CN111676286B - 肺癌血浆游离dna甲基化检测用的多重pcr引物***、检测方法及应用 - Google Patents
肺癌血浆游离dna甲基化检测用的多重pcr引物***、检测方法及应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种肺癌血浆游离DNA甲基化检测用的多重PCR引物***、检测方法及应用。该肺癌血浆游离DNA甲基化检测用的多重PCR***包括第一轮多重PCR引物组和/或第二轮多重PCR引物，其中，第一轮多重PCR引物组包含55对PCR引物对，序列分别如序列表中SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.110所示，第二轮多重PCR引物的序列如SEQ ID NO.111～SEQ ID NO.112所示。本发明提供的肺癌血浆游离DNA甲基化检测方法能一次性同时对肺癌相关的55个甲基化位点进行检测，多重PCR引物之间相互干扰小，特异性强，扩增效率高，并且减少样本损耗，降低检测成本，提高检测效率，配合高通量测序技术，可明显提高早期肺癌的检出率，适于推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学检测领域，尤其涉及肺癌血浆游离DNA甲基化检测用的多重PCR引物***、检测方法及应用。
背景技术
肺癌一直都是世界发生率和死亡率最高的癌症。肺癌的早期诊断主要是根据病史中的高危因素，并结合影像学、内镜以及分子生物学等手段进行早期筛查，从而达到早发现早治疗的目的。但这些肺癌早期诊断检查方法也存在明显不足：低剂量螺旋CT(LDCT)存在辐射的风险；支气管内镜法往往是有创的，并且假阴性的情况比较多；痰液脱落细胞检查也存在敏感度低、假阴性较多的问题。还有穿刺组织活检等方法，创伤大，只能应用癌症确诊中。
临床分子诊断技术一直是癌症诊断的研究方向，肿瘤分子标记物则是其中的重点研究目标。肺癌相关基因的异常甲基化被认为是肺癌发生过程中的早期事件，且随着发生异常甲基化的基因数量增加，发生肺癌的风险也逐渐增加。例如Belinsky等在小鼠肺癌模型的癌前病变中就检测到p16基因出现异常甲基化，而且异常甲基化的频率会随着病变的发展而升高。Palmisano等也在三年后才被诊断为肺癌的患者痰液里全部检测到MGMT基因及(或)p16基因出现异常甲基化。另外，肺癌相关基因的异常甲基化，不仅能在肺癌组织以及痰液中检测到，还能在肺癌患者支气管灌洗液、支气管刷检标本以及血清或血浆等中检测到，具有标本易获取的优点。因此，肺癌相关基因的异常甲基化可作为肺癌的肿瘤标志物，用来做肺癌早期诊断或风险评估。
血浆游离DNA(cfDNA)又称为循环游离DNA，是存在于血浆中的细胞外核酸，一般呈片段化，其长度在150bp到21k bp不等。有研究发现，在肿瘤发生的早期就能在血浆cfDNA中检测出肿瘤相关基因的异常甲基化，且cfDNA中的异常甲基化总是与肿瘤细胞中的异常甲基化同时出现，同时血浆cfDNA中基因异常甲基化具有较高的敏感性和特异性。2017年Nature主刊发表论文显示，游离DNA甲基化能够对于肺癌早期、胰腺癌早期进行筛查，其灵敏度分别为0.975及0.914，对于其他癌症(乳腺癌、结直肠癌、肾癌、膀胱癌、急性髓系白血病)均具有约0.9以上的准确性。因而，游离DNA甲基化是一种稳定可靠的癌症标志物，将游离DNA甲基化检测应用于肺癌筛查具有项目实施的可行性以及大人群筛查所需要的无创、操作简单、易于取样和灵敏度及特异性高的特点，在肺癌早期诊断及风险评估中具有极其重要的意义。
在目前的研究中，DNA甲基化作为肿瘤标志物应用于肿瘤筛查，被广泛的学术研究证实过，且有部分标志物已经被商业化，如septin9被认定为肠癌筛查的金标准。而肺癌DNA甲基化标志物并没有被广泛应用于大健康筛查和伴随诊断领域中。癌症早期筛查不但能够提高癌症生存率，同时能够减轻患者家庭经济负担以及社会负担。因此，开发一种基于肺癌血浆游离DNA甲基化检测的肺癌早期筛查的方法存在迫切需求。
发明内容
有鉴于此，本发明提出了一种肺癌血浆游离DNA甲基化检测用的多重PCR引物***、检测方法及应用，该多重PCR引物***能同时检测肺癌相关的55个甲基化位点，且各引物之间相互干扰小，特异性强，扩增效果好，可提高检测效率，降低检测成本，并且可配合高通量测序技术进行高通量测序，对肺癌高危人群具有辅助筛查和提示作用。
本发明的技术方案是这样实现的：
第一方面，本发明提供了一种肺癌血浆游离DNA甲基化检测用的多重PCR引物***，包括第一轮多重PCR引物组，所述第一轮多重PCR引物组含有55对PCR引物对，且该55对PCR引物对的序列如下：
位点1
正向引物 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGACCCCATCCTATTAAACATACA(SEQID NO.1)
反向引物 TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGAGTGGGTAGTATAAAGTATTGGAT(SEQ ID NO.2)
位点2
正向引物 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCCCCCACATTATCCTACTCT(SEQID NO.3)
反向引物 TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGGGATTTGAATGATATGAAGGG(SEQID NO.4)
位点3
正向引物 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAGGATTTGGAAAGGAATGAATAAT(SEQ ID NO.5)
反向引物 TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGACATCTAAATCCTTCATCACC(SEQID NO.6)
位点4
正向引物 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAGTTGGGAAGTAGTTATTATAGAT(SEQ ID NO.7)
反向引物 TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGTCTCCTCCTCTTCAATAACAT(SEQID NO.8)
位点5
正向引物 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAAGAGATGATTTAGAATTAATAGTG(SEQ ID NO.9)
反向引物 TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGCTCCCTACTACTCTCTTCTA(SEQID NO.10)
位点6
正向引物 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTTTCCTTTTCAAATCATAAAACT(SEQ ID NO.11)
反向引物 TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGATTTTAGAGTTGGTATGGAGTAAT(SEQ ID NO.12)
位点7
正向引物 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGTTTTAAATATGTATAGTAGAGAGT(SEQ ID NO.13)
反向引物 TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGTCCACCCTTAACCTATCTCA(SEQ IDNO.14)
位点8
正向引物 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGAGATTTTGAGATAGTGAGAATT(SEQ ID NO.15)
反向引物 TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCCCATCTACATCACCAATA(SEQ IDNO.16)
位点9
正向引物 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTTGGTTGGTAAGGAAATATAGG(SEQID NO.17)
反向引物 TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGTCCCCCTATATCCAAACATA(SEQ IDNO.18)
位点10
正向引物 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGACCAACCTATTTCACTCCAA(SEQID NO.19)
反向引物 TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGAGTGATTTAGATTTAGAGGATTGTA(SEQ ID NO.20)
