WO2019161472A1

WO2019161472A1 - Método e kit para classificação de nódulos de tireoide

Info

Publication number: WO2019161472A1
Application number: PCT/BR2019/050053
Authority: WO
Inventors: Marcos Tadeu dos SANTOS; Ana Lígia BUZOLIN; Rozany Mucha DUFLOTH; Eduardo Caetano Albino Da SILVA; Ricardo Ribeiro GAMA; André Lopes CARVALHO
Original assignee: Onkos Diagnósticos Moleculares Ltda Me; Fundação Pio Xii
Priority date: 2018-02-23
Filing date: 2019-02-22
Publication date: 2019-08-29
Also published as: BR102018003587A2; US20210214799A1; BR112020018735A2

Abstract

A presente invenção descreve um método e um kit para classificação de nódulos de tireoide que permite uma identificação mais precisa do tipo de nódulo da tireoide, sendo maligno, benigno ou subclassificações, compreendendo pelo menos uma etapa de medição do nível de expressão de pelo menos um microRNA normalizador e pelo menos um microRNA discriminador e pelo menos uma etapa de correlação entre o nível de expressão de pelo menos um microRNA normalizador e pelo menos um microRNA discriminador. A presente invenção se situa nos campos da Genética e Biologia Molecular.

Description

Relatório Descritivo de Patente de Invenção

MÉTODO E KIT PARA CLASSIFICAÇÃO DE NÓDULOS DE TIREOIDE

Campo da Invenção

[0001] A presente invenção descreve um método e um kit para classificação de nódulos de tireoide. A presente invenção se situa nos campos da Genética e da Biologia Molecular

Antecedentes da Invenção

[0002] Nódulos tireoidianos, principal manifestação clínica de diversas doenças da tireoide, são comumente observados na prática médica. Estudos por ultrassonografia em populações aleatórias mostram que até 68% da população podem desenvolver um nódulo na tireoide em algum momento da vida.

[0003] Diretrizes clínicas Internacionais, de sociedades médicas de Endocrinologia e Metabolismo, Cirurgia de Cabeça e Pescoço e Citopatologia recomendam que todos os pacientes com nódulo(s) acima de 1 cm e função tireoidiana normal devem ser puncionados para avaliação citológica através de Punção de Aspirativa por Agulha Fina (PAAF), preferencialmente guiado por ultrassonografia, técnica considerada “gold-standard” inclusive pela Associação Americana de Tireoide (ATA), para avaliação de benignidade ou malignidade do nódulo.

[0004] A avaliação citológica destes nódulos (a partir do material colhido pela PAAF) revela que cerca de 60 a 80% são lesões benignas (Classificação “Bethesda II”), situação em que o paciente normalmente apenas observa e acompanha o nódulo e usualmente não exige intervenções ou tratamentos associados. Por outro lado, cerca de 5 a 15% das biópsias realizadas por PAAF em nódulos tireoidianos são classificadas como malignas (Classificação “Bethesda VI”). Nestes casos, o tratamento padrão internacionalmente adotado é a remoção total ou parcial da glândula tireoide, situação que exige que o paciente seja submetido a um procedimento cirúrgico que pode causar diversos problemas como a hipocalcemia, rouquidão temporária ou crónica, infecções e danos ao nervo laríngeo recorrente. A consequência mais incomoda deste procedimento é a necessidade de reposição hormonal para o resto da vida do paciente.

[0005] O problema reside que, entre 15 a 30% dos pacientes com nódulos puncionados, recebem um resultado conhecido como“nódulo indeterminado” (Classes“Bethesda III”, “Bethesda IV” ou“Bethesda V”), ou seja, o médico (cito)patologista que avaliou o conteúdo puncionado do nódulo, não tem elementos suficientes para discriminar a lesão entre“benigno” ou“maligno”. Nestes casos, a maioria das diretrizes internacionais recomendam também o tratamento através do procedimento cirúrgico de retirada total ou parcial da tireoide, uma vez que o risco de malignidade para lesões indeterminadas é relevante, variando de 5 a 75%.

[0006] Entretanto, a grande maioria das cirurgias de tireoide por nódulos indeterminados são desnecessárias, visto que cerca de 70 a 80% destes nódulos são identificados como“benignas” durante a análise histológica pós- cirúrgica. É evidente também o enorme gasto desnecessário do sistema de saúde com este procedimento. Sem contar as complicações clínicas que uma cirurgia desta modalidade pode trazer ao paciente desnecessariamente: Cirurgias de tireoide possuem taxas de mortalidade perioperativas entre 0,1 e 0,2%. Complicações não letais sérias ou permanentes, que incluem danos recorrentes ao nervo da laringe, hipocalcemia, re-sangramento e infecções, ocorrem entre 2 a 10% das cirurgias. No Brasil, 34,7% das tireoidectomias realizadas em hospital universitário apresentam algumas destas complicações, incluindo o hipoparatireoidismo em 8.8% dos casos. Além dos riscos inerentes ao procedimento cirúrgico a reposição de levotiroxina será necessária durante toda a vida. Somente no Brasil, estima-se cerca de 40000 cirurgias desnecessárias de tireoide por ano.

[0007] Estes dados confirmam a necessidade crítica de melhorias nos procedimentos diagnósticos pré-operativos para pacientes com nódulos tireoidianos classificados como indeterminados no exame citológico após a PAAF.

[0008] O uso de técnicas moleculares tem sido uma alternativa cada vez mais utilizada na avaliação de nódulos tireoidianos indeterminados e novos exames surgiram nos últimos anos com a proposta de auxiliar na tomada da melhor decisão clínica para esses casos.

[0009] A análise de mutações de genes como BRAF, TERT, RAS, TP53 e de diversas fusões, em análises isoladas ou em formato de painéis, tem demonstrado uma boa especificidade e valor preditivo positivo (VPP) e são normalmente usadas como testes para identificar malignidade (testes“Rule- in”), e não na intenção de evitar cirurgias desncessarias.

[0010] Por outro lado, classificadores moleculares que trabalham com assinaturas genéticas por RNA tem se mostrado ótimas ferramentas na identificação de lesões benignas (testes“Rule-out”), no objetivo claro de reduzir cirurgias desnecessárias, visto apresentarem bons resultados em sensibilidade e valor preditivo negativo (VPN).

[0011] Um estudo de revisão e meta-analise publicado em 2018 por Vargas Salas e colaboradores, propôs valores de corte (Thresholds) específicos para definição de testes moleculares para nódulos indeterminados de tireoide. Este estudo propõe que um teste ideal deve ter uma sensibilidade de pelo menos 92% e uma especificidade de pelo menos 80% para ter uma performance clinica dentro da prevalência de câncer de tireoide comumente observada mundialmente (20 a 40%), de forma a atingir um VPN de pelo menos 94% e um VPP de pelo menos 60%.

