CN117586966B - 一株耐酸碱产气荚膜梭菌噬菌体rdp-cp-22005及其应用 - Google Patents

一株耐酸碱产气荚膜梭菌噬菌体rdp-cp-22005及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株耐酸碱产气荚膜梭菌噬菌体RDP‑CP‑22005及其应用，该噬菌体于2023年3月23日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.45449。本发明还提供了上述噬菌体或杀菌组合物在制备以下至少一种产品中的应用：(1)杀灭或抑制产气荚膜梭菌的产品；(2)预防和/或治疗产气荚膜梭菌所引起的家禽疾病的产品；(3)预防和/或治疗产气荚膜梭菌引起的炎症反应的产品。该噬菌体在pH为2.0‑13.0条件下具有良好的耐酸碱性，保证了噬菌体的活性不会丧失。该噬菌体对产气荚膜梭菌有较好的裂解作用，且能裂解多种血清型的宿主，具有较宽的裂解谱，可以替代抗生素，抵抗胃酸的腐蚀，使得宿主肠道疾病得到有效治疗，同时该噬菌体对环境友好。

Description

一株耐酸碱产气荚膜梭菌噬菌体RDP-CP-22005及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株耐酸碱产气荚膜梭菌噬菌体RDP-CP-22005及其应用。
背景技术
产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是一种厌氧杆菌，革兰氏染色呈阳性。起初是由美国病理学家W.H.Welchii等从一高度腐烂的尸体血管组织中分离获得，人们便以他的名字来命名，故又被称为魏氏梭菌。后来因国际细菌命名法规的变动其学名历经多次修订，并最终更名为产气荚膜梭菌。该菌菌体长为3μm-9μm，宽为0.6μm-2.4μm，两端钝圆呈粗杆状，边缘笔直。菌体形态并不固定，往往在菌体生长的早期呈球状，而到生长末期，由于培养基营养成分的耗尽，常出现蝌蚪状、丝状和颗粒状。镜下可见单个或成短链排列，有时也会成对分布。
该菌能够产生多种强烈的外毒素，目前已知的有α、β、ε、γ、η、δ、ι、θ、κ、λ、μ，和ν十二种。其中最重要的是α、β、ε、ι这四种外毒素，且均为蛋白质，具有酶活性、抗原性。它们是最主要的致死性毒素和分型毒素。根据分泌的主要外毒素不同，可以将产气荚膜梭菌分为：A-E 5个毒素型，各毒素及菌型都可不同程度地引发动物和人发病。
在临床上，传统治疗产气荚膜梭菌病的基本方法是采用抗生素。近些年，随着抗菌药物的大量使用，尤其在我国，抗生素作为饲料添加剂长期添加于饲料中，使得致病菌产生耐药性，而且耐药谱不断扩大，传播速度也越来越快，严重威胁着人们的健康和公共卫生安全。但是随着抗生素的滥用，耐药菌株的出现，治疗产气荚膜梭菌病的目前遇到了很大的困难。
噬菌体又称细菌病毒，是一种在细菌体内完成增殖，通过裂解细菌将自身释放到环境中的微生物。与抗生素治疗相比，噬菌体治疗具有代谢效率低、杀死细菌的最低剂量低、高度的特异性、高效的杀菌效果、筛选速度快等优势。
近年来，有关噬菌体的研究有了巨大的发展，国内外对噬菌体的应用研究范围很广，包括针对人类疾病的防治、动物疾病的防治、食品中病原菌的清除、农作物的细菌感染防治、细菌生物被膜的裂解等方面。虽然噬菌体应用前景巨大，但不容忽视的是，噬菌体往往具有较窄的宿主谱，一种噬菌体通常只能裂解一种细菌。而且，噬菌体在实际生产应用过程种多采用口服的方式，噬菌体经过消化道时，胃酸等成分容易使噬菌体失活。