位点11
正向引物 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAGGTTTGTAAGGAGTGTGAT(SEQID NO.21)
反向引物 TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCCTCCATCTATTTAACCTCCTA(SEQID NO.22)
位点12
正向引物 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTGGTGTAGGATGAAGGTATGA(SEQID NO.23)
反向引物 TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGAACTCCCCATTACCCTTCTA(SEQ IDNO.24)
位点13
正向引物 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGACCAACCAACTCCTCTTATA(SEQID NO.25)
反向引物 TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGAGAGATTGGAAAGAAAGTATTGTG(SEQ ID NO.26)
位点14
正向引物 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTCCATCAATCTATTAATTACACTA(SEQ ID NO.27)
反向引物 TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGAAATAGGTATAATATTAGGGTTTTT(SEQ ID NO.28)
位点15
正向引物 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAATCAATTCTCATCATACAACTCA(SEQ ID NO.29)
反向引物 TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGAGTGTGTGTTAGTTAGTTTATGT(SEQID NO.30)
位点16
正向引物 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGTGTTTTGGTATAAGTGTTTGTAA(SEQ ID NO.31)
反向引物 TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGACTTCCCAATCCTCCAATTT(SEQ IDNO.32)
位点17
正向引物 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGGGTGTTTGGTATAGAGAGTTGA(SEQID NO.33)
反向引物 TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGACATTCCATAATCCCATATCC(SEQID NO.34)
位点18
正向引物 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGAACCATTTCCTATACCTTTTAA(SEQID NO.35)
反向引物 TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGGGTGGGGAGTTGTAAAAA(SEQ IDNO.36)
位点19
正向引物 GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAGCAAATTTAACAAAAATAATCTTACC(SEQ ID NO.37)
反向引物 TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGAGGAAGTTTGATATAGGAAATAATA(SEQ ID NO.38)
位点20
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位点21
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位点22
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位点23
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位点43
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位点45
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位点50
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位点55
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反向引物 TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGTGGTATAGTTTAGAGTTTAGTGGTA(SEQ ID NO.110)
在以上技术方案的基础上，优选的，所述多重PCR引物***还包括第二轮多重PCR引物，所述第二轮多重PCR引物的序列如下：
正向引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTCTCGTGGGCTCGG(SEQ ID NO.111)
反向引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTC(SEQ ID NO.112)
进一步，优选的，所述第二轮多重PCR引物的序列中包含6-10个可变碱基，用于对样本DNA进行标记。
更进一步，优选的，所述第二轮多重PCR引物的序列中可变碱基数目为8个，所述第二轮多重PCR引物的序列如下：
正向引物 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNGTCTCGTGGGCTCGG(SEQ IDNO.113)
反向引物 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACNNNNNNNNTCGTCGGCAGCGTC(SEQ IDNO.114)
第二方面，本发明提供了第一方面所述的肺癌血浆游离DNA甲基化检测用的多重PCR引物***在制备肺癌血浆游离DNA甲基化水平的筛查检测试剂中的应用。
第三方面，本发明提供了一种肺癌血浆游离DNA甲基化检测用试剂盒，包括第一方面所述的肺癌血浆游离DNA甲基化检测用的多重PCR引物***。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述肺癌血浆游离DNA甲基化检测用试剂盒还包括DNA提取试剂、亚硫酸氢盐转化试剂、PCR扩增试剂和DNA纯化试剂。
进一步，优选的，所述DNA纯化试剂为磁珠法纯化试剂。
第四方面，本发明还提供了一种肺癌血浆游离DNA甲基化水平的检测方法，包括如下步骤：
S1、提取样本血浆游离DNA；
S2、对步骤S1提取的游离DNA进行亚硫酸氢盐转化及纯化；
S3、使用本发明第一方面所述的肺癌血浆游离DNA甲基化检测用的多重PCR引物***，以步骤S2转化纯化后的DNA为模板进行多重PCR扩增；
S4、对步骤S3多重PCR扩增得到的产物进行高通量测序，并将测序结果与转化后的人基因组参考序列进行比对，分析判断样本血浆游离DNA的甲基化水平。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述人基因组参考序列为hg19或hg38。
本发明的肺癌血浆游离DNA甲基化检测用的多重PCR引物***、检测方法及应用相对于现有技术具有以下有益效果：
(1)2mL外周血只含有10-20ng DNA，只能满足1-2个PCR反应需求，而亚硫酸氢盐处理后，血浆DNA被转化为单链，血浆游离DNA会被进一步降解，如果需要对多个位点单独检测是无法实现的，本发明针对血浆游离DNA甲基化位点设计的多重PCR引物***包括两轮引物，第一轮多重PCR引物组包含有55对PCR引物对，能够在一个反应管中一次性完成55个甲基化位点的扩增，各引物之间相互干扰小，特异性强，扩增效果好，可提高检测效率，完美解决血浆游离DNA量少的问题，降低检测成本，减少样本损耗；
(2)由于目前常见的二代测序方法需要进行末端修复、末端加A、接头连接、扩增、纯化、二次扩增加测序引物以及再次纯化等多个步骤，本发明提供的二轮PCR扩增建库***，第一轮多重PCR引物对正反向引物上游各带有一段20-40个碱基通用序列，用于与第二轮多重PCR引物对正反向引物下游序列结合，第二轮多重PCR引物对正反向引物上游序列用于进行高通量测序，不需要末端修复、末端加A和接头连接过程，只需要简单的两步扩增，即可完成建库，产物纯化后直接可以用于通用SE50/SE100/SE150/PE50/PE100/PE150测序；