[0012] Outra característica muito desejada para este tipo de teste é a capacidade de ser realizado a partir do material da PAAF já coletada do paciente, sem a necessidade de se realizar uma nova coletado. O procedimento de coleta por PAAF é invasivo, dolorido e estressante. Além disso, fazer a análise exatamente das mesmas células que foram classificadas como“indeterminadas” é uma vantagem técnica clara e desejada. [0013] Uma importante limitação das soluções atualmente disponíveis é que não existe nenhum exame molecular para nódulos indeterminados que seja feito a partir da amostra já coletada e que alcance os valores mínimos de performance clínica propostos por Vargas-Salas e colaboradores em 2018, podendo ser considerado um teste tanto“rule-in”, quanto“rule-out”.

[0014] Os exames disponíveis atualmente que são feitos a partir do material já coletado, são ou“rule-in” ou“rule-out”. Os exames disponíveis atualmente que são considerados “rule-in” e “rule-out”, necessitam uma nova PAAF do paciente.

[0015] Outra importante limitação é que os exames disponíveis atualmente tem um alto custo financeiro e são realizados em laboratórios centralizados principalmente nos Estados Unidos o que limita o acesso de pacientes de todo o mundo ao uso destas tecnologias e atrasa consideravelmente o prazo de resultado.

[0016] O uso de microRNAs (miRNAs - pequenos RNAs de 18 a 25 nucleotídeos em simples-fita, não-codificantes, participantes do processo de regulação da expressão gênica) como biomarcadores únicos ou na identificação de perfis de sua expressão, tem se mostrado como uma das tecnologias mais promissoras para o diagnóstico, principalmente para câncer, uma vez que participam efetivamente na regulação de diversos processos de crescimento e diferenciação celular.

[0017] Recentemente, novas alternativas de classificadores moleculares para nódulos indeterminados que utilizam microRNAs como alvo principal, foram disponibilizadas comercialmente e demonstraram um aumento na especificidade, chegando a 72% e 85% quando combinado com a análise de um painel de mutações específicas.

[0018] Na busca pelo estado da técnica em literaturas científica e patentária, foram encontrados os seguintes documentos que tratam sobre o tema:

[0019] O documento WO2015175660A1 , intitulado “miRNA expression. signature in the classification of thyroid tumors”, revela métodos de classificação de tumores da tireoide utilizando moléculas de microRNA associadas a tumores de tireoide específicos.

[0020] O documento WO2010129934A2, intitulado“Methods and compositions for diagnosis of thyroid conditions”, revela composições, kits e métodos para perfis moleculares e diagnósticos de câncer, incluindo marcadores de DNA genômico associados ao câncer. O referido documento revela perfis moleculares associados ao câncer de tireoide, métodos para determinar perfis moleculares e métodos de análise de resultados para fornecer um diagnóstico.

[0021] O documento WO2013066678A1 , intitulado “MicroRNA expression profiling of thyroid câncer”, revela métodos de rastreio ou diagnóstico para o câncer de tireoide ou um potencial para desenvolver câncer de tireoide que incluem determinar os níveis de expressão de pelo menos um miRNA selecionado de um grupo específico de miRNAs e comparar os níveis de expressão de miRNA do indivíduo com um indivíduo controle que não apresente câncer de tireoide ou hiperplasia nodular.

[0022] O documento W02012068400A2, intitulado“MiRNAs as biomarkers for distinguishing benign from malignant thyroid neoplasms”, revela métodos e composições para identificar um perfil de miRNA para uma condição particular, tais como nódulos de tireoide ou câncer de tireoide, e usar o perfil no diagnóstico de um paciente para uma condição, como os nódulos tireoidianos ou câncer de tireoide.

[0023] Assim, do que se depreende da literatura pesquisada, não foram encontrados documentos antecipando ou sugerindo os ensinamentos da presente invenção, de forma que a solução aqui proposta, aos olhos dos inventores, possui novidade e atividade inventiva frente ao estado da técnica.

[0024] A invenção se mostra como uma alternativa para resolver os diversos problemas e inconvenientes presentes nos métodos classificação de nódulos de tireoide indeterminados já existentes na intenção de avançar em direção a um método ideal através da solução aos problemas de especificidade, sensibilidade, acessibilidade, conveniência e custo para a classificação de nódulos de tireoide indeterminados.

Sumário da Invenção

[0025] A presente invenção tem por objetivo resolver os problemas constantes no estado da técnica, a partir de um método melhorado para classificação de nódulos de tireoide. O método da invenção compreende pelo menos uma etapa de medição do nível de expressão de microRNAs e pelo menos uma etapa de correlação entre o nível de expressão de microRNA normalizador e pelo menos um microRNA discriminador; em que o referido microRNA normalizador é selecionado em combinações de um a seis dentro do grupo consistindo de dme-miR-7, hsa-let-7a, hsa-let-7b, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-let-7g, hsa-miR-1 , hsa-miR-101 , hsa-miR-103, hsa-miR-106a, hsa-miR-106b, hsa-miR-10a, hsa- miR-1 179, hsa-miR-122, hsa-miR-125a-3p, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-125b, hsa-miR-126, hsa-miR-130b, hsa-miR-133a, hsa-miR-136^*, hsa-miR-136, hsa- miR-138, hsa-miR-144, hsa-miR-145, hsa-miR-146a, hsa-miR-146b, hsa-miR- 149, hsa-miR-150, hsa-miR-151 -5P, hsa-miR-152, hsa-miR-155, hsa-miR-15a, hsa-miR-16, hsa-miR-17, hsa-miR-181 a, hsa-miR-181 b, hsa-miR-183, hsa- miR-18a, hsa-miR-18b, hsa-miR-190, hsa-miR-191 , hsa-miR-195, hsa-miR- 197, hsa-miR-199a-3p, hsa-miR-199b, hsa-miR-200a, hsa-miR-200b, hsa-miR- 200c, hsa-miR-203, hsa-miR-204, hsa-miR-205, hsa-miR-208, hsa-miR-208b, hsa-miR-20a, hsa-miR-20b, hsa-miR-21 , hsa-miR-221 , hsa-miR-222, hsa-miR- 23b, hsa-miR-26a, hsa-miR-26b, hsa-miR-29a, hsa-miR-302c, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30c-2^*, hsa-miR-30e-3p, hsa-miR-31 , hsa-miR-3151 , hsa-miR-346, hsa-miR-34a, hsa-miR-34c, hsa-miR-365, hsa-miR-375, hsa-miR- 424, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-449b, hsa-miR-503, hsa-miR-520b, hsa-miR- 608, hsa-miR-613, hsa-miR-618, hsa-miR-642, hsa-miR-651 , hsa-miR-7-2^*, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-9, hsa-miR-933, hsa-miR-99a, mmu-miR-137, mmu- miR-187, mmu-miR-451 , RNU44, RNU48, U6 snRNA; e

