CN106472819A - 一种富硒及蛹虫草活性物质的饲料的制备方法及应用 - Google Patents
一种富硒及蛹虫草活性物质的饲料的制备方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种富硒及蛹虫草活性物质的饲料的制备方法及应用。本发明提供了一种制备混合菌发酵物的方法，包括如下步骤(a1)和步骤(a2)：(a1)将产朊假丝酵母、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌接种至固体发酵培养基进行培养；(a2)完成步骤(a1)后，向培养体系中加入干酪乳杆菌和植物乳杆菌进行发酵培养。本发明采用蛹虫草培养基为主要原料，将富硒蛹虫草子实体收获后的废料充分利用。本发明获得的产品填补了发酵饲料领域的空白，开发集蛹虫草活性物质和硒的诸多生理功能于一体的新型功能型发酵饲料，而且工艺简单可行且绿色环保，在饲料行业和养殖业中具有很强的应用价值和广阔的前景，具有很大的社会效益和经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种富硒及蛹虫草活性物质的饲料的制备方法及应用。
背景技术
目前蛹虫草的人工栽培技术已经相当成熟，其人工培养基多采用小麦或大米培养基，生产已有相当规模，而且取得了一定的经济效益。在蛹虫草的人工培育过程中，注重收获的往往是具备较高活性成分如虫草素含量的蛹虫草子实体，而对于蛹虫草培养基(基座)却较少问津，这往往造成大量的蛹虫草培养基废弃，发酸变臭，造成环境污染。蛹虫草培养基虽已被代谢利用，但其主要成分仍多为淀粉、蛋白质等物质，很适合作为复合益生菌的培养原料。不仅如此，经研究表明，蛹虫草培养基中也含有很多有效的蛹虫草活性成分，如虫草素、虫草多糖等。近年来，开发高效、无残留、无公害的饲料添加剂成为研究的主要目标，这不仅是保障畜牧业持续健康发展的必然，也是保障人类健康、维持生态环境平衡的迫切需要。一些对环境友好、对人类健康的绿色饲料添加剂相继问世，如酶制剂、微生态制剂、功能性寡糖、酸化剂和中草药制剂等，安全、生态、绿色、经济成为饲料添加剂开发的主要方向。而功能型饲料由于具有特定的生物学作用，也成为研究热点。蛹虫草活性成分具有增强心脏功能、调节免疫、抗病毒、抗癌及促进造血等功能，如果将蛹虫草培养基相关产品再度开发为动物用饲料添加剂，则不仅可以协同疫苗免疫作用，增强群体免疫水平，降低疫病的发生率，而且有助于改善肉质和风味，提高产品附加值，是一种非常理想的功能型饲料。
在我国，硒的缺乏是一个普遍存在的问题。对缺硒地区而言，通过补充无机硒源——***钠，其吸收利用率低、安全性差，补硒还应主要以富含有机硒为好，因有机硒在利用率方面要优于无机硒，而通过微生物吸收、转化、富集的硒就是一类生物利用率非常高的硒源。
发明内容
本发明的目的是提供一种富硒及蛹虫草活性物质的饲料的制备方法及应用。
本发明提供了一种制备混合菌发酵物的方法，包括如下步骤(a1)和步骤(a2)：
(a1)将产朊假丝酵母、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌接种至固体发酵培养基进行培养；
(a2)完成步骤(a1)后，向培养体系中加入干酪乳杆菌和植物乳杆菌进行发酵培养。
所述产朊假丝酵母、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和固体发酵培养基的配比为：0.5×109CFU-1.5×109CFU：0.8×109CFU-2.1×109CFU：1.1×109CFU-2.6×109CFU：1.5×106CFU-5.0×106CFU：0.5×107CFU-1.5×107CFU：100g。