(3)目前二代测序的测序通量极大(50Gb-4Tb)，单个样本的扩增产物测序量不足10M，无法满足单次测序通量，并且由于人群筛查，常单日收集样本在1000-10000个样本，如果每个样本单独建库，会严重限制检测通量。本发明的第二轮多重PCR引物上下游之间包含6-10个可变碱基(N)，用于对样本进行标记，该区域的随机组合在第二轮PCR过程中，每个样本只加入1种固定组合，从而实现一次性对高达第二轮正向引物28×第二轮反向引物28个，共65536个样本进行二代测序，不但能够节约检测时间，同时能节约检测成本，极容易实现检测自动化。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
实施例1、肺癌血浆游离DNA甲基化检测用的多重PCR引物***
本实施例引物设计针对的目标区域为肺癌特异的甲基化位点上下游各120个碱基的区域。因血浆游离DNA的最长长度一般不会超过约200bp，所以需要将引物的扩增长度限定在120个碱基以内。
本实施例设计的肺癌血浆游离DNA甲基化检测用的多重PCR引物设计概况如表1所示。
表1肺癌血浆游离DNA甲基化检测用的多重PCR引物设计概况
实施例2、利用本发明设计的多重PCR引物***检测肺癌血浆游离DNA甲基化水平
S1、肺癌血浆游离DNA提取
使用QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Qiagen 55114)，按照试剂盒说明书步骤进行肺癌血浆游离DNA提取。
S2、血浆游离DNA亚硫酸氢盐转化及纯化
使用EZ DNA Methylation-Gold Kit(zymo Research D5005s)，按照试剂盒说明书步骤对10ng血浆游离DNA进行转化，具体实施步骤如下：
1)根据说明书配制CT Conversion Reagent转化液，现配现用；
2)取20μL未转化的DNA样本(样本体积不足20μL，加水补足)，加入130μL CTConversion Reagent转化液，振荡使其充分混匀，并短暂离心将反应液收集至管底；
3)将PCR管置于PCR仪中，进行下述反应：
98℃ 10min
64℃ 2.5h
4℃ 保持；
4)向收集柱中加入600μL M-Binding Buffer，再将PCR产物加入到已有M-BindingBuffer的收集柱中，盖上盖子颠倒混匀几次，10000g离心30s，丢弃过滤液；
5)加入100μL M-Wash Buffer，10000g离心30s，丢弃过滤液；
6)加入200μL M-Desulphonation Buffer，室温放置15-20min，10000g离心30s，丢弃过滤液；
7)加入200μL M-Wash Buffer，10000g离心30s，丢弃过滤液，再重复此步骤一次；
8)将收集管放入一个新的1.5mL离心管中，加入9μL ddH2O，10000g离心30s，将转化后的DNA样本放入-20℃保存。
S3、转化后DNA的第一轮多重PCR扩增
将第一轮多重PCR的55对引物按照预设比例进行混合后，以转化后的血浆游离DNA为模板，进行第一轮多重PCR扩增。扩增体系见表2。
表2第一轮多重PCR扩增体系
| 试剂 | 体积(μL) |
| 2×Taq Master Mix | 10 |
| 引物混合液(10μM each) | 3 |
| 模板 | 7 |
| 总体积 | 20 |
PCR扩增程序见表3。
表3第一轮多重PCR扩增程序
S4、第一轮多重PCR扩增产物纯化
使用AMPure XP(Beckman Agencourt)磁珠对第一轮多重PCR扩增产物进行纯化，具体实施步骤如下：
1)将AMPure XP磁珠提前30min从2-8℃取出，静置使其温度平衡至室温；
2)向第一轮PCR产物中加入20μL(1.2×)AMPure XP磁珠，用移液枪吹打10次充分混匀，室温孵育5min，使DNA结合到磁珠上；
3)将离心管保持在磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清；
4)将离心管保持在磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇溶液漂洗磁珠，室温孵育30s，小心移除上清；
5)重复步骤4)一次；
6)将离心管保持在磁力架上，于室温下开盖干燥约5-10min；
7)将离心管从磁力架上取出，加入10μL ddH2O，用移液枪吹打10次充分混匀，室温静置5min后置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心吸取9μL上清至一个新的灭菌PCR管中，-20℃保存。
S5、第二轮多重PCR扩增
使用具有不同标记的第二轮多重PCR引物，以第一轮PCR纯化产物为模板进行第二轮多重PCR扩增。扩增体系见表4。
表4第二轮多重PCR扩增体系
| 试剂 | 体积(μL) |
| 2×Taq Master Mix | 10 |
| 引物混合液(10μM each) | 1 |
| 模板 | 9 |
| 总体积 | 20 |
PCR扩增程序见表5。
表5第二轮多重PCR扩增程序
S6、第二轮多重PCR扩增产物纯化
使用AMPure XP(Beckman Agencourt)磁珠对第二轮多重PCR扩增产物进行纯化，具体实施步骤如下：
1)将AMPure XP磁珠提前30min从2-8℃取出，静置使其温度平衡至室温；
2)向第二轮PCR产物中加水补足至50μL体系，混匀后加入42.5μL(0.85×)AMPureXP磁珠，使用移液枪吹打10次充分混匀；
3)室温孵育5min；
4)将离心管放于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心转移上清至新的灭菌PCR管中，丢弃磁珠；
5)振荡混匀AMPure XP磁珠并吸取5μL(0.1×)AMPure XP磁珠于上清中，用移液枪轻轻吹打10次充分混匀，室温孵育5min；
6)将离心管保持在磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心移除上清；
7)将离心管保持在磁力架上，加入200μL新鲜配制的80％乙醇溶液漂洗磁珠，室温孵育30s，小心移除上清；
8)重复步骤7)一次；
9)将离心管保持在磁力架上，于室温下开盖干燥约5-10min；
10)将离心管从磁力架上取出，加入12.5μL ddH2O，用移液枪轻轻吹打充分混匀，室温静置5min后置于磁力架上，待溶液澄清后(约5min)，小心吸取10μL上清至一个新的灭菌PCR管中，-20℃保存。
S7、质检和测序
1)使用Qubit荧光定量仪对文库浓度进行测量；
2)使用Agilent 2100bioanalyzer对文库质量进行质检；
3)使用Nextseq 500测序仪对样本文库进行测序。
S8、实验结果和数据分析
使用fastp对下机数据进行数据质控，去除测序质量低的测序数据，并根据indexA以及indexB对下机数据进行拆分。随后使用Bowtie2将各样本下机数据与自建数据库中的转化后人基因组序列hg19或hg38进行比对。利用固定位点序列中的位点信息进行该位点的甲基化水平评估，最后整合生成检测结果，如表6所示。
表6甲基化水平检测结果
如表6所示，通过对该55个位点甲基化水平的评估以及正常人与肺癌患者甲基化水平进行关联比对后，通过自建模型对样本进行综合评估，预测样本的肺癌风险。
综上，本发明血浆游离DNA甲基化检测方法针对血浆游离DNA的55个甲基化位点同时进行检测，多重PCR引物的特异性强，扩增效率高，样本损耗低，操作方便快捷，提高检测效率的同时大大节约了检测成本，配合高通量测序技术，对早期肺癌诊断具有辅助筛查和提示作用。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 武汉爱基百客生物科技有限公司
<120> 肺癌血浆游离DNA甲基化检测用的多重PCR引物***、检测方法及应用
<130> 2020-5-15
<160> 114
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 56
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagacccca tcctattaaa cataca 56
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<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
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<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
