CN112159846A

CN112159846A - 组合物、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN112159846A
Application number: CN202010999451.6A
Authority: CN
Inventors: 张核子; 巴颖; 周代志; 卢晓萍; 丁世涛
Original assignee: Shenzhen Nuclear Gene Technology Co ltd
Current assignee: Shenzhen Nuclear Gene Technology Co ltd
Priority date: 2020-09-22
Filing date: 2020-09-22
Publication date: 2021-01-01

Abstract

本发明提供组合物、试剂盒及其应用。该组合物包括检测Septin9基因的CpG岛的至少两个甲基化靶区域的第一检测试剂和检测SDC2基因的CpG岛的至少两个甲基化靶区域的第二检测试剂。本发明实施例的组合物至少具有如下有益效果：本发明实施例针对结直肠癌相关的多个目标基因进行联合检测，对于同一基因上的不同甲基化位点，选择彼此相隔一定距离的不同甲基化靶区域的位点组合分别独立设置检测试剂进行检测，有效增加检测靶位点，依据不同位点的叠加信号进行判断，有效增强检测信号，提高对有限样本的利用效率，从而提高检测的灵敏度。

Description

组合物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及癌症检测技术领域，尤其是涉及组合物、试剂盒及其应用。

背景技术

相关数据表明，结直肠癌的发病率和死亡率位居我国肿瘤发病率和死亡率的第三和第五位，而且随着近些年人口老龄化和饮食结构的改变呈快速上升的趋势。在临床实践中，结直肠癌的早期发现对于癌症患者的有效治疗非常重要。DNA甲基化是肿瘤发生的一个早期事件，与肿瘤的发生发展密切相关，相关基因CpG岛的高度甲基化早于肿瘤的发生，同时，DNA甲基化稳定存在，可以通过PCR放大效应进行检测。因此，这些基因的甲基化状态可以作为潜在的肿瘤标志物，用于肿瘤的早筛、辅助诊断及疗效评估。相比其它癌种，结直肠癌的甲基化检测进行的较多，国内外已有几款产品进入临床应用，但临床灵敏度和特异性普遍较低，和临床需求存在差距。因此，有必要提供一种检测灵敏度更高的组合物。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种检测灵敏度更高的能够用于结直肠癌检测的组合物、试剂盒及其应用。

第一方面，本发明的一个实施例提供了一种组合物，该组合物包括检测Septin9基因的CpG岛的至少两个甲基化靶区域的第一检测试剂和检测SDC2基因的CpG岛的至少两个甲基化靶区域的第二检测试剂。

本发明实施例的组合物至少具有如下有益效果：

本发明实施例针对结直肠癌相关的多个目标基因进行联合检测，对于同一基因上的不同甲基化位点，选择彼此相隔一定距离的不同甲基化靶区域的位点组合分别独立设置检测试剂进行检测，有效增加检测靶位点，依据不同位点的叠加信号进行判断，有效增强检测信号，提高对有限样本的利用效率，从而提高检测的灵敏度。

根据本发明的一些实施例的组合物，Septin9基因的甲基化靶区域包括Septin9第一靶区域和Septin9第二靶区域；SDC2基因的甲基化靶区域包括SDC2第一靶区域和SDC2第二靶区域。

Septin9基因和SDC2基因的第一靶区域和第二靶区域内均分布有多个甲基化位点，上述这些位点在结直肠癌患者与正常人体内存在极为明显的差异化甲基化，通过对任一基因的多个靶区域内不同甲基化位点的组合分别进行检测，获得累加信号，从而有效提高检测灵敏度。

根据本发明的一些实施例的组合物，第一检测试剂包括第一探针组，第一探针组包括特异性检测Septin9第一靶区域的第一探针(Septin9-1)和特异性检测Septin9第二靶区域的第二探针(Septin9-2)；第二检测试剂包括第二探针组，第二探针组包括特异性检测SDC2第一靶区域的第三探针(SDC2-1)和特异性检测SDC2第一靶区域的的第四探针(SDC2-2)；