目前尚未出现能够预防和治疗产气荚膜梭菌病的耐酸碱的噬菌体产品，因此，研发一种可耐强酸强碱、裂解谱宽、兼具预防和治疗，且效果显著、稳定遗传的噬菌体产品用于治疗产气荚膜梭菌病迫在眉睫。
发明内容
本发明旨在针对现有技术的不足，提供一株耐酸碱产气荚膜梭菌噬菌体RDP-CP-22005及其应用。本发明提供的一株耐酸碱产气荚膜梭菌噬菌体RDP-CP-22005可耐强酸强碱，保证了噬菌体的活性不会丧失，可以替代抗生素，可抵抗胃酸的腐蚀，对宿主肠道疾病得到有效治疗，同时该噬菌体对环境友好。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
第一方面，本发明提供了一株耐酸碱产气荚膜梭菌噬菌体RDP-CP-22005，该噬菌体从山东某发病养殖场的病禽盲肠中分离得到的，于2023年3月23日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.45449。
通过电镜观察到：该噬菌体RDP-CP-22005有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约46nm，有一个长约22nm的尾，有尾鞘，颈部连着头部和尾部。根据病毒分类国际委员会(ICTV)的分类标准鉴定，其形态符合有尾病毒目的特征，该噬菌体属于短尾病毒科。
该噬菌体RDP-CP-22005在MOI＝0.1条件下培养8h，其效价高达7.93×109PFU/mL。
该噬菌体在pH为2.0-13.0条件下处理2h仍能够保持自身稳定性，在强酸强碱环境下仍然具有较高的活性，对宿主菌依然保持较高的裂解作用，相较于其他现有的噬菌体，耐酸碱能力强；基于上述优异的生物学特征，该噬菌体能够适应强酸和强碱严苛的环境。
该噬菌体传代30次的过程中，始终保持较高的效价，没有出现明显波动，说明该噬菌体可以稳定遗传，适宜于大规模工业生产。
该噬菌体对产气荚膜梭菌有较好的裂解作用，经过实验证明，其对产气荚膜梭菌的裂解率高达90.9％，且能裂解A型、B型、C型、D型、E型多种血清型的宿主，例如在本发明的实施例中，对所选的A型产气荚膜梭菌的裂解率达到82.4％(17株能裂解14株)，对所选的B型产气荚膜梭菌的裂解率达到100％(6株均能裂解)，对所选的C型产气荚膜梭菌的裂解率达到90.9％(11株能裂解10株)，对所选的D型产气荚膜梭菌的裂解率达到100％(5株均能裂解)，对所选的E型产气荚膜梭菌的裂解率达到100％(5株均能裂解)。这说明本发明的噬菌体RDP-CP-22005对多种血清型的产气荚膜梭菌均有优异的裂解性能，具有较宽的裂解谱，裂解范围和应用对象更广，其在杀灭环境中的产气荚膜梭菌以及防治产气荚膜梭菌引起的疾病方面具有很好的应用前景。
第二方面，基于同一个发明构思，本发明还提供了一种杀菌组合物，包括如上所述的产气荚膜梭菌噬菌体RDP-CP-22005。
第三方面，基于同一个发明构思，本发明还提供了产气荚膜梭菌噬菌体RDP-CP-22005或如上所述的杀菌组合物在制备以下至少一种产品中的应用：(1)杀灭或抑制产气荚膜梭菌的产品；(2)预防和/或治疗产气荚膜梭菌所引起的家禽疾病的产品；(3)预防和/或治疗产气荚膜梭菌引起的炎症反应的产品。优选的，本发明提供了产气荚膜梭菌噬菌体RDP-CP-22005或如上所述的杀菌组合物在制备预防和/或治疗产气荚膜梭菌所引起的家禽疾病的产品中的应用。优选的，所述家禽为鸡。本文中术语“预防”是指包括通过给予所述噬菌体来抑制或延迟所述疾病的所有行为。本文中术语“治疗”是指包括通过给予所述噬菌体而使所述疾病好转或有所改善的所有行为。