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<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
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<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
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<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
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<211> 58
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tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagagtgatt tagatttaga ggattgta 58
<210> 21
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 21
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagaggttt gtaaggagtg tgat 54
<210> 22
<211> 55
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 22
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcctccat ctatttaacc tccta 55
<210> 23
<211> 55
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 23
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagtggtgt aggatgaagg tatga 55
<210> 24
<211> 53
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 24
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagaactccc cattaccctt cta 53
<210> 25
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 25
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagaccaac caactcctct tata 54
<210> 26
<211> 57
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 26
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagagagatt ggaaagaaag tattgtg 57
<210> 27
<211> 58
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 27
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagtccatc aatctattaa ttacacta 58
<210> 28
<211> 58
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 28
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagaaatagg tataatatta gggttttt 58
<210> 29
<211> 58
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 29
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagaatcaa ttctcatcat acaactca 58
<210> 30
<211> 56
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 30
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagagtgtgt gttagttagt ttatgt 56
<210> 31
<211> 57
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 31
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagtgtttt ggtataagtg tttgtaa 57
<210> 32
<211> 53
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 32
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagacttccc aatcctccaa ttt 53
<210> 33
<211> 56
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 33
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagggtgtt tggtatagag agttga 56
<210> 34
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 34
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagacattcc ataatcccat atcc 54
<210> 35
<211> 56
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 35
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagaaccat ttcctatacc ttttaa 56
<210> 36
<211> 52
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 36
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggggtggg gagttgtaaa aa 52
<210> 37
<211> 59
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 37
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagcaaatt taacaaaaat aatcttacc 59
<210> 38
<211> 58
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 38
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagaggaagt ttgatatagg aaataata 58
<210> 39
<211> 58
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 39
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggaagag atggtatttt atagggga 58
<210> 40
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 40
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagactaact tcaccacatc cttt 54
<210> 41
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 41
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagccctct tcatatccct aaac 54
<210> 42
<211> 58
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 42
