CN115088785A - 一种防治嗜水气单胞菌的复方发酵中药饲料添加剂的制备方法及其用途 - Google Patents
一种防治嗜水气单胞菌的复方发酵中药饲料添加剂的制备方法及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物饲料领域，具体涉及一种防治嗜水气单胞菌的复方发酵中药饲料添加剂的制备方法及其用途；步骤为：活化菌株、培养得到芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌发酵种子液；将研磨成粉的复方中药材与豆粕、次粉混合后，添加复合酶得到发酵培养基，接种芽孢杆菌发酵种子液、酵母菌发酵种子液以及乳酸菌发酵种子液，在密闭条件下进行厌氧发酵后得到最终产品；本发明采用复方中药材进行菌酶协同发酵，得到的产品能够有效控制嗜水气单胞菌，且该饲料添加剂中富含益生菌，可有效提升养殖动物的免疫力，具还有酸香味、动物喜食；且利于工业生产，使用方便、便于贮藏，具备良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物饲料领域，具体涉及一种防治嗜水气单胞菌的复方发酵中药饲料添加剂的制备方法及其在水产养殖中的应用。
背景技术
嗜水气单胞菌(Aeromonas Hydrophila)是一种革兰氏阴性的条件致病菌，当水体洁净时无污染时一般不致病，而当水质恶化时，其菌体毒力提升，其会产生许多致病物质，如几丁质酶、胞外蛋白酶、脂酶等多种酶和溶血毒素、肠毒素、细胞毒素等外毒素。它也是水产养殖过程中最常见也是危害最大的致病菌之一，水产动物一旦被感染会出现胃肠道出血，体表溃烂流血等症状。且病原菌会随着被感染动物的身体，***物等继续在养殖池里传播，继续造成感染，导致养殖动物成片死亡。为了防治疾病的爆发，养殖户往往加入过量抗生素，而随着抗生素的禁用亟需寻找一种抗生素替代品。发酵中草药最有机会成为抗生素替代品用于水产养殖，其除了具有中草药绿色安全的特性外，经过发酵后产生的有机酸、抗菌肽等物质同样具有抗菌效果，且其中还富含丰富的活菌成分可于养殖动物肠道内定植，增强养殖动物的免疫力。
目前已有部分研究将发酵中药用于动物养殖和疾病的防治，但其主要均应用于畜牧养殖业中的疾病防治，如专利CN113616715A、专利CN113813345A等等。现有的文献中缺少发酵中药针对水产养殖业中应用方面的研究，特别是在水产养殖中危害极大的嗜水气单胞菌的防治。而且多数文献在研制发酵中药饲料时，缺少一个对中药进行筛选的过程，中药种类繁多，功效各不相同，因此在针对不同疾病，不同病原菌应该选择不同种类的中药原料。有文献公开将蝙蝠蛾拟青霉接种于药性基质中进行发酵制备发酵中药用于治疗断奶仔猪的腹泻，其发酵中药属于好氧发酵，发酵敞口进行，因此会增加空气中的杂菌污染发酵基质的风险。如专利CN113648393A，其将中药、辅料与发酵菌种—乳酸菌和枯草芽孢杆菌，混匀同时发酵，但其发酵菌株未选择酵母菌同时进行，并且效果欠佳，尤其是在提升养殖动物的免疫力方面。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种防治嗜水气单胞菌的复方发酵中药饲料添加剂的制备方法及在水产养殖中应用；首先针对病原菌——嗜水气单胞菌的抑菌中药做了大量筛选，同时还对发酵菌种和酶进行了筛选，对中药与辅料的添加比例和发酵菌种的生长关系进行了研究，得到了最适的中药添加比例。
通过抑菌实验筛选得到针对嗜水气单胞菌具有较好抑菌效果的中药材、通过筛选得到合适的菌酶用于发酵、通过改变不同中药添加比例测定发酵菌种的菌群变化探究合适的中药添加量，将复方中药材进行发酵处理，使其药效成分提升或转化为其它易于吸收的药效成分，且该饲料添加剂中富含益生菌，针对嗜水气单胞菌有极好的防治效果。同时可有效提升养殖动物的免疫力、肠道消化水平；在短期嗜水气单胞菌攻毒实验中，亦可有效提升中华鳖稚鳖的存活率。
为实现上述发明目的，本发明采取的技术方案具体如下：
(1)配制发酵培养基：将复方中药材、豆粕与次粉混合，再添加纤维素酶、半纤维素酶、单宁酶，混合后得到固态发酵培养基；
发酵培养基的各组分重量百分含量分别为：复方中药材10～90％；豆粕6～54％；次粉4～36％；复合酶添加量0.1～10％；所述复方中药材由以下重量百分比的材料组成：黄芩4～36％、五倍子2.4～21.6％、野菊花2.8～25.2％、地锦草0.8～7.2％；所述复合酶由纤维素酶、半纤维素酶和单宁酶组成；
(2)将芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌分别接种到相应的液体培养基进行活化培养，分别得到芽孢杆菌发酵种子液、酵母菌发酵种子液和乳酸菌发酵种子液；
(3)接种步骤(2)得到的芽孢杆菌种子液、酵母菌种子液、乳酸菌种子液于步骤(1)得到的发酵培养基中，调整发酵温度以及培养基的含水量，混合均匀，得到发酵混合物，在密闭条件下进行厌氧发酵后得到防治嗜水气单胞菌感染的复方发酵中药饲料添加剂。
优选的，步骤(1)中所述豆粕在使用时需要烘干、研磨成粉末状使用；所述粉末是过50～80目筛得到；所述复方中药材研磨成粉末状使用，所述粉末是过50～80目筛得到。
优选的，步骤(1)中所述纤维素酶、半纤维素酶、单宁酶的质量比为2:2:3；所述复合酶中，半纤维素酶酶活力为5万u/g，纤维素酶和单宁酶的酶活均为1万u/g。
优选的，步骤(1)中所述发酵培养基的各组分重量百分含量分别为：复方中药材50％；豆粕30％；次粉20％；复合酶添加量1％；所述复方中药材由以下重量百分比的材料组成：黄芩20％、五倍子12％、野菊花14％、地锦草4％。
优选的，步骤(2)中所述的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌；所述酵母菌为酿酒酵母；所述乳酸菌为植物乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌。
优选的，步骤(3)中所述芽孢杆菌发酵种子液和酵母菌发酵种子液的接种量均为发酵培养基重量的0.1％～9％(V/W，mL/g；即种子液与培养基的用量关系为0.1～9mL：100g)；所述芽孢杆菌和酵母菌的活菌总数均为1.0×108～2.8×109cfu/mL；所述酵母菌发酵种子液为酿酒酵母发酵种子液；
所述乳酸菌发酵种子液为植物乳杆菌发酵种子液、发酵乳杆菌发酵种子液和鼠李糖乳杆菌发酵种子液，活菌总数为1.5×108～3.5×109cfu/mL，所述乳酸菌发酵种子液的接种量为发酵培养基重量的0.8％～5.7％(V/W，mL/g；即种子液与培养基的用量关系为0.8～5.7mL：100g)；
所述乳酸菌发酵种子液、芽孢杆菌发酵种子液和酵母菌发酵种子液接种时的体积比为2：2：3。
更优选的，所述芽孢杆菌发酵种子液和酵母菌发酵种子液的接种量均为发酵培养基重量的2％(V/W，mL/g)。
优选的，步骤(3)中所述发酵培养基的含水量为40％～60％；所述发酵时间为5～20天，发酵温度为24～38℃。
本发明制备的复方发酵中药饲料添加剂添加剂用于添加到水产养殖饲料中抑制嗜水气单胞菌的用途；具体操作是：将复方发酵中药饲料添加剂添加到水产饲料中得到混合饲料进行喂养；所述复方发酵中药饲料添加剂的添加量占混合饲料的重量为5％～25％。
技术方案的具体筛选过程如下：
(1)中药原料的筛选：从45种抑菌中药(乌梅、天冬、山茱萸、大蒜、五味子、黄连、鱼腥草、连翘、虎杖、马齿苋、青皮、知母、秦皮、夏枯草、苏木、地锦草、白头翁、诃子、艾叶、黄芩、黄芪、黄柏、五倍子、野菊花、女贞子、白术、板蓝根、银杏叶、蒲公英、荆芥、当归、杜仲、大黄、赤芍、杜仲叶、山楂、儿茶、地黄、甘草、川穹、金银花、大青叶、苍耳子、石榴皮、穿心莲)中，通过抑菌实验筛选得到发酵前后对嗜水气单胞菌具有较强抑菌效果的中药。抑菌实验采用琼脂扩散法，抑菌圈大小见表1。
根据实验结果可观察到地锦草、五倍子、野菊花、大黄、黄芩具有较好地抑菌效果，且其发酵后，抑菌能力明显增强。通过预实验制备发酵中药饲料添加剂时，发现中华鳖不摄食的情况。其可能原因为大黄味苦，适口性不佳、因此综合考虑选择地锦草、五倍子、野菊花、黄芩这四味中药作为复方中药发酵原料。