第四方面，基于同一个发明构思，本发明还提供了一种噬菌体药物制剂，所述噬菌体药物制剂的有效成分包括如上所述的产气荚膜梭菌噬菌体RDP-CP-22005。
如上所述的噬菌体制剂，所述噬菌体制剂中还包含药学上可接受的载体，所述药物制剂形式为口服给药型或者注射给药剂型。优选的，所述噬菌体药物制剂形式为口服给药型，噬菌体在实际生产应用过程中采用口服给药的方式，噬菌体经过消化道时，胃酸等成分容易使噬菌体失活，但是本申请的发明人意外的发现，该噬菌体RDP-CP-22005可耐强酸强碱，保证了噬菌体的活性不会丧失，而且达到预防或者治疗产气荚膜梭菌病的作用。
本发明的有益效果是：
1、本发明提供的一株耐酸碱产气荚膜梭菌噬菌体RDP-CP-22005，在pH为2.0-13.0条件下具有良好的耐酸碱性，可耐强酸强碱，保证了噬菌体的活性不会丧失。该噬菌体可以替代抗生素，抵抗胃酸的腐蚀，对宿主肠道疾病得到有效治疗，同时该噬菌体对环境友好。
2、本发明提供的一株耐酸碱产气荚膜梭菌噬菌体RDP-CP-22005，具有较宽的裂解谱，对44株来源于山东省、江苏省、黑龙江省、河北省等不同地域的产气荚膜梭菌裂解率高达90.9％，应用范围广，为工业化生产噬菌体以及提供用于预防和治疗产气荚膜梭菌引起的疾病提供了噬菌体来源。
3、本发明提供的噬菌体从自然界获得，可以稳定遗传，适宜于大规模工业生产，而且使用安全，绿色环保。
附图说明
图1为噬菌体RDP-CP-22005的噬菌斑图片；
图2为噬菌体RDP-CP-22005的电镜照片；
图3为噬菌体RDP-CP-22005的一步生长曲线；
图4为噬菌体RDP-CP-22005的pH稳定性测试结果图；
图5为不同噬菌体的耐酸碱对比图；
图6为噬菌体RDP-CP-22005对温度敏感性测试结果图；
图7为噬菌体RDP-CP-22005的遗传稳定性测试结果图；
图8为噬菌体RDP-CP-22005对肉鸡的生存曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的内容，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明中，若非特指，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明中，产气荚膜梭菌CP-20032或被简称为“CP-20032”，产气荚膜梭菌噬菌体RDP-CP-22005或被简称为“噬菌体RDP-CP-22005”或者“RDP-CP-22005”。
实施例1宿主产气荚膜梭菌CP-20032的分离与鉴定
从山东某发病养殖场采样，无菌操作取病禽盲肠，在选择性培养基上划线，37℃厌氧环境培养18-24h，病菌在血液琼脂培养基上的形态为圆顶状的菌落，菌落表面光滑，半径为1-2.5mm，呈半透明，边缘整齐；在血琼脂基础平板(5％绵羊血+1％葡萄糖)上挑取草绿色、周围有双层溶血环的菌落接种于胰月示-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂基础(TSC)上，放置厌氧环境，45℃培养18-24h；挑取典型菌落继续划线纯化3-5次，直至菌落形态一致，然后挑取单菌落接种于5mL的液体硫乙醇酸盐(FTG)肉汤培养基中，37℃厌氧培养箱中培养12h，得到均匀浑浊的细菌悬浮液。再通过16SrRNA分子鉴定和血清型鉴定，确定为致病性产气荚膜梭菌，将其中一株命名为CP-20032，鉴定好的菌株在血琼脂基础平板培养基平板上划线，培养12h，将全部菌落用接种环刮至60％甘油-FTG液体中，保存于-80℃冰箱。
实施例2噬菌体RDP-CP-22005的分离与鉴定