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggtggaat tttattgtgt tgatttaa 58
<210> 43
<211> 58
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 43
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagtggagt ttagtatgaa gtaatgtg 58
<210> 44
<211> 53
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 44
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcccatcc ttttacccaa atc 53
<210> 45
<211> 55
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 45
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagtttgag gggaataggt tggta 55
<210> 46
<211> 53
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 46
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagatccccc aattcatctt cac 53
<210> 47
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 47
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggtttgg agaaggttag tgga 54
<210> 48
<211> 57
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 48
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagacaacac cattaaatta atcatca 57
<210> 49
<211> 55
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 49
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagaaaggg gtggtttagg ataaa 55
<210> 50
<211> 56
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 50
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagacaaatc aaatatttcc aacata 56
<210> 51
<211> 57
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 51
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagtttttg ggatttttgt ttttggt 57
<210> 52
<211> 55
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 52
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagaccatca tttcaaccaa taacc 55
<210> 53
<211> 55
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 53
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagtttttg taattggagg agtga 55
<210> 54
<211> 56
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 54
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagcaaattt ttccttacaa ccactc 56
<210> 55
<211> 57
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 55
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagtggagg tagagtttag agaagta 57
<210> 56
<211> 53
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 56
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagtttactc tccacactcc tca 53
<210> 57
<211> 55
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 57
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagaagtga aaagaaaagg agtta 55
<210> 58
<211> 53
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 58
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggcctttc cttaaccatt cct 53
<210> 59
<211> 55
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 59
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggttaga aaggggtgtt aggaa 55
<210> 60
<211> 55
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 60
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagccccaca accataaaat catta 55
<210> 61
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 61
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagcctccc aattcccata ccta 54
<210> 62
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 62
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggggtttt ggaagaatag ggta 54
<210> 63
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 63
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagcaccct cctcactata ctca 54
<210> 64
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 64
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagggaaagg ggagttgagt tata 54
<210> 65
<211> 56
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 65
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggttggg ggatgggtta tattta 56
<210> 66
<211> 55
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 66
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagaaacctt ctttacacaa acact 55
<210> 67
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 67