表1发酵前后中药原料对嗜水气单胞菌抑菌圈的大小
注：发酵前与发酵后抑菌圈直径每列中，标注相同字母的表示差异不显著(P＞0.05)，标注不同字母表示差异显著(P＜0.05)。不同中药发酵前后抑菌圈直径每行中，标注相同字母的表示差异不显著(P＞0.05)，标注不同字母表示差异显著(P＜0.05)。“/”表示无抑菌效果。
(2)发酵菌种的筛选：不同发酵菌种作用于复方中药会对复方中药产生不同的效果。因此，进一步对发酵菌种进行筛选，以达到有效提升中药药效成分是十分有必要的。以复方中药、豆粕和次粉为发酵原料；复方中药由地锦草、五倍子、野菊花、黄芩这四味中药组成。
取用各个单一菌种的培养菌液(培养至对数生长期)进行发酵，以10％(V/W，mL/g)的添加量加入到发酵原料中，加入蒸馏水控制发酵原料的含水量为50％(V/W，mL/g)翻拌均匀后，置于单向透气孔的发酵袋中置于30℃培养箱中厌氧发酵，发酵7d后得到复方发酵中药饲料添加剂，检测其药效成分变化，药效成分变化采用HPLC法测定。
中药药效成分的测定方法：
A:色谱条件建立
本发明建立了一个可以同时测定绿原酸、阿魏酸、黄芩素、黄芩苷、槲皮素、木犀草素的色谱条件，具体为：采用月旭XB-C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，以甲醇(A)-0.1％磷酸溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0～10min，15％A→45％A，85％B→55％B；10～20min，45％A→57％A，55％B→43％B；20～40min，57％A→85％A，43％B→15％B)，检测波长为335nm，流速为0.8mL/min，进样量：10μL。
表2六种药效成分梯度洗脱条件
没食子酸测定色谱条件：采用月旭XB-C18(250mm×4.6mm，5μm)色谱柱，以甲醇(A)-0.1％磷酸溶液(B)为流动相，流动相以相同比例洗脱。甲醇(A)-0.1％磷酸溶液(B)＝15：85。检测波长为270nm，流速为0.8mL/min，进样量：10μL。
B:标准品溶液的制备
精密称取各个标准品各20mg，60％甲醇溶解定容至10mL，作为标准品母液。将绿原酸、阿魏酸、黄芩素、黄芩苷、槲皮素、木犀草素标准品母液各吸取1mL混合，作为混合标准品母液，准备完成后置于4℃冰箱备用。
C:中药浸提液制备
称取前文步骤(2)中得到的复方发酵中药饲料添加剂1g于50mL锥形瓶中，加入10mL60％甲醇溶液浸提30min。过滤取上清液，置于4℃冰箱保存备用。
绿原酸、阿魏酸、黄芩苷、槲皮素、木犀草素、黄芩素的混合对照品及没食子酸标准品的高效液相色谱图见图1、图2；可看出在本色谱条件下，各药效成分能很好的分离，出峰完全且峰形良好。
回归分析得到各个有效成分的峰面积(y)和含量(x)的线性关系，如表3。
表3药效成分的标准曲线
注：各个药效成分在0到500ug范围内和其峰面积有良好的线性关系。
其中发酵菌种分别为酿酒酵母、产朊假丝酵母、热带假丝酵母、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌、乳双歧乳杆菌和植物乳杆菌；
发酵原料为(质量百分比)：黄芩20％、五倍子12％、野菊花14％、地锦草4％、豆粕30％、次粉20％。
不同单菌发酵复方中药饲料，发酵7d后测定了各个组别中的产物中几个主要的药效成分的变化，具体见表4(该实验所用的中药材与发酵用酶筛选实验中的中药材为不同批次的，因此其药效成分有差别，但同一批实验所用中药材原料相同，因此实验批间内可用于比较)。
由实验结果可明显观察到，不同菌株单菌发酵对复方中药饲料中，药效成分有明显的不同。
在酵母菌中，可观察到几种菌对绿原酸、槲皮素、木犀草素、黄芩素等药效成分均有大小不等的提升。阿魏酸、黄芩苷这两种药效成分发酵后均减少。其中热带假丝酵母单菌发酵后没食子酸含量减少，酿酒酵母、产朊假丝酵母提升了复方中药中的没食子酸含量。酿酒酵母总体上发酵效果更佳，其可提升绿原酸含量至发酵前的约5.27倍、槲皮素为发酵前的约1.88倍、木犀草素约为发酵前的4.38倍、黄芩素约为发酵前的2.91倍、没食子酸为发酵前的8.22倍。
在芽孢杆菌中，可观察到几种芽孢杆菌均能提升复方中药中绿原酸、槲皮素、木犀草素、黄芩素、绿原酸的含量，阿魏酸、黄芩苷成分均有所减少。其中枯草芽孢杆菌单菌发酵提升中药药效成分总体上效果更好，其提升绿原酸含量为发酵前的2.55倍、槲皮素含量为发酵前的1.71倍。木犀草素为发酵前的4.83倍、黄芩素为发酵前的2.06倍、没食子酸为发酵前的4.10倍。
在乳酸菌中，各个乳酸菌对药效成分的改变各不相同。其中发酵乳杆菌、植物乳杆菌、鼠李糖乳杆菌在单菌发酵中药时表现相对较好。发酵乳杆菌可提升槲皮素为发酵前的2.05倍，提升木犀草素为发酵前的7.14倍，提升黄芩素为发酵前的2.17倍，提升没食子酸为发酵前的14.07倍。植物乳杆菌可提升槲皮素为发酵前的3.37倍，提升木犀草素为发酵前的8.31倍，提升黄芩素为发酵前的1.30倍，提升没食子酸为发酵前的14.10倍。鼠李糖乳杆菌可提升绿原酸为发酵前的5.91倍，提升槲皮素为发酵前的2.37倍，提升木犀草素为发酵前的9.83倍，提升黄芩素为发酵前的1.93倍，提升没食子酸为发酵前的1.61倍。
表4不同菌株发酵后中药添加剂中药效成分含量
注1：每列标识相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，标识不同字母表示差异显著(P＜0.05)。
(3)发酵用酶的筛选：不同单酶发酵复方中药饲料添加剂，发酵7d后测定了各个组别中的几个主要的药效成分的变化，具体结果见表5。
根据测定结果可观察到：
1.漆酶添加仅对提升复方中药中的绿原酸成分有益，但对于其他药效成分，如阿魏酸、黄芩苷、槲皮素、黄芩素、没食子酸均有所减少，不如无酶添加组。如其黄芩素发酵后为1.33mg/g，仅为无酶发酵组的37.89％；没食子酸发酵后为2.50mg/g，为无酶发酵组的83.06％。其可能原因为漆酶虽然作为一种商品酶广泛应用于木质素的降解，但其也能降解植物中的一些酚类物质，本研究配方中，其主要药效作用的物质均为多酚类物质，因此在发酵酶解过程中，也被一定程度上降解了，药效成分均有降低的情况。
2.半纤维素酶添加可提升黄芩素含量至4.81mg/g，为发酵前的16.62倍，是无酶对照组的137.04％，提升没食子酸至4.12mg/g，为发酵前的10.84倍，是无酶对照组的136.88％。
3.纤维素酶添加提升绿原酸至0.37mg/g，为发酵前的3.36倍，较无酶对照组提升了68.18％，提升了黄芩素含量至3.69mg/g，为发酵前的12.30倍，还提升了没食子酸含量至3.61mg/g，为发酵前的9.5倍，是无酶对照组的119.93％。
4.单宁酶添加可大幅提升没食子酸含量，发酵后，其没食子酸含量为5.72mg/g，其为发酵前的15.05倍，是无酶对照组的190.03％。除此之外，其对提升黄芩素含量也有一定作用，可将黄芩素提升至3.97mg/g，是发酵前的13.23倍，也是无酶对照组的113.11％。综合上述实验结果可得出，除漆酶对中药中主要药效成分的增加没有太大作用外，其他几种酶如半纤维素酶、纤维素酶、单宁酶对中药饲料中的主要药效成分的增加均有增益效果，因此选择半纤维酶、纤维素酶、单宁酶作为发酵用酶。
表5不同酶发酵后中药添加剂中药效成分含量
注1：每列标识相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，标识不同字母表示差异显著(P＜0.05)。
(4)最适中药添加比例的确定
经过抑菌实验结果显示，配方所选的中药具有广谱抑菌效果，对于发酵菌种其也可能会有一定的影响，因此需要确定一个合适的中药添加比例，以使其既可以发挥抑菌中药的抑菌效果，又能使发酵菌种生长。
本发明通过改变发酵中不同的复方中药材添加比例通过PMA-qPCR检测的方法，测定发酵过程中，不同中药添加比例组别中发酵菌株的活菌数，探究复方中药与发酵菌株之间的关系，寻找得到一组既不影响发酵菌种生长，又可以发挥中药的抗菌作用的中药添加比例。