em que o referido microRNA discriminador é selecionado do grupo consistindo de dme-miR-7, hsa-let-7a, hsa-let-7b, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-let- 7g, hsa-miR-1 , hsa-miR-101 , hsa-miR-103, hsa-miR-106a, hsa-miR-106b, hsa- miR-10a, hsa-miR-1 179, hsa-miR-122, hsa-miR-125a-3p, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-125b, hsa-miR-126, hsa-miR-130b, hsa-miR-133a, hsa-miR-136^*, hsa- miR-136, hsa-miR-138, hsa-miR-144, hsa-miR-145, hsa-miR-146a, hsa-miR- 146b, hsa-miR-149, hsa-miR-150, hsa-miR-151 -5P, hsa-miR-152, hsa-miR- 155, hsa-miR-15a, hsa-miR-16, hsa-miR-17, hsa-miR-181 a, hsa-miR-181 b, hsa-miR-183, hsa-miR-18a, hsa-miR-18b, hsa-miR-190, hsa-miR-191 , hsa- miR-195, hsa-miR-197, hsa-miR-199a-3p, hsa-miR-199b, hsa-miR-200a, hsa- miR-200b, hsa-miR-200c, hsa-miR-203, hsa-miR-204, hsa-miR-205, hsa-miR- 208, hsa-miR-208b, hsa-miR-20a, hsa-miR-20b, hsa-miR-21 , hsa-miR-221 , hsa-miR-222, hsa-miR-23b, hsa-miR-26a, hsa-miR-26b, hsa-miR-29a, hsa- miR-302c, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30c-2^*, hsa-miR-30e-3p, hsa-miR-31 , hsa-miR-3151 , hsa-miR-346, hsa-miR-34a, hsa-miR-34c, hsa-miR- 365, hsa-miR-375, hsa-miR-424, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-449b, hsa-miR-503, hsa-miR-520b, hsa-miR-608, hsa-miR-613, hsa-miR-618, hsa-miR-642, hsa- miR-651 , hsa-miR-7-2^*, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-9, hsa-miR-933, hsa-miR- 99a, mmu-miR-137, mmu-miR-187, mmu-miR-451 , RNU44, RNU48, U6 snRNA ou combinações dos mesmos.

[0026] Em um segundo aspecto, a presente invenção define um kit para classificação de nódulos de tireoide compreendendo:

- materiais para medição do nível de expressão de pelo menos um microRNA normalizador e pelo menos um microRNA discriminador; e

- pelo menos um meio para correlacionar o nível de expressão de um a seis microRNA normalizador e pelo menos um microRNA discriminador;

em que o referido microRNA normalizador é conforme descrito acima, e em que o referido microRNA discriminador é conforme descrito acima.

[0027] O conceito inventivo comum a todos os contextos de proteção reivindicados é a solução apresentada para o problema de uma classificação mais precisa de nódulos da tireoide, que inclui um ou mais dos miRNAs normalizadores e um ou mais dos miRNAs discriminadores e/ou a forma específica de correlação entre eles.

[0028] Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e pelas empresas com interesses no segmento, e serão descritos em detalhes suficientes para sua reprodução na descrição a seguir.

Breve Descrição das Figuras

[0029] Com o intuito de melhor definir e esclarecer o conteúdo do presente pedido de patente, são apresentadas as seguintes figuras:

[0030] Figura 1. Algoritmo para conduta de pacientes com nódulos na tireoide. O algoritmo acima foi adaptado e resumido a partir das diretrizes e do consenso brasileiro e americano. Destaque em vermelho para o elevado número de cirurgias desnecessárias que são realizadas em pacientes com nódulos indeterminados, evidenciando problemas nos procedimentos diagnósticos pré-operativos. SB = Sistema de Bethesda - Categorias.

[0031] A figura 2 mostra um fluxograma resumido da seleção de biomarcadores, onde 1 - 96 microRNAs selecionados com base na revisão da literatura; 2 - Análise da expressão nas 78 amostras do desenvolvimento (39 malignas, 39 benignas); 3 - 65 microRNAs com expressão em pelo menos 95% das amostras; 4 - 10 microRNAs candidatos a NORMALIZADORES; 5 - Geração de 175 valores normalizadores (N) (Todas combinações possíveis pela média); 6 - 55 microRNAs candidatos a DISCRININADORES (D); 7 - Geração de 9625 (175x55) features (Cada discriminador normalizado por cada valor normalizador = 2^L(N'0)),· 8 - Seleção das 10 melhores features por métodos metaheurísticos baseado em filtros; 9 - 17 microRNAs (8 Normalizadores + 9 discriminadores) que compõe as 10 melhores features; 10 - Geração de algoritmos de classificação baseado em técnicas de Aprendizado de Maquina por Floresta de Árvores de Decisão; 1 1 - Treino e teste ( 10-fold cross validation); 12 - VALIDAÇÃO (Análise da expressão nas 95 amostras da validação (37 malignas, 58 benignas)); 13 - TESTE CEGO e 14 - Melhor algoritmo: - 25 features compostas por microRNAs: 1 1 (6 Normalizadores e 5 Discriminadores)

[0032] A figura 3 mostra um fluxograma detalhado do desenvolvimento e validação da seleção de microRNAs, onde 1 - 1205 Pacientes com resultado de PAAF disponível (JAN/2013 - JUL/2016); 2 - 272 Pacientes com resultado indeterminado Bethesda III, IV ou V na PAAF; 3 - 212 Pacientes com > 2 lâminas de PAAF e o respectivo tecido pós cirúrgico disponíveis; 4 - Revisão por dois patologistas independentes (lâminas de PAAF e tecido pós cirúrgico); 5 - 192 Pacientes elegíveis ao estudo; 6 - 40 pacientes - tecido pós cirúrgico de nódulos tireoidianos BENIGNOS que haviam sido classificados como indeterminados (Bethesda III, IV ou V) na PAAF; 7 - 40 pacientes - tecido pós cirúrgico de nódulos tireoidianos MALIGNOS que haviam sido classificados como indeterminados (Bethesda III, IV ou V) na PAAF; 8 - Extração de RNA; 9 - Pré-Amplificação; 10 - cDNA; 1 1 - Real-Time PCR (TLDA Array Cards); 12 - Dados de expressão de 39 amostras BENIGNAS; 13 - Dados de expressão de 39 amostras MALIGNAS; 14 - Seleção de biomarcadores; 15 - Geração e seleção das features; 16 - Treino e Teste ( 10-fold cross-validation); 17 - 70 pacientes - lâmina da PAAF de nódulos tireoidianos classificados como indeterminados (Bethesda III, IV ou V) BENIGNOS; 18 - 42 pacientes - lâmina da PAAF de nódulos tireoidianos classificados como indeterminados (Bethesda III, IV ou V) MALIGNOS; 19 - Extração de RNA; 20 - Pré-Amplificação; 21 - cDNA; 22 - Real-Time PCR (individual assays); 23 - Dados de expressão de 58 amostras BENIGNAS; 24 - Dados de expressão de 37 amostras MALIGNAS; 25 - Geração das mesmas features pré definidas no desenvolvimento; 26 - TESTE CEGO e 27 - ALGORITMO FINAL (Modelo com 1 1 microRNAs).