(1)病料处理：从养殖场取病鸡，解剖留取盲肠，无菌操作取盲肠内容物，加入2mL灭菌FTG液体，将盲肠内容物充分浸泡，然后10000rpm离心30min，取上清液过0.22μm滤器，将滤出液备用；
(2)制备噬菌体富集液：取0.2mL菌悬液和1mL滤出液加入5mL FTG肉汤中，37℃厌氧箱培养过夜，然后10000rpm离心5min，取上清液过0.22μm滤器，滤出液备用；
(3)噬菌体分离：采用双层平板法进行噬菌体的分离，取噬菌体富集液滤出液0.1mL和宿主产气荚膜梭菌菌悬液0.2mL混合均匀后，37℃水浴10min，然后铺双平板，放于37℃厌氧培养箱培养6-8h后，挑取透明斑于1mL SM缓冲液中4℃浸泡12h，取0.1mL浸出液和0.2mL菌悬液37℃水浴10min，铺双平板，37℃厌氧培养箱培养4-6h纯化，照此步骤纯化5次，即得。RDP-CP-22005在双平板形成的噬菌斑直径在1mm-3mm，如图1所示。
噬菌体RDP-CP-22005保存方法：将噬菌体增殖液与60％的甘油按照体积比1∶1的比例混合，保存于-80℃冰箱或液氮中均可。
实施例3噬菌体RDP-CP-22005的电镜观察
取20μL含噬菌体粗制颗粒的液体滴于铜网上，自然沉淀15min，并用滤纸从侧面吸去多余液体，加一滴2％的磷钨酸(PTA)于铜网上对噬菌体染色10min，然后用滤纸从侧面吸去染色液，待样品干燥后用电子显微镜观察噬菌体形态，如图2所示。
观察得到：噬菌体RDP-CP-22005有一个多面体立体对称的头部，包裹着核酸，直径约46nm，有一个长约22nm的尾，有尾鞘，颈部连着头部和尾部。根据病毒分类国际委员会(ICTV)的分类标准鉴定，该噬菌体归类为有尾病毒目，短尾病毒科。
该噬菌体于2023年3月23日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.45449，并被分类命名为噬菌体，其序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例4噬菌体RDP-CP-22005的全基因组的ORF预测及功能注释
浓缩后高纯度的噬菌体液，采用二代Illumina Hiseq测序技术，进行全基因组二代测序组装。
将噬菌体RDP-CP-22005的全基因组序列，使用GeneMarkS软件对新测序的基因组进行编码基因预测。将预测基因的蛋白序列分别与Nr和Swiss-Prot数据库行blastp比对，从而获得预测基因的注释信息。通过与eggNOG数据库进行blastp比对，获得基因所对应的COG注释结果，并根据COG注释结果对蛋白进行功能归类。通过在线网站Virulence FactorDatabase，VFDB(http：//www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm)和CARD(https：//card.mcmaster.ca/)逐一核对可能存在的毒力基因和抗药性基因，最终完成噬菌体的功能注释。
噬菌体全基因组组装结果如表1所示。
表1噬菌体基因组组装结果统计表
噬菌体基因组ORF分析及功能注释如下，噬菌体基因信息统计如表2所示。
表2噬菌体基因信息统计表
噬菌体RDP-CP-22005基因组ORF蛋白的氨基酸序列与Nr和Swiss数据库中的氨基酸序列进行了比较，预测到21个开放阅读框，平均长度为859bp，通过功能同源性预测了12个蛋白的潜在功能，其余9个蛋白与已知的噬菌体或细菌蛋白没有相似之处。噬菌体RDP-CP-22005按蛋白功能归类为3个部分：细胞壁/膜/包膜生物发生(ORF11、OR13)，DNA复制及调控相关基因(ORF4、ORF21)和噬菌体结构相关蛋白(ORF5、ORF9、ORF10、ORF12、ORF15、ORF16、ORF18)。其中ORF13编码一种肽聚糖水解酶：N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase)，其能特异性裂解胞壁酸的乳酰基和L-丙氨酸的α-氨基之间的酰胺键。噬菌体RDP-CP-22005不含耐药基因及毒力基因，不含溶原性相关基因。
实施例5噬菌体RDP-CP-22005的最佳感染复数测定
1、实验方法：
按照感染复数为100、10、1、0.1、0.01、0.001的比例将噬菌体增殖液和宿主加入FTG肉汤中，并且确保培养体系的总体积相同。于37℃厌氧箱中培养8h后，常温下12000r/min离心5min，取上清液铺双平板测定其效价。具体参见表3。
表3最佳感染复数的测定结果
2、实验结果及分析：
由表3可以看出，当感染复数为0.1时，培养8h后，增殖液较为清澈，效价最高，说明RDP-CP-22005的最佳感染复数为0.1，对应最高效价为7.93×109PFU/mL。
实施例6噬菌体RDP-CP-22005的一步生长曲线的测定
1、实验方法：
取对数生长期的产气荚膜梭菌悬液，按照最佳感染复数的比例接种产气荚膜梭菌CP-20032和噬菌体RDP-CP-22005，在37℃的条件下，水浴10min，然后常温下12000r/min离心5min，弃上清液，除去未吸附在宿主上的游离噬菌体，如此用FTG肉汤培养基洗涤两次。再将沉淀重悬于37℃的FTG肉汤培养基中，迅速置于37℃ 200r/min的摇床中振荡培养并计时。前30min每隔5min取样计数，30-60min每隔20min计数，60-300min每隔30min计数，以时间为横坐标，噬菌体效价对数值为纵坐标，绘制生长曲线，得出噬菌体的潜伏期、裂解期，并计算出平均裂解量。平均裂解量＝爆发末期噬菌体滴度/感染初期宿主菌浓度。结果如图3所示。
2、实验结果及分析：
由图3可以看出，噬菌体感染宿主菌后的50min内效价没有明显变化，表明其潜伏期约50min，感染后50-100min内噬菌体的效价明显上升，之后趋于稳定，表明噬菌体裂解期约为50min。通过计算，噬菌体裂解量约为178PFU/感染细胞，表明噬菌体具有较强的裂解和复制能力。
实施例7噬菌体RDP-CP-22005的pH稳定性的测定
1、实验方法：
制备105CFU/mL的指数期宿主菌液，将RDP-CP-22005的噬菌体液按最佳感染复数调整浓度。调整FTG液体培养基的pH值分别为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，取噬菌体液加入到等体积的不同pH值下的FTG液体培养基混匀，37℃培养箱静置2h后，取100μL混合液与等体积的菌液混合，通过双层板法测效价，每个pH值三个平行。以pH值为横坐标，噬菌体效价的对数值为纵坐标，绘制噬菌体pH值稳定性曲线，确定最高点的pH范围。噬菌体RDP-CP-22005的结果如图4所示。
2、实验结果及分析：
由图4可以看出，噬菌体RDP-CP-22005在pH2-13范围能维持较好的活性，噬菌体能保持较高的效价，在pH为2或13时，噬菌体效价只降低了一个数量级。随着pH值的降低或升高，噬菌体的效价下降不明显，表明噬菌体RDP-CP-22005能够耐受强酸和强碱。
实施例8噬菌体RDP-CP-22005的耐酸碱对比实验
1、实验方法：
同时准备噬菌体RDP-CP-22005和RDPCP23017，其中噬菌体RDPCP23017已进行了保藏，保藏编号为CGMCC N0.45574。