将黄芩、地锦草、野菊花、五倍子按照一定比例混合(即黄芩40％、五倍子24％、野菊花28％、地锦草8％)，为复方中药预混料。将豆粕和次粉按照一定比例混合(豆粕60％、次粉40％)，作为辅料预混料；设计七组实验，以复方中药和辅料预混料的混合物作为发酵原料，两者的质量和为100％，其中复方中药预混料添加质量比例分别为0％、10％、30％、50％、70％、90％、100％；发酵菌种以菌液(培养至稳定期)的形式添加，添加量占发酵原料的2％(V/W，mL/g)，含水量为50％，发酵温度30℃，得到发酵饲料添加剂；通过PMA-qPCR的方法测定其发酵过程中的菌群变化。
发酵菌种菌量测定
A、基因组提取：取各个发酵菌种(枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌)的种子液(培养至对数生长期)1mL，12000rpm离心2分钟，弃上清，加入60μL TE Buffer，100℃煮沸2分钟，冷却后8000rpm离心1分钟，小心吸取上清液，得到发酵菌种(枯草芽孢杆菌、酿酒酵母、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌)基因组DNA。
B、标准曲线构建：
1.枯草芽孢杆菌：将枯草芽孢杆菌基因组DNA用特异性引物对(上游引物F:CGTAGAGCCACTTGAGCG，下游引物R:CTGCCGTTACAGTTCCTT)进行PCR扩增，获得的PCR产物经切胶、回收后，稀释至1×102～1×109拷贝/μL，作为标准品进行荧光定量PCR反应。将测得标准品的DNA浓度换算成拷贝数，以拷贝数的对数值为横坐标，对应Ct值为纵坐标，生成枯草芽孢杆菌标准曲线；
拷贝数计算公式如下：拷贝数＝DNA浓度(ng/μL)×10-9×6.023×1023/(660×碱基数)；
所述枯草芽孢杆菌的标准曲线拟合方程为Y＝-3.4359X+34.363；
2.酿酒酵母：将酿酒酵母基因组DNA用特异性引物对(上游引物F:GCGATAACGAACGAGACCCTAA,下游引物R:CCAGCACGACGGAGTTTCACAAGAT)进行PCR扩增，获得的PCR产物经切胶、回收后，稀释至1×102～1×109拷贝/μL，作为标准品进行荧光定量PCR反应。将测得标准品的DNA浓度换算成拷贝数，以拷贝数的对数值为横坐标，对应Ct值为纵坐标，生成枯酿酒酵母标准曲线；
拷贝数计算公式如下：拷贝数＝DNA浓度(ng/μL)×10-9×6.023×1023/(660×碱基数)；
所述酿酒酵母的标准曲线拟合方程为Y＝-3.4868X+39.322；
3.发酵乳杆菌：将发酵乳杆菌基因组DNA用特异性引物对(上游引物F:CCTGATTGATTTTGGTCGCCAAC,下游引物R:ACGTATGAACAGTTACTCTCATACGT)进行PCR扩增，获得的PCR产物经切胶、回收后，稀释至1×102～1×109拷贝/μL，作为标准品进行荧光定量PCR反应。将测得标准品的DNA浓度换算成拷贝数，以拷贝数的对数值为横坐标，对应Ct值为纵坐标，生成发酵乳杆菌标准曲线；
拷贝数计算公式如下：拷贝数＝DNA浓度(ng/μL)×10-9×6.023×1023/(660×碱基数)；
所述发酵乳杆菌的标准曲线拟合方程为Y＝-3.8953X+38.279；
4.植物乳杆菌：将植物乳杆菌基因组DNA用特异性引物对(上游引物F:GTGGTGCGGTCGATATTTTAGTT,下游引物R:TCAGCCGCGCTTGTAACC)进行PCR扩增，获得的PCR产物经切胶、回收后，稀释至1×102～1×109拷贝/μL，作为标准品进行荧光定量PCR反应。将测得标准品的DNA浓度换算成拷贝数，以拷贝数的对数值为横坐标，对应Ct值为纵坐标，生成植物乳杆菌标准曲线；
拷贝数计算公式如下：拷贝数＝DNA浓度(ng/μL)×10-9×6.023×1023/(660×碱基数)；
所述植物乳杆菌的标准曲线拟合方程为Y＝-3.3338X+33.904；
5.鼠李糖乳杆菌：将鼠李糖乳杆菌基因组DNA用特异性引物对(上游引物F:GACGCAGCCGGTTGACCCAA下游引物R:GGCGGCAGTTGCCCCAGAAT)进行PCR扩增，获得的PCR产物经切胶、回收后，稀释至1×102～1×109拷贝/μL，作为标准品进行荧光定量PCR反应。将测得标准品的DNA浓度换算成拷贝数，以拷贝数的对数值为横坐标，对应Ct值为纵坐标，生成鼠李糖乳杆菌标准曲线；Y＝-3.1942X+32.687
拷贝数计算公式如下：拷贝数＝DNA浓度(ng/μL)×10-9×6.023×1023/(660×碱基数)；
所述鼠李糖乳杆菌的标准曲线拟合方程为Y＝-3.1942X+32.687；
C、饲料样品DNA提取：准确称取步骤(4)所得发酵饲料添加剂1g，加入10mL PBS缓冲液，振荡20分钟后用8层纱布过滤，取1mL滤液，12000rpm离心2分钟，弃上清，加入60μL TEBuffer，100℃煮沸2分钟，冷却后8000rpm离心1分钟，小心吸取上清液，得到饲料样品DNA模板；
D、荧光定量PCR检测：采用QuantStudio 3Real-Time PCR System(AppliedBiosystems公司)进行扩增与分析。荧光定量PCR反应体系为：SYBR Green Premix Ex Taq10μL，Rox Reference Dye 0.4μL，上、下游引物各0.8μL，DNA模板2μL，ddH2O 6μL。荧光定量PCR反应条件：95℃预变性30s，扩增95℃5s、60℃30s共40个循环，之后进行熔解曲线分析，所得Ct值根据标准曲线计算发酵菌种数量。
Ⅰ.枯草芽孢杆菌在不同中药添加比例下其菌量的变化
不同中药添加比例下，枯草芽孢杆菌的在发酵过程中的菌量变化如图4。可明显观察到。0％、10％中药添加量的发酵中药饲料中，复方中药预混料添加质量比例为0％、10％时，枯草芽孢杆菌的菌量是呈现下降趋势的，但10％的菌量高于0％；其他组别的中药添加组，其菌量在开始都是迅速增加，在发酵1d时菌量达到最大，随后开始下降并趋于温度。其中50％、70％、90％组别最后都能维持在一个较高菌量。在7d时，其中添加量70％的组别菌量仍维持在较高水平，为1.44*106copies/g，是0％组别菌量—2.37*104copies/g的60.76倍。
实验结果说明配方中的复方中药添加对枯草芽孢杆菌的生长有益，但并非是越多越好。在中药添加量为70％以下时，中药添加量越大，其增益效果越明显；但超过70％时，其增益效果有所下降。
Ⅱ.酿酒酵母在不同中药添加比例下其菌量的变化
不同中药添加比例下，酿酒酵母在发酵过程中的菌量变化如图5。各个中药添加组别的菌量变化趋势都大致相同。随着发酵的进行，酿酒酵母菌量增大，在发酵1d时达到最大，随后不断减少。但可以较为明显的观察到，中药添加对酵母菌的生长有益。在发酵1d时，可明显得观察到，50％中药添加组别的菌量最大为1.57*109copies/g，较0％中药添加组别的4.63*107copies/g菌量来说，提升了约33.91倍。在发酵的第7天，70％中药添加组别的酿酒酵母菌量最大，为6.62*107copies/g，约是0％中药添加组别的1.54*106copies/g的42.99倍。
Ⅲ.发酵乳杆菌在不同中药添加比例下其菌量的变化
不同中药添加比例下，发酵乳杆菌的在发酵过程中的菌量变化如图6。可观察到不同组别中药添加其发酵乳杆菌的菌量变化趋势大致相同，均为在1d时，菌量达到最大，随后慢慢减少。其中10％中药添加组别在前5d发酵时，其菌量于0％接近，但在第7d时10％中药添加组别菌量稍少于0％组别。由实验结果可推断，少量中药的添加(10％)对发酵乳杆菌生长没有太大影响。大量的中药添加对发酵乳杆菌的生长有抑制。但抑制效果并没有太强，其在50％、70％中药添加量组别中，仍具有较高的活菌数，达到了107数量级，分别为，3.20*107copies/g、1.04*107copies/g。
Ⅳ.植物乳杆菌在不同中药添加比例下其菌量的变化
