及同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒。本发明提供的引物探针组合中,包括针对甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒的特异性引物、探针。该引物和探针具有良好的特异性,结合real time PCR检测方法,能够实现对FluA/FluB/RSV的快速、准确、灵敏的鉴定。实验表明,本发明的引物探针的检测FluA/FluB/RSV的最低检测限均为25copies/ml。并且,该试剂具有良好的稳定性,2~8℃保存3、6、9、12个月的试剂都可以实现对样品的稳定检测。
Description
技术领域
本发明涉及PCR检测技术领域,尤其涉及同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒。
背景技术
呼吸道感染是人类最常见的疾病之一,造成呼吸道感染的主要原因是各种呼吸道病毒以及一些细菌、支原体、衣原体。其中,甲型流感病毒(influenza A virus)、乙型流感病毒(influenza B virus)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)为临床较常见且重要的呼吸道病毒。呼吸道病毒引起的感染症状和流行性感冒特点相似,而引起的疫情及对社会造成的危害程度却不相同,由于很难仅靠临床症状确定真正的病原体,因此快速有效的鉴定呼吸道病原体种类,对于制定治疗和用药方案以及疫情防控均具有重要意义。
在现有技术中,分离培养是呼吸道病毒检测的“金标准”,但该方法操作复杂,耗时长,不适合用于早期诊断。抗体检测虽然操作简便,但其灵敏度和特异性变化较大,容易出现假阳性和假阴性。以核酸为基础的PCR(聚合酶链式反应)是一种用于特定核酸片段的扩增放大技术,该技术广泛应用于基因检测和病原体检测,具有灵敏度高,特异性好,简便,快捷等特点,对生物和医学研究及临床诊断具有重大意义。但现有技术中的荧光PCR检测,因引物特异性等方面的原因,很难实现对甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒的多重检测。并且,现有技术中的检测试剂保存条件非常严苛(为-20℃),对运输条件要求高,且冻融次数少(小于3次),导致检测成本高。且针对FluA/FluB/RSV鉴定的基因片段的选择和引物探针的涉及存在不合理的现象,导致多数检测试剂无法实现准确、快速、灵敏的检测。
发明内容
有鉴于此,本发明要解决的技术问题在于提供同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒,该试剂盒具有良好的灵敏性、特异性,且试剂的可以于2~8℃稳定性保存。
本发明提供的引物探针组合,其包括:
甲型流感病毒的正向引物,其核酸序列如SEQ ID NO:1所示;
甲型流感病毒的反向引物,其核酸序列如SEQ ID NO:2所示;
甲型流感病毒的探针,其核酸序列如SEQ ID NO:3所示;
乙型流感病毒的正向引物,其核酸序列如SEQ ID NO:4所示;
乙型流感病毒的反向引物,其核酸序列如SEQ ID NO:5所示;
乙型流感病毒的探针,其核酸序列如SEQ ID NO:6所示;
呼吸道合胞病毒的正向引物,其核酸序列如SEQ ID NO:7所示;
呼吸道合胞病毒的反向引物1,其核酸序列如SEQ ID NO:8所示;
呼吸道合胞病毒的反向引物2,其核酸序列如SEQ ID NO:9所示;
呼吸道合胞病毒的探针,其核酸序列如SEQ ID NO:10所示。
本发明所述的引物探针组合,可以用于对样品中的甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒进行定性或定量检测。本发明中,SEQ ID NO.1~2所示引物对扩增的片段如SEQ ID NO:14所示;该片段为甲型流感病毒的保守序列M基因。如SEQ ID NO.4~5所示引物对扩增的片段如SEQ ID NO:15所示。该片段为乙型流感病毒的nuclear exportprotein(NEP)基因。如SEQ ID NO.7~9所示引物对扩增的片段如SEQ ID NO:16所示。该片段为呼吸道合胞病毒的保守序列并经过NCBI多序列比对。
本发明还提供了同时检测检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒,其包括含有本发明所述引物探针组合的反应液。
一些实施例中,所述反应液中还包括内标的引物和探针;所述内标的序列为SEQID NO:17。本发明中,所述内标采用18S rRNA基因,针对其中SEQ ID NO:17所示的核苷酸片段设计引物和探针。其中,内标的正向引物,其核酸序列如SEQ ID NO:11所示;内标的反向引物,其核酸序列如SEQ ID NO:12所示;内标的探针,其核酸序列如SEQ ID NO:13所示。
本发明提供的引物和探针均具有良好的特异性,互相不发生交叉反应。从而能够在一个反应体系中,同时检测多个靶标,具有良好的准确性、特异性和灵敏度,并且能够节约成本。由于本发明采用了特异性较高的探针应用于该试剂盒,可以对未知样本中的甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸进行快速检测,为诊断甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸提供可靠的实验依据,解决了现有试剂盒效率低、特异性差和灵敏度低的技术问题。
