CN110872631A - Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒 - Google Patents

Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN110872631A
CN110872631A CN201911367385.4A CN201911367385A CN110872631A CN 110872631 A CN110872631 A CN 110872631A CN 201911367385 A CN201911367385 A CN 201911367385A CN 110872631 A CN110872631 A CN 110872631A
Authority
CN
China
Prior art keywords
seq
dna
artificial sequence
combination
methylation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201911367385.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110872631B (zh
Inventor
阮微媚
蒋泽宇
李霞
陈志伟
范建兵
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
AnchorDx Medical Co Ltd
Original Assignee
AnchorDx Medical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by AnchorDx Medical Co Ltd filed Critical AnchorDx Medical Co Ltd
Priority to CN201911367385.4A priority Critical patent/CN110872631B/zh
Priority to EP20908235.3A priority patent/EP4083232A4/en
Priority to PCT/CN2020/072770 priority patent/WO2021128519A1/zh
Priority to JP2022525590A priority patent/JP2023516525A/ja
Publication of CN110872631A publication Critical patent/CN110872631A/zh
Priority to US17/036,424 priority patent/US11851714B2/en
Application granted granted Critical
Publication of CN110872631B publication Critical patent/CN110872631B/zh
Priority to US18/504,402 priority patent/US20240084398A1/en
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/118—Prognosis of disease development
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及一种用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志物组合，其选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.22中的任意两种或两种以上的组合，或选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.22的完全互补的序列的任意两种或两种以上的组合。本发明还涉及对上述甲基化标志物组合的检测试剂盒。本发明利用多个特异性甲基化区域的共甲基化状态的组合对膀胱癌的发生进行判别和分析，该特异性甲基化组合对于判别膀胱癌的发生灵敏度高，检测方法简便可行。本试剂盒的引物对组合在引物序列设计上克服了单个甲基化位点检测错配造成假阳性的缺点，并考虑了多个甲基化生物标记物引物及探针对组合之间的相互作用。