不同中药添加比例下，植物乳杆菌的在发酵过程中的菌量变化如图7。植物乳杆菌在不同中药添加比例的样本中，其菌量变化趋势大致相同，均在发酵第1天时达到菌量最大，随后逐渐减少。根据实验结果显示一定浓度的中药添加对植物乳杆菌的生长有益。在发酵第7天，在中药添加量为0％～50％范围内，植物乳杆菌的菌量随着中药添加量的增加而增加，50％中药添加的组别中植物乳杆菌菌量最多，数量为3.59*108copies/g，是0％中药添加组别菌量——7.47*107copies/g的4.80倍。高浓度的中药添加对植物乳杆菌生长不利，如100％中药添加组别的其菌量仅为7.44*106copies/g，仅仅为50％中药添加组别菌量的2.07％。
Ⅴ.鼠李糖乳杆菌在不同中药添加比例下其菌量的变化
不同中药添加比例下，鼠李糖乳杆菌的在发酵过程中的菌量变化如图8。植物乳杆菌在不同中药添加比例的样本中，其菌量变化趋势大致类似，也是在发酵第1天时达到菌量最大，随后逐渐减少。根据实验结果可明显观察到，在0％～10％组别中，随着中药的添加，菌量有所增加。在30％中药添加量时，菌量最高为2.23*106copies/g，较0％中药添加组别的4.64*105copies/g菌量来说，提升了4.81倍。在发酵第7天时，50％中药添加组别的鼠李糖乳杆菌菌量最高，为3.47*105copies/g，是0％中药添加组菌量——7.27*104copies/g的4.77倍。其结果说明，低含量的中药添加对鼠李糖乳杆菌的生长有益，但当中药含量过高时，其生长就会受到抑制。
根据各个菌在不同中药添加比例中的菌量结果，综合考虑选择50％的中药添加比例作为后续用于实验的中药添加比例。在该中药添加比例下，各个发酵菌种均具有较好的生长，且中药添加量不至于过低影响其药效成分作用效果。
本发明的有益效果：
(1)本发明针对病原菌——嗜水气单胞菌的抑菌中药、发酵菌种、酶、对中药与辅料的添加比例和发酵菌种的生长关系进行了创造性的研究，得到最适的中药添加比例、发酵条件和发酵工艺。最后，将本发明研制的发酵中药添加剂用于中华鳖的养殖，其在长期饲喂是能有效提升中华鳖的免疫功能，肠道消化水平等，在短期嗜水气单胞菌攻毒实验中，可有效提升中华鳖稚鳖的存活率。本发明所述的发酵中药可作为一个优质的饲料添加剂用于水产养殖，且其针对嗜水气单胞菌有显著的防治效果。
(2)本发明通过改变不同中药添加比例测定发酵菌种的菌群变化探究合适的中药添加量，将复方中药材进行发酵处理，使其药效成分提升或转化为其它易于吸收的药效成分，且该饲料添加剂中富含益生菌，可有效提升养殖动物的免疫力，具还有酸香味和一定抑菌作用，便于贮藏。
附图说明
图1为六种药效成分的高效液相色谱图；其中1.绿原酸；2.阿魏酸；3.黄芩苷；4.槲皮素；5.木犀草素；6.黄芩素；
图2为没食子酸的高效液相色谱图；
图3为发酵菌种引物特异性验证；其中(a)枯草芽孢杆菌引物特异性验证；(b)酿酒酵母引物特异性验证；(c)发酵乳杆菌引物特异性验证；(d)植物乳杆菌引物特异性验证；(e)鼠李糖乳杆菌引物特异性验证；
M：DNA Marker(50～500bp)；1：枯草芽孢杆菌；2：酿酒酵母；3：发酵乳杆菌；4：植物乳杆菌；5：鼠李糖乳杆菌；
图4为发酵过程中不同中药添加比例下枯草芽孢杆菌的菌量的变化；
图5为发酵过程中不同中药添加比例下酿酒酵母的菌量的变化；
图6为发酵过程中不同中药添加比例下发酵乳杆菌的菌量的变化；
图7为发酵过程中不同中药添加比例下植物乳杆菌的菌量的变化；
图8为发酵过程中不同中药添加比例下鼠李糖乳杆菌的菌量的变化；
图9为交互因子的响应面和等高线图；(a)交互因子的响应面(b)交互因子的等高线；
图10为不同菌种添加比例发酵中药后的总酚含量；
图11为不同酶添加比例发酵中药后的总酚含量；
图12为接种量对总酚含量的影响图；
图13为酶添加量对总酚含量的影响图；
图14为发酵温度对总酚含量的影响图；
图15为含水量对总酚含量的影响图；
图16发酵时间对总酚含量的影响图；
图17为发酵时间和含水量对总酚含量影响的响应面3D图(a)和等高线图(b)；
图18为酶添加量和发酵时间对总酚含量影响的响应面3D图(a)和等高线图(b)；
图19为酶添加量和含水量对总酚含量影响的响应面3D图(a)和等高线图(b)；
图20为中华鳖肠道石蜡切片；其中(a)、(c)为实验组；(b)、(d)为对照组。
具体实施方法
下面结合具体实施例对本发明作进一步描述。
本发明所使用的漆酶购自于山东苏柯汉生物科技有限公司，酶活为10000U/g。酸性纤维素酶、木聚糖酶、甘露聚糖酶、单宁酶均购自于夏盛(北京)生物科技开发有限公司，酶活均为10000U/g。β-葡聚糖酶购自于夏盛(北京)生物科技开发有限公司，酶活为50000U/g。
菌种来源：Ⅰ芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)CGMCC1.921；Ⅱ酵母菌：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CGMCC2.1527；Ⅲ乳酸菌：发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)CGMCC 1.15608、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)CGMCC 1.577、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
实施例1：
(1)芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的活化培养：
A、首先配置芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的培养基；
芽孢杆菌液体和固体培养基：胰蛋白胨10g，氯化钠10g，酵母粉5g，蒸馏水1L，pH自然，121℃灭菌20min，芽孢杆菌固体培养基的成分同液体培养基；区别是加入琼脂15g。
酵母菌液体和固体培养基：200g马铃薯煮软后8层纱布滤汁，葡萄糖20g，磷酸二氢钾3g，硫酸镁1.5g，蒸馏水定容至1L，pH自然，121℃灭菌20min；酵母菌固体培养基的成分同液体培养基，区别是加入琼脂15g；
乳酸菌液体和固体培养基：牛肉膏10g，胰蛋白胨10g，葡萄糖20g，酵母粉5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸氢二铵2g，无水乙酸钠5g，吐温80 1mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，蒸馏水1L，pH7.2，121℃灭菌20min；乳酸菌固体培养基的成分同液体培养基，区别是加入琼脂15g；
B、芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的活化培养方法：
芽孢杆菌液体菌种培养：无菌条件下将-80℃保存的甘油菌接种至芽孢杆菌固体培养基，30℃培养18h复苏菌种，挑取单菌落接种到装有100mL芽孢杆菌液体培养基的摇瓶(250mL)中，180r/min，30℃培养12h，得到芽孢杆菌发酵种子液；按实际需要再以2％(v/v，即每100mL液体培养基接种2mL发酵种子液)的接种量接种到液体培养基中扩大培养；所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌CGMCC1.921。
酵母菌液体菌种培养：无菌条件下将-80℃保存的甘油菌接种至酵母菌固体培养基，28℃培养20h复苏菌种，然后挑取单菌落接种到装有100mL酵母液体培养基的摇瓶(250mL)中，180r/min，28℃培养12h，得到酵母菌发酵种子液；按实际需要再以2％(v/v，即每100mL液体培养基接种2mL发酵种子液)的接种量接种到液体培养基中扩大培养；所述酵母菌为酿酒酵母CGMCC 2.1527。
乳酸菌液体菌种培养：无菌条件下分别将-80℃保存的甘油菌接种至乳酸菌固体培养基，37℃培养24h复苏菌种，挑取单菌落接种到装有50mL乳酸菌液体培养基的厌氧瓶(50mL)中，静置37℃培养18h，得到乳酸菌发酵种子液，按实际需要再以2％(v/v，即每100mL液体培养基接种2mL发酵种子液)的接种量接种到液体培养基中扩大培养；所述乳酸菌为植物乳杆菌CGMCC1.557、发酵乳杆菌CGMCC1.15608、鼠李糖乳杆菌CGMCC1.577。