一些实施例中,
如SEQ ID NO.3所示探针的5’端连接FAM荧光基团;
如SEQ ID NO.6所示探针的5’端连接ROX荧光基团;
如SEQ ID NO.10所示探针的5’端连接CY5荧光基团;
如SEQ ID NO.13所示探针的5’端连接HEX荧光基团。
一些实施例中,所述反应液中还包括:Tricine、KOAc、Tween20、DMSO、dNTPs、Tth酶、醋酸锰和水。
本发明中,所述反应液中的Tricine、KOAc、Tween20、DMSO、dNTPs、Tth酶、醋酸锰,可以以溶液形式分别独立存在,也可以混合形成反应液共同存在,在该反应液存储的过程中,可以包括或不包括引物和探针。一些实施例中,所述反应液中的Tricine、KOAc、Tween20、DMSO、dNTPs、Tth酶、醋酸锰,以溶液形式分别独立存在,其中,Tricine的浓度为1M/L、KOAc的浓度为10M/L、10%的Tween20、100%的DMSO、dNTPs的浓度为10mM、Tth酶的浓度为5u/ul、醋酸锰的浓度为50mM。
本发明所述的试剂盒中,还包括核酸提取及纯化试剂(安图生物,豫郑械备20180037号)。
一些实施例中,本发明所述的试剂盒还包括阴性质控品和阳性质控品;所述阴性质控品为无菌水;所述阳性质控品为人工合成的浓度1×105Copies/ml的装甲RNA。
本发明还提供了一种非诊断目的同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的方法,其以本发明所述的试剂盒对样品进行检测,根据荧光信号判断样品是否存在甲型流感病毒、乙型流感病毒或呼吸道合胞病毒。
本发明中,所述的检测方法为real-time PCR法,根据报告的Ct值判断样品是否存在甲型流感病毒、乙型流感病毒或呼吸道合胞病毒。所述根据Ct值判断包括:
SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.10所示探针通道无荧光值,且SEQ IDNO.13所示探针通道的CT值≤35,报告检测结果为阴性;
SEQ ID NO.3、所示探针通道的CT值≤40,报告为甲型流感病毒阳性;
SEQ ID NO.6、所示探针通道的CT值≤40,报告为乙型流感病毒阳性;
SEQ ID NO.10、所示探针通道的CT值≤40,报告为呼吸道合胞病毒阳性;
SEQ ID NO.3所示探针通道CT值皆≥40,但SEQ ID NO.13所示探针通道CT值≤35,报告甲型流感病毒样本浓度低于检测下限;SEQ ID NO.6所示探针通道CT值皆≥40,但SEQID NO.13所示探针通道CT值≤35,报告乙型流感病毒样本浓度低于检测下限;SEQ IDNO.10所示探针通道CT值皆≥40,但SEQ ID NO.13所示探针通道CT值≤35,报告呼吸道合胞病毒样本浓度低于检测下限;
当SEQ ID NO.13所示探针通道CT值≥35,出现阴性对照有CT值或呈典型S扩增曲线、阳性对照无CT值或无扩增曲线两种情况中的任一种时,该检测结果无效,应查找并排除原因,并重复试验。
本发明中,所述样品为咽拭子、鼻拭子或环境样品。
所述扩增的体系包括:25μL反应液和5μL样品提取物;
所述反应液包括:
本发明所述方法中,所述扩增的程序包括:
本发明提供的引物探针组合中,包括针对甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒的特异性引物、探针。该引物和探针具有良好的特异性,结合real time PCR检测方法,能够实现对FluA/FluB/RSV的快速、准确、灵敏的鉴定。实验表明,本发明的引物探针的检测FluA/FluB/RSV的最低检测限均为25copies/ml。并且,该试剂具有良好的稳定性,2~8℃保存3、6、9、12个月的试剂都可以实现对样品的稳定检测。
附图说明
图1示甲型流感病毒线性扩增图;
图2示乙型流感病毒线性扩增图;
图3示呼吸道合胞病毒线性扩增图。
具体实施方式
本发明提供了同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明采用的试材皆为普通市售品,皆可于市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂盒的制备
试剂盒中的引物、探针序列如下表1所示:
表1引物、探针序列
名称 | 核苷酸序列 | |
FluA上游引物 | SEQ ID NO:1 | CTTCTAACCGAGGTHGAAACG |
FluA下游引物 | SEQ ID NO:2 | GAGGTGACAGGATYGGTCTTGT |
FluA探针 | SEQ ID NO:3 | CCMTCAGGCCCCCTCAAAGCCGA |
FluB上游引物 | SEQ ID NO:4 | TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG |
FluB下游引物 | SEQ ID NO:5 | CCAATTTGGTCAAGAGCACCG |
FluB探针 | SEQ ID NO:6 | CCAATTCGAGCAGCTGAAACTGCGG |
RSV上游引物 | SEQ ID NO:7 | GGCAAATATGGAAACATACGTGA |
