CN111690568A - 枯草芽孢杆菌及其在发酵处理亚麻籽饼脱毒方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了枯草芽孢杆菌BS，其保藏登记号为CGMCC No.18229，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏时间为2019年7月15日。本发明还公开了枯草芽孢杆菌BS的培养物、枯草芽孢杆菌BS的菌悬液。本发明还公开了一种产品，其活性成分为枯草芽孢杆菌BS、枯草芽孢杆菌BS的培养物或枯草芽孢杆菌BS的菌悬液。本发明还公开了枯草芽孢杆菌BS、枯草芽孢杆菌BS的培养物或枯草芽孢杆菌BS的菌悬液的应用，所述应用如下：a)降解生氰糖苷；或b)降解亚麻籽饼中大分子蛋白质；或c)生产多肽。

Description

枯草芽孢杆菌及其在发酵处理亚麻籽饼脱毒方面的应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株枯草芽孢杆菌，以及该枯草芽孢杆菌在发酵处理亚麻籽饼脱毒方面的应用。
背景技术
亚麻(Linum ustitatissimum L.)又称胡麻，属亚麻科、亚麻属。亚麻是世界上最古老的纤维作物之一，品种较多，但大致可分为3类：油用亚麻、纤维用亚麻和油纤两用亚麻，其种子均可榨油，已成为世界十大油料作物之一。据统计，2018年全球亚麻籽年产量约260万吨，居世界油料总产量的第7位。油用亚麻主要产于加拿大、中国、阿根廷、美国。
油用亚麻作为我国重要油料作物之一，是我国重要的经济作物，也是我国华北、西北、东北高寒地区种植的主要油料作物，面积和总产量仅次于加拿大，居世界第二位。我国亚麻籽主要用来榨油，居我国油料总产量的第4位。我国是在公元前2世纪开始种植，初始亚麻籽主要作药用，直到16世纪才用其种子榨油。
亚麻籽又称胡麻籽，是亚麻科、亚麻属的一年生或多年生草本植物亚麻的种子。亚麻籽由壳和仁组成，其主要成分为油和蛋白。亚麻籽含34％的油脂，亚麻籽的蛋白主要由白蛋白和球蛋白组成，是优质植物蛋白。其氨基酸组成与大豆相似，赖氨酸、蛋氨酸缺乏，富含色氨酸。亚麻籽中富含多种功能活性成分，如α–亚麻酸、木酚素、植物胶、亚麻二糖苷、酚酸、黄酮类等，尤其其中许多成分被证明具有抗癌活性。
亚麻籽油是亚麻籽榨取的油类。油的生产工艺一般分为压榨法和浸出法。压榨法的副产物为亚麻饼，浸出法的副产物为亚麻粕。
压榨法又称“物理压榨法”，就是用外力把油料里的油给挤压出来，不使用其他的化学溶剂等，避免了油中有机溶剂的残留。压榨的生产工艺最大程度的保留了亚麻籽中的多不饱和脂肪酸以及蛋白质、膳食纤维、维生素、微量元素等多种对人体有益的营养成分，更适合用于专项补充和人体保健。压榨法又分为“冷榨法”和“热榨法”。热榨法是指将油作物经过高温火炒或蒸炒后，在经过物理压榨而成的油脂，是比较传统的压榨工艺，出油率较高。冷榨法是指在低温条件下，用物理机械巨大的压力榨取的植物油，没有经过传统的高温炒或者蒸的过程，所以油脂仍分布在未变性蛋白质细胞中，含有非常丰富的亚麻籽固有的成分。
浸提工艺生产出的油也叫浸出油，就是用有机溶剂浸提油料。浸出法是采用溶剂油将油脂原料经过浸泡后，进行高温提取，使油脂被萃取出来的一种制油工艺。
亚麻籽榨油后的副产物为亚麻籽饼粕。亚麻籽饼粕中蛋白质、α–亚麻酸等含量丰富，其粗蛋白质含量为28％～36％，可作为植物性蛋白质饲料原料。另外，亚麻籽饼粕中还富含多种生物功能活性成分，如α–亚麻酸、木酚素等，因此亚麻籽饼粕具有较高的饲用潜能。随着中国畜牧业的快速发展和玉米豆粕型日粮的普及，饲料工业对豆粕的需要量越来越大，蛋白质饲料原料供应日趋紧张，而且我国豆粕价格的波动严重影响到了养殖业的稳定。所以，引入亚麻籽饼粕、菜籽饼粕、棕榈饼粕等杂粕会一定程度上缓解豆粕的供需矛盾并促进中国特色畜牧养殖业持续发展。
但是，亚麻籽饼粕中还含有许多有毒物质和抗营养因子，如亚麻籽胶、植酸、变应原、生氰糖苷、胰蛋白酶抑制因子、抗VB6因子等，特别是其中生氰糖苷的毒性，极大地限制了亚麻籽饼粕在动物日粮中的使用量。
研究表明，生氰糖苷是亚麻籽饼中的主要抗营养因子。生氰糖苷(Cyanogeneticglycosides，下文简称CGs)亦称氰苷、氰醇苷，是由氰醇衍生物的羟基和D–葡萄糖缩合形成的糖苷。生氰糖苷主要存在于亚麻籽的壳和仁中，亚麻籽中的生氰糖苷主要有二糖苷和单糖苷，二糖苷为β–龙胆二糖丙酮氰醇和β–龙胆二糖甲乙酮氰醇，单糖苷是亚麻苦苷和百脉根苷，其中二糖苷含量较多，分别为0.17％和0.19％，单糖苷含量较少。