所述产朊假丝酵母、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和固体发酵培养基的配比具体可为：1.0×109CFU：1.4×109CFU：1.8×109CFU：3.2×106CFU：1.0×107CFU：100g。
所述产朊假丝酵母、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和固体发酵培养基的配比具体可为：0.5×109CFU：0.8×109CFU：1.1×109CFU：1.5×106CFU：0.5×107CFU：100g。
所述产朊假丝酵母、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和固体发酵培养基的配比具体可为：1.5×109CFU：2.1×109CFU：2.6×109CFU：5.0×106CFU：1.5×107CFU：100g。
所述固体发酵培养基的原料组成配比如下：蛹虫草基础培养基45-55g：麸皮25-35g：豆粕15-25g：水100ml。
所述固体发酵培养基的原料组成配比具体可为：蛹虫草基础培养基50g：麸皮30g，豆粕20g：水100ml。
所述固体发酵培养基的原料组成配比具体可为：蛹虫草基础培养基45g：麸皮25g：豆粕15g：水100ml。
所述固体发酵培养基的原料组成配比具体可为：蛹虫草基础培养基55g：麸皮35g：豆粕25g：水100ml。
所述蛹虫草基础培养基为培养过富硒蛹虫草子实体，将富硒蛹虫草子实体采收后的废弃培养基。
所述蛹虫草基础培养基为硒含量为3.0mg/kg以上的蛹虫草培养基。
所述蛹虫草基础培养基为硒含量为3.0mg/kg-10.0mg/kg的蛹虫草培养基。
所述蛹虫草基础培养基具体可为硒含量为5.0mg/kg的蛹虫草培养基。
所述蛹虫草基础培养基具体可为蛹虫草小麦基础培养基。
所述蛹虫草基础培养基具体还可为蛹虫草大米基础培养基。
所述蛹虫草小麦基础培养基的制备方法为：将蛹虫草菌株接种于蛹虫草子实体小麦培养基中进行培养；培养结束后，收获子实体(沿着培养基座表面将子实体割断，采收)，将剩余的培养体系烘干粉碎并过40目筛，得到富硒蛹虫草小麦培养基。
所述蛹虫草大米基础培养基的制备方法为：将蛹虫草菌株接种于蛹虫草子实体大米培养基中进行培养；培养结束后，收获子实体(沿着培养基座表面将子实体割断，采收)，将剩余的培养体系烘干粉碎，得到富硒蛹虫草大米培养基。
所述烘干为65℃烘干至水分含量为8％(质量百分含量)。
所述“蛹虫草小麦基础培养基的制备方法”或“蛹虫草大米基础培养基的制备方法”中，所述培养包括如下阶段：发菌暗培养阶段(10天)：黑暗培养，温度20℃，空气相对湿度60％；转色期培养阶段(20天)：温度18℃-28℃(存在昼夜温差，最高温度为28℃，最低温度为18℃)，空气相对湿度70％，光照强度300lux，光照时间10小时/天，光源类型为日光灯；子实体生长管理阶段(15天)：温度14℃，空气相对湿度80％，光照强度300Lux，光照时间8小时/天，光源类型为日光灯；蓝光培养阶段(10天)：温度14℃，空气相对湿度80％，光照强度200Lux，光照时间8小时/天，光源类型为蓝光。
所述蛹虫草子实体小麦培养基的原料配比为：1L营养液：1000g小麦籽粒；所述营养液由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述营养液中的浓度如下：葡萄糖1g/100ml、蔗糖0.5g/100ml、酵母粉0.5g/100ml、蛋白胨0.5g/100ml、磷酸二氢钾0.03g/100ml、磷酸氢二钾0.05g/100ml、柠檬酸铁铵0.03g/100ml、氯化钠0.05g/100ml、硫酸镁0.02g/100ml、***钠1mg/100ml、维生素B1 2mg/100ml、维生素B2 1mg/100ml、维生素B11 1mg/100ml；所述溶剂为水。