RSV下游引物1 | SEQ ID NO:8 | GATGCAGGATCATCGTCTTTTTC |
RSV下游引物2 | SEQ ID NO:9 | GATGCGGGATCATCATCTTTTTC |
RSV探针 | SEQ ID NO:10 | CACGAAGGCTCCACATACACAGC |
内标上游引物 | SEQ ID NO:11 | GGTTGCAAAGCTGAAACTTAAA |
内标下游引物 | SEQ ID NO:12 | AGTCAAATTAAGCCGCAGGC |
内标探针 | SEQ ID NO:13 | TTGACGGAAGGGCACCACCAGG |
试剂盒中还包括:Tricine的浓度为1M/L、KOAc的浓度为10M/L、10%的Tween20、100%的DMSO、dNTPs的浓度为10mM、Tth酶的浓度为5U/ul、醋酸锰的浓度为50mM。试剂盒还包括阴性对照(无菌水)和阳性对照(人工合成的浓度1×105Copies/ml的装甲RNA)。
实施例2本发明试剂盒的检测方法
本发明的检测方法为Realtime RT-PCR,Real Time RT-PCR反应过程为(1)逆转录,在逆转录酶的作用下,合成出互补的cDNA,时间和长度取决于靶核酸长度及碱基组成,预变性的温度一般为42℃~60℃,时间和长度取决于靶核酸长度及碱基组成,预变性的温度一般为90℃~105℃,时间一般为10~20min。(2)预变性,时间和长度取决于靶核酸长度及碱基组成,预变性的温度一般为90℃~105℃,时间一般为2~10min,预变性的目的为使双链核酸序列彻底分离为单链;(3)变性,温度一般为91℃~105℃,时间一般为10s~35s;(4)退火,使各引物退火至甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒或内标质控核酸的靶序列上。退火的温度通常为40℃~60℃,退火的时间可以是10s~60s(5)延伸,引物与模板结合,开始合成新的DNA双链,延伸温度一般为40℃~80℃,延伸时间可以是10s~1min。
每个检测体系的组成如表2:
荧光检测通道选择:(1)选择FAM通道(ReporTer:FAM,QuenCher:none),检测甲型流感病毒;(2)选择ROX通道(ReporTer:ROX,QuenCher:none),检测乙型流感病毒;(3)选择CY5通道(ReporTer:CY5,QuenCher:none),检测呼吸道合胞病毒;(4)选择HEX通道,检测内标;(5)参比荧光(PAssive ReferenCe)设置为none。荧光定量实时反应条件如下表3所示。
表3:荧光定量实时PCR反应条件
反应结束后,仪器自动保存结果,利用仪器自带的软件进行自动分析或手动调节基线的开始值、结束值以及阂值线值进行分析,然后记录样本CT值和定值结果。具体测试结果分析如下:
SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.10所示探针通道无荧光值,且SEQ IDNO.13所示探针通道的CT值≤35,报告检测结果为阴性;
SEQ ID NO.3、所示探针通道的CT值≤40,报告为甲型流感病毒阳性;
SEQ ID NO.6、所示探针通道的CT值≤40,报告为乙型流感病毒阳性;
SEQ ID NO.10、所示探针通道的CT值≤40,报告为呼吸道合胞病毒阳性;
SEQ ID NO.3所示探针通道CT值皆≥40,但SEQ ID NO.13所示探针通道CT值≤35,报告甲型流感病毒样本浓度低于检测下限;SEQ ID NO.6所示探针通道CT值皆≥40,但SEQID NO.13所示探针通道CT值≤35,报告乙型流感病毒样本浓度低于检测下限;SEQ IDNO.10所示探针通道CT值皆≥40,但SEQ ID NO.13所示探针通道CT值≤35,报告呼吸道合胞病毒样本浓度低于检测下限;
当SEQ ID NO.13所示探针通道CT值≥35,出现阴性对照有CT值或呈典型S扩增曲线、阳性对照无CT值或无扩增曲线两种情况中的任一种时,该检测结果无效,应查找并排除原因,并重复试验。
实施例3本发明试剂盒的可行性试验
1.最低检测限(LOD)试验
(1)甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂配制:通过采用实施例1的方法制备甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测。
(2)样本提取
将管中5个不同浓度的甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒样本,利用核酸提取及纯化试剂(安图生物,豫郑械备20180037号)批号为:20190527。进行核酸的纯化。
(3)样本检测
将25μl处理好的标本上清加入到甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂反应管中,每个浓度20个复孔,同时加入25μl纯净水到检测液中作为阴性对照,按照实施例2中检测方法进行检测。
(4)结果分析
通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂各浓度梯度的样本进行检测,表明本检测方法的检测灵敏度(LOD)甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒均为25copies/ml。具体数据表4,表5、表6。