在低温条件下进行冷榨时，亚麻籽中的亚麻苦苷可原封不动地残留在饼粕中。
生氰糖苷本身不呈现毒性。生氰糖苷经过植物中与其共存的水解酶的作用，水解产生氢氰酸(HCN)而引起动物中毒。但在正常情况下，生氰糖苷和酶存在于植物不同的部位，并不能接触，因此不会引起氢氰酸的释放。生氰糖苷产生氢氰酸的反应由两种酶共同作用。生氰糖苷首先在β–葡萄糖苷酶的作用下分解生成氰醇和糖，氰醇很不稳定，自然分解为相应的酮、醛化合物和氢氰酸。羟腈分解酶可加速这一降解反应。
生氰糖苷的毒性是由于β–葡萄糖苷酶的作用而使氢氰酸(HCN)释放的结果，而HCN是一种呼吸抑制剂。氢氰酸的主要毒作用在于氢氰酸被吸收后，随血液循环进入组织细胞，并透过细胞膜进入线粒体，氰离子(CN-)能迅速与氧化型细胞色素氧化酶的三价铁(Fe3+)结合，生成非常稳定的高铁细胞色素氧化酶，使其不能转变为具有二价铁(Fe2+)的还原型细胞色素氧化酶，致使细胞色素氧化酶失去传递电子、激活分子氧的功能，使组织细胞不能利用氧，形成“细胞内窒息”，导致细胞中毒性缺氧症。生氰糖苷的急性中毒症状包括心律紊乱、肌肉麻痹和呼吸窘迫。氢氰酸的最小致死口服剂量为0.5～3.5mg/kg体重。以生氰糖苷形式经口摄入的HCN，对牛、羊的最低致死剂量每千克体重为2mg。我国国家饲料卫生标准中饲料中氰化物允许含量为不高于50mg/kg。
动物日粮中生氰糖苷的含量高于动物的耐受量会引发动物的急性中毒或死亡。日粮中生氰糖苷的含量即使没有高于动物的耐受量，也可引起动物的慢性中毒，如造成动物甲状腺肿大、采食量下降、生长缓慢、视神经受损等。慢性中毒的机理是由于CN-在动物体内经硫氰酸酶的催化作用转化为硫氰酸盐(毒性为氰化物的1/200)。其硫氰基(CN-)由于和碘离子(I-)有相似的分子体积及电荷，在甲状腺腺泡细胞聚碘过程中可与I-竞争，从而减少了甲状腺腺泡细胞对碘的浓聚，导致机体甲状腺激素的合成与分泌减少。根据甲状腺机能调节***(下丘脑—腺垂体—甲状腺轴)的调节机制，当血液中甲状腺激素的浓度降低时，通过负反馈作用，使腺垂体分泌大量促甲状腺激素(TSH)。TSH持续不断地作用于甲状腺，从而使甲状腺腺泡细胞呈现增生性变化，形成甲状腺肿。亚麻饼粕中毒一般为氢氰酸中毒的慢性过程，但症状会逐渐加重。
国内外有关研究人员对亚麻籽生氰糖苷的脱毒方法及途径进行了广泛而深入的研究，取得了许多研究成果。常用的亚麻籽及其饼粕脱毒方法主要有水煮法、温热处理法、酸处理-湿热处理法和干热处理法，以及近年来发展的新方法，如挤压法、微波法、压热法、微生物法和溶剂法等。各种脱毒方法虽都可显著降低亚麻籽中生氰糖苷含量，然而这些方法都存在着不同程度的缺陷，它们或者脱毒率不够高，或设备尚未完善，或者成本高，或者造成二次污染，难以在生产实际中应用，大部分加工工艺会影响亚麻籽中的营养成分，降低营养价值。因此，有必要继续寻找低成本、高效率、工艺设备简单的脱毒方法，同时注重强化亚麻籽的营养价值，提高营养物质利用率。
采用微生物发酵的方法对亚麻籽饼粕中的生氰糖苷进行去除，是因为微生物可以通过自身的代谢产生β–葡萄糖苷酶，而β–葡萄糖苷酶能够降解生氰糖苷。采用微生物发酵法则能够克服传统方法中的诸多缺陷，不仅能有效的脱除亚麻籽饼粕中的抗营养因子—生氰糖苷，同时还可改善亚麻籽饼粕的营养价值，在提高亚麻籽饼粕饲用价值方面具有较好的应用前景。因此，通过微生物发酵来脱除亚麻籽饼粕中的抗营养因子，不仅可以充分利用我国独特的地源型饲料资源，还能缓解豆粕的供需矛盾进而促进中国特色畜牧养殖业的可持续发展。采用微生物发酵方法进行脱毒，具有条件温和、安全高效、成本较低的优点。因此采用微生物发酵脱毒是一种环保高效的方法。
梅莺等(2013)在试验中采用微生物发酵的方法对亚麻饼粕进行脱毒，确定微生物的最佳发酵条件为：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae CICC31077，菌种接种量为3％，含水量为50％，发酵温度和发酵时间分别为28℃和72h，在这种条件下，生氰糖苷的脱除率可以达到76.91％(梅莺等，亚麻饼粕微生物脱毒工艺，食品与发酵工业，第39卷第3期：111-114，2013年)。
