CN116144604A - 一种广谱沙门氏菌噬菌体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种广谱沙门氏菌噬菌体，所述噬菌体命名为S4P，保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏号为：CCTCC NO:M2021765。本发明噬菌体能够快速杀灭21种不同血清型的临床致病性沙门氏菌，裂解率超过95％。本发明还提供了噬菌体S4P的应用，具体可用于制备沙门氏菌抑菌剂、防治畜禽沙门氏菌病的饲料添加剂、畜禽养殖环境消毒剂。

Description

一种广谱沙门氏菌噬菌体及其应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种广谱沙门氏菌噬菌体及其应用。

背景技术

沙门氏菌是重要的人畜共患病原菌之一。动物源性产品、粪便、尿液及污水等都是沙 门氏菌的传播媒介，可经消化道感染人和动物。目前，人们已从养殖场、污水池和粪便等分离筛选出不同类型的沙门氏菌噬菌体，并在防控猪源沙门氏菌方面取得了一定的进展。

鸡沙门氏菌病是由沙门氏杆菌引起的一类常见多发病的总称，包括鸡白痢杆菌病、鸡 副伤寒、鸡伤寒等病，严重危害鸡只的健康，常常给养鸡场造成严重经济损失。由于可以 垂直传播，因此发病率极高。家禽是沙门氏菌最主要的宿主，致病性沙门氏菌可引起雏鸡 大批死亡，成年鸡产蛋率和生产性能下降，但是大多数患病鸡以无症状的消化道定植为特 征，并不会引发全身性症状。这些隐性感染的沙门氏菌常以禽蛋、肉为主要媒介，是引发 人类食源性疾病的主要病原菌。

沙门氏菌病目前主要的防控措施是种群净化及定期为鸡群喂食抗菌药，以减少沙门氏 菌病的发病率。但由于长期喂食抗菌药，部分鸡群会产生严重的抗药性，一旦感染沙门氏 菌，再采用药物治疗将难以取得良好的治疗效果，严重影响了养殖户的经济效益。

我国的养殖业普遍存在滥用抗生素的现象，在抗生素的选择条件下甚至产生了交叉耐 药的现象。面对广泛的细菌性疾病，抗生素治疗失败及耐药性问题严重制约着养殖业的发 展。随着全球细菌耐药性的日益严峻，特别是“超级细菌”的出现，新型抗生素的开发难 度与日俱增，人类抗感染治疗已经面临无药可用的局面。同时饲料养殖业因长期滥用抗生 素而引起的耐药性问题也呈现逐年增长趋势，新型无抗养殖已经成为畜牧业发展的趋势。 噬菌体治疗是当前有望替代抗生素治疗的一种新的手段，近年来备受人们关注。

噬菌体早在上世纪已运用于人类的疾病治疗，抗生素的出现使人们将其忘却，而如今 当细菌耐药的频频出现，抗生素的耐药性不能满足人类健康需求时，噬菌体又再次登上了 历史舞台。随着细菌耐药性的日益严峻，人类即将进入无抗生素可用的后抗生素时代。面 临2020年我国饲料端“全面禁抗”，养殖端“减抗、限抗”等政策的实施，研发天然高效抗菌替代产品势在必行。

与抗生素治疗相比，噬菌体治疗具有代谢效率低、剂量小、特异性强、高效杀菌、增殖速度快等优势。同时，由于分子生物学的快速发展，人们对噬菌体基因组分析、起源与 进化、噬菌体－宿主相互关系及细菌的致病性等方面有了更深入的理解。目前，噬菌体的 应用研究引起了人们的广泛关注，不仅针对人类疾病的预防与治疗，在动物、食品及饲料 中病原菌的清除、细菌生物被膜的裂解等方面的研究与开发正在改变当前用药形式。