Description

DNA甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种DNA甲基化生物标志物组合和检测试剂盒以及检测方法。
背景技术
膀胱癌是泌尿***最常见的恶性肿瘤之一，在中国膀胱癌的2014年发病人数为7.8万人/年，并且发病率有逐年上升的趋势。膀胱癌具有发病率高、易复发的特点。血尿为膀胱癌的常见临床症状，其中约17％的血尿患者检出膀胱癌。目前，膀胱癌的主要诊断方法包括影膀胱镜检查、尿脱落细胞学检查、尿液FISH检测及肿瘤标记物检查。其中，膀胱镜检查结合活检组织病理为膀胱镜诊断的金标准，但是该检查方法具有侵入性，容易产生并发症，患者依随性低。而影像学检查对于微小病灶的诊断能力有限，尿脱落细胞学检查的灵敏度低，尿液FISH检测操作复杂、判读结果具有主观性。现有肿瘤标记物检查主要基于尿液中的特定蛋白质的存在进行检测，但由于尿液中测定蛋白的含量低，敏感性及特异性仍然具有局限性。
通过寻找膀胱癌特异性DNA甲基化生物标记物(标志物)的组合，进行基于多个DNA甲基化位点的检测克服了单个DNA甲基化信号低的问题，提高了检测的灵敏度及特异性。同时，基于DNA甲基化的检测简单易行、判读客观，避免了人为判读结果的主观性，提高了准确率。同时该检测具有非侵入性，能避免膀胱镜检查引发的并发症，提高患者依随性。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种可用于膀胱癌诊断的DNA甲基化标志物组合。
实现上述目的的技术方案如下。
一种用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志物组合，选自由[CG]指示的共甲基化位点的SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.22的任意两种或两种以上序列的组合，或选自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.22的完全互补的序列的任意两种或两种以上序列的组合。
进一步地，可选任意2-3个、2-4个、2-5个、2-6个、2-8个、2-9个、2-10、2-11个、2-12个、2-13个、2-14个、2-15个、2-16个、2-17个、2-18个、2-19个、2-20个、2-21、2-22个DNA甲基化标志物的序列的组合。
在其中一些实施例中，所述用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志物组合包括选自SEQID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ IDNO.17中的至少2种的组合，或选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17的完全互补序列的至少2种的组合。
在其中一些实施例中，所述用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志物组合为SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2的组合或其完全互补序列的组合。
在其中一些实施例中，，所述用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志物组合为SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的组合，或选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3的完全互补序列的组合。
在其中一些实施例中，所述用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志物组合为自SEQ IDNO.1至SEQ ID NO.8的组合或其完全互补序列的组合。
在其中一些实施例中，所述用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志物组合为SEQ IDNO.1至SEQ ID NO.22的组合或其互补序列的组合。
在其中一些实施例中，所述用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志物组合为如下任一组，或以下任一组DNA甲基化标志物的完全互补序列的组合：
组合A SEQ ID NO.2 SEQ ID NO.1
组合B SEQ ID NO.17 SEQ ID NO.20 SEQ ID NO.1
组合C SEQ ID NO.2 SEQ ID NO.9 SEQ ID NO.8
组合D SEQ ID NO.15 SEQ ID NO.6
组合E SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.18 SEQ ID NO.14
组合F SEQ ID NO.16 SEQ ID NO.12
组合G SEQ ID NO.22 SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.4
组合H SEQ ID NO.13 SEQ ID NO.10 SEQ ID NO.21
组合I SEQ ID NO.19 SEQ ID NO.11 SEQ ID NO.7
组合K SEQ ID NO.2 SEQ ID NO.6
组合L SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.4
本发明的另一目的是提供上述DNA甲基化标记物组合在制备检测、诊断、分类或预测、治疗监测、预后或其它评价膀胱癌的试剂盒中应用。
本发明的另一目的是提供一种检测膀胱癌试剂盒。该试剂盒可以用于膀胱癌患者的诊断，监测，伴随诊断，分析、评级、治疗等。
一种判断膀胱癌不同级别或不同分期试剂盒，具有检测包括由[CG]指示的共甲基化区域的SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.13、SEQ IDNO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.21、SEQ IDNO.22中的至少2种的DNA甲基化标志物组合，或其完全互补序列的组合的共甲基化程度的试剂。
在其中一些实施例中，所述DNA甲基化标志物组合包括SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.16、和SEQ ID NO.18或其完全互补序列的DNA甲基化标志物。
在其中一些实施例中，所述DNA甲基化标志物组合包括：SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.10、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.16、和SEQ ID NO.18或其完全互补序列的DNA甲基化标志物。
在其中一些实施例中，所述DNA甲基化标志物组合包括：SEQ ID NO.17、和SEQ IDNO.13或其完全互补序列的DNA甲基化标志物。
在其中一些实施例中，所述DNA甲基化标志物组合为SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.5，或其完全互补序列；或者所述DNA甲基化标志物组合为SEQ ID NO.17、SEQID NO.13和SEQ ID NO.22，或其完全互补序列。
另一方面提供一种诊断膀胱癌试剂盒，包括检测上述的DNA甲基化标志物组合的甲基化程度的试剂。
在其中一些实施例中，采用荧光定量PCR方法，所述检测试剂盒包括针对每个甲基化区域的扩增引物和荧光探针，所述扩增引物和荧光探针为：针对SEQ ID NO.1的SEQ IDNO.23和SEQ ID NO.45，以及SEQ ID NO.67；
针对SEQ ID NO.2的SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.46，以及SEQ ID NO.68；
针对SEQ ID NO.3的SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.47，以及SEQ ID NO.69；
针对SEQ ID NO.4的SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.48，以及SEQ ID NO.70；
针对SEQ ID NO.5的SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.49，以及SEQ ID NO.71；
针对SEQ ID NO.6的SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.50，以及SEQ ID NO.72；
针对SEQ ID NO.7的SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.51，以及SEQ ID NO.73；
针对SEQ ID NO.8的SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.52，以及SEQ ID NO.74；
针对SEQ ID NO.9的SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.53，以及SEQ ID NO.75；
针对SEQ ID NO.10的SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.54，以及SEQ ID NO.76；
针对SEQ ID NO.11的SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.55，以及SEQ ID NO.77；
针对SEQ ID NO.12的SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.56，以及SEQ ID NO.78；
针对SEQ ID NO.13的SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.57，以及SEQ ID NO.79；
针对SEQ ID NO.14的SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.58，以及SEQ ID NO.80；
针对SEQ ID NO.15的SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.59，以及SEQ ID NO.81；
针对SEQ ID NO.16的SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.60，以及SEQ ID NO.82；
针对SEQ ID NO.17的SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.61，以及SEQ ID NO.83；
针对SEQ ID NO.18的SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.62，以及SEQ ID NO.84；
针对SEQ ID NO.19的SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.63，以及SEQ ID NO.85；
针对SEQ ID NO.20的SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.64，以及SEQ ID NO.86；
针对SEQ ID NO.21的SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.65，以及SEQ ID NO.87；
针对SEQ ID NO.22的SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.66，以及SEQ ID NO.88；或为与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物和探针。
在其中一些实施例中，采用荧光定量PCR方法，所述检测试剂盒包括针对每个甲基化区域的扩增引物和荧光探针，所述扩增引物和荧光探针为：
针对SEQ ID NO.1的SEQ ID NO.89和SEQ ID NO.111，以及SEQ ID NO.133；
针对SEQ ID NO.2的SEQ ID NO.90和SEQ ID NO.112，以及SEQ ID NO.134；
针对SEQ ID NO.3的SEQ ID NO.91和SEQ ID NO.113，以及SEQ ID NO.135；
针对SEQ ID NO.4的SEQ ID NO.92和SEQ ID NO.114，以及SEQ ID NO.136；
针对SEQ ID NO.5的SEQ ID NO.93和SEQ ID NO.115，以及SEQ ID NO.137；
针对SEQ ID NO.6的SEQ ID NO.94和SEQ ID NO.116，以及SEQ ID NO.138；
针对SEQ ID NO.7的SEQ ID NO.95和SEQ ID NO.117，以及SEQ ID NO.139；
针对SEQ ID NO.8的SEQ ID NO.96和SEQ ID NO.118，以及SEQ ID NO.140；
针对SEQ ID NO.9的SEQ ID NO.97和SEQ ID NO.119，以及SEQ ID NO.141；
针对SEQ ID NO.10的SEQ ID NO.98和SEQ ID NO.120，以及SEQ ID NO.142；
针对SEQ ID NO.11的SEQ ID NO.99和SEQ ID NO.121，以及SEQ ID NO.143；
针对SEQ ID NO.12的SEQ ID NO.100和SEQ ID NO.122，以及SEQ ID NO.144；
针对SEQ ID NO.13的SEQ ID NO.101和SEQ ID NO.123，以及SEQ ID NO.145；
针对SEQ ID NO.14的SEQ ID NO.101和SEQ ID NO.124，以及SEQ ID NO.146；
针对SEQ ID NO.15的SEQ ID NO.103和SEQ ID NO.125，以及SEQ ID NO.147；
针对SEQ ID NO.16的SEQ ID NO.104和SEQ ID NO.126，以及SEQ ID NO.148；
针对SEQ ID NO.17的SEQ ID NO.105和SEQ ID NO.127，以及SEQ ID NO.149；
针对SEQ ID NO.18的SEQ ID NO.106和SEQ ID NO.128，以及SEQ ID NO.150；
针对SEQ ID NO.19的SEQ ID NO.107和SEQ ID NO.129，以及SEQ ID NO.151；
针对SEQ ID NO.20的SEQ ID NO.108和SEQ ID NO.130，以及SEQ ID NO.152；
针对SEQ ID NO.21的SEQ ID NO.109和SEQ ID NO.131，以及SEQ ID NO.153；
针对SEQ ID NO.22的SEQ ID NO.110和SEQ ID NO.132，以及SEQ ID NO.154；或为与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物和探针。
在其中一些实施例中，采用荧光定量PCR方法，所述检测试剂盒包括针对每个甲基化区域的扩增引物和荧光探针，所述扩增引物和荧光探针为：
针对SEQ ID NO.1的SEQ ID NO.155和SEQ ID NO.177，以及SEQ ID NO.199；
针对SEQ ID NO.2的SEQ ID NO.156和SEQ ID NO.178，以及SEQ ID NO.200；
针对SEQ ID NO.3的SEQ ID NO.157和SEQ ID NO.179，以及SEQ ID NO.201；
针对SEQ ID NO.4的SEQ ID NO.158和SEQ ID NO.180，以及SEQ ID NO.202；
针对SEQ ID NO.5的SEQ ID NO.159和SEQ ID NO.181，以及SEQ ID NO.203；
针对SEQ ID NO.6的SEQ ID NO.160和SEQ ID NO.182，以及SEQ ID NO.204；
针对SEQ ID NO.7的SEQ ID NO.161和SEQ ID NO.183，以及SEQ ID NO.205；
针对SEQ ID NO.8的SEQ ID NO.162和SEQ ID NO.184，以及SEQ ID NO.206；
针对SEQ ID NO.9的SEQ ID NO.163和SEQ ID NO.185，以及SEQ ID NO.207；
针对SEQ ID NO.10的SEQ ID NO.164和SEQ ID NO.186，以及SEQ ID NO.208；
针对SEQ ID NO.11的SEQ ID NO.165和SEQ ID NO.187，以及SEQ ID NO.209；
针对SEQ ID NO.12的SEQ ID NO.166和SEQ ID NO.188，以及SEQ ID NO.210；
针对SEQ ID NO.13的SEQ ID NO.167和SEQ ID NO.189，以及SEQ ID NO.211；
针对SEQ ID NO.14的SEQ ID NO.168和SEQ ID NO.190，以及SEQ ID NO.212；
针对SEQ ID NO.15的SEQ ID NO.169和SEQ ID NO.191，以及SEQ ID NO.213；
针对SEQ ID NO.16的SEQ ID NO.170和SEQ ID NO.192，以及SEQ ID NO.214；
针对SEQ ID NO.17的SEQ ID NO.171和SEQ ID NO.193，以及SEQ ID NO.215；
针对SEQ ID NO.18的SEQ ID NO.172和SEQ ID NO.194，以及SEQ ID NO.216；
针对SEQ ID NO.19的SEQ ID NO.173和SEQ ID NO.195，以及SEQ ID NO.217；
针对SEQ ID NO.20的SEQ ID NO.174和SEQ ID NO.196，以及SEQ ID NO.218；
针对SEQ ID NO.21的SEQ ID NO.175和SEQ ID NO.197，以及SEQ ID NO.219；
针对SEQ ID NO.22的SEQ ID NO.176和SEQ ID NO.198以及SEQ ID NO.220；或为与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物和探针。
在实际应用中，将根据特异性甲基化区域的组合进行选择相应的引物和探针。
在其中一些实施例中，还包括有内参基因的引物和探针：SEQ ID NO.221-SEQ IDNO.223；或选自与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物和探针。
本发明的另一个目的是提供了一种检测膀胱癌的方法。
实现上述目的的技术方案如下：
一种检测膀胱癌的方法，包括以下步骤：提取将待测的生物样品基因组DNA和/或游离DNA；对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化；
对所述经过亚硫酸氢盐转化的DNA和对照进行如上述DNA甲基化标志物组合的共甲基化检测，得到甲基化图谱；
将甲基化标志物组合的甲基化图谱与从基于数据集数学建模得到的图谱判定阈值进行比较，判断生物样品中膀胱癌的存在。
在其中一些实施例中，所述共甲基化检测方法包括：甲基化特异性PCR、DNA甲基化芯片、靶向DNA甲基化测序、数字PCR定量及荧光定量PCR。
另一个方面，本发明还提供了一种对膀胱癌诊断和分期、分类的方法。
一种对膀胱癌诊断和分期、分类的方法，包括以下步骤：提取待测的生物样品基因组DNA和/或游离DNA；
对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化；
对所述经过亚硫酸氢盐转化的DNA进行如上述DNA甲基化标志物组合的共甲基化检测；
得到目标DNA甲基化标志物区域的相对循环数d-CT，与设定阈值相比较，
对不同来源的生物样品的膀胱癌级别或分期进行判断。
另一个方面，本发明还提供了一种对膀胱癌预测、治疗监测、预后或其它评价的方法。
一种对膀胱癌预测、治疗监测、预后或其它评价的方法，包括以下步骤：
获得个体的生物样品，
提取所述生物样品基因组DNA和/或游离DNA；
对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化；
对所述经过亚硫酸氢盐转化的DNA与特异性检测上述的DNA甲基化标志物的共甲基化程度的多种试剂接触，测定所述生物样品的所述的DNA甲基化标志物的共甲基化程度，比对从基于数据集数学建模得到的共甲基化程度判定阈值，对膀胱癌的预测、治疗检测、预后作出判断。
本发明利用多个特异性甲基化区域(标志物，marker)的共甲基化(co-methylation)状态的组合对膀胱癌的发生进行判别，该特异性甲基化组合对于判别膀胱癌的发生灵敏度高，检测方法简便可行。发明人发现，相对于单一甲基化区域的共甲基化状态而言，所述选择的多个甲基化区域共甲基化状态的组合在对膀胱癌发生的判别中具有更优越的性能。