其中，第一探针、第二探针、第三探针、第四探针的核苷酸序列如下：

第一探针Septin9-1：TAACCGCGAAATCCGAC(SEQ ID No.3)；

第二探针Septin9-2：CGTCCGCGACCGC(SEQ ID No.7)；

第三探针SDC2-1：GCGCGCGTGGATTTTGT(SEQ ID No.11)；

第四探针SDC2-2：GAGGGCGCCGCGTTCCCGGG(SEQ ID No.15)。

根据本发明的一些实施例的组合物，第一探针、第二探针、第三探针、第四探针的5′端标记有荧光报告基团，第一探针、第二探针、第三探针、第四探针的3′端标记有荧光淬灭基团；不同探针组的探针的荧光报告基团和荧光淬灭基团的发射光谱不相同。

根据本发明的一些实施例的组合物，荧光报告基团选自FAM、VIC、HEX、JOE、ROX、CY5，荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA。

根据本发明的一些实施例的组合物，第一探针和第二探针的荧光报告基团为FAM，荧光淬灭基团为BHQ1；第三探针和第四探针的荧光报告基团为ROX，荧光淬灭基团为BHQ2。

根据本发明的一些实施例的组合物，第一检测试剂还包括第一特异性引物组，第一特异性引物组包括特异性扩增Septin9第一靶区域的第一引物对(Septin9-1-F/R)和特异性扩增Septin9第二靶区域的第二引物对(Septin9-2-F/R)；第二检测试剂还包括第二特异性引物组，第二引物组包括特异性扩增SDC2第一靶区域的第三引物对(SDC20-1-F/R)和特异性扩增SDC2第二靶区域的第四引物对(SDC20-2-F/R)；

其中，第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对的核苷酸序列如下：

第一引物对上游引物Septin9-1-F：GATTCGTTGTTTATTAGTTATTATG(SEQ ID No.1)，

第一引物对下游引物Septin9-1-R：AAATAATCCCATCCAACT(SEQ ID No.2)；

第二引物对上游引物Septin9-2-F：GGTGTTGGGTTGGTTGT(SEQ ID No.5)，

第二引物对下游引物Septin9-2-R：CACCCGCAAAATCCTCT(SEQ ID No.6)；

第三引物对上游引物SDC2-1-F：TAGTCGGTTTTTGGGGA(SEQ ID No.9)，

第三引物对下游引物SDC2-1-R：AACCACCAAACCCAAAATA(SEQ ID No.10)；

第四引物对上游引物SDC2-2-F：GAGTGCAGAAACCAACAAGT(SEQ ID No.13)，

第四引物对下游引物SDC2-2-R：CCTCCTCCTGCGCCTGCTC(SEQ ID No.14)。

根据本发明的一些实施例的组合物，第一检测试剂还包括第一阻断序列(Blocker)组，第一阻断序列组包括第一阻断序列(Blocker1)和第二阻断序列(Blocker2)，第二检测试剂还包括第二阻断序列组，第二阻断序列组包括第三阻断序列(Blocker3)和第四阻断序列(Blocker4)；Blocker1～4分别用于和Septin9第一靶区域、Septin9第二靶区域、SDC2第一靶区域和SDC2第二靶区域的非甲基化序列结合，避免非甲基化序列干扰甲基化检测的核苷酸序列。

其中，第一阻断序列、第二阻断序列、第三阻断序列、第四阻断序列的核苷酸序列分别如下：

第一阻断序列Blocker1：TTATTATGTTGGATTTTGTGGTTAATGTGTA(SEQ ID No.4)，

第二阻断序列Blocker2：TTGTTGTGGTTGTGGATGTGTTG(SEQ ID No.8)；

第三阻断序列Blocker3：TAAACAAAATCCACACACACCACATATT(SEQ ID No.12)，

第四阻断序列Blocker4：GTGAGAGGGCGCCGCGTTCCCGGGGCGCAGCTGCGGGCGGCGGG(SEQID No.16)。

根据本发明的一些实施例的组合物，第一阻断序列、第二阻断序列、第三阻断序列和第四阻断序列的3′端经磷酸化修饰。

第二方面，本发明的一个实施例提供了一种试剂盒，该试剂盒包括上述的组合物。

根据本发明的一些实施例的试剂盒，还包括内参基因的检测试剂。内参基因如ACTB在不同组织细胞中表达恒定，用作参照物以校正上样时的实验误差，保证结果的准确性。

根据本发明的一些实施例的试剂盒，内参基因的检测试剂包括内参基因的检测探针和上下游引物。

根据本发明的一些实施例的试剂盒，内参基因的检测探针的核苷酸序列如下：

ACTB探针：CTTTACACCAACCTCATAACCTTATCAC(SEQ ID No.19)。

根据本发明的一些实施例的试剂盒，内参基因的检测探针的5′端标记有荧光报告基团，3′端标记有荧光淬灭基团；荧光报告基团为VIC，荧光淬灭基团为BHQ1。

根据本发明的一些实施例的试剂盒，内参基因的上下游引物的核苷酸序列如下：

ACTB-F：GTGTTTAAGATAGTGTTGTGG(SEQ ID No.17)，

ACTB-R：CTACTTAATACACACTCCAAAAC(SEQ ID No.18)。

根据本发明的一些实施例的试剂盒，还包括缓冲液、聚合酶、二价阳离子和dNTPs。

根据本发明的一些实施例的试剂盒，还包括阳性对照品和/或阴性对照品。

根据本发明的一些实施例的试剂盒，阳性对照品包括HeLa细胞。

根据本发明的一些实施例的试剂盒，阳性对照品为HeLa细胞与牛血清白蛋白、TE缓冲液的混合液。

根据本发明的一些实施例的试剂盒，阴性对照品包括Jurkat细胞。

根据本发明的一些实施例的试剂盒，阴性对照品为Jurkat细胞与牛血清白蛋白、TE缓冲液的混合液。

第三方面，本发明的一个实施例提供上述组合物或上述试剂盒在制备结直肠癌诊断试剂中的应用。上述组合物或试剂盒针对结直肠癌相关的多个目标基因进行联合检测，检测靶位点更多，不同位点的叠加信号更强，对结直肠癌检测的灵敏度更高。

附图说明

图1是本发明的一个实施例的早期结直肠癌样本的检测结果的FAM通道的扩增曲线图。

图2是本发明的一个实施例的早期结直肠癌样本的检测结果的VIC通道的扩增曲线图。

图3是本发明的一个实施例的早期结直肠癌样本的检测结果的ROX通道的扩增曲线图。

图4是本发明的另一个实施例的不同甲基化比例样本的检测结果的FAM通道的扩增曲线图。

图5是本发明的另一个实施例的不同甲基化比例样本的检测结果的VIC通道的扩增曲线图。

图6是本发明的另一个实施例的不同甲基化比例样本的检测结果的ROX通道的扩增曲线图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

本文中，“Septin9基因”是一类具有三磷酸鸟苷酶活性的保守基因家族成员之一，与染色体分离、DNA修复、迁移和凋亡等许多细胞功能有关。Septin9基因在结直肠癌发生中起抑癌基因作用，该基因的甲基化会抑制其正常表达，使抑癌功能丧失，并最终导致细胞***和癌变。其甲基化异常是结直肠癌的重要分子特征，可用于结直肠癌的早期诊断。

本文中，“SDC2基因”是黏结蛋白聚糖2(syndecan-2，SDC2)基因。该SDC2基因在大肠癌和腺癌组织中呈现高水平的甲基化现象，这种高度的甲基化，这一现象预示着其作为大肠癌诊断标志物具有较高的价值。

本文中，“甲基化特异性PCR”是一种利用差异化的PCR扩增来检测DNA的甲基化修饰是否存在的方法。该方法主要利用NaOH和亚硫酸氢钠对DNA模板进行硫转化预处理，未甲基化的胞嘧啶碱基(C)被转化为尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶则不会被转化，随后采用特异的PCR引物和探针来识别甲基化或未甲基化的DNA模板。