冯爱娟等用重组毕赤酵母发酵亚麻籽，在最佳发酵条件下，HCN的脱除率达到97.0％以上(冯爱娟等，重组毕赤酵母GS115-Ch-Glu发酵亚麻籽脱毒工艺的优化，食品工业，第36卷第2期：105-107，2015年)。
发明内容
本发明的目的是提供枯草芽孢杆菌BS及其在亚麻籽饼脱毒中的应用。
本发明提供的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)strain BS，分离自中国农业科学院中试基地采集的绵羊瘤胃液。该菌株已于2019年07月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.18229。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCCNo.18229，下文中简称为枯草芽孢杆菌BS。
本发明还提供枯草芽孢杆菌BS的培养物。
本发明还提供枯草芽孢杆菌BS的菌悬液。所述菌悬液具体可通过用无菌生理盐水重悬菌体得到。
本发明还提供一种产品，其活性成分为枯草芽孢杆菌BS、枯草芽孢杆菌BS的培养物或枯草芽孢杆菌BS的菌悬液。
本发明还提供一种降解生氰糖苷的方法，包括如下步骤：使用枯草芽孢杆菌BS、枯草芽孢杆菌BS的培养物或枯草芽孢杆菌BS的菌悬液对含有生氰糖苷的物质进行发酵处理，实现生氰糖苷的降解。
本发明还提供一种降解亚麻籽饼生氰糖苷的方法，包括如下步骤：使用枯草芽孢杆菌BS、枯草芽孢杆菌BS的培养物或枯草芽孢杆菌BS的菌悬液对亚麻籽饼进行发酵处理，实现生氰糖苷的降解。
本发明还提供一种降解亚麻籽饼大分子蛋白质的方法，包括以下步骤：将枯草芽孢杆菌BS、枯草芽孢杆菌BS的培养物或枯草芽孢杆菌BS的菌悬液与亚麻籽饼混合发酵，实现亚麻籽饼大分子蛋白质的降解。
本发明还提供一种提高亚麻籽饼中多肽含量的方法，包括以下步骤：将枯草芽孢杆菌BS、枯草芽孢杆菌BS的培养物或枯草芽孢杆菌BS的菌悬液与亚麻籽饼混合发酵，实现亚麻籽饼多肽含量的提高。
本发明还提供一种改善亚麻籽饼营养价值的方法，包括以下步骤：将枯草芽孢杆菌BS、枯草芽孢杆菌BS的培养物或枯草芽孢杆菌BS的菌悬液与亚麻籽饼混合发酵，降低亚麻籽饼中的抗营养因子—生氰糖苷，分解亚麻籽饼中不易消化的大分子蛋白质，提高亚麻籽饼多肽含量，从而改亚麻籽饼营养价值。
本发明还提供枯草芽孢杆菌BS、枯草芽孢杆菌BS的培养物或枯草芽孢杆菌BS的菌悬液的应用，所述应用如下：a)降解生氰糖苷；或b)降解亚麻籽饼中大分子蛋白质；或c)生产多肽。
本发明还提供枯草芽孢杆菌BS、枯草芽孢杆菌BS的培养物或枯草芽孢杆菌BS的菌悬液在制备发酵亚麻籽饼中的应用。
本发明还提供枯草芽孢杆菌BS、枯草芽孢杆菌BS的培养物或枯草芽孢杆菌BS的菌悬液在亚麻籽饼脱毒中的应用。所述亚麻籽饼脱毒具体可为降解亚麻籽饼中的主要抗营养因子生氰糖苷。
本发明还提供枯草芽孢杆菌BS、枯草芽孢杆菌BS的培养物或枯草芽孢杆菌BS的菌悬液在提高亚麻籽饼多肽含量中的应用。
本发明的枯草芽孢杆菌BS、枯草芽孢杆菌BS的培养物或枯草芽孢杆菌BS的菌悬液可以用于降解含有生氰糖苷的物质，例如亚麻籽饼。亚麻籽饼可以是各种方法准备的亚麻籽饼。因为低温冷榨亚麻籽饼最大程度地保留了生氰糖苷，动物毒性尤其高，所以使用本发明的方法进行发酵处理，可以卓有成效地去除亚麻籽饼中的生氰糖苷。
本发明提供的枯草芽孢杆菌BS，培养方法简单、生长速度快、能耐受高温、安全性高。本发明提供的枯草芽孢杆菌可应用于如下方面：(1)由于其具有较强的生氰糖苷降解能力，可用亚麻籽饼的脱毒处理；(2)由于其可显著提高亚麻籽饼多肽含量，可用于发酵亚麻籽饼或发酵饲料的制备；(3)由于该菌株具有抑制有害菌能力，因此可作为饲料添加剂使用，促进动物对营养物质的消化吸收，抑制动物胃肠道病原菌繁殖，促进肠道微生态平衡。
具体而言，本发明如下：
1.枯草芽孢杆菌BS，其保藏登记号为CGMCC No.18229，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏时间为2019年7月15日。
2.项1所述枯草芽孢杆菌BS的培养物。
3.项1所述枯草芽孢杆菌BS的菌悬液。
4.一种产品，其活性成分包括：项1所述枯草芽孢杆菌BS、项2所述培养物或项3所述菌悬液。
5.一种降解生氰糖苷的方法，包括以下步骤：将项1所述枯草芽孢杆菌BS、项2所述培养物或项3所述菌悬液与含有生氰糖苷的物质混合发酵。