表4:甲型流感病毒检测限确认
样本浓度(copies/ml) | 检测重复数 | 阳性检测数 | 阳性检出率 |
1 | 21 | 1 | 9.52% |
2.5 | 21 | 10 | 47.62% |
10 | 21 | 16 | 76.19% |
25 | 21 | 21 | 100.00% |
100 | 21 | 21 | 100.00% |
表5:乙型流感病毒检测限确认
表6:呼吸道合胞病毒检测限确认
样本浓度(copies/ml) | 检测重复数 | 阳性检测数 | 阳性检出率 |
1 | 21 | 1 | 9.52% |
2.5 | 21 | 8 | 38.10% |
10 | 21 | 12 | 57.14% |
25 | 21 | 20 | 95.24% |
100 | 21 | 21 | 100.00% |
2、试剂线性灵敏度验证
(1)实验样本
取6份不同浓度的甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒样本(浓度分别为2.5×104copies/mL、2.5×103copies/mL、2.5×102copies/mL、25copies/mL、2.5copies/mL、1.0copies/mL)对试剂的线性灵敏度进行验证。
(2)结果分析
通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂各浓度梯度的样本进行检测,具体数据图1,图2、图3。
3、与其它疾病的交叉反应情况
(1)甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂配制,通过采用实施例1的方法制备甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂。
(2)交叉病原体样本提取:将管中含有麻疹病毒,腮腺炎病毒,风疹病毒,金黄色葡萄球菌,大肠埃希菌,铜绿假单胞菌,人副流感病毒4型病原体,白色念珠菌,巨细胞病毒,单纯疱疹病毒1型,EB病毒,百日咳杆菌,杰氏棒杆菌,流感嗜血杆菌,嗜肺军团菌,卡他莫拉菌,脑膜炎奈瑟菌,肺炎链球菌,化脓性链球菌,表皮葡萄球菌,唾液链球菌,肺炎克雷伯菌,肺炎支原体,肺炎衣原体的咽拭子洗脱液用移液器混匀,利用索莱宝生物科技有限公司的RNA病毒基因组提取试剂盒进行核酸RNA的纯化。
(3)样本检测:将25μl处理好的标本上清加入到甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测反应管中,同时加入25μl纯净水到检测液中作为阴性对照,提取的甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒作为阳性对照试验,按照实例2中检测方法进行检测。
(4)结果分析:通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒以外的其它病原体进行检测,结果表明:本发明试剂盒对甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒阳性对照为阳性,阴性对照为阴性,麻疹病毒,腮腺炎病毒,风疹病毒,金黄色葡萄球菌,大肠埃希菌,铜绿假单胞菌,人副流感病毒4型病原体,白色念珠菌,巨细胞病毒,单纯疱疹病毒1型,EB病毒,百日咳杆菌,杰氏棒杆菌,流感嗜血杆菌,嗜肺军团菌,卡他莫拉菌,脑膜炎奈瑟菌,肺炎链球菌,化脓性链球菌,表皮葡萄球菌,唾液链球菌,肺炎克雷伯菌,肺炎支原体,肺炎衣原体病原体感染样本无交叉反应,表明其具有高特异性,具体结果如表7。
表7:交叉反应实验
4、对潜在外源物质的抗干扰性
(1)甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂配制:通过采用实施例1的方法制备甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂配制。
(2)样本处理
选取甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒高值和低值两个浓度值。甲型流感病毒两个浓度值分别为1×106copies/ml和25copies/ml,乙型流感病毒两个浓度值分别为1×106copies/ml和25copies/ml。呼吸道合胞病毒两个浓度值分别为1×106copies/ml和25copies/ml,同时将干扰物质以3倍的峰值浓度(Cmax)加入到对应病毒样本中,采用实例3中交叉反应方法处理样本,按照实例2中检测方法进行检测。
(3)结果分析
干扰判断:干扰率小于项目所在行标允许的正确度偏倚(设定为10%),即可判断为通过。
干扰率计算公式:(干扰样本浓度-对照样本浓度)/对照样本浓度×100%。
试验表明,当样本中含有利巴韦林、氯化钠、***、盐酸组胺、盐酸组胺、奥司他韦、莫匹罗星、妥布霉素等常见的抗病毒药物时,本发明试剂盒的检测灵敏度不会受到明显干扰,具体见表8。
表8:外源物质的抗干扰性实验
药物名称 | 干扰率(%) | 药物名称 | 干扰率(%) |
利巴韦林 | 2.2 | 盐酸组胺 | 3.1 |
氯化钠 | 2.4 | 奥司他韦 | 2.2 |