Descrição Detalhada da Invenção

[0033] Em um primeiro objeto, a presente invenção define um método para classificação de nódulos de tireoide compreendendo pelo menos uma etapa de medição do nível de expressão de microRNAs e pelo menos uma etapa de correlação entre o nível de expressão de microRNA normalizador e pelo menos um microRNA discriminador; em que o referido microRNA normalizador é selecionado em combinações de um a seis dentro do grupo consistindo de dme-miR-7, hsa-let-7a, hsa-let-7b, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-let-7g, hsa-miR-1 , hsa-miR-101 , hsa-miR-103, hsa-miR-106a, hsa-miR-106b, hsa-miR-10a, hsa- miR-1 179, hsa-miR-122, hsa-miR-125a-3p, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-125b, hsa-miR-126, hsa-miR-130b, hsa-miR-133a, hsa-miR-136^*, hsa-miR-136, hsa- miR-138, hsa-miR-144, hsa-miR-145, hsa-miR-146a, hsa-miR-146b, hsa-miR- 149, hsa-miR-150, hsa-miR-151 -5P, hsa-miR-152, hsa-miR-155, hsa-miR-15a, hsa-miR-16, hsa-miR-17, hsa-miR-181 a, hsa-miR-181 b, hsa-miR-183, hsa- miR-18a, hsa-miR-18b, hsa-miR-190, hsa-miR-191 , hsa-miR-195, hsa-miR- 197, hsa-miR-199a-3p, hsa-miR-199b, hsa-miR-200a, hsa-miR-200b, hsa-miR- 200c, hsa-miR-203, hsa-miR-204, hsa-miR-205, hsa-miR-208, hsa-miR-208b, hsa-miR-20a, hsa-miR-20b, hsa-miR-21 , hsa-miR-221 , hsa-miR-222, hsa-miR- 23b, hsa-miR-26a, hsa-miR-26b, hsa-miR-29a, hsa-miR-302c, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30c-2^*, hsa-miR-30e-3p, hsa-miR-31 , hsa-miR-3151 , hsa-miR-346, hsa-miR-34a, hsa-miR-34c, hsa-miR-365, hsa-miR-375, hsa-miR- 424, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-449b, hsa-miR-503, hsa-miR-520b, hsa-miR- 608, hsa-miR-613, hsa-miR-618, hsa-miR-642, hsa-miR-651 , hsa-miR-7-2^*, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-9, hsa-miR-933, hsa-miR-99a, mmu-miR-137, mmu- miR-187, mmu-miR-451 , RNU44, RNU48, U6 snRNA; e

[0034] Em uma concretização, o referido microRNA normalizador é selecionado do grupo consistindo de RNU48, hsa-miR-197, hsa-let-7b, hsa- miR-125a-5p, hsa-miR-103, hsa-let-7a, hsa-let-7e, hsa-miR-145 ou combinações dos mesmos.

[0035] Em uma concretização, o referido microRNA discriminador é selecionado grupo consistindo de hsa-miR-204, hsa-miR-152, hsa-miR-222, hsa-miR-181 b, hsa-miR-146b, hsa-miR-155, hsa-miR-181 a, hsa-miR-200b, hsa-miR-221 ou combinações dos mesmos.

[0036] Em uma concretização, os microRNAs normalizadores e os microRNAs discriminadores são correlacionados a partir de um ou mais dos seguintes features :

Tabela 1

[0037] Em uma concretização, os microRNAs normalizadores e os microRNAs discriminadores são correlacionados a partir de um ou mais dos seguintes grupos:

Tabela 2

[0038] Em uma concretização pela classificação de nódulo de tireoide consiste em pelo menos um entre: benigno, maligno, câncer medular de tireoide, carcinoma papilífero de tireoide e suas variantes, carcinoma foliculares de tireoide e suas variantes, carcinoma insular de tireoide, neoplasia tireoide folicular não invasiva com aspectos nucleares de semelhança papilífero “NIFTP”, bócio e suas variantes, tireoidite e suas variantes, adenomas e suas variantes, células de Hurthle em tireoide e suas variantes e hiperplasias de tireoide e suas variantes.

[0039] Em uma concretização quando a classificação é para câncer medular de tireoide, o dito microRNA discriminador é pelo menos o hsa-miR-375.

[0040] Em uma concretização, o método compreende as etapas de:

a) coletar amostra de tecido de tireoide;

b) extrair ácidos nucleicos da amostra da etapa (a);

c) medir o nível de expressão de pelo menos um microRNA normalizador e pelo menos um microRNA discriminador; e

d) correlacionar os dados obtidos na etapa (c) do nível de expressão de pelo menos um microRNA normalizador e pelo menos um microRNA discriminador.

[0041] Em uma ou mais concretizações, a etapa (a) é feita através de punção aspirativa por agulha fina ou biópsia; e/ou a etapa (c) é feita através de técnica selecionada do grupo consistindo de RT-PCR, sequenciamento, microarrays, análise de fragmentos, eletroforese em gel, espectrometria de massa ou combinações das mesmas; e/ou a etapa (d) é feita através de um algoritmo.

[0042] O método da presente invenção funciona tanto com amostras“fresca e líquida” de uma nova PAAF ou com material extraído a partir de lâminas de citologia já preparadas e coradas e com lamínula.

[0043] Em uma concretização, o dito algoritmo utiliza sistema de árvores de decisão simples e/ou em comité (RandonForest, ExtraTrees, C4.5, DecisionJungle, Boosted DecisionTrees e outras) para classificação das amostras a partir da análise das features geradas pela normalização conjunta dos microRNAs discriminadores pelos normalizadores.