6.一种降低亚麻籽饼中生氰糖苷的方法，包括以下步骤：将项1所述枯草芽孢杆菌BS、项2所述培养物或项3所述菌悬液与亚麻籽饼混合发酵。
7.一种降解亚麻籽饼大分子蛋白质、提高亚麻籽饼中多肽含量的方法，包括以下步骤：将项1所述枯草芽孢杆菌BS、项2所述培养物或项3所述菌悬液与亚麻籽饼混合发酵。
8.一种改善亚麻籽饼营养价值的方法，包括以下步骤：将项1所述枯草芽孢杆菌BS、项2所述培养物或项3所述菌悬液与亚麻籽饼混合发酵。
9.项1所述枯草芽孢杆菌BS、项2所述培养物或项3所述菌悬液的应用，所述应用如下：a)降解生氰糖苷；或b)降解亚麻籽饼中大分子蛋白质；或c)生产多肽。
10.项1所述枯草芽孢杆菌BS、项2所述培养物或项3所述菌悬液在制备发酵亚麻籽饼中的应用。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌BS的菌落图片。
图2为枯草芽孢杆菌BS的显微镜图片。
图3为枯草芽孢杆菌BS的生长曲线。
图4表示时间对枯草芽孢杆菌BS降解亚麻籽饼生氰糖苷的影响。
图5表示温度对枯草芽孢杆菌BS降解亚麻籽饼中生氰糖苷的影响。
图6表示料水比对枯草芽孢杆菌BS降解亚麻籽饼中生氰糖苷的影响。
图7表示接种量对枯草芽孢杆菌BS降解亚麻籽饼中生氰糖苷的影响。
图8表示最优工艺下枯草芽孢杆菌BS发酵处理亚麻籽饼生氰糖苷的含量。
图9为最优工艺下枯草芽孢杆菌BS发酵处理亚麻籽饼多肽的含量。
生物材料保藏信息
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)strain BS，保藏登记号为CGMCC No.18229，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏时间为2019年7月15日。
具体实施方式
下面给出以下的实施例，便于更好地理解本发明，但是本发明并不受到这些实施例的限定。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三个重复实验，结果取平均值。以下实施例中，所用水均为去离子水。以下实施例，如无特殊说明，所用亚麻籽饼均为购自呼和浩特市蒙谷香生物科技有限公司低温冷榨亚麻籽饼。
实施例1、枯草芽孢杆菌的分离纯化及鉴定
1.1枯草芽孢杆菌的分离纯化
1.1.1试验材料
亚麻籽饼采购于呼和浩特市蒙谷香生物科技有限公司。
绵羊瘤胃液采自中国农业科学院中试基地，并于4℃条件下保存。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
1.1.2培养基
细菌筛选固体培养基(七叶苷-LB固体培养基)：酵母提取物0.5g，琼脂粉1.5g，蛋白胨1g，氯化钠1g，七叶苷0.05g，柠檬酸铁0.01g，蒸馏水100mL，121℃灭菌20min。
细菌基础液体培养基(LB液体培养基)：酵母提取物0.5g，蛋白胨1g，氯化钠1g，蒸馏水100mL，121℃灭菌20min。
LB固体培养基：酵母提取物0.5g，琼脂粉1.5g，蛋白胨1g，氯化钠1g，蒸馏水100mL，121℃灭菌20min。
1.1.3试验方法
1.1.3.1生氰糖苷(CGs)降解菌的分离
本试验使用含有七叶苷柠檬酸铁的固体培养基，采用稀释涂布平板法分离目的菌株。其原理为：生氰糖苷的降解需要关键酶β–葡萄糖苷酶的参与。七叶苷可被β–葡萄糖苷酶分解生成七叶素，而七叶素与铁离子反应形成黑色化合物，可根据产生黑色圈的情况来筛选产β–葡萄糖苷酶的菌株。
取2个250mL锥形瓶分别标记为A1、A2，向每个锥形瓶中分别加入10g亚麻籽饼粉和10mL无菌蒸馏水，将4℃保存的绵羊瘤胃液混匀分别将5mL绵羊瘤胃液加入上述锥形瓶中，搅拌均匀，封瓶口膜封口，将A1、A2锥形瓶置于37℃的培养箱，培养72h，以富集能利用亚麻籽饼的菌株。培养72h后，分别取A1、A2锥形瓶中的培养物10g于另外2个250mL锥形瓶中，并加入100mL无菌蒸馏水和若干颗无菌玻璃珠，置于200r/min的摇床振荡30min。然后将所有锥形瓶取出，静置10min，出现上层清液后，取1mL上层清液按10-1、10-2、10-3、10-4倍稀释。将A1、A2的上层清液稀释液分别涂布于七叶苷-LB固体培养基，并置于37℃培养箱培养72h。培养72h后，挑取周围变黑的菌落，进行划线、分离，按照上述方法反复划线分离纯化，直至出现单一菌落。