(2)配置厌氧发酵培养基，各组分重量百分含量分别为：复方中药材(黄芩20％、五倍子12％、野菊花14％、地锦草4％)、豆粕30％、次粉20％、复合酶1％，混合均匀，得到厌氧发酵培养基。
(3)将步骤(1)活化培养后的枯草芽孢杆菌发酵种子液、酿酒酵母发酵种子液、植物乳杆菌发酵种子液、发酵乳杆菌发酵种子液、鼠李糖乳杆菌发酵种子液接种到步骤(2)的发酵培养基中，总接菌量为发酵培养基重量的2％(v/m，即2mL：100g)，各个种子液的添加比例为(乳酸菌：芽孢杆菌：酵母菌的体积比＝2：2：3)，乳酸菌发酵种子液活菌总数为1.5×108～3.5×109cfu/mL；所述芽孢杆菌和酵母菌的活菌总数均为1.0×108～2.8×109cfu/mL；所述酵母菌发酵种子液为酿酒酵母发酵种子液、乳酸菌发酵种子液活菌总数为1.5×108～3.5×109cfu/mL。混合均匀，调整含水量为45％，得到厌氧发酵混合物；置于发酵袋中在密封条件下进行厌氧发酵，发酵温度为30℃，发酵7天后获得成品，即为复方发酵中药饲料添加剂。
实施例2：发酵中药饲料添加剂配方的优化
以黄芩、五倍子、野菊花、地锦草用Design-Expert中的D-最优混料设计优化配方，以不同嗜水气单胞菌最小抑菌浓度为响应，得到一组有效抑制嗜水气单胞菌的复方中药配方。
最小抑菌浓度测定方法：在超净台中，将100μL液体营养琼脂培养基加入96孔板中的一行。将中药提取液50μL加入第一孔中混匀，随后吸取第一孔中的溶液50μL加入到第二孔中混匀，随后吸取第二孔中的溶液50μL加入到第三孔中混匀，以此类推。将最后一孔混匀后吸出50μL溶液弃去。最后，每个孔加入培养到对数生长期对的致病菌菌液50μL。以添加60％的甲醇为阴性对照、以添加浓度为0.2mg/mL的卡那霉素为抗生素阳性对照，以不加菌液的营养琼脂孔为空白对照。将96孔板置于37℃培养箱培养24h，随后观察其长菌状况，肉眼观察得到透明无菌生长的浓度即为最小抑菌浓度。
配方设计和结果如表6所示，表7列出了用不同比例黄芩、地锦草、五倍子、野菊花发酵后，对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度的试验结果，表中A、B、C、D分别为黄芩、地锦草、五倍子、野菊花的质量分数，利用软件，对响应值的试验值进行二次多项回归拟合，建立回归模型如下：
Y＝10.72A+20.73B+92.64C+21.63D-1.82AB-165.49AC+16.30AD-204.57BC+84.86BD-182.92CD-2305.77ABC+2892.73ABD-485.90ACD+262.30BCD R2＝0.9950 P＜0.0001
表6实验因素与水平
表7D-最优设计方案及试验结果
表8回归方程的方差分析
多元相关系数R2＝0.995，校正决定系数R2Adj＝0.9842，说明该模型对实际情况拟合较好，拟合模型和混合线性模型P＜0.0001，试验所选用的模型具有高度的显著性，失拟项在P＝0.05水平上不显著，因此该模型的拟合程度较好，可以用此模型来确定复方中药的配方。
根据D-混料设计实验结果和回归方程绘制黄芩、地锦草和五倍子交互因子的等高线和响应面分析，如图9可看出响应曲面图为一曲面，说明三者间具有一定的交互作用。用软件的最优化功能设定各因素的变化范围，设定所期望的响应值如表9。
软件数据分析给出了达到或接近目标响应值的几个组合，并提供了预测值。选择黄芩40％、地锦草8％、五倍子22.94％、野菊花29.06％为复方中药配方，其发酵后对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度响应值预测为4.5903mg/mL。采用优化后的组合黄芩40％、地锦草8％、五倍子24％、野菊花28％，其发酵后对嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度实际值为4.6517mg/mL，与预测值无明显差异(P＞0.05)，为所有试验中最小值，因此选择该配方为复方发酵中药配方。
表9回归方程的方差分析
实施例3：最适菌种添加比例的确定
根据上述实验结果，挑选单菌发酵后能有效提升药效成分的菌种作为发酵菌种。以不同菌种添加比例进行发酵，控制其他发酵条件相同，探究其发酵前后对总多酚的影响。其中设定9个组别，乳酸菌发酵种子液、芽孢杆菌发酵种子液和酵母菌发酵种子液接种时的体积比分别为1：1：1、1：2：2、1：3：3、2：1：2、2：2：3、2：3：1、3：1：3、3：2：1和3：2：3。在固态发酵体系中，乳酸菌、芽孢菌和酵母菌协同进行发酵。枯草芽孢杆菌好氧生长消耗密封袋中的残余氧气，且产丰富的酶系分解利用发酵中药饲料添加剂中的大分子物质。酿酒酵母好氧呼吸消耗氧气，同时其自身生长产酶促进分解利用发酵基质中的大分子物质。除此之外，酿酒酵母其还能产氨基酸、维生素等营养物质，可促进乳酸菌的生长增殖。芽孢杆菌、酵母菌在发酵前期消耗氧气，厌氧的环境更能促进乳酸菌的生长。乳酸菌除了能产有机酸外，还富含丰富的酶系，可降解大分子物质使其生成小分子物质如单糖、氨基酸等物质。酵母菌又可利用单糖满足自身生长增殖。因此，各个发酵菌种之间相互作用是十分紧密的，需要寻找一个合适的菌种比例，在该比例下可有效提升中药有效成分的释放。实验结果如图10显示，当乳酸菌：枯草芽孢杆菌：酿酒酵母为2：2：3时，其总酚含量最高为37.69mg/g。
实施例4：最适酶添加比例的确定
其中设定9个组别，纤维素酶、半纤维素酶、单宁酶的质量比为分别为1：1：1、1：2：2、1：3：3、2：1：2、2：2：3、2：3：1、3：1：3、3：2：1和3：2：3。有研究显示纤维素酶、半纤维素酶、单宁酶之间存在协同作用，纤维素酶、半纤维素酶作用于植物的不同结构可更高效地降解木质纤维素，使其药效成分更容易被释放出来，从而使其胞内的植物单宁更易与单宁酶结合。单宁酶水解植物单宁生成更易被机体利用的小分子酚酸类物质。因此需要寻找一个合适的酶添加比例，实验结果见图11，选择纤维素酶：半纤维素酶：单宁酶为2：2：3的比例作为添加比例，在该比例下，其总酚含量最高，为41.25mg/g。
实施例5：发酵条件的优化
①单因素优化发酵条件
1.接种量对发酵中药的影响
称取1000g中药(黄芩400g、五倍子240g、野菊花280g、地锦草80g)、600g豆粕和400g次粉混匀后，将混合物平均分成20份，每份50g，将其作为发酵基质。
各组选取7组发酵基质，以发酵基质的质量为参考，分别添加不同接菌量比例的发酵菌液，分别为0％、0.5％、1％、2％、4％、8％、16％(V/W)。另外加入蒸馏水控制各组含水量为50％，并加入发酵酶制剂1％(W/W)；封包厌氧发酵，发酵温度30℃，发酵时间为7d。实验每组3个平行，取均值，重复3次，下同。
在菌酶协同发酵过程中，发酵菌种往往起到较为重要的作用。发酵菌种利用中药饲料中的营养物质，代谢产生了多种次级代谢产物，如木质纤维素酶、单宁酶等等物质，促进了药效成分的释放，因此总酚量增加。如图12所示，当接种量为2％(V/W)时，发酵中药饲料中总酚含量最高，为42.27mg/g。接种量较小时，发酵微生物初始数量较少，代谢分泌的酶等较少，因此总酚含量较低。当接菌量较大时，基质中的微生物数量较多，因此发酵早期就消耗大量的营养物质以满足自身生长，由于营养物质不足而受到抑制。除此之外，较高的接菌量在发酵时产丰富的有机酸会导致其饲料中的pH迅速下降，过低的pH对发酵菌种的生长和产酶有所抑制。因此选择接菌量为2％(V/W)。
2.发酵酶添加量对发酵中药的影响
根据上述实验，选择接菌量为2％(V/W)，其他发酵条件不变，改变不同酶制剂的添加量，分别为添加量0％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、4％(W/W)。
如图13所示，酶的添加量对发酵中药中总酚含量起着重要影响，发酵中药中总酚含量随着酶的增加而增加，但在1％添加量之后其总酚增速减慢。其可能原因为酶的添加，可帮助水解植物细胞壁成分，使胞内的多酚类物质更易释放出胞外。酶添加量为4％时，相较与前两个添加量组别有微微下降的趋势。其原因可能为底物量一定，酶的量已经达到饱和，因此对总酚的增加没有那么显著的增益。且酶添加量过高，导致每克发酵中药添加剂中，中药占比减少，因此其每克发酵中药添加剂中的总酚含量降低。