[0044] Em uma concretização, o método compreende adicionalmente as etapas de:

a1 ) preparo da amostra coletada na etapa (a) antes de executar a etapa (b); b1 ) purificação dos ácidos nucleicos obtidos na etapa (b);

b2) síntese de cDNA a partir dos ácidos nucleicos obtidos na etapa (b1 ); e opcionalmente,

b3) pré-amplificação anterior à etapa (c).

[0045] Em um segundo aspecto, a presente invenção proporciona um kit para classificação de nódulos de tireoide, referido kit compreendendo:

em que o dito microRNA normalizador é selecionado do grupo consistindo de dme-miR-7, hsa-let-7a, hsa-let-7b, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-let- 7g, hsa-miR-1 , hsa-miR-101 , hsa-miR-103, hsa-miR-106a, hsa-miR-106b, hsa- miR-10a, hsa-miR-1 179, hsa-miR-122, hsa-miR-125a-3p, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-125b, hsa-miR-126, hsa-miR-130b, hsa-miR-133a, hsa-miR-136^*, hsa- miR-136, hsa-miR-138, hsa-miR-144, hsa-miR-145, hsa-miR-146a, hsa-miR- 146b, hsa-miR-149, hsa-miR-150, hsa-miR-151 -5P, hsa-miR-152, hsa-miR- 155, hsa-miR-15a, hsa-miR-16, hsa-miR-17, hsa-miR-181 a, hsa-miR-181 b, hsa-miR-183, hsa-miR-18a, hsa-miR-18b, hsa-miR-190, hsa-miR-191 , hsa- miR-195, hsa-miR-197, hsa-miR-199a-3p, hsa-miR-199b, hsa-miR-200a, hsa- miR-200b, hsa-miR-200c, hsa-miR-203, hsa-miR-204, hsa-miR-205, hsa-miR- 208, hsa-miR-208b, hsa-miR-20a, hsa-miR-20b, hsa-miR-21 , hsa-miR-221 , hsa-miR-222, hsa-miR-23b, hsa-miR-26a, hsa-miR-26b, hsa-miR-29a, hsa- miR-302c, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30c-2^*, hsa-miR-30e-3p, hsa-miR-31 , hsa-miR-3151 , hsa-miR-346, hsa-miR-34a, hsa-miR-34c, hsa-miR- 365, hsa-miR-375, hsa-miR-424, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-449b, hsa-miR-503, hsa-miR-520b, hsa-miR-608, hsa-miR-613, hsa-miR-618, hsa-miR-642, hsa- miR-651 , hsa-miR-7-2^*, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-9, hsa-miR-933, hsa-miR- 99a, mmu-miR-137, mmu-miR-187, mmu-miR-451 , RNU44, RNU48, U6 snRNA ou combinações dos mesmos, e

em que o dito microRNA discriminador é selecionado do grupo consistindo de dme-miR-7, hsa-let-7a, hsa-let-7b, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-let- 7g, hsa-miR-1 , hsa-miR-101 , hsa-miR-103, hsa-miR-106a, hsa-miR-106b, hsa- miR-10a, hsa-miR-1 179, hsa-miR-122, hsa-miR-125a-3p, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-125b, hsa-miR-126, hsa-miR-130b, hsa-miR-133a, hsa-miR-136^*, hsa- miR-136, hsa-miR-138, hsa-miR-144, hsa-miR-145, hsa-miR-146a, hsa-miR- 146b, hsa-miR-149, hsa-miR-150, hsa-miR-151 -5P, hsa-miR-152, hsa-miR- 155, hsa-miR-15a, hsa-miR-16, hsa-miR-17, hsa-miR-181 a, hsa-miR-181 b, hsa-miR-183, hsa-miR-18a, hsa-miR-18b, hsa-miR-190, hsa-miR-191 , hsa- miR-195, hsa-miR-197, hsa-miR-199a-3p, hsa-miR-199b, hsa-miR-200a, hsa- miR-200b, hsa-miR-200c, hsa-miR-203, hsa-miR-204, hsa-miR-205, hsa-miR- 208, hsa-miR-208b, hsa-miR-20a, hsa-miR-20b, hsa-miR-21 , hsa-miR-221 , hsa-miR-222, hsa-miR-23b, hsa-miR-26a, hsa-miR-26b, hsa-miR-29a, hsa- miR-302c, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30c-2^*, hsa-miR-30e-3p, hsa-miR-31 , hsa-miR-3151 , hsa-miR-346, hsa-miR-34a, hsa-miR-34c, hsa-miR- 365, hsa-miR-375, hsa-miR-424, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-449b, hsa-miR-503, hsa-miR-520b, hsa-miR-608, hsa-miR-613, hsa-miR-618, hsa-miR-642, hsa- miR-651 , hsa-miR-7-2^*, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-9, hsa-miR-933, hsa-miR- 99a, mmu-miR-137, mmu-miR-187, mmu-miR-451 , RNU44, RNU48, U6 snRNA ou combinações dos mesmos.

[0046] Em uma concretização do kit, o dito microRNA normalizador é selecionado do grupo consistindo de RNU48, hsa-miR-197, hsa-let-7b, hsa- miR-125a-5p, hsa-miR-103, hsa-let-7a, hsa-let-7e, hsa-miR-145 ou combinações dos mesmos, e pelo dito microRNA discriminador ser selecionado grupo consistindo de hsa-miR-204, hsa-miR-152, hsa-miR-222, hsa-miR-181 b, hsa-miR-146b, hsa-miR-155, hsa-miR-181 a, hsa-miR-200b, hsa-miR-221 ou combinações dos mesmos.

[0047] Em uma concretização, o kit compreende adicionalmente:

- material para coleta de amostra de tecido de tireoide ou para extração do material a partir de lâminas de citologia da PAAF já existentes;

- material para preparo da dita amostra;

- reagentes para extração de ácidos nucleicos;

- reagentes para síntese de cDNA;

- opcionalmente, reagentes para pré-amplificação; e

- material para medição do nível de expressão dos MicroRNAs.

[0048] O método e kit da presente invenção proporcionam uma classificação mais precisa do tipo tumor do nódulo da tireoide, sendo maligno ou benigno. Além disso, o método da presente invenção viabiliza o uso tanto de amostra “fresca e líquida” de uma nova PAAF ou com material extraído a partir de lâminas de citologia já preparadas e coradas e com lamínula, o que configura uma vantagem significativa adicional frente aos outros métodos já existentes. Exemplos - Concretizações

[0049] Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo sem limitar, o escopo da mesma.

Exemplo 1 - Metodologia para medição dos níveis de expressão

Remover a lamínula

[0050] Antes de iniciar, reforçar a marcação da região delimitada pelo médico patologista com uma caneta permanente forte (Sharpie ou similar) do lado de baixo da lâmina.

[0051] Preparar 4 cubas da seguinte forma:

[0052] Em uma cuba adicionar xilol

[0053] Na segunda cuba, adicionar água.