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagtggggt tatgtaaggg gatg 54
<210> 68
<211> 56
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 68
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagaccaaac aactactaat caaaca 56
<210> 69
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 69
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagaagttg gaagagggaa atta 54
<210> 70
<211> 55
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 70
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagtcaaaaa tccttctact cacct 55
<210> 71
<211> 53
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 71
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggttaga gagtggtgga gga 53
<210> 72
<211> 53
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 72
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagccaacac tactctttct cca 53
<210> 73
<211> 58
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 73
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagaagtta attagtaggt ataggttt 58
<210> 74
<211> 53
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 74
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagactccct tacaacctat cct 53
<210> 75
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 75
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagacacct cacttttcaa ccta 54
<210> 76
<211> 53
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 76
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagggaggtg ttatggttgt gat 53
<210> 77
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 77
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagcccact ccaaccattt aact 54
<210> 78
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 78
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggggatag ggtatagggt atgt 54
<210> 79
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 79
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggttata ggtgtgttgg gtga 54
<210> 80
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 80
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagccccaac ctacttacta aact 54
<210> 81
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 81
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagactctt aacttctcac caat 54
<210> 82
<211> 56
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 82
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagggtattt tggttttatg tgatga 56
<210> 83
<211> 55
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 83
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acaggggttg ggagttaatg agtat 55
<210> 84
<211> 55
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 84
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagccccaaa accaaatcac taatt 55
<210> 85
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 85
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagggaaag taggtaatgg gagg 54
<210> 86
<211> 53
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 86
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagaccaact ctcccaacaa tta 53
<210> 87
<211> 59
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 87
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagaaacca ttatataaaa atactacca 59
<210> 88
<211> 55
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 88
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagaaagaga tttgagttgt agggt 55
<210> 89
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 89
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagcaccaa cacccactct ataa 54
<210> 90
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 90
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagtttgggg agaatgagaa ttgt 54
<210> 91
<211> 56
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 91
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagagtgag ggtttatgtt tgtata 56
<210> 92
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 92
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggcttccc tcacctaaaa taca 54
<210> 93
<211> 55