本文中，“阻断序列(Blocker)”是指用于和非甲基化序列结合，避免非甲基化序列干扰甲基化检测的核苷酸序列。

以下实施例所用试剂包括：

游离核酸提取试剂盒，德国Qiagen公司；

重亚硫酸盐转化试剂盒，美国ZYMO RESEARCH公司；

Taq酶，日本TAKARA公司；

10×PCR Buffer，日本TAKARA公司；

dNTPs，日本TAKARA公司；

MgCl₂，日本TAKARA公司。

以下实施例所用仪器包括：ABI 7500荧光定量PCR仪、水浴锅、涡旋混匀器、高速离心机、真空泵。

实施例1

引物和探针的设计

针对目标基因Septin9和SDC2各选定两个甲基化靶区域作为检测目标，每个甲基化靶区域包含2～4个甲基化位点，根据各甲基化靶区域分别设计上游扩增引物、下游扩增引物、探针、阻断序列。其中上下游扩增引物、探针均是基于硫转化后的序列进行设计，即原序列中非甲基化位点的C全部转化为T的序列；阻断序列是用于和非甲基化序列结合，避免非甲基化序列对于甲基化检测产生干扰，所以阻断序列是在该转化后的序列基础上，进一步将甲基化位点的C也转化为T后进行设计。将内参基因ACTB的一段序列转化为硫转化之后的序列，设置相应的上下游扩增引物和探针。最终的引物、探针、阻断序列见表1，将各个序列送至合成供应商进行合成，合成后的序列溶解稀释为10μM备用。

表1.检测试剂序列

其中，Septin9-1探针和Septin9-2探针的5′端标记有荧光报告基团FAM，3′端标记有荧光淬灭基团BHQ1；SDC2-1探针和SDC2-2探针的5′端标记有荧光报告基团ROX，3′端标记有荧光淬灭基团BHQ2；ACTB探针的5′端标记有荧光报告基团VIC，3′端标记有荧光淬灭基团BHQ1。

实施例2

检测实验

对照品制备：培养HeLa细胞并进行分离，加入牛血清白蛋白和1×TE缓冲液，HeLa细胞终浓度分别为4×10³个/mL，牛血清白蛋白终浓度为50g/L，得阳性对照品。培养Jurkat细胞并进行分离，加入牛血清白蛋白和1×TE缓冲液，Jurkat细胞终浓度分别为4×10³个/mL，牛血清白蛋白终浓度为50g/L，得阴性对照品。

取两个结直肠癌患者的血浆样本采用甲基化特异性PCR通过实施例1设计的检测试剂进行检测，具体步骤如下：

(1)Streck管抽取患者外周血10mL，离心，分离出血浆。

(2)取患者样本血浆及阳性对照品和阴性对照品4mL，采用游离核酸提取试剂盒进行平行提取，得到游离DNA样本。

(3)利用重亚硫酸盐转化试剂盒对游离DNA进行硫转化并纯化。

(4)纯化产物进行荧光定量PCR检测，PCR反应终体系为50μL，包含24μL的PCR反应混合液、1μL的Taq酶以及25μL的纯化产物，各反应成分终浓度见表2，反应程序见表3。

表2.PCR反应体系

表3.PCR反应程序

反应结束后，依据Ct值对结果进行判断，结果见图1～图3。从图中可以看出，4组反应内参的Ct值均在40以下，两个结直肠癌样本及阳性对照在FAM和ROX通道的Ct值均有明显扩增曲线，Ct值位于40以下，阴性对照在FAM和ROX通道无扩增曲线，测试结果符合预期，证明该试剂盒可以有效检测血浆阳性样本。

实施例3

对比实验

收集早期结直肠癌患者样本70例，收集健康人血浆100例，采用实施例2中的方法对DNA进行提取和硫转化。分别采用实施例2和对比例1的PCR反应体系对硫转化后的样本进行检测。对比例1是一种单靶区域反应体系，每个靶基因仅有一个靶区域纳入检测，具体见表4。

表4.单靶区域检测PCR反应体系

检测结束后，对结果进行判断，阳性对照FAM通道、VIC通道、ROX的Ct值小于或等于40则判断为正常，阴性对照VIC通道内参基因Ct值小于40且FAM、ROX的均无Ct值则判断为正常；检测样本VIC通道Ct值大于40则判定样本不合格；检测样本VIC通道Ct值小于或等于40且FAM和ROX的Ct值至少有一个小于或等于42则判断为阳性；检测样本VIC通道Ct值小于或等于40且FAM和ROX通道Ct值均大于42或无扩增则判断为阴性。