本发明所述多个甲基化区域的检测试剂盒中，引物对及探针的设计及其组合设计对于同时并行检测多个甲基化区域的共甲基化程度起关键作用，本试剂盒的引物对组合在引物序列设计上克服了单个甲基化位点检测错配造成假阳性的缺点，并考虑了多个甲基化生物标记物引物及探针对组合之间的相互作用。本试剂盒的多重荧光定量PCR反应体系对反应组分作出了优化，具备较高的扩增效率，提高了检测方法的灵敏度。
附图说明
图1膀胱癌组织和正常组织的多个DNA甲基化区域的共甲基化差异热图。
图2膀胱癌人群和正常人群的尿液DNA中多个甲基化区域的共甲基化差异热图。
图3基于DNA共甲基化组合的膀胱癌风险得分在膀胱癌人群和正常人群的中的显著差异。
图4三个组合的引物探针对对于SEQ ID NO.8的甲基区域的共甲基化程度的检测对比。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
定义为了便于理解本技术，下面定义了一些术语和短语。
在整个说明书和权利要求书中，以下术语具有与本文明确相关的含义，除非上下文另有明确规定。在本发明中使用的短语“在一个实施方案中”不一定指代相同的实施方案，尽管其可能是。此外，在本发明中使用的短语“在另一实施方案中”不一定指代不同的实施方案，尽管其可能是。因此，如下所述，可以容易地组合本发明的各个实施方案，而不脱离本发明的范围或精神。
此外，如本发明所使用的，术语“或”是包含性的“或”符号，并且等同于术语“和/或”，除非上下文另有明确规定。术语“基于”不是排他性的，并且允许基于未描述的其他因素，除非上下文另有明确规定。此外，在整个说明书中，“一个”、“一种”和“所述/该”的含义包括复数指示物。“在......中”中的含义包括“在......中”和“在......上”。
术语“互补”和“互补性”是指与碱基配对规则相关的核苷酸(例如，1个核苷酸)或多核苷酸(例如核苷酸的序列)。例如，序列5′-A-G-T-3′与序列3′-T-C-A-5′互补。互补可以是“部分的”，其中仅一些核酸碱基根据碱基配对规则进行匹配。或者，核酸之间可能存在“完全”或“总”互补。核酸链之间的互补程度影响核酸链之间杂交的效率和强度。这在扩增反应和依赖核酸之间的结合的检测方法中尤其重要。
术语“聚合酶链式反应”用于扩增靶序列,该方法由以下步骤组成：将大量过量的两种寡核苷酸引物引入到含有期望靶序列的DNA混合物中，随后在DNA聚合酶存在下进行精确的热循环顺序。两种引物与双链靶序列的相应链互补。为了进行扩增，将混合物变性，然后引物与靶分子内的其互补序列退火。退火后，用聚合酶扩增引物，形成一对新的互补链。变性、引物退火和聚合酶延伸的步骤可以重复多次(即，变性、退火和延伸构成一个“循环”；可以有许多“循环”)以获得高浓度的期望靶序列的扩增片段。期望靶序列的扩增片段的长度由引物相对于彼此的相对位置确定，因此该长度是可控参数。由于该方法的重复方面，该方法被称为“聚合酶链式反应”(“PCR”)。由于靶序列的期望扩增片段成为混合物中的主要序列(以浓度计)，所以称其被“PCR扩增”，是“PCR产物”或“扩增子”。
如本发明所用，术语“核酸检测测定”是指确定目标核酸的核苷酸组成的任何方法。核酸检测测定包括但不限于DNA测序方法、探针杂交方法。
术语“可扩增核酸”是指可以通过任何扩增方法扩增的核酸。预期“可扩增核酸”通常将包含“样品模板”。
术语“样品模板”是指来源于样品的用于分析“靶”(下文定义)的存在的核酸。相比之下，“背景模板”用于指样品模板以外的核酸，其可能存在或可能不存在于样品中。背景模板通常是无意的。这可能是遗留的结果，或者可能是由于试图从样品中纯化走的核酸污染物的存在。例如，来自生物体的待检测核酸以外的核酸可以作为测试样品的背景存在。
术语“引物”是指在纯化的限制性消化物中天然存在的或合成产生的寡核苷酸，当处于其中诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下(例如，在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶的存在下并且在合适的温度和pH下)时，其能够作为合成的起点。引物优选是单链的，用于扩增的最大效率，但也可以是双链的。如果是双链，则在用于制备延伸产物之前首先处理引物以分离其链。优选地，引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在诱导剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素，包括温度、引物来源以及方法的使用。
术语“探针”是指在纯化的限制性消化物中天然存在的或者合成、重组或通过PCR扩增产生的寡核苷酸(例如，核苷酸序列)，其能够与另一种感目标寡核苷酸杂交。探针可以是单链或双链的。探针可用于特定基因序列的检测、鉴定和分离(例如，“捕获探针”)。预期在一些实施方案中，本发明中使用的任何探针可以用任何“报道分子”进行标记，使得在任何检测***中可检测。
如本文所用，“甲基化”是指胞嘧啶位置C5或N4的胞嘧啶甲基化，腺嘌呤的N6位点或其他类型的核酸甲基化。体外扩增的DNA通常是未甲基化的，因为通常体外DNA扩增方法不能保留扩增模板的甲基化模式。然而，“未甲基化DNA”或“甲基化DNA”也可以分别指原始模板未甲基化或甲基化的扩增DNA。
因此，如本文所用，“甲基化核苷酸”或“甲基化核苷酸碱基”是指在核苷酸碱基上存在甲基部分，其中甲基部分不存在于公认的典型核苷酸碱基中。例如，胞嘧啶在其嘧啶环上不包含甲基部分，但是5-甲基胞嘧啶在其嘧啶环的5位包含甲基部分。因此，胞嘧啶不是甲基化核苷酸，5-甲基胞嘧啶是甲基化核苷酸。在另一个实例中，胸腺嘧啶在其嘧啶环的5位含有甲基部分；然而，为了本文的目的，当存在于DNA中时不认为胸腺嘧啶是甲基化核苷酸，因为胸腺嘧啶是DNA的典型核苷酸碱基。
甲基化状态可任选地由“甲基化值”表示或指示(例如，表示甲基化频率、分数、比例、百分比等)。甲基化值可以例如在用甲基化依赖性限制酶限制性消化之后定量存在的完整核酸的量，或者通过比较亚硫酸氢盐反应后的扩增谱，或者通过比较亚硫酸氢盐处理和未处理的核酸的序列来产生。因此，诸如甲基化值的值代表甲基化状态，因此可用作基因座的多个拷贝中甲基化状态的定量指标。共甲基化程度由多于一个甲基化位点的甲基化状态表示或指示，在一段甲基化区域内，当多于一个甲基化位点的甲基化状态均为甲基化时定义为共甲基化。
如本文所用，术语“亚硫酸氢盐试剂”是指在一些实施方案中包含亚硫酸氢盐(bisulfite)、亚硫酸氢盐(disulfite)、亚硫酸氢盐(hydrogen sulfite)或其组合的试剂，经过亚硫酸氢盐试剂处理的DNA，其未经过甲基化的胞嘧啶核苷酸将转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶及其他碱基维持不变，因此可以区分例如CpG二核苷酸序列中的甲基化和未甲基化胞苷。
术语“甲基化测定”是指用于确定核酸序列内的一个或多个CpG二核苷酸序列的甲基化状态的任何测定。
一个方面，本发明提供了一组可用于判断个体膀胱癌发生的基因组中的甲基化区域的组合，这些区域在膀胱癌的组织DNA中有较高的共甲基化(co-methylation)程度，而在正常组织中甲基化程度较低，甲基化程度在癌与非癌之间存在显著差异(图1)，说明这些甲基化区域的共甲基化程度可以较灵敏及特异的反映膀胱癌的发生。本发明还提供了所述甲基化区域组合在利用尿液样本进行膀胱癌的发生的诊断的应用。与组织样本的结果类似，上述甲基化区域组合在膀胱癌人群的尿液DNA中有较高的共甲基化(co-methylation)程度，而正常人群的尿液DNA中共甲基化程度较低，共甲基化程度在两个人群中存在显著差异(图2)，说明所选甲基化区域组合在尿液DNA中与膀胱癌相关的信号较高，对膀胱癌的检出有优越的灵敏度。同时，采用尿液作为测试样本是非侵入的方式，可以较大程度减轻患者的负担，增加患者检测的依随性。
另一个方面，所述检测手段包括使用甲基化特异性聚合酶链式反应、核酸测序、质谱法、甲基化特异性核酸酶、基于质量的分离或靶捕获。
本发明的对上述甲基化区域的检测，包括如下主要步骤：
采用DNA提取试剂盒，提取待测生物样本的基因组DNA和/或游离DNA；
对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化；
对所述经过亚硫酸氢盐转化的DNA进行多个甲基化区域的共甲基化检测；
共甲基化检测方法包括：甲基化特异性PCR(MSP)、DNA甲基化芯片、靶向DNA甲基化测序、数字PCR定量及荧光定量PCR。
在一些实施方案中，通过本领域中的任何标准手段，包括使用可商购的试剂盒，来分离DNA(例如，基因组DNA，如提取的基因组DNA或经处理的基因组DNA)。
在一些实施方案中，在一些实施方案中，待检测的生物样品为活检物。在一些情况下，该生物样品为组织样品。在一些情况下，该生物样品为组织活检样品。在一些情况下，该生物样品为血液样品包括血浆、唾液、血清。在一些情况下，该生物样品为尿液样品包括尿液脱落细胞、尿沉渣、尿液上清。
MSP检测方法的主要步骤包括
1)利用特异性引物对SEQ ID NO.23-44对经过亚硫酸氢盐转化的DNA分别进行选定目的区域共甲基化片段的扩增；
2)利用特异性引物对对经过亚硫酸氢盐转化的DNA分别进行选定目的区域非甲基化片段的扩增；
3)对所述1)和2)的扩增产品进行琼脂凝胶电泳分析；
4)根据电泳结果条带的有无及密度判断选定目的区域的共甲基化程度
DNA甲基化芯片检测方法的主要步骤包括：
1)对经过亚硫酸氢盐转化的DNA进行全基因组的扩增，
2)使用SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.22或其在序列上完全互补的核酸序列作为目标区域在芯片上合成共甲基化及非甲基化的捕获探针，
3)对所述2)中的扩增产物在芯片中进行靶向捕获，并进行带有标记的单碱基延伸反应，
4)根据荧光染色反应将捕获的序列信号进行放大及读取，计算目的区域的共甲基化程度。
靶向DNA甲基化测序的主要步骤包括：
1)对经过亚硫酸氢盐转化的DNA进行全基因组的扩增，
2)对所述1)中的扩增产物进行接头连接，
3)对所述2)中的建库产物进行靶向捕获，其中所用捕获探针为包含SEQ ID NO.1-22或与其反向互补配对序列的经过转化的DNA序列，
4)对所述3)的捕获产物进行测序，
5)根据测序结果计算选定目的区域的共甲基化程度
数字PCR法的主要步骤包括
1)利用特异性引物及探针SEQ ID NO.23-220对经过亚硫酸氢盐转化的DNA分别进行选定目的区域共甲基化程度的绝对定量，
2)利用特异性引物及探针对经过转化的DNA分别进行选定目的区域的非甲基化程度的绝对定量，
3)根据每个区域的非甲基化程度及共甲基化程度的绝对定量计算该区域的甲基化率(优选方法)荧光定量PCR法的主要步骤见下述方法。
另一个方面，针对上述检测目标甲基化区域共甲基化程度的其中一种检测试剂盒。试剂盒中，引物对及探针的设计及其组合设计对于同时并行检测多个甲基化区域的共甲基化程度起关键作用，本试剂盒的引物对组合在引物序列设计上克服了单个甲基化位点检测错配造成假阳性的缺点，并考虑了多个甲基化生物标记物引物对组合之间的相互作用。本试剂盒的多重PCR反应体系对反应组分作出了优化，在保证目标片段扩增效率的前提下，可同时扩增最多23个目标片段。本试剂盒的多重荧光定量PCR反应液，可实现最多3个目标区域共甲基化程度的检测。
上述应用包括如下试剂盒组分包含3组22个甲基化目标区域的选定组合的引物对及探针的组合之一，其序列如表2-1、2、3，及内参基因的甲基化区域的引物对及探针多重PCR反应体系多重荧光定量PCR反应液。
另一个方面，提供了根据上述检测试剂盒进行目标甲基化区域共甲基化程度测定的检测方法。该检测方法可并行检测多至22个甲基化区域的共甲基化程度，同时处理多个样本，具有高通量、简单易行的优势。
上述应用包括如下主要步骤：
1)用所述引物、探针及反应试剂对亚硫酸氢盐转化后的全基因组DNA进行直接荧光定量PCR反应；
2)所得CT值通过内参校正后，用于衡量目标区域的共甲基化程度，根据逻辑回归计算膀胱癌风险得分。
另一个方面，提供了一种基于上述甲基化区域共甲基化程度判断膀胱癌发生(包括检测、诊断、分类或预测、治疗监测、预后或其它评价膀胱癌)的方法。根据膀胱癌人群及正常人群的多个甲基化区域的共甲基化程度进行逻辑回归方程拟合，通过拟合的逻辑回归方程算出膀胱癌的风险得分，该得分在膀胱癌人群和正常人群中存在显著的差异(图3)，可明显将膀胱癌人群从正常人群中检出。本发明判断膀胱癌发生的方法完全采用统计学的数学公式，避免了任何在传统尿液FISH检测中涉及人为判定结果的主观性，使得判读上更准确、稳定、可靠。
实施例1
用于膀胱癌检测、诊断、分类或预测、治疗监测、预后或其它评价膀胱癌的甲基化区域的共甲基化，包括表1所列核酸序列中由[CG]指示的多个甲基化位点的共甲基化以及与表1中的由[CG]指示的核酸在序列上完全互补的核酸的多个甲基化位点的共甲基化。
表1 DNA甲基化区域的共甲基化组成
Figure BDA0002338790120000121
Figure BDA0002338790120000131
Figure BDA0002338790120000141
实施例2
一种用于膀胱癌检测、诊断、分类或预测、治疗监测、预后或其它评价膀胱癌的多个甲基化区域的共甲基化测试试剂盒，包括多个甲基化区域共甲基化的特异性引物对及探针，如表2所示：
表2-1 22个甲基化区域共甲基化检测的引物及探针序列组合1
Figure BDA0002338790120000142
Figure BDA0002338790120000151
Figure BDA0002338790120000161
表2-2 22个甲基化区域共甲基化检测的引物及探针序列组合2
Figure BDA0002338790120000162
Figure BDA0002338790120000171
表2-3 22个甲基化区域共甲基化检测的引物及探针序列组合3
Figure BDA0002338790120000172
Figure BDA0002338790120000181
Figure BDA0002338790120000191
在实际应用中，将根据特异性甲基化区域的组合进行选择相应的引物和探针。
内参引物和探针：
Figure BDA0002338790120000192
试剂盒需包括PCR扩增引物及探针组(探针荧光标记可采用FAM、VIC及NED等荧光基团标记)3组组合的其中一组，3组组合对于22个区域的检测性能类似，以SEQ ID NO.8的甲基化区域的共甲基化程度检测为例，分别使用3个组合的引物对按照实施例3的检测方法对系列甲基化标准品(Qiagen公司)在该区域的共甲基化程度检测如图4，组合1、2、3的引物对及探针对于该区域的共甲基化检测的线性关系分别为0.993、0.998、0.987，线性关系没有显著差异，拟合线性方程斜率分别为-3.73、-3.66、-3.83，可判断扩增效率类似，没有显著差别。
本发明所述引物购于Invitrogen公司，多重PCR反应试剂购于Thermo Fisher公司，多重荧光定量PCR试剂购于Qiagen公司或Bio-Rad公司或诺唯赞公司。
实施例3
多重荧光定量PCR对于2-3个甲基化区域的共甲基化检测
使用商业化的完全甲基化(阳性对照)及非甲基化(阴性对照)标准品(购自QIAGEN公司)对22个甲基化区域(SEQ ID NO.1-22)进行每2-3个甲基化区域的共甲基化检测。
具体流程如下：
1、DNA提取
提取试剂盒购自QIAGEN公司，按照试剂盒说明书进行。
2、DNA亚硫酸氢盐转化
DNA亚硫酸氢盐转化试剂盒购于Zymo公司，按照试剂盒说明书进行。
3、多重PCR扩增
采用22个甲基化区域(SEQ ID NO.1-8)的引物对，在1个反应孔(引物序列见表2)中进行多重PCR，扩增出含目标区域的目标序列，产物大小在70-130bp左右。
1)配置单个引物浓度为5μM(每个引物)PCR引物混合物，里面包含多重反应里每个甲基化区域的正向和反向引物，共1个反应孔。
2)PCR混合液配置：根据表3配制PCR混合液，DNA不要加在其中。
表3PCR混合液配置方案
试剂 终浓度 体积(μL)
DEPC水 / 18.5
5x PCR Buffer 1X 10.0
25mM MgCl<sub>2</sub> 0.25mM 0.5
25mM dNTP混合物 250μM 0.5
5μM Primer混合物 0.5μM 5.00
5U/μl PCR酶 2.5Unit 0.5
体积[μl] / 35.00
3)加入DNA样本：加35μL PCR混合液到PCR反应孔，向其中加入转化后的DNA，DNA转化前上样量25ng，PCR反应总体积50μL。涡旋震荡和离心。
4)PCR反应程序：98℃30秒；98℃15秒，60℃15秒，72℃15秒，20个循环；72℃5分钟；4℃保存备用
4、多重荧光定量PCR测定
1)22个甲基化区域的引物及探针(序列见表2)，及内参的引物及探针中的每个甲基化区域按照每个引物浓度10μM,每个探针浓度5μM的终浓度配制成一套混合液，22个甲基化区域的22套混合液可等比进行每2-3个甲基化区域的混合。其中列举的一些3个甲基化区域组合如表4所示：
表4 22个甲基化区域(SEQ ID NO.1-22)的引物探针混合液组合方案(组合内的3个甲基化区域可选任意2-3个进行组合)
组合方案 FAM标记荧光通道 VIC标记荧光通道 NED标记荧光通道
组合A SEQ ID NO.2 内参 SEQ ID NO.1
组合B SEQ ID NO.17 SEQ ID NO.20 SEQ ID NO.1
组合C SEQ ID NO.2 SEQ ID NO.9 SEQ ID NO.8
组合D SEQ ID NO.15 内参 SEQ ID NO.6
组合E SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.18 SEQ ID NO.14
组合F SEQ ID NO.16 SEQ ID NO.12
组合G SEQ ID NO.22 SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.4
组合H SEQ ID NO.13 SEQ ID NO.10 SEQ ID NO.21
组合I SEQ ID NO.19 SEQ ID NO.11 SEQ ID NO.7
组合J 内参 SEQ ID NO.7
组合K SEQ ID NO.2 内参 SEQ ID NO.6
组合L SEQ ID NO.3 内参 SEQ ID NO.4
2)多重qPCR反应液配置：根据表4的组合方案将选定的2-3个甲基化区域的引物探针混合液等比混合配制PCR混合液，DNA不要加在其中。
表3 PCR混合液配置方案
试剂 体积(μL)
DEPC水 1.5-2
2X PCR Master Mix 5.00
2种或3种标志物的引物和探针 0.5(每套)
体积[μl] 8.00
3)加入DNA样本：加8μL PCR混合液到PCR反应孔，向其中加入2μL经过两倍稀释的多重PCR产物。PCR反应总体积10μL。涡旋震荡和离心。
4)荧光定量PCR反应程序：95℃5分钟；95℃20秒，62℃60秒，于62℃收集荧光信号，40个循环。
5、数据分析以商业化的完全甲基化(阳性对照)及非甲基化(阴性对照)标准品对22个甲基化区域的共甲基化程度按照表格4所示混合方式(组合A-L)进行多重荧光定量PCR测定，与22个甲基化区域的单个甲基化荧光定量PCR测定(单个定量)的CT值比较，其中阴性对照在所有组合及单个定量中均无检出，阳性对照的CT值如表5所示：
表5阳性对照在2-3个甲基化区域组合方案的多重荧光定量PCR与单个甲基化区域荧光定量PCR测定的CT值比较
Figure BDA0002338790120000221
Figure BDA0002338790120000231
Figure BDA0002338790120000241
表5的结果显示，按照这些组合方案中的组合内任意2-3个甲基化区域的引物探针混合物进行混合所进行的多重荧光定量PCR所得的CT值与单个区域定量的CT值相近，没有显著差异，由此判断多重荧光定量的组合方案中的22个甲基化区域的扩增效率没有相互干扰，定量性能与单个区域定量等同，可实现2-3个甲基化区域的同时定量检测。
实施例4对膀胱癌细胞株、膀胱癌组织及膀胱癌旁组织22个甲基化区域的共甲基化检测。
使用实施例3中所述的检测方法对膀胱癌细胞株5637、T24(购自上海细胞所)及UM-UC-3(购自sigma)的细胞DNA以及16例膀胱癌组织DNA和与之配对的癌旁正常组织DNA进行22个甲基化区域的共甲基化检测，以验证这些甲基化区域在膀胱癌诊断中的应用。其中，检测所得每个甲基化区域的CT值通过内参CT值进行校正，得到目标区域的相对循环数d-CT＝CT(目标区域)-CT(内参)；若目标区域未检出，则赋予目标区域的相对循环数d-CT＝35。
18例膀胱癌组织的患者病理组成信息如表6所示：
表6膀胱癌组织样本患者病理组成信息
Figure BDA0002338790120000242
检测所得的膀胱癌细胞株、膀胱癌组织及癌旁正常组织以及阳性对照在22个甲基化区域的共甲基化程度的中位数相对循环数d-CT值如表7所示，根据22个甲基化区域d-CT值的所有组织样本的甲基化热图如图1。
表7膀胱癌细胞株、膀胱癌组织及癌旁正常组织在22个甲基化区域的共甲基化程度的中位数相对循环数d-CT值
Figure BDA0002338790120000251