制备105CFU/mL的指数期宿主菌液，将RDP-CP-22005和RDPCP23017的噬菌体液按最佳感染复数调整浓度。调整FTG液体培养基的pH值分别为3、5、7、9、11、13，取RDP-CP-22005和RDPCP23017的噬菌体液分别加入到等体积的不同pH值下的FTG液体培养基混匀，37℃培养箱静置2h后，分别测定两组噬菌体效价。噬菌体RDP-CP-22005和RDPCP23017两种不同噬菌体的耐酸碱对比的结果如图5所示。
2、实验结果及分析：
由图5结果可以看出，噬菌体RDP-CP-22005在pH3-13的环境下，均能保持较好的效价，而对比噬菌体RDPCP23017在强酸强碱环境下，噬菌体效价下降比较明显，因此，噬菌体RDP-CP-22005对酸碱的耐受性明显强于噬菌体RDPCP23017。
实施例9噬菌体RDP-CP-22005的最适生长温度的测定
1、实验方法：
制备105CFU/mL指数期宿主菌液，将RDP-CP-22005噬菌体原液按照最佳感染复数稀释到适合浓度，取100μL与等体积菌液混合，倒双层平板，分别置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃下培养30min和60min，30min后每隔10min取出噬菌体液体，冷却至室温，然后通过双层板法测噬菌体效价，每个温度三个平行。以温度为横坐标，以噬菌体效价的对数值为纵坐标，绘制噬菌体对温度敏感性曲线，确定噬菌体RDP-CP-22005生长的温度范围。结果如图6所示。
2、实验结果及分析：
由图6可以看出，噬菌体RDP-CP-22005在50℃以下活性可保持80％，在70℃时，活性也可以保持60min以上，90℃环境中60min内活性下降较快，说明该噬菌体能耐受一定高温，不能耐受极高的温度。
实施例10噬菌体RDP-CP-22005遗传稳定性的测定
1、实验方法：
将噬菌体RDP-CP-22005连续传代30次，每代培养基中加入等量的RDP-CP-22005和CP-20032，每代培养时间6h，然后倒双平板，测定其效价。结果如图7所示。
2、实验结果及分析：
从图7可以看出，噬菌体RDP-CP-22005在传代30次的过程中，始终保持较高的效价，没有出现明显波动，说明该噬菌体可以稳定遗传，适合工业化生产。
实施例11噬菌体裂解谱测定
1、实验方法：
噬菌体宿主谱采用点滴法检测。于细菌库中随机选取产气荚膜梭菌的不同血清型的宿主44株，各取100μL待测菌液分别涂布于厌氧肉干汤固体培养基上，待晾干后，吸取10μL噬菌体液各滴2滴于培养基上，37℃厌氧倒置培养12-16h，观察是否出现空斑，若出现则说明噬菌体对该菌株有裂解作用。
2、实验结果及分析：
如表4所示，噬菌体RDP-CP-22005可对试验中所选的44株产气荚膜梭菌中的40株有裂解作用，产气荚膜梭菌来源于申请人实验室自行分离获得，均为鸡源。其裂解率为90.9％，说明该噬菌体有较宽的裂解谱。结果如表4所示。
表4噬菌体RDP-CP-22005裂解谱
从表4可以看出，该噬菌体对产气荚膜梭菌有较好的裂解作用，且能裂解多种血清型的宿主，具有较宽的裂解谱，可替代抗生素，环境友好。
实施例12噬菌体RDP-CP-22005的雏鸡治疗实验
1、实验方法：
(1)取75只1周龄的白羽肉鸡，设置试验组、对照组和空白组，随机分成5组(每组15只)，试验组和对照组各组鸡只口服1mL产气荚膜梭菌CP-20032(108CFU/mL)，空白组口服等体积的生理盐水。