1.1.3.2生氰糖苷(CGs)降解菌的初筛
将上述纯化后出现变色圈的菌株分别接种于10mL LB液体培养基中，培养24h后，摇匀，分别取10μL培养液滴在相应的七叶苷固体培养基的中央，在培养48h后用刻度尺分别测量变色圈直径(d1)和菌落直径(d2)的大小。每株菌设置三个重复。以d1/d2的结果为指标，筛选d1/d2比值结果较大的3株菌并保藏。
1.1.3.3生氰糖苷降解菌的复筛
将初筛得到的3株菌扩大培养后，分别取3mL菌液于300mL烧杯中，加入21mL的无菌蒸馏水，混匀，然后再加入30g亚麻籽饼粉，并搅拌均匀，用封瓶口膜封口，置于37℃培养箱中培养72h。每个处理设置3个重复。发酵结束后，将发酵料在自然状态下晾干。测定各试验样品中生氰糖苷的含量，选取生氰糖苷降解效果好的株菌进行鉴定。
1.1.4结果与分析
1.1.4.1数据统计与分析
试验数据采用Excel建立数据库，采用SPSS19.0软件中的单因素方差分析法进行分析，试验结果都以平均值±标准误的形式表示，以P<0.05表示差异显著。
1.1.4.2初筛结果
以绵羊瘤胃液为菌群来源，使用含有七叶苷柠檬酸铁的LB固体培养基，采用稀释涂布平板法从LB固体培养基中分离得到8株出现黑色圈的菌株，表1为这8株目的菌株黑色圈直径(d1)与菌落直径(d2)的测定值及d1/d2的计算结果。8株目的菌株中有3株菌(L1、L3、L4)的d1/d2的结果大于1.5。
表1目的菌株培养48h变色圈直径(d1)与菌落直径(d2)比值
Figure BDA0002579348870000081
1.1.4.3复筛结果
以发酵后亚麻籽饼中生氰糖苷(CGs)含量为指标，对初筛的3株菌进行复筛，结果如表2所示，菌株L4的脱毒效果最好，显著高于L1和L3的脱毒效果(P＜0.05)，因此菌株L4可作为发酵亚麻籽饼的目的菌株。
表2不同目的菌株发酵处理亚麻籽饼脱毒效果
Figure BDA0002579348870000091
注：同列数据肩标小写字母，表示差异显著(P＜0.05)。
1.2菌种的鉴定
1.2.1形态观察
参照《常见细菌***鉴定手册》对筛选到的菌株进行初步鉴定，目的菌株培养48h后观察单菌落的颜色、形状、大小、粗糙程度、边缘等。图1为菌株L4的菌落图片。将复筛得到的菌株L4在分离平板上培养48h后，可观察到菌株L4形成圆形菌落，边缘不规则，表面干燥粗糙。
图2为菌株L4显微镜下形态图片。在显微镜下观察到L4的菌体为杆状，革兰氏染色为阳性。
1.2.2分子生物学鉴定
将目的菌委托北京美吉桑格生物医药科技有限公司进行16S rDNA菌株鉴定。对L4菌株的16S rDNA进行扩增，将纯化后的PCR产物测序。
16S rDNA菌株鉴定结果表明：菌株L4属于芽孢杆菌属，与枯草芽孢杆菌(KY652941.1Bacillus subtilis strain)的相似性达100％。综合形态鉴定、分子生物学鉴定的结果，确定L4为枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)strain BS。
上述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)strain BS，已于2019年07月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为CGMCC No.18229。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC No.18229，本文称之为枯草芽孢杆菌BS。
实施例2、枯草芽孢杆菌BS发酵亚麻籽饼降解生氰糖苷功能的研究
2.1枯草芽孢杆菌BS生长曲线测定
将分离得到的枯草芽孢杆菌BS平板划线培养，挑取平板上单菌落于10mL LB液体培养基中并置于37℃、200r/min摇床振荡培养24h制成种子液，并按1％的接种量接种于250mL液体LB培养基中并置于37℃、200r/min摇床振荡培养36h，每2h取样一次，在紫外可见分光光度计600nm处测其光密度(OD)值，以OD600值表征菌体生长量，并绘制OD600与时间的关系曲线图。
图3为枯草芽孢杆菌BS的生长曲线。如图3所示，枯草芽孢杆菌BS经过短暂的生长缓慢期，在2h到24h处于生长对数期，在24h达到最大生长浓度，然后进入平台期。因此，在后续发酵试验中选取培养24h的菌液作为发酵的种子液。