虽然在酶的添加量为2％时，其总酚含量最高，为43.21mg/g。但考虑到1％酶添加的组别其总酚含量与2％组别相差不大，为42.89mg/g。出于经济角度考虑，选择1％添加量。
3.发酵温度对发酵中药的影响
根据上述实验，选择酶添加量为1％(W/W)，其他发酵条件不变，改变发酵温度分别为20℃、25℃、30℃、35℃、40℃。
实验结果见图14可知发酵温度在发酵过程中起着十分重要的作用。在20℃到30℃这段区间，总酚随着温度提升而提升。在30℃时最高，为43.02mg/g。然而在30℃以后，其多酚含量呈现下降的趋势。其可能原因为，酵母菌在发酵过程中起着比较重要的作用，酿酒酵母的最适生长温度在25℃到30℃之间，在30℃以上，菌种逐渐衰亡。乳酸菌的最适生长温度在30℃到40℃之间，芽孢杆菌最适温度为30℃到37℃之间。
在30℃这个发酵温度环境中，各个发酵菌种都能较好的生长。因此可选择该温度作为最适的发酵温度。
4.不同含水量对发酵中药的影响
根据上述实验，选择发酵温度为30℃，其他发酵条件不变，改变不同含水量，分别为30％、40％、50％、60％、70％、80％(V/W)。
实验结果见图15显示随着含水量的增加，其总酚含量提升。水在发酵过程中十分重要，发酵菌种的生长增殖产酶都需要水。随着含水量的增加，其总酚含量增加。推测原因一：饲料中的含水量增加，饲料中的自由水含量增加，菌种活动生长更适合，因此其发酵菌群长得更好。原因二：饲料中含水量增加，中药材中水溶性的总酚更易被其溶解释放。因此总酚含量提升。但含水量过高时，除了发酵菌株的生长外，其他有害菌在其中也会在其中增殖，导致其变质，不易保存。在发酵60d时，观察到含水量为70％、80％组别的饲料中，有一些霉菌产生。因此选择含水量为50％。
5.探究不同发酵时间对发酵中药的影响
根据上述实验，选择发酵含水量为50％(V/W)，其他发酵条件不变，改变不同发酵时间，分别为0d、1d、3d、5d、7d、9d、14d、28d。
中药饲料在发酵过程中发生了一系列的物质变化，如发酵菌种的生长增殖、物质的代谢转化等过程。这一过程需要一定时间，但发酵时间的延长并不一定能达到更好发酵效果，还可能会导致药效成分被利用，有害菌污染，增加发酵成本等问题。
如图16所示，在发酵1到7天时，总酚含量随着发酵时间的增加而增加。但在7天后，发酵中药饲料中的总酚含量反而有所减少。其可能原因为初期发酵阶段，发酵菌种首先吸收利用易分解的豆粕、次粉等营养物质用于自身生长增殖。随着发酵菌种的增殖，其代谢产生了木质纤维素酶、单宁酶等可分解中药材中难以分解的成分。且乳酸菌产有机酸为饲料提供了一个偏酸性的环境(pH约4.0到5.0)，其更适合木质纤维素酶发挥作用。因此，在前期总酚含量逐渐增加。但在发酵后期，由于发酵菌株大量存在，易被消化的豆粕、次粉等物质已被利用完，因此，发酵菌群开始利用总多酚以满足自身的生长。综上所述，选择合适发酵时间为7天。
②响应面优化发酵条件
根据之前实验结果，以总酚含量为指标，选择发酵时间量、含水量和酶添加量为影响因素进行研究。采用Design Expert 8.0.6软件的Box-Behnken Design(BBD)进行实验设计与优化。实验因素及水平见表10。
表10实验因素与水平
根据上述实验的结果，以总酚含量为响应值，发酵时间、含水量和酶添加量为自变量，采用Design Expert 8.0.6的Box-Behnken Design(BBD)设计响应面优化实验。实验方案及结果如表11所示。
表11响应面实验设计及结果
将数据进行多元回归拟合，得到A(发酵时间)、B(含水量)、C(酶添加比例)与发酵中药饲料中总酚含量(X)之间的二次多项式模型方程：
X＝+38.89+1.26*A-1.35*B+1.70*C+1.28*A*B-0.31*A*C-0.72*B*C-0.084*A2+2.71*B2+0.060*C2
方差分析见表12。响应面回归模型显著(P＜0.05)，表明不同条件下总酚含量存在显著差异。失拟项不显著(0.0521＞0.05)，表明该模型能较好地描述不同发酵条件与复方中药饲料添加剂中总酚含量之间的关系。变异系数为2.52小于5％，表明模型具有可重复性。模型的R2和Adj R2分别为0.9266和0.8232，表明拟合程度较好，误差较小，回归方程可以模拟实际实验点对总酚含量增加的影响。Adeq precision大于4.0，模型满足预测要求。
在本实验建立的模型中，A、B、C、B2对发酵中药总酚含量的影响极显著(P＜0.01)，AB对发酵中药总酚含量的影响显著(P＜0.05)。
表12回归模型的方差分析
C.V.％2.52；R2＝0.9266；Adj R2＝0.8323；Pred R2＝0.8589；Adeq precision＝12.673
图17、18、19所示，响应面3D图越陡，该因素对响应值的影响越大，等高线分布情况表明两变量之间交互作用的显著性，等高线越密集，越趋向椭圆表示交互作用越强，如图17、19所示，表明发酵时间和含水量的交互作用、酶添加量和含水量对总酚含量有显著影响，响应面3D图也证明了这一观点。
响应面模型预测最适发酵工艺：发酵时间为7天，复方中药饲料含水量为45％，酶添加量为1％，此时，理论总酚含量为45.40mg/g。以上述实验条件下发酵(发酵时间为7天，复方中药饲料含水量为45％，酶添加量为1％)，测定总酚含量，实验重复3次，发酵饲料中总酚含量平均值为45.38mg/g，与理论值接近(P＞0.05)。
实施例6：产品饲喂效果实验；本发明实施例1制备的复方中药发酵饲料添加剂到普通水产饲料中得到混合饲料用于特种水产动物的喂养，添加量为得到混合饲料的5％～25％(以重量计)。
选取在江苏大学应用微生物研究所甲鱼温室养殖池进行实验，养殖池长1.57m，宽1.22m，高0.72m，水深调整为0.5m。每个组别设置三个平行组，每个平行组养殖20只大小体重相近的中华鳖，时间为2021年10月到2022年1月，预实验15天，正式实验60天。试验用平均体质量(雌雄各半，平均体质量(200±15)g，健康的中华鳖。将其随机分为两组，即实验组和对照组；
实验组饲喂10％发酵复方中药饲料添加剂和90％全价粉料；
对照组饲喂100％全价粉料。中华鳖饲料配方见表13，全价粉料组成见表14。
实验组、对照组分别在试验开始前投喂按照表13制备的软团状饲料驯养2周，日投饵量为中华鳖体重的2％。试验开始后各个组别在每日11：00-14：00、19：00-22：00分别投喂按照表13制备的软团状饲料，日投饵料量为中华鳖体重的2％，投喂1h后采用虹吸管清理残饵。养殖期间，水体pH在7到8.5之间，溶氧量为3到5mg/L，氨氮小于2mg/L，水体水温30℃。
表13中华鳖饲料配方
表14全价粉料组成成分
中华鳖的饲料系数见表15。在长期饲喂试验中，已知复方发酵中药饲料添加剂中，其主要成分为植物组织，其不如全价粉料(主要为动物蛋白)更易被动物吸收，但实验组中华鳖饲料系数和对照组差距不大。其可能原因为复方中药饲料添加剂经过发酵后，发酵菌株产生次级代谢产物如——木质纤维素酶，可降解饲料中的木质纤维素成分转化为易被吸收的糖类物质；如蛋白酶可降解大分子蛋白成为小分子肽，发酵后的中药饲料添加剂更易被有机体的吸收。另外可能原因为复方发酵中药饲料添加剂中，其含有丰富的活菌成分，随着中华鳖的摄入后在中华鳖肠道内定植，提升其消化吸收功能。
表15中华鳖的饲料系数
注1：饲料系数＝饲料消耗量/增重量×100％
注2：同行数据标记相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，无标记表示差异显著(P＜0.05)。
中华鳖肠道切片见图20。绒毛高度、隐窝深度、绒毛高度/隐窝深度见表16。
小肠是吸收养分的重要部位，小肠绒毛高度、隐窝深度、绒毛高度/隐窝深度比值都是衡量机体消化吸收功能的重要指标。小肠绒毛越长，小肠绒毛高度与隐窝深度的比值越大表明肠道消化吸收功能越强。实验组小肠绒毛长度、小肠绒毛高度与隐窝深度的比值均比对照组大，说明复方中药发酵饲料添加剂对中华鳖肠道吸收有益。
表16复方发酵中药饲料添加剂对中华鳖肠道的影响
注：同行数据标记相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，无标记表示差异显著(P＜0.05)。