*** | 0.8 | 莫匹罗星 | 1.6 |
盐酸组胺 | 1.2 | 妥布霉素 | 1.4 |
5、对潜在内源物质的抗干扰性
(1)甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂配制:通过采用实施例1的方法制备甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂配制。
(2)样本处理
选取甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒高值和低值两个浓度值。甲型流感病毒两个浓度值分别为1×106copies/ml和25copies/ml,乙型流感病毒两个浓度值分别为1×106copies/ml和25copies/ml。呼吸道合胞病毒两个浓度值分别为1×106copies/ml和25copies/ml,同时将内源性干扰物质加入到对应病毒样本中,采用实例3中交叉反应方法处理样本,按照实例2中检测方法进行检测。
(3)结果分析
干扰判断:干扰率%小于项目所在行标允许的正确度偏倚(设定为10%),即可判断为通过。
干扰率计算公式:(干扰样本浓度-对照样本浓度)/对照样本浓度×100%。
试验表明,当样本中含有200mg/dL血红蛋白、3000mg/dL甘油三酯、20mg/dL胆红素等内源性干扰物质时,本发明试剂盒的检测灵敏度不会受到明显干扰,具体见表9。
表9:内源物质的抗干扰性实验
干扰物质 | 干扰率(%) |
血红蛋白 | 2.1 |
甘油三酯 | 1.6 |
胆红素 | 2.3 |
实施例4本发明试剂盒的2-8℃稳定性考核
1.加速稳定性试验
(1)甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂配制:通过采用实施例1的方法制备甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测。
(2)样本提取
将管中检出限浓度的甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒人咽拭子洗脱液用移液器混匀,利用索莱宝生物科技有限公司的RNA病毒基因组提取试剂盒进行核酸RNA的纯化。
(3)样本检测
将25μl处理好的标本上清加入到45℃加速7、10、14天的甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂反应管中,每个型别2个复孔,同时加入25μl纯净水到检测液中作为阴性对照,按照实施例2中检测方法进行检测。
(4)结果分析
通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对2-8℃运输7天45℃加速7、10、14天的甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂进行检测,具体数据表10。
表10:加速稳定性试验
加速(45℃)时间(d) | 检出情况 |
7 | 稳定检出 |
10 | 稳定检出 |
14 | 稳定检出 |
2.实时稳定性试验
(1)甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂配制:通过采用实施例1的方法制备甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测。
(2)样本提取
将管中检出限浓度的甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒人咽拭子洗脱液用移液器混匀,利用索莱宝生物科技有限公司的RNA病毒基因组提取试剂盒进行核酸RNA的纯化。
(3)样本检测
将25μl处理好的标本上清加入到2-8℃运输7天2-8℃保存3、6、9、12个月的甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂反应管中,每个型别2个复孔,同时加入25μl纯净水到检测液中作为阴性对照,按照实施例2中检测方法进行检测。
(4)结果分析
通过采用实施例1制备的试剂盒和采用实施例2的检测方法对2-8℃保存3、6、9、12个月的甲型流感病毒/乙型流感病毒/呼吸道合胞病毒核酸检测试剂进行检测,具体数据表11。
表11:实时稳定性试验
加速(2-8℃)时间(month) | 检出情况 |
3 | 稳定检出 |
6 | 稳定检出 |
9 | 稳定检出 |
12 | 稳定检出 |
以上仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 郑州安图生物工程股份有限公司
<120> 同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒
<130> MP2019802
<160> 17
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cttctaaccg aggthgaaac g 21
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaggtgacag gatyggtctt gt 22