所述蛹虫草子实体大米培养基的原料配比为：1L营养液：1000g大米；所述营养液由溶质和溶剂组成；所述溶质及其在所述营养液中的浓度如下：葡萄糖1g/100ml、蔗糖0.5g/100ml、酵母粉0.5g/100ml、蛋白胨0.5g/100ml、磷酸二氢钾0.03g/100ml、磷酸氢二钾0.05g/100ml、柠檬酸铁铵0.03g/100ml、氯化钠0.05g/100ml、硫酸镁0.02g/100ml、***钠1mg/100ml、维生素B1 2mg/100ml、维生素B2 1mg/100ml、维生素B11 1mg/100ml；所述溶剂为水。
所述方法还包括如下步骤：完成步骤(a1)后，向培养体系中加入无菌水使培养体系的含水量达60-70％。
所述步骤(a1)的培养条件为：28-33℃培养，第0-24h每6h搅拌一次，第24h-36h静置培养。
所述步骤(a1)的培养条件具体可为：33℃培养，第0-24h每6h搅拌一次，第24h-36h静置培养。
所述步骤(a1)的培养条件具体可为：28℃培养，第0-24h每6h搅拌一次，第24h-36h静置培养。
所述步骤(a1)的培养条件具体可为：30℃培养，第0-24h每6h搅拌一次，第24h-36h静置培养。
所述步骤(a2)的培养条件为：35-42℃静置发酵48h。
所述步骤(a2)的培养条件具体可为：35℃静置发酵48h。
所述步骤(a2)的培养条件具体可为：42℃静置发酵48h。
所述步骤(a2)的培养条件具体可为：38℃静置发酵48h。
本发明还保护所述采用所述方法制备得到的混合菌发酵物。
所述混合菌发酵物满足如下参数(c1)-(c12)中至少一种：
(c1)有机硒含量为400mg/kg以上；
(c2)总硒含量为420mg/kg以上；
(c3)虫草素含量为1000mg/kg以上；
(c4)腺苷含量为700mg/kg以上；
(c5)游离氨基酸含量为50mg/g以上；
(c6)小肽占总肽的质量分数为5.5％以上；
(c7)还原糖含量为40mg/g以上；
(c8)枯草芽孢杆菌活菌数为1.5×108cfu/g以上；
(c9)地衣芽胞杆菌活菌数为1.5×108cfu/g以上；
(c10)干酪乳杆菌活菌数为0.5×107cfu/g以上；
(c11)植物乳杆菌活菌数为0.5×106cfu/g以上；
(c12)产朊假丝酵母菌活菌数为2.5×107cfu/g以上。
本发明还保护所述混合菌发酵物的应用，为如下(b1)-(b4)中任一种：
(b1)作为饲料；
(b2)作为饲料添加剂；
(b3)制备饲料；
(b4)制备饲料添加剂。
本发明还保护一种混合菌剂，包括产朊假丝酵母、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌和植物乳杆菌。
所述混合菌剂的用途为制备所述混合菌发酵物。
本发明还保护一种用于制备所述混合菌发酵物的试剂盒，包括产朊假丝酵母、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、麸皮和豆粕。
本发明还保护所述蛹虫草基础培养基在制备饲料或饲料添加剂中应用。
以上任一所述饲料或饲料添加剂具体可为猪饲料或猪饲料添加剂。
以上任一所述饲料或饲料添加剂可以增加饲养动物的日采食量和日增重，降低饲养动物的腹泻率。
以上任一所述麸皮具体为小麦麸皮。
以上任一所述产朊假丝酵母具体可为产朊假丝酵母S1204；所述产朊假丝酵母S1204的来源具体可为：中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：M2012216。产朊假丝酵母S1204已经在发明专利(申请日：2012.07.24，申请号：201210258191.2，授权公告日：2014.09.10，授权公告号：CN102816707 B)中公开。
以上任一所述地衣芽孢杆菌具体可为广东省微生物菌种保藏中心，编号：GIM1.182的菌株。
以上任一所述枯草芽孢杆菌具体可为广东省微生物菌种保藏中心，编号：GIM1.372的菌株。
以上任一所述干酪乳杆菌具体可为广东省微生物菌种保藏中心，编号：GIM1.159的菌株。
以上任一所述植物乳杆菌具体可为广东省微生物菌种保藏中心，编号：GIM1.191的菌株。
本发明采用蛹虫草培养基为主要原料，将富硒蛹虫草子实体收获后的废料充分利用，同时采用富硒产朊假丝酵母菌株等益生菌对蛹虫草培养基中无机硒进行进一步的转化与富集，增加有机硒源，提高营养价值，化废为宝；在选用蛹虫草培养基为主要原料的同时，发酵过程中还添加了豆粕粉、麸皮粉为辅料，经益生菌代谢消化，使辅料在发酵时既保证了益生菌的有效发酵，降低了抗营养因子含量，又可减少豆粕麸皮中的营养物质由于发酵造成的损失。而且经过发酵之后，蛹虫草活性活性成分得到有效释放，达到特别强化虫草活性营养成分目的。本发明获得的产品填补了发酵饲料领域的空白，开发集蛹虫草活性物质和硒的诸多生理功能于一体的新型功能型发酵饲料，而且工艺简单可行且绿色环保，在饲料行业和养殖业中具有很强的应用价值和广阔的前景，具有很大的社会效益和经济效益。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
蛹虫草菌株：广东省微生物菌种保藏中心，编号：GIM5.269。
产朊假丝酵母S1204：中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC；地址：中国武汉，武汉大学；邮编：430072)，保藏编号为CCTCC NO：M2012216。产朊假丝酵母S1204已经在发明专利(申请日：2012.07.24，申请号：201210258191.2，授权公告日：2014.09.10，授权公告号：CN102816707 B)中公开。
地衣芽胞杆菌：广东省微生物菌种保藏中心，编号：GIM1.182。
枯草芽孢杆菌：广东省微生物菌种保藏中心，编号：GIM1.372。
干酪乳杆菌：广东省微生物菌种保藏中心，编号：GIM1.159。
植物乳杆菌：广东省微生物菌种保藏中心，编号：GIM1.191。
活化培养基：马铃薯浸出粉20g，葡萄糖20g，***钠5mg，琼脂15-20g，蒸馏水定容至1000mL；121℃高压蒸汽灭菌20min。
PDA液体培养基：马铃薯浸出粉20g，葡萄糖20g，蛋白胨15g，***钠5mg，磷酸二氢钾0.8g，硫酸镁0.3g，维生素B1 20mg，蒸馏水定容至1000mL；调pH至6.5-7.0，121℃高压蒸汽灭菌20min。
蛹虫草子实体小麦培养基：取葡萄糖，蔗糖，酵母粉，蛋白胨，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，柠檬酸铁铵、氯化钠，硫酸镁，***钠，维生素B1，维生素B2，维生素B11，调pH至7.5，蒸馏水定容至1000ml，制成营养液；1000ml营养液与1000g小麦籽粒混合均匀，121℃高压蒸汽灭菌20min。各溶质在营养液中的浓度如下：葡萄糖1g/100ml、蔗糖0.5g/100ml、酵母粉0.5g/100ml、蛋白胨0.5g/100ml、磷酸二氢钾0.03g/100ml、磷酸氢二钾0.05g/100ml、柠檬酸铁铵0.03g/100ml、氯化钠0.05g/100ml、硫酸镁0.02g/100ml、***钠1mg/100ml、维生素B1 2mg/100ml、维生素B2 1mg/100ml、维生素B11 1mg/100ml。