实验组、对照组血细胞测定实验结果见表17，实验组中，中华鳖血液中白细胞的数量远小于对照组。白细胞是中华鳖免疫功能中重要的一环，白细胞参与免疫过程，其含量升高的其可能存在一定的细菌感染情况。实验结果说明饲喂复方发酵中药饲料添加剂对中华鳖的免疫功能有所益处，可减少一定程度上的细菌感染情况。根据红细胞数量可看出，实验组中的红细胞数量大于对照组。有部分研究学者认为红细胞除了与氧气运输相关，还可能与机体的免疫功能相关。本实施例实验结果表明，复方发酵中药饲料添加剂的饲喂对中华鳖的造血功能及红细胞参与的免疫功能有一定的增益作用。
表17复方发酵中药饲料添加剂对中华鳖血常规指标的影响
注：同行数据标记字母表示差异不显著(P＞0.05)，无标记表示差异显著(P＜0.05)。
实验组、对照组中华鳖的血液生化指标见表18。谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)主要分别存在于肝细胞的细胞浆和线粒体内，是评价肝功能是否正常的两个重要指标[120]。当肝受到损伤时，细胞膜的通透性增高，转氨酶活性会升高[121]。实验组中的ALT、AST均小于对照组。实验表明，复方发酵中药饲料添加剂对中华鳖的肝功能具有一定的保护效果。尿素(UREA)、肌酐(CREA)、尿酸(UA)的含量与中华鳖的肾功能的蛋白质代谢相关[126]。一旦肾功能降低或丧失，就会引起不同内源性化学成分如UREA、CREA、UA等物质在血液中积蓄，从而引发高尿酸血症。本研究实验结果显示，实验组别的UREA、CREA、UA均小于全价粉料的组别，说明其复方发酵中药饲料添加剂可在预防肾脏损伤方面好于全价粉料组别。甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)的含量与脂代谢相关。甘油三酯其主要的功能是储存和供给能量，实验结果表明，实验中和对照组的血清中甘油三酯的含量相当，但实验组中HDL高于对照组，实验组的LDL低于对照组。实验组HDL含量高说明复方发酵中药饲料添加剂在参与中华鳖胆固醇代谢作用有较好的增益效果。LDL的主要功能是运送胆固醇到组织内部，但当其引入过多胆固醇时，容易黏附在血管壁上造成动脉硬化，因此LDL含量不宜过多，而实验组的LDL低于对照组。根据测定结果中两个组别间TG含量相近、实验组中HDL高于对照组、实验组中LDL低于对照组。根据该结果可得出复方发酵中药饲料添加剂对中华鳖血脂的调控有益。
表18复方发酵中药饲料添加剂对中华鳖生化指标的影响
注：同行数据标记字母表示差异不显著(P＞0.05)，无标记表示差异显著(P＜0.05)。
实验组、对照组中华鳖的血清抗氧化免疫指标见表19。血清中溶菌酶(LSM)是由单核细胞、嗜中性细胞和巨噬细胞产生的能溶解细菌细胞壁的酶。它是一种重要的非特异性防御因子，也是水产动物的非特异性免疫防御水平的重要标志之一。实验结果表明，饲喂复方发酵中药饲料添加剂的中华鳖其溶菌酶酶活远高于对照组。其结果可一定程度上说明饲喂复方发酵中药饲料添加剂作为长期日粮可提升中华鳖的非特异性免疫。
中华鳖机体内中含有大量地多不饱和脂肪酸，其十分容易被氧化，从而导致疾病的产生。有研究表明抗氧化能力与非特异性免疫相关，提高机体抗氧化能力，可激发机体免疫功能，从而提高机体免疫力和抗病性。因此测定中华鳖血清抗氧化能力可侧面观测其免疫功能。通过测定两组中华鳖血清总抗氧化能力(T-AOC)结果可得出，复方发酵中药饲料添加剂组别的中华鳖血清抗氧化能力约是全价粉料组别的两倍之多。可说明添加复方发酵中药饲料添加剂用于中华鳖养殖可提升中华鳖的抗氧化能力，从而达到增强机体免疫力的效果。
酸性磷酸酶(ACP)是巨噬细胞中的溶酶体酶的标志酶，在体内参与磷酸基团的转移和代谢，在血细胞吞噬和包囊反应时伴随有ACP的释放。魏炜等人在研究育蚌的ACP与免疫反应的关系中研究发现。育蚌在受到外界的损伤时候，其机体的ACP活力会上升。在损伤恢复后会恢复到正常状况。其研究认为，ACP活力与机体损伤机制相关。本次试验结果显示，复方发酵中药饲料添加剂组组别的中华鳖ACP活力略低于饲喂全价粉料的中华鳖组别。其结果预示，全价粉料组别的中华鳖可能存在一些机体损伤情况。实验结果说明，日粮添加复方发酵中药饲料添加剂可一定程度上减轻中华鳖在日常养殖中发生的机体损伤情况。
对于中华鳖来说，碱性磷酸酶(AKP)是一个十分重要的酶。它参与骨骼背甲形成、钙磷代谢。AKP活力高低是反映成骨细胞活性和生成状况，钙、磷代谢的重要指标之一。钙、磷供应不足对动物生长有重大影响，其主要表现为骨结构异常﹑食欲降低、软骨病、生产性能下降等。年幼动物血液中的AKP主要来自骨骼组织，随着其生长成熟，来自骨骼的AKP会不断减少。在本次实验中因中华鳖个体存在一定差异，具体表现在有几个组别中，中华鳖个体大小相差过大。其AKP测定结果也显示，体型较小的中华鳖AKP活力大于体型较大的中华鳖。因此直接相加计算其平均值作为测定结果不太准确。本次试验将其AKP活力与中华鳖的体重相比作为结果。其结果显示两个组别的中华鳖的AKP活力/体重基本相近，其结果可说明，说明复方发酵中药饲料添加剂添加对中华鳖骨骼背甲形成、钙磷代谢没有太大影响。
表19复方发酵中药饲料添加剂对中华鳖血清抗氧化免疫指标的影响
注：同行数据标记相同字母表示差异不显著(P＞0.05)，无标记或者是标记不同字母的表示差异显著(P＜0.05)。
实验结果表明，长期饲喂复方发酵中药饲料添加剂对中华鳖的生产性能没有显著影响。复方发酵中药饲料添加剂其能有效改善中华鳖的肠道功能，提高中华鳖的免疫力，对减少机体损伤，提升中华鳖的肝肾功能和血糖调节能力有明显效果。
实施例7：致病菌攻毒实验1
本发明实施例1制备的复方发酵中药饲料添加剂到普通水产饲料中得到混合饲料用于特种水产动物的喂养，添加量为混合饲料的5％～25％(以重量计)。复方发酵中药饲料添加剂配方为：复方中药材50％(黄芩20％、五倍子12％、野菊花14％、地锦草4％)、豆粕30％、次粉20％、复合酶1％。生物饲料配方为：豆粕60％、次粉40％、复合酶1％。复方发酵中药饲料添加剂与生物饲料的发酵条件相同，区别仅在于配方不同。
选择雌雄各半、健康活跃的中华鳖稚鳖，其平均体重均在10±5g。将其随机分为三组，分别饲喂相同数量的A、B、C三组饲料，A为10％复方发酵中药饲料添加剂和90％全价粉料组、B为10％生物饲料和90％全价粉料组，C为100％全价粉料饲料。每个组3个重复，每个30只中华鳖。
攻毒实验开始时在日粮中添加嗜水气单胞菌，平均每只稚鳖摄入致病菌约为108CFU菌量，随后正常饲喂不同日粮。
攻毒实验结果见表20，从攻毒实验第七天稚鳖存活结果可看出，攻毒实验过程中，全价粉料组别稚鳖大量死亡，生物饲料组别少量死亡，复方发酵中药饲料添加剂组别存活率最高。
观察稚鳖的活动状况可看出，在添加致病菌后，其全价粉料组别的一些稚鳖活动缓慢，出现浮水，身体个别部位出现溃烂等细菌性感染的情况。生物饲料组别个别稚鳖出现上述情况。但在复方发酵中药饲料添加剂组别，未见明显异常，活动活跃进食正常。
表20嗜水气单胞菌攻毒实验
注：同行数据标记字母表示差异不显著(P＞0.05)，无标记表示差异显著(P＜0.05)。
实施例8：致病菌攻毒实验2
本发明制备的复方发酵中药饲料添加剂到普通水产饲料中得到混合饲料用于特种水产动物的喂养，添加量为混合饲料的5％～25％(以重量计)。复方发酵中药饲料添加剂配方为：复方中药材50％(黄芩20％、五倍子12％、野菊花14％、地锦草4％)、豆粕30％、次粉20％、复合酶1％
选择雌雄各半、健康活跃的中华鳖稚鳖，其平均体重均在10±5g。将其随机分为三组，分别饲喂相同数量的A、B、C三组饲料，A为10％复方发酵中药饲料添加剂和90％全价粉料组、B为10％生物饲料和90％全价粉料组，C为100％全价粉料饲料。每个组3个重复，每个30只中华鳖。
攻毒实验开始时在日粮中添加嗜水气单胞菌，平均每只稚鳖摄入致病菌约为1012CFU菌量，随后正常饲喂不同日粮。
攻毒实验结果见表21，本次攻毒实验加大了致病菌的攻毒量，可明显观察到各组别稚鳖存活率降低，但复方发酵中药饲料添加剂组别的稚鳖仍比其他组别的存活率高，说明复方发酵中药饲料添加剂具有较好的抵御嗜水气单胞菌侵染的作用。