表5.对比实验检测结果

检测结果见表5，从表中可以看出：对于70例早期结直肠癌样本，对比例1的反应体系检出的阳性为56例，实施例2的反应体系检出的阳性为62例；对于100例健康人血浆，对比例1的反应体系检出的阳性为4例，实施例2的反应体系检出的阳性为5例，对比例1和实施例2的检测灵敏度分别为80％、88.6％，检测特异性分别为96％、95％。该结果显示，本发明实施例所采用的多基因多靶区域检测体系的检测灵敏度相比多基因单靶区域检测体系的检测灵敏度有明显提高，特异性略有下降但差异很小，表明本发明所提供的多基因多靶区域检测试剂相比传统检测能够有效提升检测灵敏度。

实施例4

甲基化梯度实验

分别利用Hela和Jurkat细胞提取DNA，硫转化后进行定量并稀释到1ng/μL，配制甲基化模板占比分别为50％、5％、1％、0.5％的混合DNA模板(对应非甲基化模板占比分别为50％、95％、99％、99.5％)，利用表2中的反应体系进行检测。结果如图4～6所示，该体系针对以上模板均能够有效检出阳性结果。现有的检测试剂在总模板甲基化比例较低，且甲基化模板总量很低时，会出现假阴性结果。而本发明实施例所提供的检测试剂针对至少两个包含多个甲基化位点的靶区域分别进行检测，获得累加信号，能够有效检出甲基化比例低至0.5％的样本，相比于传统的检测方法，增加了甲基化位点的检出率，有效提高了检测灵敏度。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所述技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

SEQUENCE LISTING

<110> 1

深圳市核子基因科技有限公司

<120> 组合物、试剂盒及其应用

<130> 1

<160> 19

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gattcgttgt ttattagtta ttatg 25

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

aaataatccc atccaact 18

<210> 3

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

taaccgcgaa atccgac 17

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ttattatgtt ggattttgtg gttaatgtgt a 31

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

ggtgttgggt tggttgt 17

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

cacccgcaaa atcctct 17

<210> 7

<211> 13

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

cgtccgcgac cgc 13

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ttgttgtggt tgtggatgtg ttg 23

<210> 9

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

tagtcggttt ttgggga 17

<210> 10

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

aaccaccaaa cccaaaata 19

<210> 11

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gcgcgcgtgg attttgt 17

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

taaacaaaat ccacacacac cacatatt 28

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

gagtgcagaa accaacaagt 20

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

cctcctcctg cgcctgctc 19

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

gagggcgccg cgttcccggg 20

<210> 16

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

gtgagagggc gccgcgttcc cggggcgcag ctgcgggcgg cggg 44

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

gtgtttaaga tagtgttgtg g 21

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

ctacttaata cacactccaa aac 23

<210> 19

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

ctttacacca acctcataac cttatcac 28

Claims

1.组合物，其特征在于，包括检测Septin9基因的CpG岛的至少两个甲基化靶区域的第一检测试剂和检测SDC2基因的CpG岛的至少两个甲基化靶区域的第二检测试剂。

2.根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述Septin9基因的甲基化靶区域包括Septin9第一靶区域和Septin9第二靶区域；所述SDC2基因的甲基化靶区域包括SDC2第一靶区域和SDC2第二靶区域；

所述第一检测试剂包括第一探针组，所述第一探针组包括特异性检测所述Septin9第一靶区域的第一探针和特异性检测所述Septin9第二靶区域的第二探针；所述第二检测试剂包括第二探针组，所述第二探针组包括特异性检测所述SDC2第一靶区域的第三探针和特异性检测所述SDC2第二靶区域的第四探针；