结合图1、表7显示，膀胱癌细胞株、膀胱癌组织在22个甲基化区域的中位数相对循环数d-CT值与阳性对照较接近，相较于癌旁正常组织的d-CT值普遍偏小，在统计学中显示显著差异(p<0.005),而d-CT值越小说明其共甲基化程度越高，因此可以判断选定的22个甲基化区域的共甲基化程度在膀胱癌细胞株、膀胱癌组织中显著偏高，与膀胱癌的发成呈正相关的关系，可以作为判断膀胱癌发生的生物标记物。
此外，根据膀胱癌组织样本的级别与分期分析不同级别及不同分期下的22个甲基化区域的d-CT值发现，其中一些甲基化区域可以对不同级别或不同分期作出显著区分(p<0.05),说明这些甲基化区域及其组合可进一步作为膀胱癌不同级别或不同分期的判断的生物标记物。所述甲基化区域列举如表8，显示的数值为这些甲基化区域的在所述组别的中位d-CT值及其d-CT值的四分点范围。
表8不同甲基化区域在膀胱癌不同级别及不同分期组别中的中位d-CT值(及四分点范围interquartile range,IQR)
Figure BDA0002338790120000261
实施例5对尿液DNA样本中22个甲基化区域的共甲基化检测
对来自膀胱癌人群、患有泌尿良性疾病人群以及健康人群的尿液DNA样本进行22个甲基化区域的共甲基化检测以确定这些甲基化区域在尿液样本中对膀胱癌的发生及分型判断的应用。其中，膀胱癌人群的尿液样本共70例；患有泌尿良性疾病人群(包括泌尿系结石、***、***增生、线性膀胱炎等)的尿液样本共49例；健康人群(尿常规检查/泌尿***超声检查结果正常且不携带疑似其他肿瘤)尿液样本共5例；所有样本的病理及临床信息组成如表9所示。
表9尿液DNA样本病理及临床组成信息
Figure BDA0002338790120000262
Figure BDA0002338790120000271
使用实施例3中所述的检测方法对上述124例尿液DNA进行22个甲基化区域的共甲基化检测。其中，检测所得每个甲基化区域的CT值通过内参CT值进行校正，得到目标区域的相对循环数d-CT＝CT(目标区域)-CT(内参)；若目标区域未检出，则赋予目标区域的相对循环数d-CT＝35。
检测所得的124例尿液DNA样本的22个甲基化区域的共甲基化相对循环数d-CT中位值及四分点范围如表10所示，单个甲基化区域的不同组别的差异性比较p-value也如表10所示，其中两组之间有统计学上显著差异的标准为p<0.05。22个甲基化区域在124例样本中每例样本的甲基化分布热图如图2所示。
表10来自膀胱癌、泌尿良性疾病及健康人群的尿液DNA样本中22个甲基化区域的共甲基化程度的相对循环数d-CT值中位数、四分点范围及不同组别的差异性分析
Figure BDA0002338790120000272
Figure BDA0002338790120000281
Figure BDA0002338790120000291
结合图2、表10的结果表明，膀胱癌人群的尿液DNA在22个甲基化区域相对循环数d-CT值的中位数较泌尿良性疾病显著偏小(p<0.05),因此可以判断选定的22个甲基化区域的共甲基化程度在膀胱癌人群的尿液DNA中较高，与膀胱癌的发成呈正相关的关系，可以作为判断用于基于尿液DNA的膀胱癌发生的生物标记物。同时，膀胱癌人群相较于健康人人群在多个甲基化区域中也存在显著差异，因此，这些甲基化区域也可以用于作为基于尿液DNA的膀胱癌发生的普通筛查的生物标记物。结合实施例4中的结果，所述22个甲基化区域在判断膀胱癌的发生中的应用可同时用于组织样本与尿液样本，其结果相近。
此外，根据膀胱癌尿液样本的患者病理信息对肿瘤不同级别与不同分期下的22个甲基化区域的d-CT值的分析发现，其中一些甲基化区域可以对不同级别或不同分期作出显著区分(p<0.05),说明这些甲基化区域及其组合可进一步作为基于尿液DNA的膀胱癌不同级别或不同分期的判断的生物标记物。所述甲基化区域列举如表11，显示的数值为这些甲基化区域的在所述组别的中位d-CT值及其d-CT值的四分点范围。
表11不同甲基化区域在膀胱癌不同级别及不同分期的尿液样本组别中的中位d-CT值(及四分点范围interquartile range,IQR)
Figure BDA0002338790120000292
Figure BDA0002338790120000301
同时，该实施例描述的检测方法按照实施例3的组合方案，可用于2-22个甲基化区域的并行检测，检测方法对于甲基化区域的组合搭配灵活、简单易行。
实施例6
22个甲基化区域中任意1-3个甲基化区域的共甲基化并行检测当目标甲基化区域的共甲基化并行检测为22个甲基化区域的任意1-3个时，使用实施例3中的组合方案，可以采用以下的检测方法。具体检测流程如下：
1、DNA提取
提取试剂盒购自QIAGEN公司，按照试剂盒说明书进行。
2、DNA亚硫酸氢盐转化
DNA亚硫酸氢盐转化试剂盒购于Zymo公司，按照试剂盒说明书进行。
3、荧光定量PCR测定
选用1-3个甲基化区域的引物及探针及内参的引物及探针，在1个反应孔进行测定(引物探针序列见表2，甲基化区域的组合方案见实施例3)
1)qPCR反应液配置：根据表12配制PCR混合液，DNA不要加在其中。
表12 PCR混合液配置方案
Figure BDA0002338790120000302
Figure BDA0002338790120000311
2)加入DNA样本：加15μL PCR混合液到PCR反应孔，向其中加入转化后的DNA，DNA转化前上样量25ng，转化产物作为一个PCR反应孔。PCR反应总体积20μL。涡旋震荡和离心。
3)荧光定量PCR反应程序：95℃5分钟；95℃15秒，62℃40秒，于62℃收集荧光信号，60个循环。
4、数据处理与分析
将目标区域的检测所得每个甲基化区域的CT值通过内参CT值进行校正，得到目标区域的相对循环数d-CT＝CT(目标区域)-CT(内参)；若目标区域未检出，则赋予目标区域的相对循环数d-CT＝35。
以阳性对照、甲基化区域引物探针组合方案A和L(实施例3)的检测为例，对照实施例3的检测方法，所得到的甲基化区域的相对循环数d-CT值与实施例3中的对比如表13。
表13阳性对照任意1-3个甲基化区域的共甲基化并行检测与22个甲基化区域检测方法的d-CT值比较
Figure BDA0002338790120000312
表13的结果表明，使用该实施例所述检测方法检测所得的d-CT值与检测22个甲基化区域所述检测方法(实施例3)得到的d-CT值高度一致，对这些区域两种检测方法的d-CT值做相关性分析，其相关系数为R＝0.995(Pearson R)，因此可以判定这两种检测方法在检测同一个甲基化区域的共甲基化程度上没有差别。
当目标甲基化区域的共甲基化并行检测为22个甲基化区域的任意1-3个时，本实施例所述检测方法可以减少多重PCR预扩增目标片段的步骤，使少于4个甲基化区域的并行检测更为方便快捷。
实施例7
对实施例5中得到的124例尿液DNA样本的22个甲基化区域(SEQ ID NO.1-22)的共甲基化相对循环数d-CT值进行甲基化区域组合的数学建模分析，以探讨22个甲基化区域作为生物标记物组合对于膀胱癌发生及膀胱癌分型的应用，对比使用单个甲基化区域作为标记物的判断性能优越性。
首先，对比124例尿液样本的病理及临床信息，根据22个甲基化区域共甲基化在膀胱癌人群及非膀胱癌人群(包括泌尿良性疾病人群及健康人群)中的相对循环数d-CT值对比病理建立单个甲基化区域判别膀胱癌发生的诊断模型ROC曲线，并根据ROC曲线计算AUC值及划分该区域的判定阈值。根据阈值对比病理计算该甲基化区域的判别灵敏度、特异性及Youden指数。同时，根据22个甲基化区域共甲基化的相对循环数d-CT值选择2-22个甲基化生物标记物进行逻辑回归拟合，拟合方程可用于计算每个样本的膀胱癌风险得分，用于判断膀胱癌的发生。根据不同的2-22个甲基化区域的组合，可以产生多个用于判断膀胱癌发生的逻辑回归模型及方程。使用这些方程计算的膀胱癌风险得分对比病理得到该甲基化区域组合的判别灵敏度、特异性、AUC及Youden指数。列举其中的一些组合的模型对于膀胱癌的发生的判定性能参数对比单个甲基化区域如表14所示。另外，图3列举了使用22个甲基化区域中的其中8个(SEQ ID NO.1-8)组合模型的风险得分在膀胱癌及非膀胱癌人群中的分布。
如图3所示，采用8个甲基化区域组合判别模型得到的膀胱癌风险得分可以将膀胱癌人群及非膀胱癌人群作出明显的区分，再次说明这些甲基化区域的组合可以作为用于判断膀胱癌发生的生物标记物组合。
根据表14的诊断效能比较可以看出，使用单个甲基化区域作为诊断模型的对比多个个甲基化区域组合模型诊断性能较低，2-22个甲基化区域的组合在判别膀胱癌的发生上有更高的灵敏度，反映灵敏度及特异性的总体性能参数Youden指数明显高于单个甲基化区域的判别，更优越的判别优势。
表14单个甲基化区域的模型与多个甲基化区域的模型对于诊断膀胱癌发生的比较
区域组合(SEQ ID NO) AUC 敏感度 特异性 Youden指数
1 0.84 70％ 96％ 0.66
1+2 0.89 80％ 91％ 0.71
1+2+3 0.89 89％ 85％ 0.75
1-8 0.89 84％ 85％ 0.69
1-22 0.88 81％ 89％ 0.70
更进一步的，2-22个甲基化区域组合模型对于不同级别和不同分期的判别敏感度对比单个甲基化区域如表15。
表15单个甲基化区域的模型与多个甲基化区域的模型对于膀胱癌不同分期及分级灵敏度的比较
Figure BDA0002338790120000331
表15的数据进一步表明，使用2-22个甲基化区域组合模型对于判别高级别、低级别、浸润性及非浸润性膀胱癌的灵敏度均高于使用单个甲基化的模型判别，说明2-22个甲基化区域的组合模型可用于对膀胱癌这些组别的判别。
另外，选用2-22个甲基化区域对高级别与低级别膀胱癌人群或浸润性膀胱癌及非浸润性膀胱癌人群进行数学建模，采用random forest算法先优选出可以做出判断的甲基化区域组合，再进行每个甲基化区域的阈值判断设定，得出判别模型。根据这些判别模型对膀胱癌的人群作出分级(高级别与低级别)或分期(浸润性与非浸润性)的区分，与病理结果相比得到灵敏度、特异性及Youden指数，与单个甲基化区域对于不同分级或分期的对比如表16所示。
表16单个甲基化区域的模型与多个甲基化区域的模型对于膀胱癌不同分期及分级灵敏度的比较
Figure BDA0002338790120000332
Figure BDA0002338790120000341
根据表16的分级与分期诊断效能比较可以看出，使用单个甲基化区域作为分级或者分期的诊断模型的对比多个个甲基化区域组合模型诊断性能较低，2-22个甲基化区域的组合在进一步判别膀胱癌的不同级别或不同分期上有更高的灵敏度与特异性，在反映灵敏度及特异性的总体性能参数Youden指数明显高于单个甲基化区域的判别，具有更优越的判别优势。此外也再次说明，这22个甲基化区域中的多个甲基化区域组合可用于膀胱癌的进一步分级与分期，对于膀胱癌的诊疗方案与用药指导具有更精确的指导意义。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州市基准医疗有限责任公司
<120> DNA甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒
<160> 223
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 94
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
taggaagact cgggcaccgt tcagcgcatt ggcttcgcgg acccagccgc ccaggcggat 60
cgccggaagc gcaagtagcg gtgtgtgcgc acag 94
<210> 2
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgttcggcg gcccgggcac cgcgagccgg ccgagctcca gccggagcta cgtgactacg 60
tccacccgca cctacagcct gggcagc 87
<210> 3
<211> 108
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttggcggtca aagtggcccc gactcgggat gacaattgac ggggatcaag ggattgccca 60
ttctgtgcct gtaagaaccg attcgtgcca gagaaactca tcaagtgg 108
<210> 4
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cgccgggctc cagggctccc gcgctccagt ggcccagcct gggcggagag cagagcgcgg 60
cccccgcggc cccgcggcct cgagccccg 89
<210> 5
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cccggagtgg ggcaggtgtc ggagctgggt gggaagcaga cgcggtacgg tgggcagagg 60
tccccagcct gcggggagcg ctat 84
<210> 6
<211> 82
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccggtggtgc accacgaggg ctacccgttt gccgccgccg ccgccgcagc tgccgccgcc 60
gccgccagcc gctgcagcca tg 82
<210> 7
<211> 106
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cgggaactga gtgctggccc gggagaccct ccggagagct cgcgggctcg gcctcggcct 60
cggcctcggc cttcggccgc ggttaccgaa acacagacgg tagact 106
<210> 8
<211> 86
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ctcccgcgcc cccgcccccg cgttccggcc tggcctgcgg gattcgggcc gaggcaactg 60
cagggacggg gcacccctcc tgctcc 86
<210> 9
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tggagagggg tcatccgccc cggaaccgac gtgagcgcgg ggccggcccg tggaggcggc 60
tgagggatcc cccacttcca gcccgcccg 89
<210> 10
<211> 87
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gcagcagctg caggaagcgg actcggcgga aaggagcccc ggaggggaac tgagtgcctt 60
cagccaggca cgttcgggga gacagcg 87
<210> 11
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgccgcaaaa ttcgcagacg aagggcttgt agcccgcgtg gatgcggata tgcgtgttga 60
gcgtggagct gcggttgaac gctttgccg 89
<210> 12
<211> 109
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tgctacccca gccgtgtccc gctccggaga ccccagggcg ccgggaccca tctgccgctc 60
gccggccgga ggctaccagg agcaggagca gcagcgccgc ccgcagtag 109
<210> 13
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
cggccttccg gtggggcacc aaaagggaag cctcctcggc ccctggcgac ccggtgactt 60
gcagcggcgt gtgattaatc ttccacagct gtcgtgcccc atccacttga g 111
<210> 14
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gcaaccggca gcgtccagct cccgcacctc gctgcacatc gcacctgagc cccgccgcga 60
ccgcatcgcg ctcgctgcga cccattcaga ccc 93
<210> 15
<211> 116
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cttcagctgc cctcgatttt gctccacgcc tgccggccag agcctcccgg cgtttcttcc 60
gccccagcgg agtgcgctgg ggcgcgccag ggctaggccc gccggaggag cgcgtc 116
<210> 16
<211> 101
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cgtgtctgag gctcgcgggc aactggaact gagagtctga gttggcctcg cgggagccgc 60
cagaagggtg cgggctgcgt gtggcagagt aggagcactg t 101
<210> 17
<211> 85
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
tcggcagtgg ccaccacatc tggttctcgt taacttttct aaggcagcgg ccgctggagc 60
agcggggctg gcggggtaaa agctc 85
<210> 18
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cgcggccacc gcccgttcat cacccgcgcg catctgggct ggcaccgggc gaagaatcgt 60
gcgggtctgg gac 73
<210> 19
<211> 112
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
agattgcgcg gagcccacgc gatccctggg acgccggaga caacggggct cttgggaagg 60
cgcggagccc ggggaagccg gggatgtgcg cgtgagccgt gcccgcaggg tc 112
<210> 20
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggagcgtgcg ggcagcgccc ccgaacccta gcgcagccca ggaagcggtc ggaggagact 60
gtcctggccg cggtggcagc cccatccgga gtg 93
<210> 21
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
aaaactgatc cgtgtcctgc atgttggcag cagacaacct tccttgctgc tgagctgtcc 60
cgggtggctt caccgcggct ggggaatccg agccattcc 99
<210> 22
<211> 93
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
ggagagaaag tcctatctgc agcagccgaa tggtccccat tccggtaatg ggacggcggg 60
agcatttggg aggacgcgat tctaaagaga gcg 93
<210> 23
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ggaagattcg ggtatcgttt agcgta 26
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
tgttcggcgg ttcgggtatc g 21
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
tggcggttaa agtggtttcg a 21
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cgggttttag ggttttcgcg t 21
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ttcggagtgg ggtaggtgtc 20
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tcggtggtgt attacgaggg tt 22
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
gcgggaattg agtgttggtt c 21