表21嗜水气单胞菌攻毒实验
注：同行数据标记字母表示差异不显著(P＞0.05)，无标记表示差异显著(P＜0.05)。
实施例9：致病菌攻毒实验3
本发明制备的复方发酵中药饲料添加剂到普通水产饲料中得到混合饲料用于特种水产动物的喂养，添加量为混合饲料的5％～25％(以重量计)。复方发酵中药饲料添加剂配方为：复方中药材10％(黄芩4％、五倍子2.4％、野菊花2.8％、地锦草0.8％)、豆粕54％、次粉36％、复合酶0.1％
选择雌雄各半、健康活跃的中华鳖稚鳖，其平均体重均在10±5g。将其随机分为三组，分别饲喂相同数量的A、B、C三组饲料，A为10％复方发酵中药饲料添加剂和90％全价粉料组、B为10％生物饲料和90％全价粉料组，C为100％全价粉料饲料。每个组3个重复，每个30只中华鳖。
攻毒实验开始时在日粮中添加嗜水气单胞菌，平均每只稚鳖摄入致病菌约为108CFU菌量，随后正常饲喂不同日粮。攻毒实验结果见表22，本次攻毒实验选用的复方发酵中药饲料添加剂采用的中药材仅含10％，但实验结果显示仍具有较好地抑菌效果。
表22嗜水气单胞菌攻毒实验
实施例10：致病菌攻毒实验4
本发明制备的复方发酵中药饲料添加剂到普通水产饲料中得到混合饲料用于特种水产动物的喂养，添加量为混合饲料的5％～25％(以重量计)。复方发酵中药饲料添加剂配方为：复方中药材90％(黄芩36％、五倍子21.6％、野菊花25.2％、地锦草7.2％)、豆粕6％、次粉4％、复合酶10％；
选择雌雄各半、健康活跃的中华鳖稚鳖，其平均体重均在10±5g。将其随机分为三组，分别饲喂相同数量的A、B、C三组饲料，A为10％复方发酵中药饲料添加剂和90％全价粉料组、B为10％生物饲料和90％全价粉料组，C为100％全价粉料饲料。每个组3个重复，每个30只中华鳖。
攻毒实验开始时在日粮中添加嗜水气单胞菌，平均每只稚鳖摄入致病菌约为1012CFU菌量，随后正常饲喂不同日粮。攻毒实验结果见表23，本次攻毒实验选用的复方发酵中药饲料添加剂采用的中药材含量为90％，但可以观察到，其较50％中药添加组别，存活率提升了6.67％，虽有效提升了稚鳖存活率，但其添加比例在一定程度上增加了添加剂成本，采用该中药添加量时需考虑经济因素。
表23嗜水气单胞菌攻毒实验
注：同行数据标记字母表示差异不显著(P＞0.05)，无标记表示差异显著(P＜0.05)。
说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。
Claims (10)
1.一种防治嗜水气单胞菌的复方发酵中药饲料添加剂的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：
(1)配制发酵培养基：将复方中药材、豆粕与次粉混合，再添加纤维素酶、半纤维素酶、单宁酶，混合后得到固态发酵培养基；
发酵培养基的各组分重量百分含量分别为：
复方中药材10～90％；
豆粕6～54％；
次粉4～36％；
复合酶添加量0.1～10％；
所述复方中药材由以下重量百分比的材料组成：黄芩4～36％、五倍子2.4～21.6％、野菊花2.8～25.2％、地锦草0.8～7.2％；
所述复合酶由纤维素酶、半纤维素酶和单宁酶组成；
(2)将芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌分别接种到相应的液体培养基进行活化培养，分别得到芽孢杆菌发酵种子液、酵母菌发酵种子液和乳酸菌发酵种子液；
(3)接种步骤(2)得到的芽孢杆菌种子液、酵母菌种子液、乳酸菌种子液于步骤(1)得到的发酵培养基中，调整发酵温度以及培养基的含水量，混合均匀，得到发酵混合物，在密闭条件下进行厌氧发酵后得到防治嗜水气单胞菌感染的发酵中药饲料添加剂。
2.根据权利要求1所述的一种防治嗜水气单胞菌的复方发酵中药饲料添加剂的制备方法，步骤(1)中所述豆粕在使用时需要烘干、研磨成粉末状使用；所述粉末是过50-80目筛得到；所述复方中药材研磨成粉末状使用，所述粉末是过50-80目筛得到。
所述纤维素酶、半纤维素酶、单宁酶的质量比为2:2:3；所述，复合酶中，半纤维素酶酶活力为5万u/g，纤维素酶和单宁酶的酶活均为1万u/g。
3.根据权利要求1所述的一种防治嗜水气单胞菌的复方发酵中药饲料添加剂的制备方法，步骤(1)中所述发酵培养基的各组分重量百分含量分别为：
复方中药材50％；
豆粕30％；
次粉20％；
复合酶添加量1％；所述复方中药材由以下重量百分比的材料组成：黄芩20％、五倍子12％、野菊花14％、地锦草4％。
4.根据权利要求1所述的一种防治嗜水气单胞菌的复方发酵中药饲料添加剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌；所述酵母菌为酿酒酵母；所述乳酸菌为植物乳杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌。
5.根据权利要求1所述的一种防治嗜水气单胞菌的复方发酵中药饲料添加剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述芽孢杆菌发酵种子液和酵母菌发酵种子液接种时的用量与发酵培养基关系均为0.1～9ml：100g；所述芽孢杆菌和酵母菌的活菌总数均为1.0×108～2.8×109cfu/mL；所述酵母菌发酵种子液为酿酒酵母发酵种子液；
所述乳酸菌发酵种子液为植物乳杆菌发酵种子液、发酵乳杆菌发酵种子液和鼠李糖乳杆菌发酵种子液，活菌总数为1.5×108～3.5×109cfu/mL，所述乳酸菌发酵种子液的接种量与发酵培养基关系为0.8～5.7ml：100g；
所述乳酸菌发酵种子液、芽孢杆菌发酵种子液和酵母菌发酵种子液接种时的体积比为2：2：3。
6.根据权利要求5所述的一种防治嗜水气单胞菌的复方发酵中药饲料添加剂的制备方法，其特征在于，所述芽孢杆菌发酵种子液和酵母菌发酵种子液接种时的用量与发酵培养基关系均为2ml：100g。
7.根据权利要求1所述的一种防治嗜水气单胞菌的复方发酵中药饲料添加剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述发酵培养基的含水量为40％～60％；所述发酵时间为5～20天，发酵温度为24～38℃。
8.根据权利要求1～7任一项所述的方法制备的复方发酵中药饲料添加剂。
9.根据权利要求8所述的复方发酵中药饲料添加剂用于添加到水产养殖饲料中抑制嗜水气单胞菌的用途。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，具体操作是：将复方发酵中药饲料添加剂添加到水产饲料中得到混合饲料进行喂养；所述复方发酵中药饲料添加剂的添加量占混合饲料的重量为5％～25％。
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111011665A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-04-17 | 山西大禹生物工程股份有限公司 | 一种促进水产动物生长的微生物发酵湿料及其制备方法和应用 |
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Patent Citations (2)
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 曹良，等: "斑点叉尾触"腹水症"病原的体外中药药敏试验", 生态学杂志, vol. 2, no. 1, pages 95 - 97 * |
| 赵倩，等: "不同益生菌发酵中草药对鲤鱼生长性能及抗感染能力的研究", 中国饲料, no. 2, pages 35 - 39 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN115887523A (zh) * | 2022-11-21 | 2023-04-04 | 江西省科学院生物资源研究所 | 一种中草药副产物好厌氧联合发酵的方法和应用 |
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