其中，第一探针、第二探针、第三探针、第四探针的核苷酸序列分别如下：

第一探针Septin9-1：TAACCGCGAAATCCGAC(SEQ ID No.3)；

第二探针Septin9-2：CGTCCGCGACCGC(SEQ ID No.7)；

第三探针SDC2-1：GCGCGCGTGGATTTTGT(SEQ ID No.11)；

第四探针SDC2-2：GAGGGCGCCGCGTTCCCGGG(SEQ ID No.15)；

优选地，第一探针、第二探针、第三探针、第四探针的5′端标记有荧光报告基团，第一探针、第二探针、第三探针、第四探针的3′端标记有荧光淬灭基团；不同探针组的探针的荧光报告基团和荧光淬灭基团的发射光谱不相同；

优选地，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、HEX、JOE、ROX、CY5，所述荧光淬灭基团选自BHQ1、BHQ2、TAMRA。

3.根据权利要求2所述的组合物，其特征在于，所述第一检测试剂还包括第一特异性引物组，所述第一特异性引物组包括特异性扩增Septin9第一靶区域的第一引物对和特异性扩增Septin9第二靶区域的第二引物对；所述第二检测试剂还包括第二特异性引物组，所述第二特异性引物组包括特异性扩增SDC2第一靶区域的第三引物对和特异性扩增SDC2第二靶区域的第四引物对；

优选地，第一引物对、第二引物对、第三引物对、第四引物对的核苷酸序列如下：

第一引物对下游引物Septin9-1-R：AAATAATCCCATCCAACT(SEQ ID No.2)；

第二引物对上游引物Septin9-2-F：GGTGTTGGGTTGGTTGT(SEQ ID No.5)，

第二引物对下游引物Septin9-2-R：CACCCGCAAAATCCTCT(SEQ ID No.6)；

第三引物对上游引物SDC2-1-F：TAGTCGGTTTTTGGGGA(SEQ ID No.9)，

第三引物对下游引物SDC2-1-R：AACCACCAAACCCAAAATA(SEQ ID No.10)；

第四引物对上游引物SDC2-2-F：GAGTGCAGAAACCAACAAGT(SEQ ID No.13)，

第四引物对下游引物SDC2-2-R：CCTCCTCCTGCGCCTGCTC(SEQ ID No.14)。

4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述第一检测试剂还包括第一阻断序列组，所述第一阻断序列组包括第一阻断序列和第二阻断序列；所述第二检测试剂还包括第二阻断序列组，所述第二阻断序列组包括第三阻断序列和第四阻断序列；

优选地，第一阻断序列、第二阻断序列、第三阻断序列、第四阻断序列的核苷酸序列分别如下：

第一阻断序列Blocker1：TTATTATGTTGGATTTTGTGGTTAATGTGTA(SEQ ID No.4)，

第二阻断序列Blocker2：TTGTTGTGGTTGTGGATGTGTTG(SEQ ID No.8)；

第三阻断序列Blocker3：TAAACAAAATCCACACACACCACATATT(SEQ ID No.12)，

第四阻断序列Blocker4：GTGAGAGGGCGCCGCGTTCCCGGGGCGCAGCTGCGGGCGGCGGG(SEQ IDNo.16)；

优选地，所述第一阻断序列、所述第二阻断序列、所述第三阻断序列和所述第四阻断序列的3′端经磷酸化修饰。

5.试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至4任一项所述的组合物。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括内参基因的检测试剂；

优选地，所述内参基因的检测试剂包括内参基因的检测探针和上下游引物；

优选地，所述内参基因的所述检测探针的核苷酸序列如下：

ACTB探针：CTTTACACCAACCTCATAACCTTATCAC(SEQ ID No.19)；

优选地，所述内参基因的所述上下游引物的核苷酸序列如下：

ACTB-F：GTGTTTAAGATAGTGTTGTGG(SEQ ID No.17)，

ACTB-R：CTACTTAATACACACTCCAAAAC(SEQ ID No.18)。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括缓冲液、聚合酶、二价阳离子和dNTPs。

8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，还包括阳性对照品和/或阴性对照品；

优选地，所述阳性对照品包括HeLa细胞；

优选地，所述阴性对照品包括Jurkat细胞。

9.权利要求1至4任一项所述的组合物，或权利要求5至8任一项所述的试剂盒在制备结直肠癌检测试剂中的应用。