[0054] Na terceira cuba, etanol 100%

[0055] Na quarta cuba, adicionar etanol 70%

[0056] A) MÉTODO 1 :

[0057] Congelar as lâminas no freezer a -20°C.

[0058] Retirar a lâmina do freezer e remover a lamínula

[0059] Dentro de uma capela de exaustão, posicionar as lâminas (sem as lamínulas) no suporte específico (“berço”) e colocá-las de molho na cuba com xilol

[0060] Em seguida, transferir as lâminas para a cuba contendo água

[0061] Remover as lâminas da água e secar.

B) MÉTODO 2:

[0062] Posicionar as lâminas no suporte específico xilol

[0063] Após desgrudar a lamínula, hidratar a lâmina seguindo a seguinte ordem:

[0064] Deixar de molho na cuba com xilol;

[0065] Transferir para a cuba de Etanol 100 %

[0066] Transferir para a cuba de Etanol 70 % [0067] Transferir para a cuba com água

[0068] Secar

[0069] Coletar as células da lâmina (raspagem)

[0070] Preparar para cada amostra, um tubo Trizol Reagent

[0071] Após a remoção da lamínula pelo Método 1 ou 2, raspar a área marcada transferir o raspado para o respectivo tubo.

[0072] Congelar a amostra -80°C

[0073] Extração seguindo protocolo trizol reagent:

[0074] Preparar Etanol 75%

[0075] Preparar uma alíquota de clorofórmio;

[0076] Preparar uma alíquota de isopropanol;

[0077] Descongelar a amostra homogeneizada em Trizol

[0078] Dentro da capela de exaustão, clorofórmio à amostra;

[0079] Centrifugar

[0080] Coletar a fase aquosa superior

[0081] Adicionar isopropanol

[0082] Incubar a -80 °C

[0083] Centrifugar

[0084] Remover o sobrenadante

[0085] Adicionar etanol 75 %

[0086] Centrifugar

[0087] Descartar o sobrenadante

[0088] Repetir a lavagem com etanol

[0089] Secar

[0090] Adicionar água RNAse-free

[0091] Ressuspender o pellet água RNAse-free;

[0092] Quantificar;

RT-PCR

Preparo da reação de RT-PCR

[0093] No fluxo laminar pré-PCR, preparar o Mix para transcrição reversa utilizando os reagentes do Kit TaqMan microRNA Reverse Transcription e o pool de RT preparado previamente

[0094] Após preparar o mix, distribuir na microplaca.

[0095] Levar a placa para a bancada e adicionar o RNA da amostra

[0096] Colocar no termociclador com o seguinte programa:

Tabela 3

Pré-amplificação (etapa opcional)

Preparo da reação de pré-amplificação

[0097] Preparar o Mix para pré-amplificação, seguindo os seguintes volumes:

Tabela 4

[0098] Após preparar o mix, nos pocinhos da microplaca.

[0099] Levar a placa para a bancada e adicionar 1 ,25 do produto da RT.

[0100] Colocar no termociclador com a seguinte ciclagem:

Tabela 5

[0101] Adicionar H20 livre de RNAse a cada pocinho

[0102] Real-Time PCR

Preparo da placa de Real-time com os ensaios

[0103] Adicionar cada ensaio nos respectivos poços de uma placa

Reação de Real-Time

[0104] Preparar o Mix de reação com os seguintes volumes:

Tabela 6

[0105] Distribuir o Mix em cada pocinho da placa contendo ensaio pipetado previamente.

[0106] Selar a placa

[0107] Real-time

[0108] Estabelecer a ciclagem conforme tabela abaixo:

Tabela 7

[0109] Ao final da corrida ir em Exportar os resultados para uma tabela Excel [0110] Exemplo 2 - Seleção de biomarcadores

[0111] Um resumo da seleção de biomarcadores pode ser visto na figura 2.

[0112] Foi considerada uma lista inicial de 96 microRNAs para utilização no método da presente invenção:

Tabela 8

[0113] Esta lista inicial de microRNAs foi selecionada com base em dois critérios: 1 ) revisão ampla da literatura (161 artigos), buscando identificar estudos que analisaram microRNAs em Tireoide e que identificaram significativas alterações na sua expressão e 2) análises de bioinformática de amostras disponíveis em bancos de dados públicos online (como o ArrayExpress). Nesta fase não houve diferenciação entre Discriminadores e Normalizadores.

[0114] Foi analisada a expressão destes 96 microRNAs candidatos iniciais em 80 nódulos de tireoide indeterminados (40 benignos e 40 malignos - tecidos pós cirúrgicos) e então foram selecionados apenas os microRNAs que apresentaram expressão em pelo menos 95% das amostras. Esta análise selecionou 65 microRNAs, sendo 10 candidatos a normalizadores e os demais, 55, candidatos a discriminadores. A seleção dos 10 candidatos normalizadores foi feita pela análise de desvio padrão. Os 10 microRNAs com valores de expressão (Ct) com menor desvio padrão entre todas as amostras (benignas e malignas) foram pré selecionados.

Tabela 9 - candidatos a discriminadores

[0115] A seleção dos 10 candidatos normalizadores foi feita pela análise de desvio padrão. Os 10 microRNAs com valores de expressão (Ct) com menor desvio padrão entre todas as amostras (benignas e malignas) foram pré selecionados.

Tabela 10 - candidatos a normalizadores

Exemplo 3 - Geração de valores normalizadores

PASSO 1

[0116] Para gerar valores únicos que serão usados como normalizadores, nós fizemos todas as combinações possíveis entre os 10 normalizadores candidatos, de forma que o valor final fosse a média entre os valores.

[0117] Exemplos:

Tabela 1 1

[0118] No final, todas as combinações possíveis somam 175 combinações, logo 175 valores únicos para serem usados como valores de normalização. PASSO 2

[0119] Cada um dos 55 candidatos a discriminador (D) é normalizado por cada um dos 175 valores de normalização (N) gerados acima.

Formula de normalização = 2^A(N-D)

[0120] Logo, cada discriminador, gera 175 valores normalizados. Cada um destes valores é chamado de feature.

[0121] Uma ou um feature é um valor usado em machine learning, para separar classes. O conceito usado na invenção foi o de identificar um conjunto de features que possuam valores distintos entre benignos e malignos.

[0122] Logo são gerados 55 (discriminadores) x 175 (valores normalizadores) = 9625 features.

PASSO 3

[0123] Foram utilizados métodos metaheurísticos baseados em filtros para saber quais features separam melhor as classes benignos e malignos. Exemplos incluem: Pearson's correlation, Mutual Information score, Kendall's correlation coefficient, Spearman's correlation coefficient, Chi-squared statistic, Fisher score e Count based feature selection.