2.2测定指标及方法
参考GB/T13084-2006中的比色法测定生氰糖苷的含量。
以上所有测定指标的结果均以绝干质量为基础。
2.3数据统计与分析
试验数据采用Excel建立数据库，采用SPSS19.0软件中的单因素方差分析法进行分析，试验结果都以平均值±标准误的形式表示，以P＜0.05表示差异显著。
2.4时间、温度、料水比和接种量对枯草芽孢杆菌BS发酵处理亚麻籽饼降解生氰糖苷的影响的单因素试验
采用控制变量法，分别研究发酵时间、发酵温度、料水比、接种量对目的菌株发酵效果的影响。以发酵后亚麻籽饼生氰糖苷的含量为评价指标。设置不同的单因素水平，每个处理设置三个重复。
2.4.1制备菌悬液
(1)挑取平板上单菌落于10mL LB液体培养基中并置于37℃、200r/min摇床振荡培养24h制成种子液。
(2)取步骤(1)得到的种子液按1％的接种量接种于250mL LB液体培养基中并置于37℃、200r/min摇床振荡培养24h，4000rpm离心10min，收集菌体，用无菌生理盐水洗涤3次。
(3)取步骤(2)得到的菌体，用250mL无菌生理盐水重悬制得菌悬液，菌悬液中的菌浓度为1.0×1010～2.0×1010cfu/mL。
2.4.2发酵时间对枯草芽孢杆菌BS发酵处理亚麻籽饼降解生氰糖苷的影响
取步骤2.4.1的菌悬液，保持接种量为10％、料水比为1∶0.8、温度37℃不变，发酵时间分别设置为24h、36h、48h、60h、72h。按上述参数进行发酵，发酵结束后自然状态下风干粉碎，测定生氰糖苷的含量。
图4为发酵时间对枯草芽孢杆菌BS降解亚麻籽饼生氰糖苷的影响。如图4所示，当接种量为10％、料水比为1∶0.8、温度37℃时，随着发酵时间的增加，发酵亚麻籽饼中生氰糖苷的含量逐渐降低并趋于稳定，在时间为72h处，发酵亚麻籽饼生氰糖苷的含量最低。提示在正交试验中可在48h到72h之间设定发酵时间的水平。
2.4.3发酵温度对枯草芽孢杆菌BS发酵处理亚麻籽饼降解生氰糖苷的影响
取步骤(1)的菌悬液，保持接种量为10％、料水比为1∶0.8、发酵时间72h不变，发酵温度分别设置为31℃、33℃、35℃、37℃、39℃。按上述参数进行发酵，发酵结束后自然状态下风干粉碎，测定生氰糖苷的含量。
图5为发酵温度对枯草芽孢杆菌BS降解亚麻籽饼中生氰糖苷的影响。如图5所示，当接种量为10％、料水比为1∶0.8、时间为72h时，随着发酵温度的升高，发酵亚麻籽饼中生氰糖苷的含量先降低后趋于平稳，在37℃和39℃之间趋于平稳，发酵亚麻籽饼生氰糖苷的含量达到最低。提示正交试验可在35℃到39℃之间设定发酵温度水平。
2.4.4料水比对枯草芽孢杆菌BS发酵处理亚麻籽饼降解生氰糖苷的影响
取步骤(1)的菌悬液，保持接种量为10％、温度37℃、时间72h不变，料水比分别为1∶0.6、1∶0.7、1∶0.8、1∶1、1∶1.2。按上述参数进行发酵，发酵结束后自然状态下风干粉碎，测定生氰糖苷的含量。
图6为料水比对枯草芽孢杆菌BS降解亚麻籽饼中生氰糖苷的影响。如图6所示，当接种量为10％、温度为37℃、发酵72h后，随着料水比的增加，发酵亚麻籽饼中生氰糖苷的含量出现先下降后升高的变化趋势，提示在正交试验中可在1∶0.6到1∶0.8之间设定发酵料水比水平。
2.4.5接种量对枯草芽孢杆菌BS发酵处理亚麻籽饼降解生氰糖苷的影响
取步骤(1)的菌悬液，保持料水比1∶0.8、温度37℃、发酵时间72h不变，接种量分别为2％、6％、10％、14％、18％。按上述参数进行发酵，发酵结束后自然状态下风干粉碎，测定生氰糖苷的含量。
图7为接种量对枯草芽孢杆菌BS降解亚麻籽饼中生氰糖苷的影响。如图7所示，当料水比1∶0.8、温度为37℃、发酵72h后，随着接种量的增加，发酵亚麻籽饼中生氰糖苷的含量呈现先下降后升高的趋势。提示在正交试验中可在4％到8％之间设定发酵接种量的水平。
实施例3、枯草芽孢杆菌BS发酵处理亚麻籽饼降解生氰糖苷的工艺优化
3.1测定指标及方法
参考GB/T13084-2006中的比色法测定生氰糖苷的含量，采用杜马斯全自动定氮仪测定粗蛋白质含量，采用滤袋法测定粗纤维含量，采用索氏抽提法测定粗脂肪含量，参照GB/T22492-2008大豆肽粉的测定方法测定多肽含量。
以上所有测定指标的结果均以绝干质量为基础。
3.2数据统计与分析
试验数据采用Excel建立数据库，采用SPSS19.0软件中的单因素方差分析法进行分析。除正交试验外，其他试验结果都以平均值±标准误的形式表示，以P＜0.05表示差异显著。