蛹虫草子实体大米培养基：取葡萄糖，蔗糖，酵母粉，蛋白胨，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，柠檬酸铁铵、氯化钠，硫酸镁，***钠，维生素B1，维生素B2，维生素B11，调pH至7.5，蒸馏水定容至1000ml，制成营养液；1000ml营养液与1000g大米混合均匀，121℃高压蒸汽灭菌20min。各溶质在营养液中的浓度如下：葡萄糖1g/100ml、蔗糖0.5g/100ml、酵母粉0.5g/100ml、蛋白胨0.5g/100ml、磷酸二氢钾0.03g/100ml、磷酸氢二钾0.05g/100ml、柠檬酸铁铵0.03g/100ml、氯化钠0.05g/100ml、硫酸镁0.02g/100ml、***钠1mg/100ml、维生素B12mg/100ml、维生素B2 1mg/100ml、维生素B11 1mg/100ml。
PDA固体斜面培养基：马铃薯浸出粉20g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水定容至1000mL；121℃高压蒸汽灭菌22min。
种子强化培养基：酵母粉10g，蛋白胨10g，氯化钠5g，糖蜜100g，***钠50mg，加蒸馏水定容1000ml，制成营养液；1000ml营养液与1000g小麦籽粒混合均匀，隔水蒸30min，得到种子强化培养基；121℃高压灭菌25min。
YPD液体培养基：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000mL；121℃高压灭菌20min。
营养肉汁固体斜面培养基：蛋白胨5g，牛肉膏10g，氯化钠3g，磷酸氢二钾1g，15g琼脂粉，蒸馏水定容至1000mL，调pH至7.0-7.2；121℃高压蒸汽灭菌22min。
营养肉汁液体培养基：蛋白胨5g，牛肉膏10g，氯化钠3g，磷酸氢二钾1g，蒸馏水定容至1000mL，调pH至7.0-7.2；121℃高压蒸汽灭菌22min。
糖蜜培养基：糖蜜100g，硝酸铵5g，蒸馏水定容至1000mL；121℃高压蒸汽灭菌22min。
MRS培养基：蛋白胨10.0g，牛肉浸膏10.0g，酵母提取粉5.0g，葡萄糖5.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸二胺2.0g，吐温801.0g，磷酸氢二钾2.0g，七水硫酸镁0.2g，七水硫酸锰0.05g，碳酸钙20.0g，蒸馏水定容至1000mL，pH6.8；121℃高压蒸汽灭菌22min。
固体发酵培养基的配制方法为：取富硒蛹虫草小麦培养基或富硒蛹虫草大米培养基、麸皮和豆粕粉碎过40目筛，加蒸馏水定容至100ml，搅拌混合均匀，静置30min；然后在压力0.1Mpa，温度110℃条件下蒸30min，进行混合原料的灭菌，灭菌后冷却至室温。按照上述方法分别制备得到固体发酵培养基甲、固体发酵培养基乙及固体发酵培养基丙。
固体发酵培养基甲中，各溶质的浓度如下：富硒蛹虫草小麦培养基50g/100ml、麸皮30g/100ml、豆粕20g/100ml。
固体发酵培养基乙中，各溶质的浓度如下：富硒蛹虫草小麦培养基45g/100ml、麸皮25g/100ml、豆粕15g/100ml。
固体发酵培养基丙中，各溶质的浓度如下：富硒蛹虫草大米培养基55g/100ml、麸皮35g/100ml、豆粕25g/100ml。
基础日粮：玉米55％，豆粕粉22％，麸皮12％，猪浓缩料11％。
猪浓缩饲料：河南九鼎农牧发展有限公司。
杜长大仔猪：江苏辉煌猪业养猪有限公司。
实施例1、基础培养基(富硒蛹虫草培养基)的制备
一、蛹虫草菌株的活化培养
将蛹虫草菌株接种至活化培养基进行活化培养，24℃避光培养7天。
二、蛹虫草菌株液体种子的制备
1、用无菌生理盐水悬浮蛹虫草菌株的孢子，得到孢子浓度为1.8×107个/mL的孢子悬液。
2、将步骤1得到的孢子悬液接种于PDA液体培养基中(孢子悬液和PDA液体培养基的配比为5ml∶100ml)，24℃，200r/min振荡培养3天，获得液体种子。
三、蛹虫草子实体的培养与收集
将100ml步骤二得到的液体种子接种于1000g蛹虫草子实体小麦培养基中进行培养。