[0124] Os resultados permitiram observar quais microRNAs compõem as melhores features, para então analisar um painel menor de microRNAs em novas amostras (amostras de validação).

Validação

[0125] Após a aplicação dos métodos de seleção descritos, os presentes inventores observaram que as 10 melhores features (ou seja, com maior poder de discriminação entre as classes) eram compostas por estes 17 microRNAs. Então, foi analisada a expressão destes microRNAs em um novo set de pacientes (que não os utilizados anteriormente) de 95 amostras (amostras de validação), sendo 37 malignas e 58 benignas, desta vez diretamente nas lâminas de citologia da PAAF. Exemplo 4 - Seleção de features

[0126] Os features selecionados foram:

Tabela 12

[0127] Os features A, B, C, D, E, F, G, G, I, J, K, L M, N, O, P, Q R, S e T descritos abaixo proporcionaram os melhores resultados:

Tabela 13

Exemplo 5 - RESULTADOS COMPARATIVOS

[0128] Os resultados são mostrados na tabela a seguir. 3 o

n H

S3

B

o o o

Exemplo 6 - Algoritmo

[0129] Na presente invenção foram também desenvolvidos e selecionados vários algoritmos até a escolha do mais adequado. Este algoritmo foi desenvolvido, treinado e testado por cross-validation (de 3 a 12 folds) com as features geradas pela análise das amostras de desenvolvimento. Em seguida, o teste deste algoritmo foi validado com as amostras de validação. O dito algoritmo utiliza sistema de árvores de decisão simples e/ou em comité (1 a 100.000 arvores) por técnicas de RandonForest, ExtraTrees, C4.5, DecisionJungle, Boosted DecisionTrees e outras, separadas ou em emsemble, para classificação das amostras a partir da análise das features geradas pela normalização conjunta dos microRNAs discriminadores pelos normalizadores.

Exemplo 7 - Avaliação do uso do microrna hsa-miR-375 como biomarcador de carcinoma medular de tireoide

[0130] Nesta concretização, foi avaliado o carcinoma medular de tireoide (CMT), que representa cerca de 5%-10% dos tumores primários de tireoide e pode apresentar um comportamento mais agressivo que os tumores de tireoide bem-diferenciados, além de apresentar alta incidência de metástases. A identificação do CMT ao diagnóstico em nódulos de tireoide pode ser extremamente relevante para definição do correto procedimento cirúrgico a ser feito, além de sugerir também investigação para outros tumores e síndrome de MEN tipo 2 familial.

[0131] Nesta concretização, a expressão do hsa-mir-375 e de outros 8 microRNAs normalizadores (incluindo o hsa-miR-103) foi avaliada em 157 amostras de tireoide, sendo 42 de CMT, 77 benignos e 38 malignos-não-CMT. Dentre essas amostras, 77 são de pacientes com nódulos indeterminados e a análise foi realizada por qPCR a partir de células extraídas das lâminas de citologia da PAAF. Outras 80 amostras foram obtidas no banco de dados público ArrayExpress (E-GEOD-40807) provenientes de análises de microarranjos de tecidos pós-cirúrgicos. O potencial discriminador do hsa-mir- 375 foi avaliado pelo seu fold-change e m relação aos microRNAs candidatos a normalizadores.

[0132] Os resultados mostram que a análise da expressão do hsa-mir-375 em relação aos microRNAs normalizadores demonstrou que quando o fold-change é maior ou igual a 3.0, ou maior ou igual a 2.5, essa relação tem o potencial de discriminar amostras de “CMT” vs “benignos ou malignos-não-CMT” com especificidade de 92%, sensibilidade de 78.6%, valor preditivo positivo de 92%, valor preditivo negativo de 78.6% e acurácia de 88.4%.

[0133] Os resultados permitem concluir que o hsa-mir-375 tem um elevado potencial para ser utilizado como biomarcador para CMT ao diagnóstico, inclusive pela análise de sua expressão por qPCR em nódulos de tireoide indeterminados a partir de células fixadas em laminas de citologia de PAAF, podendo assim auxiliar de forma objetiva na tomada de decisão médica sobre a melhor conduta cirúrgica e investigação a ser realizada.

[0134] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes, abrangidas no escopo das reivindicações anexas.

Claims

Reivindicações

1. Método para classificação de nódulo de tireoide caracterizado por compreender pelo menos uma etapa de medição do nível de expressão de microRNAs e pelo menos uma etapa de correlação entre o nível de expressão de microRNA normalizador com pelo menos um microRNA discriminador;

em que o dito microRNA normalizador é selecionado em combinações de um a seis dentro do grupo consistindo de dme-miR-7, hsa-let-7a, hsa-let-7b, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-let-7g, hsa-miR-1 , hsa-miR-101 , hsa-miR-103, hsa- miR-106a, hsa-miR-106b, hsa-miR-10a, hsa-miR-1 179, hsa-miR-122, hsa-miR- 125a-3p, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-125b, hsa-miR-126, hsa-miR-130b, hsa- miR-133a, hsa-miR-136^*, hsa-miR-136, hsa-miR-138, hsa-miR-144, hsa-miR- 145, hsa-miR-146a, hsa-miR-146b, hsa-miR-149, hsa-miR-150, hsa-miR-151 - 5P, hsa-miR-152, hsa-miR-155, hsa-miR-15a, hsa-miR-16, hsa-miR-17, hsa- miR-181 a, hsa-miR-181 b, hsa-miR-183, hsa-miR-18a, hsa-miR-18b, hsa-miR- 190, hsa-miR-191 , hsa-miR-195, hsa-miR-197, hsa-miR-199a-3p, hsa-miR- 199b, hsa-miR-200a, hsa-miR-200b, hsa-miR-200c, hsa-miR-203, hsa-miR- 204, hsa-miR-205, hsa-miR-208, hsa-miR-208b, hsa-miR-20a, hsa-miR-20b, hsa-miR-21 , hsa-miR-221 , hsa-miR-222, hsa-miR-23b, hsa-miR-26a, hsa-miR- 26b, hsa-miR-29a, hsa-miR-302c, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR- 30c-2^*, hsa-miR-30e-3p, hsa-miR-31 , hsa-miR-3151 , hsa-miR-346, hsa-miR- 34a, hsa-miR-34c, hsa-miR-365, hsa-miR-375, hsa-miR-424, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-449b, hsa-miR-503, hsa-miR-520b, hsa-miR-608, hsa-miR-613, hsa- miR-618, hsa-miR-642, hsa-miR-651 , hsa-miR-7-2^*, hsa-miR-885-5p, hsa-miR- 9, hsa-miR-933, hsa-miR-99a, mmu-miR-137, mmu-miR-187, mmu-miR-451 , RNU44, RNU48, U6 snRNA; e

2. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pelo dito microRNA normalizador ser selecionado do grupo consistindo de RNU48, hsa- miR-197, hsa-let-7b, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-103, hsa-let-7a, hsa-let-7e, hsa-miR-145, e/ou pelo dito microRNA discriminador ser selecionado grupo consistindo de hsa-miR-204, hsa-miR-152, hsa-miR-222, hsa-miR-181 b, hsa-miR-146b, hsa-miR-155, hsa-miR-181 a, hsa-miR-200b, hsa-miR-221 ou combinações dos mesmos.

3. Método de acordo com a reivindicação 2 caracterizado pelos microRNAs normalizadores e os microRNAs discriminadores serem correlacionados a partir de um ou mais dos seguintes features:

4. Método de acordo com a reivindicação 3 caracterizado pelos microRNAs normalizadores e os microRNAs discriminadores serem correlacionados a partir de um ou mais dos seguintes features:

5. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado pela classificação de nódulo de tireoide consistir em pelo menos um entre: benigno, maligno, câncer medular de tireoide, carcinoma papilífero de tireoide e suas variantes, carcinoma foliculares de tireoide e suas variantes, carcinoma insular de tireoide, neoplasia tireoide folicular não invasiva com aspectos nucleares de semelhança papilífero “NIFTP”, bócio e suas variantes, tireoidite e suas variantes, adenomas e suas variantes, células de Hurthle em tireoide e suas variantes e hiperplasias de tireoide e suas variantes.

6. Método de acordo com a reivindicação 1 e 5 caracterizado por quando a classificação for para câncer medular de tireoide, o dito microRNA discriminador ser pelo menos o hsa-miR-375.

7. Método de acordo com a reivindicação 1 caracterizado por compreender as etapas de: a) coleta de amostra de tecido de tireoide;

b) extração de ácidos nucleicos da amostra da etapa (a);

c) medição do nível de expressão de pelo menos um microRNA normalizador e pelo menos um microRNA discriminador;

8. Método de acordo com a reivindicação 7 caracterizado pela etapa (a) ser feita através de punção aspirativa por agulha fina ou biópsia sólida ou líquida; pela etapa (c) ser feita através de técnica selecionada do grupo consistindo de RT-PCR, qPCR, sequenciamento, Nanostring, PCR-Digital, microarranjos, análise de fragmentos, eletroforese em gel, imunoistoquímica, espectrometria de massa ou combinações das mesmas; e pela etapa (d) ser feita através de um algoritmo.

9. Método de acordo com a reivindicação 7 caracterizado por compreender adicionalmente as etapas de:

a1 ) preparo da amostra coletada na etapa (a) antes de executar a etapa (b);

b1 ) purificação dos ácidos nucleicos obtidos na etapa (b);

b2) síntese de cDNA a partir dos ácidos nucleicos obtidos na etapa (b1 ); b3) opcionalmente, pré-amplificação anterior à etapa (c).

10. Kit para classificação de nódulo de tireoide caracterizado por compreender:

- pelo menos um meio para correlacionar o nível de expressão de um a seis microRNA normalizador com pelo menos um microRNA discriminador; em que o dito microRNA normalizador é selecionado do grupo consistindo de dme-miR-7, hsa-let-7a, hsa-let-7b, hsa-let-7e, hsa-let-7f, hsa-let- 7g, hsa-miR-1 , hsa-miR-101 , hsa-miR-103, hsa-miR-106a, hsa-miR-106b, hsa- miR-10a, hsa-miR-1 179, hsa-miR-122, hsa-miR-125a-3p, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-125b, hsa-miR-126, hsa-miR-130b, hsa-miR-133a, hsa-miR-136^*, hsa- miR-136, hsa-miR-138, hsa-miR-144, hsa-miR-145, hsa-miR-146a, hsa-miR- 146b, hsa-miR-149, hsa-miR-150, hsa-miR-151 -5P, hsa-miR-152, hsa-miR- 155, hsa-miR-15a, hsa-miR-16, hsa-miR-17, hsa-miR-181 a, hsa-miR-181 b, hsa-miR-183, hsa-miR-18a, hsa-miR-18b, hsa-miR-190, hsa-miR-191 , hsa- miR-195, hsa-miR-197, hsa-miR-199a-3p, hsa-miR-199b, hsa-miR-200a, hsa- miR-200b, hsa-miR-200c, hsa-miR-203, hsa-miR-204, hsa-miR-205, hsa-miR- 208, hsa-miR-208b, hsa-miR-20a, hsa-miR-20b, hsa-miR-21 , hsa-miR-221 , hsa-miR-222, hsa-miR-23b, hsa-miR-26a, hsa-miR-26b, hsa-miR-29a, hsa- miR-302c, hsa-miR-30a-3p, hsa-miR-30a-5p, hsa-miR-30c-2^*, hsa-miR-30e-3p, hsa-miR-31 , hsa-miR-3151 , hsa-miR-346, hsa-miR-34a, hsa-miR-34c, hsa-miR- 365, hsa-miR-375, hsa-miR-424, hsa-miR-425-5p, hsa-miR-449b, hsa-miR-503, hsa-miR-520b, hsa-miR-608, hsa-miR-613, hsa-miR-618, hsa-miR-642, hsa- miR-651 , hsa-miR-7-2^*, hsa-miR-885-5p, hsa-miR-9, hsa-miR-933, hsa-miR- 99a, mmu-miR-137, mmu-miR-187, mmu-miR-451 , RNU44, RNU48, U6 snRNA ou combinações dos mesmos, e

1 1. Kit de acordo com a reivindicação 10 caracterizado pelo dito microRNA normalizador ser selecionado do grupo consistindo de RNU48, hsa- miR-197, hsa-let-7b, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-103, hsa-let-7a, hsa-let-7e, hsa-miR-145 ou, e/ou pelo dito microRNA discriminador ser selecionado grupo consistindo de hsa-miR-204, hsa-miR-152, hsa-miR-222, hsa-miR-181 b, hsa-miR-146b, hsa-miR-155, hsa-miR-181 a, hsa-miR-200b, hsa-miR-221 ou combinações dos mesmos.

12. Kit de acordo com a reivindicação 10 caracterizado por compreender adicionalmente:

- material para coleta de amostra de tecido de tireoide ou para extração do material de tireoide já existente;

- material para preparo da dita amostra;

- reagentes para extração de ácidos nucleicos;

- reagentes para síntese de cDNA;

- opcionalmente, reagentes para pré-amplificação.

- material para medição do nível de expressão dos MicroRNAs.