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
tcgcgttttc gttttcgcgt 20
<210> 31
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
attcgtttcg gaatcgacgt gagc 24
<210> 32
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
gtagtagttg taggaagcgg attc 24
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
acgacaaaac gttcaaccgc a 21
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ttattttagt cgtgtttcgt ttcgga 26
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
tcggtggggt attaaaaggg aa 22
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
cggtagcgtt tagttttcgt atttc 25
<210> 37
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
tttcgatttt gttttacgtt tgtcg 25
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
cgtgtttgag gttcgcgggt 20
<210> 39
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
tcggtagtgg ttattatatt tggttttc 28
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
cgcggttatc gttcgtttat tattc 25
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
tgcgcggagt ttacgcgatt 20
<210> 42
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ggagcgtgcg ggtagcgtt 19
<210> 43
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
ttgattcgtg ttttgtatgt tggtagt 27
<210> 44
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
gagagaaagt tttatttgta gtagtcgaa 29
<210> 45
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
gcacacaccg ctacttacgc ttccg 25
<210> 46
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
gctacccaaa ctataaatac gaataaacgt 30
<210> 47
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
cacttaataa atttctctaa cacgaatcga t 31
<210> 48
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
cgaaactcga aaccgcgaaa c 21
<210> 49
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ataacgctcc ccgcaaacta a 21
<210> 50
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
aacgactaac gacgacgacg a 21
<210> 51
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
taccgtctat atttcgataa ccgcga 26
<210> 52
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ataccccgtc cctacaatta cct 23
<210> 53
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
cgaacgaact aaaaata 17
<210> 54
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
cgctatctcc ccgaacgtac c 21
<210> 55
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
tttgtcgtaa aattcgtaga cgaag 25
<210> 56
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
ctacgaacga cgctactact cctac 25
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
taaataaaac acgacaacta taa 23
<210> 58
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
ctaaataaat cgcaacgaac gcga 24
<210> 59
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
aacgcgctcc tccgacg 17
<210> 60
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
ctactctacc acacgcaacc cgcac 25
<210> 61
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
acttttaccc cgccaacccc g 21
<210> 62
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
atcccaaacc cgcacgatt 19
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
acgaacacga ctcacgcgca 20
<210> 64
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
cgaataaaac taccaccgcg a 21
<210> 65
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
aaaataactc gaattcccca acc 23
<210> 66
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 66
acgctctctt taaaatcgcg tcc 23
<210> 67
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 67
cgatccgcct aaacgactaa atccgcga 28
<210> 68
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 68
gagtcggtcg agttttagtc ggagttacgt 30
<210> 69
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 69
cccttaatcc ccgtcaatta tcatcccga 29
<210> 70
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 70
gcgaaaaccg cgctctactc tccg 24
<210> 71
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 71
cctctaccca ccgtaccgcg tctacttcc 29
<210> 72
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 72
tacgacgacg acgacgacaa acg 23
<210> 73
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 73
cgaaaccgaa cccgcgaact ctccga 26
<210> 74
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 74
gacccgaatc ccgcaaacca aaccg 25
<210> 75
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 75
cgcctccacg aaccgacccc g 21
<210> 76
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 76
tcaattcccc tccgaaactc ctttccgc 28
<210> 77
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 77
cgctcaacac gcatatccgc atccacgc 28
<210> 78
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 78
cgaccgacga acgacaaata aatcccgacg 30
<210> 79
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 79
cggtttttgg cgattcggtg atttgtagcg gc 32
<210> 80
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 80
cgatcgcgac gaaactcaaa tacgatatac 30
<210> 81
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 81
cgccccaacg cactccgcta aaacgaa 27
<210> 82
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 82
cttctaacga ctcccgcgaa accaac 26
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 83
aaggtagcgg tcgttggagt 20
<210> 84
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 84
tcgcccgata ccaacccaaa tacgcg 26
<210> 85
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 85
cgaactccgc gccttcccaa aaaccccg 28
<210> 86
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 86
cgaccgcttc ctaaactacg ctaaaattcg 30
<210> 87
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 87
cgataaaacc acccgaaaca actcaaca 28
<210> 88
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 88
actcccgccg tcccattacc gaaata 26
<210> 89
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 89
tatacgcaca caccgctact tacg 24
<210> 90
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 90
atgttcggcg gttcgggtat c 21
<210> 91
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 91
ttggcggtta aagtggtttc g 21
<210> 92
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 92
gaaactcgaa accgcgaaac c 21
<210> 93
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 93
taacgctccc cgcaaactaa a 21
<210> 94
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 94
cataactaca acgactaacg acga 24
<210> 95
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 95
cgggaattga gtgttggttc g 21
<210> 96
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 96
aataccccgt ccctacaatt acc 23
<210> 97
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 97
cgactccgaa cgaacgaact a 21
<210> 98
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 98
gctatctccc cgaacgtacc ta 22
<210> 99
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 99
tgtcgtaaaa ttcgtagacg aagg 24
<210> 100
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 100
tgttatttta gtcgtgtttc gtttcg 26
<210> 101
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 101
ctcaactcaa ataaataaaa cacgacaa 28
<210> 102
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 102
gtaatcggta gcgtttagtt ttcg 24
<210> 103
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 103
tttttagttg ttttcgattt tgttttac 28
<210> 104
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 104
acaatactcc tactctacca cacgca 26
<210> 105
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 105
cggtagtggt tattatattt ggttttcg 28
<210> 106
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 106
gcggttatcg ttcgtttatt attcg 25
<210> 107
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 107
aaccctacga acacgactca cg 22
<210> 108
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 108
cgtgcgggta gcgttttc 18
<210> 109
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 109
aaaattgatt cgtgttttgt atgttgg 27
<210> 110
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 110
gctctcttta aaatcgcgtc ctc 23
<210> 111
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 111
taggaagatt cgggtatcgt ttagc 25
<210> 112
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 112
gctacccaaa ctataaatac gaataaacg 29
<210> 113
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 113
ccacttaata aatttctcta acacgaatcg 30
<210> 114
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 114
cgtcgggttt tagggttttc g 21
<210> 115
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 115
tcggagtggg gtaggtgtcg 20
<210> 116
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 116
cggtggtgta ttacgagggt ta 22
<210> 117
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 117
aatctaccgt ctatatttcg ataaccg 27
<210> 118
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 118
ttttcgcgtt ttcgttttcg c 21
<210> 119
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 119
tggagagggg ttattcgttt cg 22
<210> 120
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 120
tagtagttgt aggaagcgga ttcg 24
<210> 121
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 121
cgacaaaacg ttcaaccgca a 21
<210> 122
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 122
ctactacgaa cgacgctact actcc 25
<210> 123
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 123
cggtggggta ttaaaaggga ag 22
<210> 124
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 124
aaatctaaat aaatcgcaac gaacg 25
<210> 125
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 125
gcgctcctcc gacga 15
<210> 126
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 126
ttgaggttcg cgggtaattg 20
<210> 127
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 127
aaacttttac cccgccaacc 20
<210> 128
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 128
atcccaaacc cgcacgat 18
<210> 129