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 93
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagtttaag taggggtgtg gtaga 55
<210> 94
<211> 53
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 94
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggctaccc tatcaacaac aca 53
<210> 95
<211> 55
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 95
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagtccaaa acccattcct attca 55
<210> 96
<211> 53
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 96
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagaatatgt agagggtagg tgg 53
<210> 97
<211> 55
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 97
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagggtgga gttgtttaaa aggtt 55
<210> 98
<211> 51
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 98
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagccaccct cccaatctta c 51
<210> 99
<211> 56
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 99
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagcaaaac ttcaacaaac attcca 56
<210> 100
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 100
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga caggggggaa tttttgaatt attt 54
<210> 101
<211> 58
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 101
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagtagtgt atttaagaaa tgttgtat 58
<210> 102
<211> 53
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 102
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagaaaatca acccaacacc aac 53
<210> 103
<211> 57
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 103
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagacaaac acaataaaac ctaaatt 57
<210> 104
<211> 55
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 104
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagggttgta tttgtaagtt gggag 55
<210> 105
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 105
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagccacat caccctctat tacc 54
<210> 106
<211> 55
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 106
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagtgtggat gtttaaggtt aaggt 55
<210> 107
<211> 56
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 107
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagtgagtt tatagtgagg gtgaaa 56
<210> 108
<211> 53
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 108
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagaatcaca acttcctctt cct 53
<210> 109
<211> 54
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 109
gtctcgtggg ctcggagatg tgtataagag acagacccac atccacccta aata 54
<210> 110
<211> 58
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 110
tcgtcggcag cgtcagatgt gtataagaga cagtggtata gtttagagtt tagtggta 58
<210> 111
<211> 39
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 111
caagcagaag acggcatacg agatgtctcg tgggctcgg 39
<210> 112
<211> 43
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 112
aatgatacgg cgaccaccga gatctacact cgtcggcagc gtc 43
<210> 113
<211> 47
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 113
caagcagaag acggcatacg agatnnnnnn nngtctcgtg ggctcgg 47
<210> 114
<211> 51
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 114
aatgatacgg cgaccaccga gatctacacn nnnnnnntcg tcggcagcgt c 51
Claims (4)
1.一种多重PCR引物***，其特征在于：包括第一轮多重PCR引物组，所述第一轮多重PCR引物组含有55对PCR引物对，且该55对PCR引物对的序列分别如序列表中SEQ ID NO.1~SEQ ID NO.110所示；还包括第二轮多重PCR引物，所述第二轮多重PCR引物的序列如序列表中SEQ ID NO.113~SEQ ID NO.114所示。
2.一种试剂盒，其特征在于：包括权利要求1所述的多重PCR引物***。
3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：还包括DNA提取试剂、亚硫酸氢盐转化试剂、PCR扩增试剂和DNA纯化试剂。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述DNA纯化试剂为磁珠法纯化试剂。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113817805B (zh) * | 2021-09-26 | 2022-10-25 | 南京兔牙生物科技有限公司 | 一种mgmt启动子甲基化检测方法、引物组以及试剂盒 |
| CN114540497B (zh) * | 2022-02-25 | 2024-02-27 | 博尔诚（北京）科技有限公司 | 用于膀胱癌筛查的标志物、探针组合物及其应用 |