3.3制备菌悬液
(1)挑取平板上单菌落于10mL LB液体培养基中并置于37℃、200r/min摇床振荡培养24h制成种子液。
(2)取步骤(1)得到的种子液按1％的接种量接种于250mL液体LB培养基中并置于37℃、200r/min摇床振荡培养24h，4000rpm离心10min，收集菌体，用无菌生理盐水洗涤3次。
(3)取步骤(2)得到的菌体，用250mL无菌生理盐水重悬制得菌悬液,菌悬液中的菌浓度为1.0×1010～2.0×1010cfu/mL。
3.4发酵工艺优化
3.4.1正交试验
在单因素试验的基础上，确定目的菌株发酵亚麻籽饼的最优工艺。取步骤3.3的菌悬液，以发酵后生氰糖苷的含量为指标，采用L9(34)的正交试验设计对发酵时间(A)、发酵温度(B)、料水比(C)、接种量(D)四个因素进行优化，每个因素设三个水平，进行三水平四因素的正交优化试验，表3为正交试验设计因素水平表。
表3L9(34)正交试验因素水平表
Figure BDA0002579348870000121
3.4.2正交试验结果
在单因素试验的基础上进行正交试验。
表4是发酵亚麻籽饼工艺优化正交试验结果直观分析表。由表4发酵亚麻籽饼工艺优化正交试验结果直观分析表的R值可知，发酵温度对亚麻籽饼发酵后生氰糖苷的含量影响最大，发酵时间次之，料水比和接种量影响较小，即B＞A＞D＞C。K值表明，A3B3C2D3的试验处理可使发酵后亚麻籽饼中生氰糖苷的含量降到最优水平，即发酵时间为72h、发酵温度为39℃、料水比为1∶0.7、接种量为8％。
表4发酵亚麻籽饼工艺优化正交试验设计因素水平表及结果直观分析表
Figure BDA0002579348870000122
Figure BDA0002579348870000131
表5是发酵亚麻籽饼工艺优化正交试验方差分析表。由表5发酵亚麻籽饼工艺优化正交实验方差分析表可知，发酵时间水平3的生氰糖苷的含量显著低于发酵时间水平1、2的生氰糖苷的含量(P＜0.05)；发酵温度水平2、3的生氰糖苷的含量显著低于发酵温度水平1的生氰糖苷的含量(P＜0.05)，发酵温度水平3的生氰糖苷的含量低于发酵温度水平2的生氰糖苷的含量，统计学上差异不显著，但是P＝0.051表明两者有差异显著的趋势；料水比各水平间差异不显著(P＞0.05)；接种量各水平间差异不显著(P＞0.05)。由上述分析结果并结合生产实际，枯草芽孢杆菌BS发酵亚麻籽饼脱除生氰糖苷的最优条件为：A3B3C2D1，即发酵时间72h、发酵温度39℃、料水比1∶0.7、接种量4％。
表5发酵亚麻籽饼工艺优化正交试验结果方差分析表
Figure BDA0002579348870000132
注：同列数据肩标小写字母，表示差异显著(P＜0.05)。
3.4.3验证试验和扩大试验
按照正交试验确定的最优发酵条件，进行验证试验，设置三个重复并测定发酵后生氰糖苷的含量。
按照正交试验确定的最优发酵条件并将原料扩大至30kg进行扩大试验，分组如下，
发酵组：发酵时间72h、发酵温度39℃、料水比1∶0.7、接种量4％(菌株培养液4％)；
对照组：发酵时间72h、发酵温度39℃、料水比1∶0.7、LB液体培养基4％、山梨酸钾1％；
未处理组：亚麻饼原料不进行任何处理。
每个处理设置三个重复，处理后的样品经自然风干后测定CGs含量并计算CGs的脱毒率。CGs脱毒率(％)＝[(未处理组生氰糖苷的含量-发酵后生氰糖苷的含量)/未处理组生氰糖苷的含量]×100。
并且，分析扩大实验中各处理组亚麻籽饼的粗蛋白质、多肽、粗纤维和粗脂肪含量。
3.4.4验证试验和扩大试验结果
按照正交实验得到的最优发酵条件进行验证试验。验证试验结果，生氰糖苷的含量为33.42±2.05mg/kg，与正交试验中处理A3B3C2D1的生氰糖苷的含量(38.78±0.20mg/kg)差异不显著(P＞0.05)。
按照正交实验得到的最优发酵条件进行扩大试验。表6为发酵亚麻饼最优工艺扩大试验结果。扩大实验的结果，生氰糖苷的含量为34.78±1.86mg/kg，与正交试验中处理A3B3C2D1的生氰糖苷的含量(38.78±0.20mg/kg)差异不显著(P＞0.05)。如表6扩大试验结果，经枯草芽孢杆菌BS在发酵时间72h、发酵温度39℃、料水比1∶0.7、接种量4％的最优条件下发酵后，亚麻籽饼生氰糖苷的含量由未处理组的584.47±8.76mg/kg降为34.78±1.86mg/kg，CGs脱毒率达94.05％。