2013年2月由美国Intralytix公司研发的针对沙门菌的噬菌体制剂SalmoFresh^TM被美国 食品药品监督管理局(FDA)认定为公认安全级产品(GRAS)，并获批准上市。随着经济 发展和人们对动物性食品安全问题广泛关注，噬菌体作为一种天然绿色、安全有效的抗生 素替代品，具有广阔的应用前景。特别是在2006年，美国FDA批准了第一个基于噬菌体的产品(ListShieldTM)用来控制肉类和家禽产品中的单核细胞增生李斯特菌，实现了西方世 界噬菌体历史上的一个重要里程碑。从那时起，其他的噬菌体产品也陆陆续续地被批准用 于食品中的生物防治。专利号为“ZL 201810125673.8”的中国专利公开了一种保藏号为CGMCC No.14332的鸡白痢沙门氏菌噬菌体SP4，该制剂针对沙门氏菌具有较强的裂解作用，但是其裂解谱相对比较窄。窄谱的噬菌体制剂无法完全应对实际养殖环境中血清型复杂多变的致病菌，因此开发一种广谱沙门氏菌噬菌体及其制剂，能有效预防和治疗畜禽养殖环境中的沙门氏菌病，是本行业中亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的主要目的在于提供一种广谱沙门氏菌噬菌体，能 有效杀灭养殖环境中的沙门氏菌、防治畜禽养殖中的沙门氏菌病、净化养殖环境。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明一方面，提供了一种广谱沙门氏菌噬菌体(Salmonella entericaserovarphage)， 所述沙门氏菌噬菌体命名为S4P，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉大学， 保藏日期为2021年6月24日，保藏编号为：CCTCC NO：M 2021765。

所述噬菌体呈现多面体的头部和较长的尾部，属于有尾目、肌尾科噬菌体。

本发明还提供了所述沙门氏菌噬菌体S4P在制备沙门氏菌抑菌剂中的应用。

所述的沙门氏菌包括鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏 菌、都柏林沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠道沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、德比沙门氏菌。

本发明还提供了所述沙门氏菌噬菌体S4P在制备净化畜禽养殖环境中沙门氏菌的消毒 剂中的应用。

本发明还提供了所述沙门氏菌噬菌体S4P在制备防治畜禽沙门氏菌病的饲料添加剂中 的应用。

所述的畜禽沙门氏菌病包括鸡白痢、禽伤寒、肠炎、猪副伤寒。

本发明还提供了一种广谱沙门氏菌噬菌体S4P的制剂，所述制剂中含有沙门氏菌噬菌 体S4P和辅剂(保护剂)。

所述辅剂为SM缓冲液，其配置方法为：将NaCl 5.8g、MgSO₄·7H₂O 2g、1moL/L的Tris·HCl 50mL(PH＝7.4)、5mL 2％的硅胶，加入蒸馏水补足至1000mL，灭菌备用。

所述广谱沙门氏菌噬菌体制剂中沙门氏菌噬菌体与辅剂按一定的比例混合，pH为7.2。

所述广谱沙门氏菌噬菌体制剂中沙门氏菌噬菌体的含量≥10¹⁰PFU/mL。

所述广谱沙门氏菌噬菌体S4P的制剂可作为消毒剂，按一定比例稀释后在运输器具、 料槽、栏舍养殖环境中喷洒，净化沙门氏菌。

所述广谱沙门氏菌噬菌体S4P的制剂可作为饲料添加剂添加到畜禽饮水中，用于畜禽 沙门氏菌病的防治。

优选地，所述畜禽沙门氏菌病可以为鸡白痢。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明沙门氏菌噬菌体S4P为广谱沙门氏菌噬菌体，能够快速杀灭21种不同血清型的临床致病性沙门氏菌，裂解率达95.5％，宿主范围广，具备有效的临床应用价值。

(2)本发明沙门氏菌噬菌体S4P在50℃条件下水浴1h后仍然有10⁸PFU/mL的噬菌体存活，在60℃水浴20min后仍有10⁶PFU/mL的噬菌体存活，表明该噬菌体具有良好的热 稳定性。

(3)本发明沙门氏菌噬菌体的发酵水平效价较高，可达10¹¹PFU/mL，工艺技术稳定，大大降低使用成本。

(4)本发明提供的噬菌体制剂为液态，适合饮水或喷雾使用，安全高效，无残留，不会造成耐药细菌的产生。

(5)本发明中的广谱沙门氏菌噬菌体S4P分离自养殖场污水和粪便样中，特异性强， 方便易得。

附图说明

图1为沙门氏菌噬菌体S4P噬菌斑示意图；

图2为沙门氏菌噬菌体S4P电镜照片；

图3为沙门氏菌噬菌体S4P一步生长曲线；

图4为沙门氏菌噬菌体S4P最佳MOI筛选图。

具体实施方式

以下将通过实施例形式的具体实施方式，对上述内容做进一步的详细说明。但不应该 将此理解为上述主题的范围仅限于以下实施例。凡基于本发明内容所实现的技术均属于范 围内。

实施例1沙门氏菌噬菌体S4P的分离、纯化和保藏

(1)样品处理：从山东滨州某鸡场采集感染了沙门氏菌的病鸡粪样、厂区污水，加入 适量SM缓冲液(将NaCl 5.8g、MgSO₄·7H₂O 2g、1moL/L的Tris·HCl 50mL(PH＝7.4)、5mL 2％的硅胶，加入蒸馏水补足至1000mL，灭菌备用；以下未做特殊说明，SM缓冲液均 与此方一致)稀释后，置于4℃冰箱冷藏浸泡过夜，次日8000rpm/min离心处理10min，取 上清过0.22μm滤膜过滤除菌，得到样品储备液。

(2)宿主菌的复苏活化：挑取山东某鸡场病死鸡体内分离的临床鸡沙门氏菌单菌落接 种于10mL TSB液体培养基中，150r/mim、37℃培养过夜，得到菌悬液，次日取100μL菌悬液再次转接于10mL TSB液体培养基中，150r/mim、37℃培养4h，得到宿主菌悬液，备 用。

(3)宿主菌的增殖：取10mL处理好的样品储备液加入到沙门氏菌宿主菌悬液中，装入无菌三角锥形瓶，37℃静置孵育过夜，得到沙门氏菌噬菌体增殖液。

(4)噬菌体的分离：将得到的沙门氏菌噬菌体增殖液10000r/min离心处理30min，过 0.22μm滤膜，装于无菌EP管中，用SM缓冲液分别稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5倍。 用双层琼脂平板法分离噬菌体，分别取100μL宿主菌悬液和各梯度稀释后的噬菌体加入到 5mL半固体培养基中(TSB液体培养基中加入0.6％的琼脂粉，121℃高温灭菌15min后， 在55℃条件下保温备用)，摇匀，迅速平铺于TSA固体平板上，待凝固以后置于37℃恒 温培养箱培养4～6h，观察结果。若有沙门氏菌噬菌体存在，则在平板的上层出现透亮的圆 斑。

(5)噬菌体的纯化：用无菌枪头挑取一个形态较大、透亮的噬菌斑，转移至1mL SM缓冲液中稀释，然后全部转接到10mLTSB液体培养基中，再接入100μL宿主菌悬液，37℃、150r/min振荡培养4～6h。将混合培养液8000rpm/min离心处理10min，取上清过0.22μm 滤膜过滤除菌，得到噬菌体原液，用SM缓冲液稀释至10^-5、10^-6、10^-7、10^-8倍后，分别取 上述100μL噬菌体稀释液与100μL宿主菌悬液加入到5mL半固体培养基中，摇匀，迅速平 铺于TSA固体平板上，待凝固以后置于37℃恒温培养箱培养4～6h，观察结果。重复此步 骤3～5次，直到每次观察到的噬菌斑形态、大小、透亮程度均匀一致时，即得到纯化后的 沙门氏菌噬菌体原液，命名S4P，纯化后的沙门氏菌噬菌体效价为≥10¹¹PFU/mL。

(7)噬菌体的保藏：申请人将该纯化的沙门氏菌噬菌体S4P保藏于中国典型培养物保 藏中心(CCTCC)，保藏号为：CCTCC NO：M2021765，保藏日期为：2021年6月24日， 保藏地址为：中国武汉市武汉大学，邮编：430072。

实施例2沙门氏菌噬菌体S4P的发酵

(1)菌种活化：将1mL EP管里的菌种用接种环挑取，然后在TSA平板上划线，37℃培养24h后挑取单个菌落，接种于10mL TSB液体培养基中，37℃、150r/min过夜培养12h 后，再用移液枪吸取100μL菌液转接于10mLTSB液体培养基中，37℃、150r/min培养4h 至对数生长期，作为发酵宿主菌的种子液。

(2)灭菌：在5L发酵罐内配制3L的TSB液体培养基，加入1mL消泡剂，121℃高 压灭菌20min后，冷却至室温，接通发酵溶氧电极和PH电极，开启搅拌和并通入无菌空气。

(3)接种：MOI＝0.01，将10mL对数生长期的宿主菌接种于3LTSB培养基中，同时 立即接种入100μL噬菌体种子，使用火焰接种环在发酵罐内接种，继续发酵10h。

(4)取样：接入噬菌体种子后在取样口每隔2h取样1mL，8000r/min离心5min后测定噬菌体效价。

(5)噬菌体效价测定半固体培养基配制：TSB液体培养基中加入0.6％的琼脂，加热溶解后每试管5mL分装，121℃高压灭菌20min后备用。

(6)噬菌体效价测定：噬菌体发酵液取样离心处理后，取上清100μL，加入900μL SM缓冲液中，依次逐级稀释至10^-7～10^-8梯度。在半固体培养基温度降至55℃左右时，加入100μL的新鲜宿主菌液和100μL稀释后的噬菌体发酵液，摇晃均匀后倾倒入TSA平板上平 铺均匀，冷却凝固后在37℃培养6～8h观察噬菌斑并统计结果，每个梯度做两个平行。

(7)发酵过程工艺参数：温度为37℃；发酵初始转速为200rpm，通气量为4.0L/min，此时溶氧维持在95％以上；发酵时间4h后，溶氧开始下降，发酵时间约5h时，溶氧降低 至30％左右，此时打开溶氧控制，通过调节通气量与转速，使溶氧值维持在30％以上，直 至发酵结束。

(8)发酵结果：沙门氏菌噬菌体S4P的发酵液中噬菌体效价达10¹¹PFU/mL。

实施例3沙门氏菌噬菌体S4P的效价检测和形态学特性

(1)噬菌体的保存：将实施例1中纯化后的沙门氏菌噬菌体原液，加入70％的甘油，按1:1比例混合均匀，用1.5mL的无菌EP管保存于-80℃即可。

(2)噬菌体效价测定方法：噬菌体效价又称噬菌体滴度、噬菌斑形成单位数(plaque-forming unit，pfu)指的是每毫升试样中侵染性噬菌体的粒子数。双层平板法是测定 噬菌体效价的最普遍使用的方法。

用无菌的SM缓冲液对沙门氏菌噬菌体原液进行倍比稀释，然后取适当稀释度的噬菌 体稀释液100μL与对数期的菌液100μL加入到5mL 50℃的TSB半固体培养基中，用漩 涡振荡器充分混匀后，倒入底层平板之上，待培养基充分冷凝之后，将其倒置于恒温培养 箱中培养至出现清晰的噬菌斑为止(约12h)，培养温度设为37℃。

每个稀释度设置三组平行，取平均值。噬菌体效价计算公式如下：

噬菌体效价(PFU/mL)＝噬菌斑数×稀释倍数×10

(3)噬菌体的形态学特性

噬菌体电镜查看：沙门氏菌噬菌体自命名为S4P，其电镜照片如图2所示，该噬菌体呈 现多面体的头部和较长的尾部，属于有尾目、肌尾科噬菌体。

实施例4沙门氏菌噬菌体S4P的一步生长曲线

以实施例1分离纯化的S4P沙门氏菌噬菌体为基础，将感染复数(MOI)为0.01的噬菌体S4P和宿主菌新鲜菌液各取10mL，混合均匀后开始计时，迅速置于37℃摇床中150r/min振荡培养，每隔10min取样1mL，8000r/min离心1min，吸取100μL的上清用SM缓冲液 10倍倍比稀释后用双层琼脂平板法测定噬菌体效价，以感染时间为横坐标，噬菌体效价为 纵坐标，绘制一步生长曲线，得到沙门氏菌噬菌体S4P的潜伏期、爆发期，结果如附图3 所示。

实施例5沙门氏菌噬菌体S4P的热稳定性试验

取1mL实施例1中沙门氏菌噬菌体S4P纯化后的原液装于无菌EP管中，分别在40℃、50℃、60℃、70℃水浴中作用5min、10min、20min、30min、45min、60min。作用时间结 束后取出EP管，立即冰浴，用SM缓冲液稀释后按双层琼脂平板法测定噬菌体效价。

结果如表1所示，与空白对照组相比，沙门氏菌噬菌体S4P在50℃条件下水浴1h后仍 然有10⁸PFU/mL的噬菌体存活，在60℃水浴20min后仍有10⁶PFU/mL的噬菌体存活。结 果表明，沙门氏菌噬菌体S4P的高温条件下仍具有良好的耐受性。

表1沙门氏菌噬菌体S4P的热稳定性试验效价结果

实施例6一种广谱沙门氏菌噬菌体制剂的制备

取实施例1获得的鸡沙门氏菌噬菌体S4P，采用双层琼脂平板法检测其效价，应≥10¹¹ PFU/mL，加入等体积的SM缓冲液，即获得一种广谱沙门氏菌噬菌体制剂，其噬菌体效价≥10¹⁰PFU/mL。

实施例7广谱沙门氏菌噬菌体制剂的杀菌效果试验

选择不同血清型的沙门氏菌菌株测定实施例6中广谱沙门氏菌噬菌体制剂的杀菌效果， 试验用菌株均由本公司微生物实验室保存，主要从各地养殖场的病死鸡上分离获得，具体 步骤如下：

采用点滴法：将培养至对数生长期的上述各个血清型沙门氏菌试验菌株取100μL，无 菌用涂布棒均匀涂布于TSA平板上，取5μL噬菌体制剂点滴于平板中央，待干燥后将平板倒置放于37℃恒温培养箱过夜，次日观察是否有裂解斑，实验结果见表2。

实验结果表明，上述广谱沙门氏菌噬菌体制剂对养殖环境中分离的致病性沙门氏菌均 有不同程度裂解作用，进一步说明该噬菌体制剂对22株里面的21种不同血清型的沙门氏 菌具有显著的杀菌效果，裂解率达到95.5％，裂解谱极广，具有制备沙门氏菌杀菌剂和畜禽 养殖环境消毒剂的前景。

表2噬菌体制剂体外杀菌效果试验

注：﹢表示具有裂解能力；－表示没有裂解能力。

实施例8广谱沙门氏菌噬菌体制剂对雏鸡人工感染的防治效果

(1)试验分组及处理

选取15日龄健康雏鸡90只，随机分为三组，空白对照组、感染组、治疗组。空白对照组不攻毒，不灌服噬菌体；感染组腹腔注射攻毒0.5mL浓度为1.0×10⁸CFU/mL的鸡白痢沙门氏菌CVCC-1797(来自于中国兽医药品监察所，属于强毒株)菌液/只雏鸡；治疗组在 攻毒的同时灌服给予1×10¹⁰PFU/mL实施例6制备的该噬菌体制剂1.0mL/只，各试验组在 相应处理后正常饲喂观察17天。剂量与分组如表3所示。

表3噬菌体制剂对鸡感染沙门氏菌治疗效果试验-剂量及分组

(2)试验观察指标

雏鸡体重：试验结束后对雏鸡进行称重。

日常观察：攻毒前后对雏鸡进行观察，而后连续观察17日。主要观察雏鸡外观、粪便 形态、采食量、腹泻情况、死亡率等。记录17天后雏鸡的死亡情况，并剖检部分活鸡观察内脏病死灶、出血点、肠道出血情况等病变。