(2)试验组为取噬菌体RDP-CP-22005，平均分成3组，A组为噬菌体RDP-CP-22005(109PFU/mL)与pH＝3的培养液等体积混合作用2h，B组为噬菌体RDP-CP-22005(107pFU/mL)与生理盐水混合，C组为噬菌体原液(105PFU/mL)对照组。
(3)2h后，以上各试验组口服不同组的噬菌体1mL，对照组、空白组肌肉注射等体积的生理盐水。分组及给药情况见表5。
表5噬菌体治疗分组
(4)每天观察各组鸡只的精神状况，连续观察8d，统计肉鸡的死亡情况绘制生存曲线。称量各组鸡只攻毒前与攻毒8d后的体重，比较各组鸡只体重的差异。结果如图8所示。
2、实验结果及分析：
从图8可以看出，实验鸡感染宿主后，对照组鸡出现了比较严重的死亡，8d内，鸡只的死亡只数是9只，死亡率为60％；噬菌体A组、B组和C组在5d内的鸡只的死亡只数是0只；噬菌体A组在8d内的鸡只的死亡只数是2只，死亡率为13.3％，噬菌体B组在8d内的鸡只的死亡只数是1只，死亡率为6.7％，噬菌体C组和空白组在8d内的鸡只的死亡只数是0只。也就是说，噬菌体A组经酸性环境处理2h后的噬菌体对试验鸡仍然具有较好的保护作用，噬菌体B组和噬菌体C组也都对鸡有很好的保护作用，试验也证明，噬菌体RDP-CP-22005对产气荚膜梭菌引起的死亡有很好的保护作用，该噬菌体在酸性环境处理2h后仍然具有较好的保护作用，说明该噬菌体对胃酸具有较好的抵抗作用，不会因为口服至消化道而失活，也说明该噬菌体可以有效的预防产气荚膜梭菌的产生。
实施例13噬菌体治疗大群试验
在山东本地某养殖场，有一栋蛋鸡舍5000只鸡，该鸡群采食量下降，羽毛蓬松，拉水样稀粪并伴有粘液。剖检病死鸡，盲肠充血，肿大数倍，内胀气明显伴有粘液，经实验室检测到产气荚膜梭菌，为梭菌性肠炎疾病。
将噬菌体RDP-CP-22005发酵液(有效浓度为108PFU/mL)，经水线饲喂该鸡群。连用3天，使用噬菌体24h后，拉稀症状明显减轻，使用48h后，拉稀现象基本消失，采食量增加，精神变好，使用72h后，鸡群痊愈。
该大群试验证明了本发明的噬菌体在实际应用中能够治疗产气荚膜梭菌病，且效果明显，减抗替抗，绿色无残留。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一株耐酸碱产气荚膜梭菌噬菌体RDP-CP-22005，其特征在于，该产气荚膜梭菌噬菌体于2023年3月23日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.45449。
2.根据权利要求1所述的产气荚膜梭菌噬菌体RDP-CP-22005，其特征在于，所述产气荚膜梭菌噬菌体在pH为2.0-13.0条件下具有良好的耐酸碱性。
3.一种杀菌组合物，其特征在于，包括如权利要求1所述的产气荚膜梭菌噬菌体RDP-CP-22005。
4.根据权利要求1所述的产气荚膜梭菌噬菌体RDP-CP-22005或根据权利要求3所述的杀菌组合物在制备以下至少一种产品中的应用：(1)杀灭或抑制产气荚膜梭菌的产品；(2)预防和/或治疗产气荚膜梭菌所引起的家禽疾病的产品；(3)预防和/或治疗产气荚膜梭菌引起的炎症反应的产品。
5.一种噬菌体药物制剂，其特征在于，所述噬菌体药物制剂的有效成分包括如权利要求1所述的产气荚膜梭菌噬菌体RDP-CP-22005或如权利要求3所述的杀菌组合物。
6.根据权利要求5所述的噬菌体药物制剂，其特征在于，所述噬菌体药物制剂还包括药学上可接受的载体；所述药物制剂形式为口服给药型或者注射给药剂型。
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