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccmtcaggcc ccctcaaagc cga 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tcctcaactc actcttcgag cg 22
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccaatttggt caagagcacc g 21
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccaattcgag cagctgaaac tgcgg 25
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggcaaatatg gaaacatacg tga 23
<210> 8
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gatgcaggat catcgtcttt ttc 23
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gatgcgggat catcatcttt ttc 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cacgaaggct ccacatacac agc 23
<210> 11
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggttgcaaag ctgaaactta aa 22
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agtcaaatta agccgcaggc 20
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
ttgacggaag ggcaccacca gg 22
<210> 14
<211> 157
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cttctaaccg aagtcgaaac gtacgttctc tctatcgtcc cgtcaggccc cctcaaagcc 60
gagatcgcgc agagactgga agatgtcttt gcagggaaga acacagatct tgaggctctc 120
atggaatggc taaagacaag accaatcctg tcacctc 157
<210> 15
<211> 105
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
atcctcaact cactcttcga gcgtctcaat gaaggacatt caaagccaat tcgagcagct 60
gaaactgcgg tgggagtctt atcccaattt ggtcaagagc accga 105
<210> 16
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
ggcaaatatg gaaacatacg tgaataaact tcacgagggc tccacataca cagctgctgt 60
tcaatacaat gtcctagaaa aagacgatga tcctgcatc 99
<210> 17
<211> 83
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gtatggttgc aaagctgaaa cttaaaggaa ttgacggaag ggcaccacca ggagtggagc 60
ctgcggctta atttgactca aca 83
Claims (6)
1.同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的试剂盒,其特征在于,其中反应液包括
。
2.根据权利要求1所述的试剂盒,其特征在于,
如SEQ ID NO.3所示探针的5’端连接FAM荧光基团;
如SEQ ID NO.6所示探针的5’端连接ROX荧光基团;
如SEQ ID NO.10所示探针的5’端连接CY5荧光基团;
如SEQ ID NO.13所示探针的5’端连接HEX荧光基团。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒,其特征在于,还包括阴性质控品和阳性质控品;所述阴性质控品为无菌水;所述阳性质控品为人工合成的浓度1×105Copies/ml的装甲RNA。
4.非诊断目的同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒及呼吸道合胞病毒的方法,其特征在于,以权利要求1~3任一项所述的试剂盒对样品进行检测,根据荧光信号判断样品是否存在甲型流感病毒、乙型流感病毒或呼吸道合胞病毒。
5.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,所述样品为咽拭子、鼻拭子或环境样品;扩增的体系包括:25μL反应液和5μL样品提取物。
6.根据权利要求4所述的方法,其特征在于,扩增的程序包括:
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