(3)试验结果

a.日常观察

试验开始前，各组雏鸡被毛光泽，采食饮水正常，精神状态良好，活动正常；试验开始后，空白对照组雏鸡未发现异常症状，感染组雏鸡出现双翅下垂，活动减少，闭眼，精 神沉郁，死亡症状，治疗组雏鸡零星出现精神沉郁症状。

b.雏鸡死亡情况

各试验组雏鸡为15日龄，雏鸡死亡情况如表4、表5所示，观察17天后，空白对照组无雏鸡死亡；感染组雏鸡死亡21只，死亡率为70％；治疗组雏鸡死亡2只，死亡率为6.67％，显著低于感染组。感染组死亡雏鸡积分(死亡雏鸡均积分)为280(9.33)，治疗组死亡雏 鸡积分(死亡雏鸡均积分)为27(0.9)显著低于感染组。

表4噬菌体制剂对雏鸡感染沙门氏菌治疗效果试验-雏鸡死亡积分

表5噬菌体制剂对雏鸡感染沙门氏菌治疗效果试验-雏鸡死亡情况

注：试验处理后，雏鸡死亡时间越早积分越高。

c.雏鸡生长性能指标

表6噬菌体制剂对雏鸡感染沙门氏菌治疗效果试验-生长性能指标

试验结果显示，观察17天后，空白对照组无雏鸡死亡，感染组雏鸡死亡21只，死亡率为70％，治疗组雏鸡死亡2只，死亡率为6.67％，显著低于感染组。感染组死亡雏鸡积 分(死亡雏鸡均积分)为280(9.33)，治疗组死亡雏鸡积分(死亡雏鸡均积分)为27(0.9) 显著低于感染组。结果表明，口服该广谱沙门氏菌噬菌体制剂能够有效地降低鸡感染沙门 氏菌后的死亡率，能改善鸡感染沙门氏菌后的料肉比，降低腹泻率。表明该广谱沙门氏菌 噬菌体制剂对鸡感染沙门氏菌有很好的治疗效果。

Claims (10)

1.一种广谱沙门氏菌噬菌体，其特征在于，所述沙门氏菌噬菌体命名为S4P，其保藏号为：CCTCC M 2021765。

2.根据权利要求1所述的广谱沙门氏菌噬菌体在制备沙门氏菌抑菌剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述沙门氏菌为鼠伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、肠炎沙门氏菌、伤寒沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、肠道沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌、副伤寒沙门氏菌、德比沙门氏菌。

4.根据权利要求1所述的广谱沙门氏菌噬菌体在制备净化畜禽养殖环境中沙门氏菌的消毒剂中的应用。

5.根据权利要求1所述的广谱沙门氏菌噬菌体在制备防治畜禽沙门氏菌病的饲料添加剂中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述畜禽沙门氏菌病包括鸡白痢、禽伤寒、肠炎、猪副伤寒。

7.一种如权利要求1所述的广谱沙门氏菌噬菌体的制剂，其特征在于，制剂中含有所述沙门氏菌噬菌体和辅剂，所述辅剂为SM缓冲液，其配置方法为：将NaCl 5.8g、MgSO₄·7H₂O2g、1moL/L的Tris·HCl 50mL(pH＝7.4)、5mL 2％的硅胶，加入蒸馏水补足至1000mL，灭菌备用。

8.根据权利要求7所述的制剂，其特征在于，所述广谱沙门氏菌噬菌体制剂中沙门氏菌噬菌体与辅剂按一定的比例混合，制剂的pH为7.2；制剂中沙门氏菌噬菌体的含量≥10¹⁰PFU/mL。

9.根据权利要求7所述的制剂，其特征在于，所述广谱沙门氏菌噬菌体的制剂可用于制备消毒剂，消毒剂按一定比例稀释后在运输器具、料槽、栏舍养殖环境中喷洒，净化沙门氏菌。

10.根据权利要求7所述的制剂，其特征在于，所述广谱沙门氏菌噬菌体的制剂可用于制备饲料添加剂，添加到畜禽饮水中，用于畜禽沙门氏菌病的防治。

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