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 129
agattgcgcg gagtttacg 19
<210> 130
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 130
cactccgaat aaaactacca ccg 23
<210> 131
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 131
aaataactcg aattccccaa ccg 23
<210> 132
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 132
ggagagaaag ttttatttgt agtagtcga 29
<210> 133
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 133
cgacgatccg cctaaacgac taaatccg 28
<210> 134
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 134
cgtaactccg actaaaactc gaccgactcg 30
<210> 135
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 135
tcccttaatc cccgtcaatt atcatcccg 29
<210> 136
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 136
cgctctactc tccgcccaaa ctaaacca 28
<210> 137
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 137
acctctaccc accgtaccgc gtctacttc 29
<210> 138
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 138
cgacaactac gacgacgacg acgacaa 27
<210> 139
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 139
ccgaaaccga aaccgaaacc gaacc 25
<210> 140
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 140
cgacccgaat cccgcaaacc aaacc 25
<210> 141
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 141
aatccctcaa ccgcctccac gaacc 25
<210> 142
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 142
ctcaattccc ctccgaaact cctttccg 28
<210> 143
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 143
cacgcatatc cgcatccacg cgaa 24
<210> 144
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 144
tcctaataac ctccgaccga cgaacgaca 29
<210> 145
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 145
ttaatcacac gccgctacaa atcaccgaa 29
<210> 146
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 146
cgcgacgaaa ctcaaatacg atatacaacg 30
<210> 147
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 147
acgcgcccca acgcactcc 19
<210> 148
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 148
cgcacccttc taacgactcc cgc 23
<210> 149
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 149
cgctactcca acgaccgcta ccttaaa 27
<210> 150
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 150
cttcgcccga taccaaccca aatacgc 27
<210> 151
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 151
gcacatcccc gacttccccg aac 23
<210> 152
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 152
tctcctccga ccgcttccta aactacgcta 30
<210> 153
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 153
aaaaccaccc gaaacaactc aacaacaaaa 30
<210> 154
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 154
aatactcccg ccgtcccatt accga 25
<210> 155
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 155
ttgtgcgtat atatcgttat ttgcg 25
<210> 156
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 156
gtttaggttg taggtgcggg tggac 25
<210> 157
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 157
tcgaacggtt tttatttttc gt 22
<210> 158
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 158
ttcgtcgagg aggaggagta c 21
<210> 159
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 159
atagcgtttt tcgtaggttg ggga 24
<210> 160
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 160
tatggttgta gcggttggc 19
<210> 161
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 161
tttatcgttt gtgtttcggt aatcg 25
<210> 162
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 162
ggagtaggag gggtgtttcg 20
<210> 163
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 163
cgggcgggtt ggaagtggg 19
<210> 164
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 164
cgttgttttt tcgaacgtgt ttgg 24
<210> 165
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 165
cgataaaacg tttaatcgta attt 24
<210> 166
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 166
ttattgcggg cggcgttgtt g 21
<210> 167
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 167
tacgatagtt gtggaagatt aatta 25
<210> 168
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 168
ggtttgaatg ggtcgtagcg agc 23
<210> 169
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 169
cgcgtttttt cggcgggtt 19
<210> 170
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 170
tttattttgt tatacgtagt tcgtatt 27
<210> 171
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 171
gtttttattt cgttagtttc g 21
<210> 172
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 172
tttagattcg tacgattttt cg 22
<210> 173
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 173
tacggtttac gcgtatattt tc 22
<210> 174
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 174
tcggatgggg ttgttatcgc 20
<210> 175
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 175
gaatggttcg gattttttag tc 22
<210> 176
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 176
ttttagaatc gcgttttttt aaatg 25
<210> 177
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 177
gaacaccgtt caacgcatta acttcg 26
<210> 178
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 178
tattcgacga cccgaacacc g 21
<210> 179
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 179
aacgaaaatc aaaaaattac ccattcta 28
<210> 180
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 180
ccaacctaaa cgaaaaacaa aacg 24
<210> 181
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 181
cgaaataaaa caaatatcga aacta 25
<210> 182
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 182
cgataataca ccacgaaaac tacccg 26
<210> 183
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 183
cgaaaactaa atactaaccc gaa 23
<210> 184
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 184
ccgcgttccg acctaacc 18
<210> 185
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 185
tcatccgccc cgaaaccg 18
<210> 186
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 186
acaacaacta caaaaaacga ac 22
<210> 187
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 187
tatcgtaaaa ttcgtaaacg aaa 23
<210> 188
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 188
aaccgtatcc cgctccgaaa ac 22
<210> 189
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 189
cgaccttccc gataaaacac caaa 24
<210> 190
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 190
cgacaacgtc caactcccgc acctcg 26
<210> 191
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 191
ctcgatttta ctccacgcct accga 25
<210> 192
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 192
cgtatctaaa actcgcgaac aacta 25
<210> 193
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 193
tcgacaataa ccaccacatc taattctc 28
<210> 194
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 194
gcgaccaccg cccgttc 17
<210> 195
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 195
aaattacgcg aaacccacgc ga 22
<210> 196
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 196
gtacgaacaa cgcccccga 19
<210> 197
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 197
actaatccgt atcctacata tta 23
<210> 198
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 198
aaatcctatc tacaacaacc gaata 25
<210> 199
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 199
gaacccaacc gcccaaacga atcgccg 27
<210> 200
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 200
gaaccgaccg aactccaacc gaaactacg 29
<210> 201
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 201
ctataaaaac cgattcgtac caaa 24
<210> 202
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 202
cgcgacctcg aacc 14
<210> 203
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 203
aaacaaacgc gatacgataa acaa 24
<210> 204
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 204
gccgccgccg caactaccgc cg 22
<210> 205
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 205
gacctcgacc tcgacctcga ccttcga 27
<210> 206
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 206
acgaaattcg aaccgaaaca actac 25
<210> 207
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 207
cgtaaacgcg aaaccgaccc gtaaaaacga 30
<210> 208
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 208
cgacgaaaaa aaaccccgaa a 21
<210> 209
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 209
cgtttaatac gtatattcgt atttacgcg 29
<210> 210
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 210
cgccgaaacc catctaccgc tcgccgaccg 30
<210> 211
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 211
cgtcgttgta agttatcggg tcgttagggg tc 32
<210> 212
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 212
cgcacctaaa ccccgccgcg accgcatcg 29
<210> 213
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 213
caacgaaata cgctaaaacg cgcca 25
<210> 214
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 214
tctaaattaa cctcgcgaaa accgccaa 28
<210> 215
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 215
gttttagcgg tcgttgtttt agaaaagtta ac 32
<210> 216
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 216
ccgcgcgcat ctaaactaac accga 25
<210> 217
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 217
aaacgccgaa aacaacgaaa ctcttaa 27
<210> 218
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 218
cctaacgcaa cccaaaaaac gatcgaa 27
<210> 219
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 219
actaaactat cccgaataac ttcaccg 27
<210> 220
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 220
tccccattcc gataataaaa cgacgaa 27
<210> 221
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 221
gtgatggagg aggtttagta agtt 24
<210> 222
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 222
ccaataaaac ctactcctcc cttaa 25
<210> 223
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 223
accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 30