具体的培养工艺包括如下阶段：发菌暗培养阶段(10天)：黑暗培养，温度20℃，空气相对湿度60％；转色期培养阶段(20天)：温度18℃-28℃(存在昼夜温差，最高温度为28℃，最低温度为18℃)，空气相对湿度70％，，光照强度300lux，光照时间10小时/天，光源类型为日光灯；子实体生长管理阶段(15天)：温度14℃，空气相对湿度80％，光照强度300Lux，光照时间8小时/天，光源类型为日光灯；蓝光培养阶段(10天)：温度14℃，空气相对湿度80％，光照强度200Lux，光照时间8小时/天，光源类型为蓝光。
四、富硒蛹虫草小麦培养基的获得
完成步骤三后，收获子实体(沿着培养基座表面将子实体割断，采收)，将剩余的培养体系65℃烘干至水分含量为8％，然后粉碎并过40目筛，得到富硒蛹虫草小麦培养基。经测定，富硒蛹虫草小麦培养基中的总硒含量为5.0mg/kg，虫草素含量为2.5g/kg。
检测总硒含量的方法：参照参考文献“王莹，铁梅，康平利，等.ICP-MS等三种测定蛹虫草硒含量方法的比较[J].光谱学与光谱分析，2009，29(3)：815-818.”中的3，3-二氨基联苯胺分光光度法。
检测虫草素的方法：NY/T 2116-2012虫草制品中虫草素和腺苷的测定高效液相色谱法。
五、富硒蛹虫草大米培养基的获得
采用蛹虫草子实体大米培养基替代蛹虫草子实体小麦培养基按照步骤一到步骤四进行操作，得到富硒蛹虫草大米培养基。富硒蛹虫草大米培养基中的总硒含量和虫草素含量与富硒蛹虫草小麦培养基中的总硒含量和虫草素含量无显著性差异。
实施例2、多类益生菌的种子液的制备
一、产朊假丝酵母S1204菌株种子液的制备
1、将产朊假丝酵母S1204菌株接种至PDA固体斜面培养基，30℃培养20h。
2、用10ml无菌的生理盐水悬浮产朊假丝酵母S1204，得到菌浓度为0.6-1.8×107CFU/ml的菌悬液。
3、将10ml步骤2制备的菌悬液接种至100g种子强化培养基中，30℃培养16h，得到强化种子。
4、称取1g步骤3得到的强化种子，接种至100mL的YPD液体培养基中，30℃、200r/min振荡培养16h，得到产朊假丝酵母S1204种子液(种子液中的菌浓度为0.5-1.5×108CFU/mL)。
二、枯草芽孢杆菌与地衣芽孢杆菌种子液的制备
分别制备枯草芽孢杆菌种子液和地衣芽孢杆菌种子液。
1、将枯草芽孢杆菌菌株和地衣芽孢杆菌菌株分别接种于营养肉汁固体斜面培养基，37℃培养16h。
2、用10ml无菌的生理盐水将步骤1培养好的营养肉汁固体斜面培养基上的菌落洗脱，得到10ml枯草芽孢杆菌菌悬液(浓度为0.5-1.2×106CFU/ml)和10ml地衣芽孢杆菌菌悬液(浓度为0.3-1.1×106CFU/ml)。
3、将步骤2制备的10ml枯草芽孢杆菌菌悬液和10ml地衣芽孢杆菌菌悬液分别接种至装有100mL的营养肉汁液体培养基的1000mL三角瓶中，37℃，摇床转速250r/min下培养16h，得到枯草芽孢杆菌种子液(浓度为1.1-2.6×108CFU/mL)和地衣芽孢杆菌种子液(浓度为0.8-2.1×108CFU/mL)。
三、植物乳杆菌种子液的制备
1、将植物乳杆菌菌株接种至装有100mL糖蜜培养基的150mL的三角瓶中，保鲜膜密封，30℃静置培养24h，得到活化的菌液(浓度为0.5-2.0×105CFU/mL)。
2、将100ml步骤1得到的菌液接种至装有200mL的糖蜜培养基的250mL三角瓶中，保鲜膜密封，30℃静置培养24h，得到植物乳杆菌种子液(浓度为0.5-1.5×106CFU/mL)。
四、干酪乳杆菌种子液的制备
1、将干酪乳杆菌菌株接种至装有100mL的MRS培养基的150mL的三角瓶中，保鲜膜密封，30℃静置培养24h，得到活化的菌液(浓度为0.3-0.9×105CFU/mL)。
2、将100ml步骤1得到的菌液接种至装有200mL的MRS培养基的250mL三角瓶中，保鲜膜密封，30℃静置培养24h，得到干酪乳杆菌种子液(浓度为1.5-5.0×105CFU/mL)。