表6发酵亚麻籽饼最优工艺扩大试验结果
Figure BDA0002579348870000141
3.4.5发酵处理对亚麻籽饼营养价值的影响
表7表示发酵处理对亚麻籽饼营养成分的影响。发酵不仅脱除了亚麻籽饼中的主要抗营养因子—CGs，还提高了其营养价值。其中粗蛋白质(CP)含量由36.79±0.37％显著提高到39.43±0.53％(P＜0.05)；多肽含量由1.65±0.06％显著提高到4.41±0.03％(P＜0.05)；粗脂肪含量由8.81±0.09％显著提高到9.55±0.07％(P＜0.05)；粗纤维含量变化不显著(P＞0.05)。
表7发酵处理对亚麻籽饼营养成分的影响
Figure BDA0002579348870000142
注：同列数据肩标小写字母，表示差异显著(P＜0.05)。
实施例4、最优工艺参数下枯草芽孢杆菌BS发酵处理亚麻籽饼生氰糖苷和多肽含量及生氰糖苷的脱毒率。
4.1制备菌悬液
(1)挑取平板上单菌落于10mL LB液体培养基中并置于37℃、200r/min摇床培养24h制成种子液。
(2)取步骤(1)得到的种子液按1％的接种量接种于250mL液体LB培养基中并置于37℃、200r/min摇床振荡培养24h，4000rpm离心10min，收集菌体，用无菌生理盐水洗涤3次。
(3)取步骤(2)得到的菌体，用250mL无菌生理盐水重悬制得菌悬液,菌悬液中的菌浓度为1.0×1010～2.0×1010cfu/mL。
4.2最优工艺参数枯草芽孢杆菌BS发酵处理亚麻籽饼对生氰糖苷脱的含量及脱毒率
取步骤4.1的菌悬液，按照实施例3中确定的最优发酵工艺发酵处理亚麻籽饼，发酵后将发酵料自然风干粉碎，测定生氰糖苷的含量并计算生氰糖苷的脱毒率。
生氰糖苷脱毒率(％)＝[(未发酵亚麻籽饼生氰糖苷的含量-发酵后亚麻籽饼生氰糖苷的含量)/未发酵亚麻籽饼生氰糖苷的含量]×100％
结果见图8，枯草芽孢杆菌BS发酵处理亚麻籽饼生氰糖苷得到有效的脱除，生氰糖苷脱毒率达94.05％。
4.3最优工艺参数枯草芽孢杆菌BS发酵处理亚麻籽饼对多肽含量的影响
取步骤(1)的菌悬液，按照实施例3中确定的最优发酵工艺发酵处理亚麻籽饼，发酵后将发酵料自然风干粉碎，测定多肽含量。
结果见图9，枯草芽孢杆菌BS发酵处理亚麻籽饼，多肽含量显著提高。枯草芽孢杆菌BS分泌的蛋白酶将大分子蛋白质转化为更易被动物消化吸收的多肽，改善了亚麻籽饼的营养价值，使其能够更好地被动物利用。

Claims (10)

1.枯草芽孢杆菌BS，其保藏登记号为CGMCC No.18229，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国，北京，中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101，保藏时间为2019年7月15日。
2.权利要求1所述枯草芽孢杆菌BS的培养物。
3.权利要求1所述枯草芽孢杆菌BS的菌悬液。
4.一种产品，其活性成分包括：权利要求1所述枯草芽孢杆菌BS、权利要求2所述培养物或权利要求3所述菌悬液。
5.一种降解生氰糖苷的方法，包括以下步骤：将权利要求1所述枯草芽孢杆菌BS、权利要求2所述培养物或权利要求3所述菌悬液与含有生氰糖苷的物质混合发酵。
6.一种降低亚麻籽饼中生氰糖苷的方法，包括以下步骤：将权利要求1所述枯草芽孢杆菌BS、权利要求2所述培养物或权利要求3所述菌悬液与亚麻籽饼混合发酵。
7.一种降解亚麻籽饼大分子蛋白质、提高亚麻籽饼中多肽含量的方法，包括以下步骤：将权利要求1所述枯草芽孢杆菌BS、权利要求2所述培养物或权利要求3所述菌悬液与亚麻籽饼混合发酵。
8.一种改善亚麻籽饼营养价值的方法，包括以下步骤：将权利要求1所述枯草芽孢杆菌BS、权利要求2所述培养物或权利要求3所述菌悬液与亚麻籽饼混合发酵。
9.权利要求1所述枯草芽孢杆菌BS、权利要求2所述培养物或权利要求3所述菌悬液的应用，所述应用如下：
a)降解生氰糖苷；或
b)降解亚麻籽饼中大分子蛋白质；或
c)生产多肽。
10.权利要求1所述枯草芽孢杆菌BS、权利要求2所述培养物或权利要求3所述菌悬液在制备发酵亚麻籽饼中的应用。
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