Claims (25)

1.一种用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志物组合，其特在于，其选自由CG指示的共甲基化区域的SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.22的任意两种或两种以上序列的组合，或选自SEQ IDNO.1至SEQ ID NO.22的完全互补的序列的任意两种或两种以上序列的组合。
2.根据权利要求1所述的用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志物组合，其特在于，所述用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志物组合包括选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17中的至少2种的组合，或选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.17的完全互补序列的至少2种的组合。
3.根据权利要求1所述的用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志物组合，其特在于，所述用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志物组合为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的组合或其完全互补序列的组合。
4.根据权利要求3所述的用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志物组合，其特在于，所述用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志物组合为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的组合，或选自SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3的完全互补序列的组合。
5.根据权利要求4所述的用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志物组合，其特在于，所述用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志物组合为自SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.8的组合或其完全互补序列的组合。
6.根据权利要求1所述的用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志物组合，其特在于，所述用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志物组合为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.22的组合或其互补序列的组合。
7.根据权利要求1所述的用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志物组合，其特在于，所述用于膀胱癌检测的DNA甲基化标志物组合为如下任一组：
SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.1的组合；
SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.1的组合；
SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.8的组合；
SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.6的组合；
SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.14的组合；
SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.12的组合；
SEQ ID NO.22、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.4的组合；
SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.21的组合；
SEQ ID NO.19、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.7的组合；
SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.6的组合；
SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的组合；或以上DNA甲基化标志物组合的完全互补序列的组合。
8.权利要求1-7任一项所述的DNA甲基化标志物组合在制备检测、诊断、分类或预测、治疗监测、预后或其它评价膀胱癌的试剂盒中的应用。
9.一种判断膀胱癌不同级别或不同分期试剂盒，其特征在于，具有检测包括由[CG]指示的共甲基化区域的SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.13、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18、SEQ IDNO.21、SEQ ID NO.22中的至少2种的DNA甲基化标志物组合，或其完全互补序列的组合的共甲基化程度的试剂。
10.根据权利要求9所述的判断膀胱癌不同级别或不同分期试剂盒，其特征在于，所述DNA甲基化标志物组合包括SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.16、和SEQ ID NO.18或其完全互补序列的DNA甲基化标志物。
11.根据权利要求10所述的判断膀胱癌不同级别或不同分期试剂盒，其特征在于，所述DNA甲基化标志物组合包括：SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.16、和SEQ ID NO.18或其完全互补序列的DNA甲基化标志物。
12.根据权利要求9所述的判断膀胱癌不同级别或不同分期试剂盒，其特征在于，所述DNA甲基化标志物组合包括：SEQ ID NO.17、和SEQ ID NO.13或其完全互补序列的DNA甲基化标志物。
13.根据权利要求12所述的判断膀胱癌不同级别或不同分期试剂盒，其特征在于，所述DNA甲基化标志物组合为SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.5，或其完全互补序列；或者所述DNA甲基化标志物组合为SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.22，或其完全互补序列。
14.一种检测膀胱癌试剂盒，其特征在于，包括检测权利要求1-7任一项所述的DNA甲基化标志物组合的甲基化程度的试剂。
15.根据权利要求14所述的检测膀胱癌试剂盒，其特征在于，采用荧光定量PCR方法，所述检测试剂盒包括针对每个甲基化区域的扩增引物和荧光探针，所述扩增引物和荧光探针选自：所述扩增引物和荧光探针为：
针对SEQ ID NO.1的SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.45，以及SEQ ID NO.67；
针对SEQ ID NO.2的SEQ ID NO.24和SEQ ID NO.46，以及SEQ ID NO.68；
针对SEQ ID NO.3的SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.47，以及SEQ ID NO.69；
针对SEQ ID NO.4的SEQ ID NO.26和SEQ ID NO.48，以及SEQ ID NO.70；
针对SEQ ID NO.5的SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.49，以及SEQ ID NO.71；
针对SEQ ID NO.6的SEQ ID NO.28和SEQ ID NO.50，以及SEQ ID NO.72；
针对SEQ ID NO.7的SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.51，以及SEQ ID NO.73；
针对SEQ ID NO.8的SEQ ID NO.30和SEQ ID NO.52，以及SEQ ID NO.74；
针对SEQ ID NO.9的SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.53，以及SEQ ID NO.75；
针对SEQ ID NO.10的SEQ ID NO.32和SEQ ID NO.54，以及SEQ ID NO.76；
针对SEQ ID NO.11的SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.55，以及SEQ ID NO.77；
针对SEQ ID NO.12的SEQ ID NO.34和SEQ ID NO.56，以及SEQ ID NO.78；
针对SEQ ID NO.13的SEQ ID NO.35和SEQ ID NO.57，以及SEQ ID NO.79；
针对SEQ ID NO.14的SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.58，以及SEQ ID NO.80；
针对SEQ ID NO.15的SEQ ID NO.37和SEQ ID NO.59，以及SEQ ID NO.81；
针对SEQ ID NO.16的SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.60，以及SEQ ID NO.82；
针对SEQ ID NO.17的SEQ ID NO.39和SEQ ID NO.61，以及SEQ ID NO.83；
针对SEQ ID NO.18的SEQ ID NO.40和SEQ ID NO.62，以及SEQ ID NO.84；
针对SEQ ID NO.19的SEQ ID NO.41和SEQ ID NO.63，以及SEQ ID NO.85；
针对SEQ ID NO.20的SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.64，以及SEQ ID NO.86；
针对SEQ ID NO.21的SEQ ID NO.43和SEQ ID NO.65，以及SEQ ID NO.87；
针对SEQ ID NO.22的SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.66，以及SEQ ID NO.88；或选自与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物和探针。
16.根据权利要求14所述的检测膀胱癌试剂盒，其特征在于，采用荧光定量PCR方法，所述检测试剂盒包括针对每个甲基化区域的扩增引物和荧光探针，所述扩增引物和荧光探针选自：
针对SEQ ID NO.1的SEQ ID NO.89和SEQ ID NO.111，以及SEQ ID NO.133；
针对SEQ ID NO.2的SEQ ID NO.90和SEQ ID NO.112，以及SEQ ID NO.134；
针对SEQ ID NO.3的SEQ ID NO.91和SEQ ID NO.113，以及SEQ ID NO.135；
针对SEQ ID NO.4的SEQ ID NO.92和SEQ ID NO.114，以及SEQ ID NO.136；
针对SEQ ID NO.5的SEQ ID NO.93和SEQ ID NO.115，以及SEQ ID NO.137；
针对SEQ ID NO.6的SEQ ID NO.94和SEQ ID NO.116，以及SEQ ID NO.138；
针对SEQ ID NO.7的SEQ ID NO.95和SEQ ID NO.117，以及SEQ ID NO.139；
针对SEQ ID NO.8的SEQ ID NO.96和SEQ ID NO.118，以及SEQ ID NO.140；
针对SEQ ID NO.9的SEQ ID NO.97和SEQ ID NO.119，以及SEQ ID NO.141；
针对SEQ ID NO.10的SEQ ID NO.98和SEQ ID NO.120，以及SEQ ID NO.142；
针对SEQ ID NO.11的SEQ ID NO.99和SEQ ID NO.121，以及SEQ ID NO.143；
针对SEQ ID NO.12的SEQ ID NO.100和SEQ ID NO.122，以及SEQ ID NO.144；
针对SEQ ID NO.13的SEQ ID NO.101和SEQ ID NO.123，以及SEQ ID NO.145；
针对SEQ ID NO.14的SEQ ID NO.101和SEQ ID NO.124，以及SEQ ID NO.146；
针对SEQ ID NO.15的SEQ ID NO.103和SEQ ID NO.125，以及SEQ ID NO.147；
针对SEQ ID NO.16的SEQ ID NO.104和SEQ ID NO.126，以及SEQ ID NO.148；
针对SEQ ID NO.17的SEQ ID NO.105和SEQ ID NO.127，以及SEQ ID NO.149；
针对SEQ ID NO.18的SEQ ID NO.106和SEQ ID NO.128，以及SEQ ID NO.150；
针对SEQ ID NO.19的SEQ ID NO.107和SEQ ID NO.129，以及SEQ ID NO.151；
针对SEQ ID NO.20的SEQ ID NO.108和SEQ ID NO.130，以及SEQ ID NO.152；
针对SEQ ID NO.21的SEQ ID NO.109和SEQ ID NO.131，以及SEQ ID NO.153；
针对SEQ ID NO.22的SEQ ID NO.110和SEQ ID NO.132，以及SEQ ID NO.154；或选自与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物和探针。
17.根据权利要求14所述的检测膀胱癌试剂盒，其特征在于，采用荧光定量PCR方法，所述检测试剂盒包括针对每个甲基化区域的扩增引物和荧光探针，所述扩增引物和荧光探针选自：
针对SEQ ID NO.1的SEQ ID NO.155和SEQ ID NO.177，以及SEQ ID NO.199；
针对SEQ ID NO.2的SEQ ID NO.156和SEQ ID NO.178，以及SEQ ID NO.200；
针对SEQ ID NO.3的SEQ ID NO.157和SEQ ID NO.179，以及SEQ ID NO.201；
针对SEQ ID NO.4的SEQ ID NO.158和SEQ ID NO.180，以及SEQ ID NO.202；
针对SEQ ID NO.5的SEQ ID NO.159和SEQ ID NO.181，以及SEQ ID NO.203；
针对SEQ ID NO.6的SEQ ID NO.160和SEQ ID NO.182，以及SEQ ID NO.204；
针对SEQ ID NO.7的SEQ ID NO.161和SEQ ID NO.183，以及SEQ ID NO.205；
针对SEQ ID NO.8的SEQ ID NO.162和SEQ ID NO.184，以及SEQ ID NO.206；
针对SEQ ID NO.9的SEQ ID NO.163和SEQ ID NO.185，以及SEQ ID NO.207；
针对SEQ ID NO.10的SEQ ID NO.164和SEQ ID NO.186，以及SEQ ID NO.208；
针对SEQ ID NO.11的SEQ ID NO.165和SEQ ID NO.187，以及SEQ ID NO.209；
针对SEQ ID NO.12的SEQ ID NO.166和SEQ ID NO.188，以及SEQ ID NO.210；
针对SEQ ID NO.13的SEQ ID NO.167和SEQ ID NO.189，以及SEQ ID NO.211；
针对SEQ ID NO.14的SEQ ID NO.168和SEQ ID NO.190，以及SEQ ID NO.212；
针对SEQ ID NO.15的SEQ ID NO.169和SEQ ID NO.191，以及SEQ ID NO.213；
针对SEQ ID NO.16的SEQ ID NO.170和SEQ ID NO.192，以及SEQ ID NO.214；
针对SEQ ID NO.17的SEQ ID NO.171和SEQ ID NO.193，以及SEQ ID NO.215；
针对SEQ ID NO.18的SEQ ID NO.172和SEQ ID NO.194，以及SEQ ID NO.216；
针对SEQ ID NO.19的SEQ ID NO.173和SEQ ID NO.195，以及SEQ ID NO.217；
针对SEQ ID NO.20的SEQ ID NO.174和SEQ ID NO.196，以及SEQ ID NO.218；
针对SEQ ID NO.21的SEQ ID NO.175和SEQ ID NO.197，以及SEQ ID NO.219；
针对SEQ ID NO.22的SEQ ID NO.176和SEQ ID NO.198以及SEQ ID NO.220；或选自与上述序列具有多个连续核苷酸至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物和探针。
18.根据权利要求14-17任一项所述的检测膀胱癌试剂盒，其特征在于，还包括有内参基因的引物和探针：SEQ ID NO.221-SEQ ID NO.223；或选自与上述序列具有多个连续核苷酸且至少70％、80％、90％、95％或99％的序列同一性的引物和探针。
19.一种检测膀胱癌的方法，其特征在于，包括以下步骤,
提取将待测的生物样品基因组DNA和/或游离DNA；
对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化；
对所述经过亚硫酸氢盐转化的DNA和对照进行如权利要求1所述DNA甲基化标志物组合的共甲基化检测，得到甲基化图谱；
将甲基化标志物组合的甲基化图谱与从基于数据集数学建模得到的图谱判定阈值进行比较，判断生物样品中膀胱癌的存在。
20.根据权利要求19所述的检测膀胱癌的方法，其特征在于，所述共甲基化检测方法包括：甲基化特异性PCR、DNA甲基化芯片、靶向DNA甲基化测序、数字PCR定量及荧光定量PCR。
21.一种对膀胱癌诊断、分期、分类的方法，其特征在于，包括以下步骤：提取待测的生物样品基因组DNA和/或游离DNA；
对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化；
对所述经过亚硫酸氢盐转化的DNA进行如权利要求1所述DNA甲基化标志物组合的共甲基化检测；
得到目标DNA甲基化标志物区域的相对循环数d-CT，与设定阈值相比较，
对不同来源的生物样品的膀胱癌级别或分期进行判断。
22.一种对膀胱癌预测、治疗监测、预后或其它评价的方法，其特征在于，包括以下步骤：
获得个体的生物样品，
提取所述生物样品基因组DNA和/或游离DNA；
对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化；
对所述经过亚硫酸氢盐转化的DNA与特异性检测权利要求1所述的DNA甲基化标志物的共甲基化的多种试剂接触，测定所述生物样品的所述的DNA甲基化标志物的共甲基化程度；比对从基于数据集数学建模得到的共甲基化程度判定阈值，对膀胱癌的预测、治疗检测、预后作出判断。
23.根据权利要求19-22任一项所述的方法，其特征在于，所述生物样品为血液、血浆、唾液、血清。
24.根据权利要求19-22任一项所述的检测膀胱癌的方法，其特征在于，所述生物样品为组织。
25.根据权利要求19-22任一项所述的检测膀胱癌的方法，其特征在于，所述生物样品为尿液、尿液脱落细胞、尿沉渣、尿液上清。
CN201911367385.4A 2019-12-26 2019-12-26 Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒 Active CN110872631B (zh)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911367385.4A CN110872631B (zh) 2019-12-26 2019-12-26 Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒
EP20908235.3A EP4083232A4 (en) 2019-12-26 2020-01-17 COMBINATION OF DNA METHYLATION BIOMARKERS AND DETECTION METHOD THEREOF AND KIT THEREOF
PCT/CN2020/072770 WO2021128519A1 (zh) 2019-12-26 2020-01-17 Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒
JP2022525590A JP2023516525A (ja) 2019-12-26 2020-01-17 Ｄｎａメチル化バイオマーカーの組み合わせ、検出方法および試薬キット
US17/036,424 US11851714B2 (en) 2019-12-26 2020-09-29 Combinations, detection methods and kits of DNA methylation biomarker
US18/504,402 US20240084398A1 (en) 2019-12-26 2023-11-08 Combinations, detection methods and kits of dna methylation biomarker