| CN114774514B (zh) * | 2022-02-28 | 2024-04-30 | 上海羿鸣生物科技有限公司 | 一种适用于高通量靶向基因组甲基化检测的文库构建方法及其试剂盒 |
| CN114736968B (zh) * | 2022-06-13 | 2022-09-27 | 南京世和医疗器械有限公司 | 血浆游离dna甲基化标志物在肺癌早筛中的用途以及肺癌早筛装置 |
Citations (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1469926A (zh) * | 2000-03-29 | 2004-01-21 | 科里克萨有限公司 | 治疗和诊断肺癌的组合物和方法 |
| CN101970692A (zh) * | 2008-03-14 | 2011-02-09 | 基因特力株式会社 | 使用肺癌特异性甲基化标记基因检测肺癌的方法 |
| CN102016067A (zh) * | 2008-01-22 | 2011-04-13 | 维里德克斯有限责任公司 | ***癌中gstp1高甲基化的检测 |
| CN103589777A (zh) * | 2012-08-14 | 2014-02-19 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | Dna甲基化的检测探针、检测方法及检测试剂盒 |
| CN104066851A (zh) * | 2011-09-30 | 2014-09-24 | 基因泰克公司 | 肿瘤或肿瘤细胞中上皮或间充质表型的诊断性甲基化标志物和对egfr激酶抑制剂的响应 |
| CN105316421A (zh) * | 2015-12-01 | 2016-02-10 | 湖南宏雅基因技术有限公司 | 用于检测与肺癌相关的shox2基因启动子区甲基化程度的试剂盒 |
| CN105368945A (zh) * | 2015-11-25 | 2016-03-02 | 中国科学院上海微***与信息技术研究所 | 一种肺癌早期检测用甲基化标志物及其检测方法 |
| CN106011292A (zh) * | 2016-07-27 | 2016-10-12 | 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 | 一种检测肺癌相关基因shox2甲基化的试剂盒 |
| CN107955836A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-04-24 | 韩林志 | 用于肺癌相关基因shox2甲基化检测的引物对、试剂盒及方法 |
| CN107974503A (zh) * | 2016-10-20 | 2018-05-01 | 上海透景诊断科技有限公司 | 多个肺癌相关基因甲基化联合检测试剂盒、联合检测方法和应用 |
| CN109563546A (zh) * | 2016-05-05 | 2019-04-02 | 精密科学发展有限责任公司 | 通过分析甲基化dna来检测肺肿瘤 |
| CN109642228A (zh) * | 2016-07-19 | 2019-04-16 | 精密科学发展有限责任公司 | 甲基化对照dna |
| CN109825586A (zh) * | 2019-03-11 | 2019-05-31 | 深圳市新合生物医疗科技有限公司 | 用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法 |
| CN109952381A (zh) * | 2016-10-06 | 2019-06-28 | 基因特力株式会社 | 用于多重检测甲基化dna的方法 |
| CN110872631A (zh) * | 2019-12-26 | 2020-03-10 | 广州市基准医疗有限责任公司 | Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒 |
-
2020
- 2020-05-29 CN CN202010479463.6A patent/CN111676286B/zh active Active
Patent Citations (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1469926A (zh) * | 2000-03-29 | 2004-01-21 | 科里克萨有限公司 | 治疗和诊断肺癌的组合物和方法 |
| CN102016067A (zh) * | 2008-01-22 | 2011-04-13 | 维里德克斯有限责任公司 | ***癌中gstp1高甲基化的检测 |
| CN101970692A (zh) * | 2008-03-14 | 2011-02-09 | 基因特力株式会社 | 使用肺癌特异性甲基化标记基因检测肺癌的方法 |
| CN104232763A (zh) * | 2008-03-14 | 2014-12-24 | 基因特力株式会社 | 使用肺癌特异性甲基化标记基因检测肺癌的方法 |
| CN104066851A (zh) * | 2011-09-30 | 2014-09-24 | 基因泰克公司 | 肿瘤或肿瘤细胞中上皮或间充质表型的诊断性甲基化标志物和对egfr激酶抑制剂的响应 |
| CN103589777A (zh) * | 2012-08-14 | 2014-02-19 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | Dna甲基化的检测探针、检测方法及检测试剂盒 |
| CN105368945A (zh) * | 2015-11-25 | 2016-03-02 | 中国科学院上海微***与信息技术研究所 | 一种肺癌早期检测用甲基化标志物及其检测方法 |
| CN105316421A (zh) * | 2015-12-01 | 2016-02-10 | 湖南宏雅基因技术有限公司 | 用于检测与肺癌相关的shox2基因启动子区甲基化程度的试剂盒 |
| CN109563546A (zh) * | 2016-05-05 | 2019-04-02 | 精密科学发展有限责任公司 | 通过分析甲基化dna来检测肺肿瘤 |
| CN109642228A (zh) * | 2016-07-19 | 2019-04-16 | 精密科学发展有限责任公司 | 甲基化对照dna |
| CN106011292A (zh) * | 2016-07-27 | 2016-10-12 | 北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司 | 一种检测肺癌相关基因shox2甲基化的试剂盒 |
| CN109952381A (zh) * | 2016-10-06 | 2019-06-28 | 基因特力株式会社 | 用于多重检测甲基化dna的方法 |
| CN107974503A (zh) * | 2016-10-20 | 2018-05-01 | 上海透景诊断科技有限公司 | 多个肺癌相关基因甲基化联合检测试剂盒、联合检测方法和应用 |
| CN107955836A (zh) * | 2017-12-29 | 2018-04-24 | 韩林志 | 用于肺癌相关基因shox2甲基化检测的引物对、试剂盒及方法 |
| CN109825586A (zh) * | 2019-03-11 | 2019-05-31 | 深圳市新合生物医疗科技有限公司 | 用于肺癌检测的DNA甲基化qPCR试剂盒及使用方法 |
| CN110872631A (zh) * | 2019-12-26 | 2020-03-10 | 广州市基准医疗有限责任公司 | Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒 |
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| Publication number | Publication date |
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Denomination of invention: A multiplex PCR primer system, detection method, and application for detecting plasma free DNA methylation in lung cancer Granted publication date: 20230414 Pledgee: Guanggu Branch of Wuhan Rural Commercial Bank Co.,Ltd. Pledgor: WUHAN IGENEBOOK BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2024980007417 |