实施例3、发酵饲料的制备
采用实施例2制备的产朊假丝酵母S1204种子液、地衣芽孢杆菌种子液、枯草芽孢杆菌种子液、干酪乳杆菌种子液和植物乳杆菌种子液进行下述试验。
1、发酵饲料的制备过程分为三个试验组(均以100g固体培养基示例描述)：
试验组甲：第一阶段：将10mL产朊假丝酵母S1204种子液(10mL种子液中含有1.0×109CFU的产朊假丝酵母)、10mL地衣芽孢杆菌种子液(10mL种子液中含有1.4×109CFU的地衣芽孢杆菌)和10mL枯草芽孢杆菌种子液(10mL种子液中含有1.8×109CFU的枯草芽孢杆菌)接种至100g固体发酵培养基甲，33℃培养，第0-24h每6h搅拌一次，第24h-36h静置培养，第36h加入无菌水增湿使培养体系的含水量达65％；第二阶段：完成第一阶段后，向培养体系中接种10mL干酪乳杆菌种子液(10mL种子液中含有3.2×106CFU的干酪乳杆菌)和10mL植物乳杆菌种子液(10mL种子液中含有1.0×107CFU的植物乳杆菌)，35℃继续静置发酵48h，得到发酵产物甲。
试验组乙：第一阶段：将10mL产朊假丝酵母S1204种子液(10mL种子液中含有0.5×109CFU的产朊假丝酵母)、10mL地衣芽孢杆菌种子液(10mL种子液中含有0.8×109CFU的地衣芽孢杆菌)和10mL枯草芽孢杆菌种子液(10mL种子液中含有1.1×109CFU的枯草芽孢杆菌)接种至100g固体发酵培养基甲，28℃培养，第0-24h每6h搅拌一次，第24h-36h静置培养，第36h加入无菌水增湿使固体培养基含水量达70％；第二阶段：完成第一阶段后，向培养体系中接种10mL干酪乳杆菌种子液(10mL种子液中含有1.5×106CFU的干酪乳杆菌)和10mL植物乳杆菌种子液(10mL种子液中含有0.5×107CFU的植物乳杆菌)，42℃继续静置发酵48h，得到发酵产物乙。
试验组丙：第一阶段：将10mL产朊假丝酵母S1204种子液(10mL种子液中含有1.5×109CFU的产朊假丝酵母)、10mL地衣芽孢杆菌种子液(10mL种子液中含有2.1×109CFU的地衣芽孢杆菌)和10mL枯草芽孢杆菌种子液(10mL种子液中含有2.6×109CFU的枯草芽孢杆菌)接种至100g固体发酵培养基甲，30℃培养，第0-24h每6h搅拌一次，第24h-36h静置培养，第36h加入无菌水增湿使固体培养基含水量达60％；第二阶段：完成第一阶段后，向培养体系中接种10mL干酪乳杆菌种子液(10mL种子液中含有5.0×106CFU的干酪乳杆菌)和10mL植物乳杆菌种子液(10mL种子液中含有1.5×107CFU的植物乳杆菌)，38℃继续静置发酵48h，得到发酵产物丙。
3、步骤2发酵结束后，分别取发酵产物甲、发酵产物乙、发酵产物丙，40℃-50℃干燥至水分含量为8％，然后粉碎过40目筛，得到饲料产品甲、饲料产品乙和饲料产品丙。各个产品冷却后密封，置于4℃干燥处保藏。
4、对步骤3得到的饲料产品甲、发酵饲料产品乙和发酵饲料产品丙进行总硒含量、有机硒含量、虫草素含量、腺苷含量、小肽含量(占总肽的质量分数)、游离氨基酸含量、还原糖含量和活菌数含量的测定。
检测总硒含量的方法：参照参考文献“王莹，铁梅，康平利，等.ICP-MS等三种测定蛹虫草硒含量方法的比较[J].光谱学与光谱分析，2009，29(3)：815-818.”中的3，3-二氨基联苯胺分光光度法。
检测有机硒含量的方法：DBS 42/002-2014富有机硒食品硒含量要求。
检测虫草素、腺苷含量的方法：NY/T 2116-2012虫草制品中虫草素和腺苷的测定高效液相色谱法。
检测小肽含量(占总肽的质量分数)的方法：GB/T22492-2008大豆肽粉中的方法。
检测游离氨基酸的方法：NY/T 1975-2010水溶肥料游离氨基酸含量的测定的氨基酸自动分析仪法。
检测还原糖的方法：采用全自动还原糖测定仪测定还原糖。
检测活菌数的方法：采用稀释涂布法进行活菌数的检测。
检测结果如表1所示。
表1饲料产品成分含量检测结果
饲料产品甲中有机硒含量占总硒含量的99.17％。
饲料产品乙中有机硒含量占总硒含量的95.24％。
饲料产品丙中有机硒含量占总硒含量的98.86％。
实施例4、饲喂效果实验
将120只杜长大健康仔猪(8.5-9.5kg)随机分为4组(对照组、实验组甲、实验组乙和实验组丙)，每组10只(公母各半)，每组设置三个重复。各组仔猪饲喂的饲料如下：
对照组：基础日粮。
实验组甲：在基础日粮中加入质量分数0.1％的实施例3得到的饲料产品甲。
实验组乙：在基础日粮中加入质量分数0.3％的实施例3得到的饲料产品乙。
实验组丙：在基础日粮中加入质量分数0.5％的实施例3得到的饲料产品丙。
饲养采用全舍饲法，仔猪自由采食和饮水，试验期为30天，记录试验猪的日采食量，试验结束时结料并称重，计算日均采食量、日增重、料重比、腹泻率和成活率。结果见表1。
表1各组统计结果
注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著：P＜0.05，肩标相同小写字母表示差异不显著：P＞0.05。
结果表明，同对照组相比，各实验组的日采食量和日增重都有显著提高，料重比降低，而且腹泻率显著下降，成活率明显增加。
Claims (10)
1.一种制备混合菌发酵物的方法，包括如下步骤：
(a1)将产朊假丝酵母、地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌接种至固体发酵培养基进行培养；
(a2)完成步骤(a1)后，向培养体系中加入干酪乳杆菌和植物乳杆菌进行发酵培养。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述产朊假丝酵母、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌和固体发酵培养基的配比为：0.5×109CFU-1.5×109CFU：0.8×109CFU-2.1×109CFU：1.1×109CFU-2.6×109CFU：1.5×106CFU-5.0×106CFU：0.5×107CFU-1.5×107CFU：100g。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述固体发酵培养基的原料组成配比如下：蛹虫草基础培养基45-55g：麸皮25-35g：豆粕15-25g：水100ml。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述蛹虫草基础培养基为硒含量为3.0mg/kg以上的蛹虫草培养基。
5.如权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：完成步骤(a1)后，向培养体系中加入无菌水使培养体系的含水量达60-70％。
6.采用权利要求1-5任一所述的方法制备的混合菌发酵物。
7.权利要求6所述混合菌发酵物的应用，为如下(b1)-(b4)中任一种：
(b1)作为饲料；
(b2)作为饲料添加剂；
(b3)制备饲料；
(b4)制备饲料添加剂。
8.一种混合菌剂，包括产朊假丝酵母、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌和植物乳杆菌。
9.一种用于制备权利要求6所述混合菌发酵物的试剂盒，包括产朊假丝酵母、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、麸皮和豆粕。
10.蛹虫草基础培养基在制备饲料或饲料添加剂中应用。
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