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201911367385.4A CN110872631B (zh) 2019-12-26 2019-12-26 Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110872631A true CN110872631A (zh) 2020-03-10
CN110872631B CN110872631B (zh) 2021-08-10

Family

ID=69718378

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201911367385.4A Active CN110872631B (zh) 2019-12-26 2019-12-26 Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN110872631B (zh)
WO (1) WO2021128519A1 (zh)

Cited By (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111676286A (zh) * 2020-05-29 2020-09-18 武汉爱基百客生物科技有限公司 肺癌血浆游离dna甲基化检测用的多重pcr引物***、检测方法及应用
CN112646888A (zh) * 2020-12-28 2021-04-13 广州市基准医疗有限责任公司 乳腺肿瘤特异性甲基化检测的试剂盒
WO2021218031A1 (zh) * 2020-04-30 2021-11-04 广州康立明生物科技股份有限公司 一种肿瘤检测试剂及试剂盒
CN113637745A (zh) * 2020-04-27 2021-11-12 广州市基准医疗有限责任公司 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物或其组合和应用
CN113755584A (zh) * 2020-06-05 2021-12-07 广州市基准医疗有限责任公司 Dna甲基化生物标志物组合及其应用
CN114645043A (zh) * 2020-12-17 2022-06-21 广州市基准医疗有限责任公司 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物组合和应用
CN114645087A (zh) * 2020-12-17 2022-06-21 广州市基准医疗有限责任公司 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物或其组合和应用
CN114959030A (zh) * 2022-05-18 2022-08-30 武汉艾米森生命科技有限公司 检测hcg9基因甲基化的试剂在制备诊断膀胱癌的产品中的应用
CN115094139A (zh) * 2022-06-22 2022-09-23 武汉艾米森生命科技有限公司 检测甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用以及膀胱癌诊断试剂盒
CN115786502A (zh) * 2022-07-14 2023-03-14 武汉艾米森生命科技有限公司 检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌的诊断产品中的应用
CN116004812A (zh) * 2022-07-06 2023-04-25 武汉艾米森生命科技有限公司 检测甲基化水平的试剂在制备食管癌诊断产品中的应用以及食管癌诊断试剂盒
WO2024002166A1 (zh) * 2022-06-29 2024-01-04 广州市基准医疗有限责任公司 一种多基因合并荧光通道检测的方法
RU2818527C1 (ru) * 2020-04-30 2024-05-02 Криэйтив Байосайенсиз (Гуанчжоу) Ко., Лтд. Реагент для обнаружения опухолей

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114317736B (zh) * 2021-08-19 2022-09-13 广州市基准医疗有限责任公司 用于泛癌种检测的甲基化标志物组合及其应用

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010084154A2 (de) * 2009-01-22 2010-07-29 Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Bestimmung des dna-methylierungsgrads
CN102311953A (zh) * 2011-09-23 2012-01-11 上海市肿瘤研究所 尿液诊断膀胱癌的方法和试剂盒
CN107592885A (zh) * 2015-02-24 2018-01-16 兹莫研究公司 测定dna甲基化的分析法和癌症的dna甲基化标记
CN108350504A (zh) * 2015-06-24 2018-07-31 Ucl商业有限公司 膀胱癌的诊断方法
CN110343762A (zh) * 2019-06-06 2019-10-18 宽盈医疗科技(上海)有限公司 膀胱癌标志物组及其应用
CN110373462A (zh) * 2019-06-06 2019-10-25 宽盈医疗科技(上海)有限公司 膀胱癌诊断***和检测尿液中目的基因甲基化水平的方法
CN110387417A (zh) * 2019-06-06 2019-10-29 宽盈医疗科技(上海)有限公司 膀胱癌诊断***、试剂组合和检测尿液中目的基因甲基化水平的方法
CN110551820A (zh) * 2019-09-05 2019-12-10 广州中鑫医学检验科技有限公司 一种膀胱癌检测试剂盒

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006133866A2 (en) * 2005-06-11 2006-12-21 Epigenomics Ag Prognostic markers for prediction of treatment response and/or survival of breast cell proliferative disorder patients
EP2644705A1 (en) * 2012-03-30 2013-10-02 RWTH Aachen Biomarker for bladder cancer
CN108441561A (zh) * 2018-04-19 2018-08-24 安徽达健医学科技有限公司 一种双重甲基化荧光定量pcr法用于膀胱癌早期筛查检测的试剂盒

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010084154A2 (de) * 2009-01-22 2010-07-29 Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf Bestimmung des dna-methylierungsgrads
CN102311953A (zh) * 2011-09-23 2012-01-11 上海市肿瘤研究所 尿液诊断膀胱癌的方法和试剂盒
CN107592885A (zh) * 2015-02-24 2018-01-16 兹莫研究公司 测定dna甲基化的分析法和癌症的dna甲基化标记
CN108350504A (zh) * 2015-06-24 2018-07-31 Ucl商业有限公司 膀胱癌的诊断方法
US20180305765A1 (en) * 2015-06-24 2018-10-25 Ucl Business Plc Methods of diagnosing bladder cancer
CN110343762A (zh) * 2019-06-06 2019-10-18 宽盈医疗科技(上海)有限公司 膀胱癌标志物组及其应用
CN110373462A (zh) * 2019-06-06 2019-10-25 宽盈医疗科技(上海)有限公司 膀胱癌诊断***和检测尿液中目的基因甲基化水平的方法
CN110387417A (zh) * 2019-06-06 2019-10-29 宽盈医疗科技(上海)有限公司 膀胱癌诊断***、试剂组合和检测尿液中目的基因甲基化水平的方法
CN110551820A (zh) * 2019-09-05 2019-12-10 广州中鑫医学检验科技有限公司 一种膀胱癌检测试剂盒

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MEI CHEN ET AL.: ""m6A RNA methylation regulators can contribute to malignant progression and impact the prognosis of bladder cancer "", 《BIOSCIENCE REPORTS》 *
YINGHUI YU ET AL.: ""Prognostic value of DNA methylation for bladder cancer"", 《CLINICA CHIMICA ACTA》 *
孟旭英等: ""组蛋白甲基转移酶EZH2抑制剂联合抗癌药物对膀胱癌细胞功能影响的研究"", 《天津医科大学学报》 *
岳峰等: ""RUNX3 甲基化在非肌层浸润性膀胱癌患者中的表达"", 《中国医药指南》 *

Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113637745A (zh) * 2020-04-27 2021-11-12 广州市基准医疗有限责任公司 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物或其组合和应用
RU2818527C1 (ru) * 2020-04-30 2024-05-02 Криэйтив Байосайенсиз (Гуанчжоу) Ко., Лтд. Реагент для обнаружения опухолей
WO2021218031A1 (zh) * 2020-04-30 2021-11-04 广州康立明生物科技股份有限公司 一种肿瘤检测试剂及试剂盒
CN111676286A (zh) * 2020-05-29 2020-09-18 武汉爱基百客生物科技有限公司 肺癌血浆游离dna甲基化检测用的多重pcr引物***、检测方法及应用
CN111676286B (zh) * 2020-05-29 2023-04-14 武汉爱基百客生物科技有限公司 肺癌血浆游离dna甲基化检测用的多重pcr引物***、检测方法及应用
CN113755584A (zh) * 2020-06-05 2021-12-07 广州市基准医疗有限责任公司 Dna甲基化生物标志物组合及其应用
CN114645087B (zh) * 2020-12-17 2023-03-24 广州市基准医疗有限责任公司 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物或其组合和应用
WO2022127717A1 (zh) * 2020-12-17 2022-06-23 广州市基准医疗有限责任公司 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物或其组合和应用
CN114645043B (zh) * 2020-12-17 2022-12-09 广州市基准医疗有限责任公司 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物组合和应用
CN114645087A (zh) * 2020-12-17 2022-06-21 广州市基准医疗有限责任公司 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物或其组合和应用
CN114645043A (zh) * 2020-12-17 2022-06-21 广州市基准医疗有限责任公司 用于检测肺结节良恶性的甲基化分子标记物组合和应用
CN112646888A (zh) * 2020-12-28 2021-04-13 广州市基准医疗有限责任公司 乳腺肿瘤特异性甲基化检测的试剂盒
CN114959030A (zh) * 2022-05-18 2022-08-30 武汉艾米森生命科技有限公司 检测hcg9基因甲基化的试剂在制备诊断膀胱癌的产品中的应用
CN115094139A (zh) * 2022-06-22 2022-09-23 武汉艾米森生命科技有限公司 检测甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用以及膀胱癌诊断试剂盒
CN115094139B (zh) * 2022-06-22 2023-04-28 武汉艾米森生命科技有限公司 检测甲基化水平的试剂在制备膀胱癌诊断产品中的应用以及膀胱癌诊断试剂盒
WO2024002166A1 (zh) * 2022-06-29 2024-01-04 广州市基准医疗有限责任公司 一种多基因合并荧光通道检测的方法
CN116004812A (zh) * 2022-07-06 2023-04-25 武汉艾米森生命科技有限公司 检测甲基化水平的试剂在制备食管癌诊断产品中的应用以及食管癌诊断试剂盒
CN115786502A (zh) * 2022-07-14 2023-03-14 武汉艾米森生命科技有限公司 检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌的诊断产品中的应用
CN115786502B (zh) * 2022-07-14 2023-08-01 武汉艾米森生命科技有限公司 检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌的诊断产品中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
WO2021128519A1 (zh) 2021-07-01
CN110872631B (zh) 2021-08-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110872631B (zh) Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒
CN114277135B (zh) 胃癌***转移相关的甲基化生物标记物及其组合和检测试剂盒
EP3942068A1 (en) Methods and systems for detecting methylation changes in dna samples
US20210222256A1 (en) Pancreatic cancer
CN112195245A (zh) 血浆中肺癌相关甲基化基因组合及其应用
KR20160041905A (ko) 전암병변의 검출방법
EP3740590A1 (en) Kits and methods for diagnosing lung cancer
US20240084398A1 (en) Combinations, detection methods and kits of dna methylation biomarker
US20090186360A1 (en) Detection of GSTP1 hypermethylation in prostate cancer
US11535897B2 (en) Composite epigenetic biomarkers for accurate screening, diagnosis and prognosis of colorectal cancer
JP6583817B2 (ja) 子宮平滑筋における腫瘍の診断マーカー
EP4083232A1 (en) Combination of dna methylation biomarkers, and detection method therefor and kit thereof
US11542559B2 (en) Methylation-based biomarkers in breast cancer screening, diagnosis, or prognosis
WO2024002165A1 (zh) 用于诊断胃癌的dna甲基化生物标记物、试剂盒及用途
CN113755584A (zh) Dna甲基化生物标志物组合及其应用
US20080213781A1 (en) Methods of detecting methylation patterns within a CpG island
TW202417642A (zh) 鑑別癌症的甲基化標誌物及應用
WO2023116593A1 (zh) 一种肿瘤检测方法及应用
CN117660622A (zh) 用于检测肺结节的甲基化分子标记物及其应用
CN117778582A (zh) 用于检测胃癌的核酸组合、试剂盒及应用
CN116356027A (zh) 一种用于食管鳞癌或癌前病变检测的试剂、试剂盒及应用
CN117431315A (zh) 大肠癌***转移检测甲基化生物标记物及检测试剂盒
CN115838798A (zh) 检测甲基化水平的试剂在制备结直肠癌诊断产品中的应用
CN116287227A (zh) 用于诊断***癌的试剂和试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant